專利名稱：改進(jìn)的生物活性肽生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物活性肽的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
高血壓是人中相對(duì)常見的疾病狀態(tài)，其代表了心血管疾病、腎衰竭和中風(fēng)的主要 風(fēng)險(xiǎn)因素。大量制藥產(chǎn)物(例如鈣阻斷劑、β阻斷劑、利尿劑、α阻斷劑、中樞α拮抗劑、 血管緊張素II拮抗劑和ACE抑制劑)的可利用性表示高血壓的生理機(jī)制是多方面的。在高血壓的生理機(jī)制中，腎素_血管緊張素機(jī)制特別受到了大量科學(xué)關(guān)注。在這 一機(jī)制中，血管緊張素由肝分泌，并被肽酶腎素切割得到無(wú)生物活性的十肽——血管緊張 素I。當(dāng)血管緊張素I經(jīng)過(guò)肺毛細(xì)管時(shí)，被稱作血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(下文稱作ACE)的另一 肽酶通過(guò)去除血管緊張素I的最后兩個(gè)殘基(His-Leu)作用于血管緊張素，形成八肽血管 緊張素II。血管緊張素II八肽顯示強(qiáng)血管收縮活性，并因此提高血壓。導(dǎo)致更低的血管緊 張素II水平的ACE抑制預(yù)防血管收縮，因此預(yù)防血壓高。除了切割血管緊張素I以外，ACE還能夠水解緩激肽——也參與血壓調(diào)節(jié)的一種 九肽。在后一機(jī)制中，ACE抑制導(dǎo)致提高的緩激肽水平，這促進(jìn)血管舒張并且降低血壓。因 此，抑制ACE通過(guò)至少兩種獨(dú)立的機(jī)制導(dǎo)致降血壓效應(yīng)。還已知八肽血管緊張素II刺激腎上腺皮質(zhì)對(duì)醛固酮的釋放。醛固酮的目標(biāo)器官 是腎，在那里醛固酮促進(jìn)腎小管對(duì)鈉的提高的重吸收。ACE抑制還通過(guò)該第三機(jī)制降低血 壓，但是在這種情況下通過(guò)減小鈉的重吸收來(lái)實(shí)現(xiàn)。因?yàn)榫哂卸嘀厣韺W(xué)效應(yīng)，所以抑制ACE的蛋白水解活性是壓制血壓的一種有效 方式。該觀察結(jié)果導(dǎo)致大量有效的制藥降血壓產(chǎn)物例如卡托普利和依那普利(Ondetti， Μ. Α.等，1977，Science, Washington DC, 196，441-444)。因?yàn)楦哐獕菏窍鄬?duì)常見的疾病狀態(tài)，所以用具有輕度活性的天然成分、特別是能 夠加入食物或飲料產(chǎn)物中的具有輕度活性的天然成分來(lái)抵抗現(xiàn)代生活方式的這一不想要 的結(jié)果會(huì)是有利的，因?yàn)檫@類產(chǎn)物可以被常規(guī)消耗?；蛘呖梢詫⑦@類有輕度活性的天然成 分加入飲食補(bǔ)充物中。在最近數(shù)十年間發(fā)現(xiàn)，經(jīng)發(fā)酵的奶中存在的特定肽具有ACE抑制能 力，并且能夠在高血壓受試者中誘導(dǎo)血壓降低。目前大量體外和體內(nèi)試驗(yàn)證明了從多種蛋 白質(zhì)來(lái)源獲得的不同肽的ACE抑制效應(yīng)。盡管體外ACE檢驗(yàn)揭示了許多不同的肽序列，但 是必須強(qiáng)調(diào)，ACE抑制肽需要在血中循環(huán)來(lái)發(fā)揮體內(nèi)效應(yīng)。這意味著有效的ACE抑制肽應(yīng) 當(dāng)?shù)挚刮改c蛋白水解消化系統(tǒng)的降解，并且應(yīng)當(dāng)在隨后沿腸壁轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)保持完整。多種ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)_功能研究表明，它們通常在C-端序列中具有Pro-Pro、 Ala-Pro 或 Ala-Hyp(Maruyama, S.and Suzuki, H. , 1982 ；Agric Biol Chem. ,46(5) 1393-1394)。該發(fā)現(xiàn)部分通過(guò)下述事實(shí)解釋ACE是不能切割涉及脯氨酸的肽鍵的肽基二 肽酶(EC3. 4. 15. 1)。因此不能從具有結(jié)構(gòu)Xaa-Pro-Pro的三肽中去除二肽Pro-Pro，因?yàn)?Xaa-Pro鍵不能被切割。因此可以想象，如果以相對(duì)高的濃度存在，則具有Xaa-Pro-Pro結(jié) 構(gòu)的三肽會(huì)抑制ACE活性。因?yàn)椴粌HACE，而且?guī)缀跛械牡鞍姿饷冈谇懈頧aa-Pro或 Pro-Pro鍵時(shí)都有困難，所以肽羧基端(多個(gè))脯氨酸殘基的存在導(dǎo)致分子相對(duì)抗蛋白酶的觀點(diǎn)幾乎是不證自明的。類似地，含有羥基脯氨酸(Hyp)來(lái)代替脯氨酸的肽是相對(duì)抗蛋白 酶的。藉此可以推斷，在羧基端帶有一個(gè)或多個(gè)(羥基)脯氨酸殘基的肽可能在胃腸道中 逃脫蛋白水解降解。這些結(jié)論會(huì)幫助我們理解特定ACE抑制肽可觀的體內(nèi)降血壓效應(yīng)它 們不僅滿足ACE抑制的結(jié)構(gòu)需要，而且抵抗胃腸蛋白水解消化系統(tǒng)的降解，并且在隨后在 腸壁上轉(zhuǎn)運(yùn)期間保持完整。已報(bào)道了三肽 Leu-Pro-Pro (LPP JP02036127)、Val-Pro-Pro (VPP ；EP 0583 074) 和 Ile-Pro-Pro (IPP J. Dairy Sci.，78 :777_7831995)的強(qiáng) ACE 抑制活性。最初所有 ACE抑制肽以它們對(duì)ACE活性的體外影響為基礎(chǔ)表征，三肽11 e-Pro-Pro (hereinafter referred to as IPP)Val-Pro-Pro (hereinafter referred to as VPP)and Leu-Pro-Pro (hereinafter referred to as LPP)因?yàn)閺?qiáng) ACE 抑制效應(yīng)導(dǎo)致相對(duì)低的 IC50 值而突出。隨后可以在自發(fā)性高血壓大鼠中證實(shí)三肽VPP以及IPP的推測(cè)的抗高血壓效 應(yīng)(Nakamura等，J. Dairy Sci.，78 12531257 (1995))。在這些實(shí)驗(yàn)中，抑制性三肽來(lái)自 于經(jīng)乳酸細(xì)菌發(fā)酵的奶。在奶發(fā)酵期間，期望的肽由生長(zhǎng)的乳酸細(xì)菌所生產(chǎn)的蛋白水解酶 (proteinase)生產(chǎn)。該發(fā)酵途徑的一個(gè)缺點(diǎn)是乳酸細(xì)菌是這樣一種生物，其生產(chǎn)的酶的種 類和數(shù)量難以控制。因此ACE抑制肽的生產(chǎn)幾乎不可再現(xiàn)，也不太可能生產(chǎn)最佳的酶集合 來(lái)確保需要的肽的最大產(chǎn)率。需要的發(fā)酵時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，這與低產(chǎn)率組合在一起，意味著生 物活性肽的不良的成本結(jié)構(gòu)。盡管具有這些缺點(diǎn)，但是若干經(jīng)發(fā)酵的奶制品已被介紹為健 康食物產(chǎn)品，所述健康食物產(chǎn)品加入預(yù)防高血壓的天然的生物活性肽。另外，ACE抑制肽已 在電滲析、中空纖維膜透析或色譜方法后從經(jīng)發(fā)酵的奶制品中濃縮，使其能夠以濃縮的飲 食補(bǔ)充物如片劑或錠劑的形式銷售。發(fā)酵生產(chǎn)途徑的上述缺點(diǎn)在例如專利申請(qǐng)WO 01/68115、EP 1 231279、WO 06/67163和WO 07/013426中被描述。在WO 06/67163中描述了從乳酪蛋白中回收三肽 Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro或Leu-Pro-Pro的純酶促工藝。本申請(qǐng)要求保護(hù)用蛋白水解 酶和肽酶消化含乳酪蛋白的材料，通過(guò)中間產(chǎn)物肽生產(chǎn)這些三肽的方法。這些酶溫育中的 每一個(gè)可耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)12小時(shí)，并且是在促進(jìn)微生物污染物長(zhǎng)出(outgrowth)的條件下進(jìn)行 的。在用肽酶溫育之前，優(yōu)選地純化中間產(chǎn)物肽，并且只有在中間產(chǎn)物肽的額外色譜純化步 驟后才獲得高的ACE抑制肽終濃度。在EP1908354中如下生產(chǎn)經(jīng)發(fā)酵的奶首先用木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶或其它密 切相關(guān)的蛋白酶消化酪蛋白，然后使用乳酸細(xì)菌發(fā)酵。EP1908354的比較實(shí)施例7-9顯示， 木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶的使用導(dǎo)致經(jīng)發(fā)酵的奶制品有提高的VPP和IPP含量，而已知能 夠生產(chǎn)VPP和IPP的其它Aspergillus酶導(dǎo)致降低的VPP和IPP含量。結(jié)論是只有在木瓜 蛋白酶和菠蘿蛋白酶與生產(chǎn)VPP和IPP的Lactobacillus Helveticus 一起時(shí)才能夠生產(chǎn) 大量的VPP和IPP，因?yàn)樗鼈兙哂袇f(xié)同效應(yīng)。W02004/098309 與 Aspergi 1 Ius oryzae 的酶制劑一起使用生產(chǎn) VPP 和 IPP 的乳酸 細(xì)菌(Lactobacillus Helveticus)。W02004/098309公開了許多蛋白水解酶制劑不適合制 備具有高VPP和IPP含量的經(jīng)發(fā)酵的奶制品。另外，發(fā)現(xiàn)有用的Aspergillus oryzae制劑 需要以以酪蛋白為基礎(chǔ)2襯％到10wt%的量添加。在實(shí)施例中使用5wt%的酶，僅在實(shí)施例 13-15中酶量改變。使用多于時(shí)僅獲得大于50% VPP或IPP的摩爾產(chǎn)率。另外， W02004/098309的經(jīng)發(fā)酵的含有VPP和IPP的產(chǎn)物均具有至少37%的DH。通常，已知具有這類高DH的經(jīng)水解的產(chǎn)物具有異味。另外，高DH與直接加入固體食物中的降低的適應(yīng)性 相關(guān)，并且其較差的可口性產(chǎn)生嚴(yán)格的感官限制。因此存在對(duì)生產(chǎn)下述經(jīng)發(fā)酵的奶制品的需要，所述經(jīng)發(fā)酵的奶制品包含大量VPP 和IPP并且解決了現(xiàn)有技術(shù)工藝的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及以高產(chǎn)率生產(chǎn)有生物活性的，優(yōu)選ACE抑制性的三肽的工藝。根 據(jù)本發(fā)明的工藝包括與酶溫育步驟組合的發(fā)酵步驟，所述發(fā)酵步驟中使用乳酸細(xì)菌或 Bifidobacterium，所述酶溫育步驟中使用添加的蛋白酶，優(yōu)選在蛋白酶或肽的氨基酸序列 中存在的脯氨酸羧基端處切割的內(nèi)切蛋白酶，更優(yōu)選脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶或脯氨酸特 異性寡肽酶，最優(yōu)選脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶。優(yōu)選地，脯氨酸特異性蛋白酶在肽或蛋白質(zhì) 中存在的脯氨酸羧基端處切割肽和蛋白質(zhì)。任選地，氨肽酶與脯氨酸特異性蛋白酶一起添 加。優(yōu)選地，氨肽酶得自Aspergillus物種。酶溫育可以在發(fā)酵過(guò)程之前進(jìn)行，或者與發(fā)酵過(guò)程同時(shí)進(jìn)行，或甚至在發(fā)酵過(guò)程 完成后進(jìn)行。優(yōu)選地，溫育與發(fā)酵過(guò)程同時(shí)進(jìn)行。在終產(chǎn)物中需要存在有活力的微生物的 應(yīng)用中，例如在特定的酸奶或益生菌制劑中，酶溫育優(yōu)選地在發(fā)酵過(guò)程之前進(jìn)行。根據(jù)本 發(fā)明，使用乳酸細(xì)菌或Bifidobacterium進(jìn)行發(fā)酵。合適的乳酸細(xì)菌和Bifidobacteria W M zS^iifS Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus IMM Lactococcus ^lJ 禾中例如 Lactococcus lactis, Leuconostoc 物禾中，Pediococcus 物禾中，Streptocoocus 物禾中 以及 Bifidobacteria 白勺代表例如 Bifidobacterium animalis>Bifidobacterium brevis、 Bifidobacterium infantis 禾口 Bifidobacterium longum。本發(fā)日月白勺方法可用于生產(chǎn) ACE-抑制性或抗高血壓的三肽，以及免疫調(diào)節(jié)、抗氧化或抗微生物的肽。特別地，優(yōu)選地生 產(chǎn)三肽IPP、VPP和LPP。通過(guò)組合根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵和酶，將發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)點(diǎn)(例如產(chǎn)生 口味、質(zhì)感(texture)或益生菌活性)與生物活性三肽的生產(chǎn)成本有效地結(jié)合。因此，本發(fā)明提供了生產(chǎn)包含三肽IPP和/或三肽VPP的經(jīng)發(fā)酵的奶制品的方法， 所述方法包括使用奶蛋白質(zhì)作為起始材料，其中使用合適的乳酸細(xì)菌或Bifidobacterium 對(duì)所述奶蛋白質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵步驟，并使用脯氨酸_特異性內(nèi)切蛋白酶或脯氨酸特異性寡肽酶 進(jìn)行酶溫育步驟。本發(fā)明的方法產(chǎn)生具有大量IPP和/或VPP的經(jīng)發(fā)酵的奶制品。有利地，在本發(fā)明的方法中使用0. 05襯％到1. 7wt% (以每份存在的奶蛋白質(zhì)量 的酶蛋白質(zhì)為基礎(chǔ))的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶或脯氨酸特異性寡肽酶。優(yōu)選地在本發(fā)明 的方法中使用0. Iwt %到1. 5wt%、最優(yōu)選0. 2襯％到1. 3wt% (以每份存在的奶蛋白質(zhì)量 的酶蛋白質(zhì)為基礎(chǔ))的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶或脯氨酸特異性寡肽酶。使用的氨肽酶的 量?jī)?yōu)選地少于5wt %，更優(yōu)選地少于3wt %，最優(yōu)選地少于Iwt % (以每份存在的奶蛋白質(zhì)量 的酶蛋白質(zhì)為基礎(chǔ))。發(fā)明詳述目前可商業(yè)獲得若干種經(jīng)發(fā)酵的奶制品，其含有生物活性的ACE-抑制肽，例如三 肽 IPP (Ile-Pro-Pro)、LPP (Leu-Pro-Pro)和 VPP (Val-Pro-Pro)。盡管所有這些產(chǎn)物通過(guò)用 公知的乳酸培養(yǎng)物發(fā)酵奶制品來(lái)制備，但是典型地，獲得的終產(chǎn)物含有的這些ACE-抑制性三肽的水平高度可變。ACE-抑制性三肽的這些可變水平導(dǎo)致不想要的產(chǎn)量損失，并且在使 用經(jīng)發(fā)酵的產(chǎn)物作為終產(chǎn)物時(shí)，導(dǎo)致有廣泛分歧的降血壓效應(yīng)。這類降血壓效應(yīng)可以根據(jù) 現(xiàn)有技術(shù)中明確的方法測(cè)試，使用高血壓大鼠通過(guò)體內(nèi)測(cè)試進(jìn)行，或使用現(xiàn)有技術(shù)中已知 的方法通過(guò)測(cè)量它們抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的能力來(lái)體外測(cè)試?？勺兯降腁CE-抑 制性三肽和藉此產(chǎn)生的降血壓效應(yīng)可通過(guò)使用的含有起始材料的不同奶蛋白質(zhì)、不同的發(fā) 酵條件和乳酸培養(yǎng)物的差異來(lái)解釋。另外，形成的ACE-抑制性三肽的性質(zhì)和量取決于在應(yīng) 用的特定發(fā)酵條件下生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌類型所表達(dá)的蛋白水解系統(tǒng)的特征。目前已知為了在 人中獲得顯著的降血壓效應(yīng)，必須消耗相對(duì)大量的三肽IPP、VPP或LPP。不幸的是，在發(fā)酵 過(guò)程期間獲得這樣高水平的這些三肽并不容易許多因素影響發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)程和使用的乳 酸細(xì)菌或Bifidobacteria對(duì)需要的蛋白水解活性的生產(chǎn)。已知生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌生產(chǎn)大量不同的蛋白酶(參閱例如Savijoki等，Appl Microbiol Biotechnol (2006) 71 394-406)。從相關(guān)的蛋白質(zhì)來(lái)源產(chǎn)生三肽 IPP、VPP 和 LPP 需要大量這些蛋白酶之間復(fù)雜的相互作用。另外，多種蛋白酶必須大量存在。含有逐漸酸 化的奶蛋白質(zhì)的發(fā)酵液的相關(guān)酪蛋白級(jí)分的凝固會(huì)使這些三肽從酪蛋白中的釋放和定量 回收進(jìn)一步復(fù)雜化。因?yàn)檫@些復(fù)雜原因，很難以下述方式進(jìn)行發(fā)酵，所述方式使得某些想要 的三肽以提高和可再現(xiàn)的量存在。也必須考慮發(fā)酵過(guò)程同樣可為其它目的(如例如改善風(fēng) 味形成、粘度、口感的多糖以及想要的益生菌(probiotic)或益生元(prebiotic)成分的生 產(chǎn))服務(wù)的事實(shí)。如果這類額外的目標(biāo)發(fā)揮作用，則在最大化ACE-抑制性三肽水平方面對(duì) 發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化變得甚至更加復(fù)雜。我們目前驚訝地發(fā)現(xiàn)，將微生物發(fā)酵步驟與脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶對(duì)奶蛋白質(zhì) 的處理組合可導(dǎo)致最終發(fā)酵產(chǎn)物中所選擇的具有羧基端脯氨酸的ACE-抑制性三肽的含量 提高。我們發(fā)現(xiàn)甚至使用由于高蛋白水解能力而已知的培養(yǎng)物發(fā)酵的產(chǎn)物也可以被改進(jìn)， 達(dá)到更高的三肽IPP、VPP和LPP水平。另外，我們發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的方法以更加可再現(xiàn)的 方式導(dǎo)致這類更高的三肽水平。甚至通過(guò)使用不產(chǎn)生期望的ACE-抑制性三肽而是由于其 風(fēng)味形成或益生菌品質(zhì)而被選擇的培養(yǎng)物，本發(fā)明的方法也會(huì)導(dǎo)致具有大量ACE-抑制性 三肽的產(chǎn)物。通過(guò)這種方式，針對(duì)例如風(fēng)味、多肽或益生元或益生菌生產(chǎn)被優(yōu)化的發(fā)酵方法 的優(yōu)點(diǎn)可以與生產(chǎn)大量選定的ACE*抑制性多肽的能力組合。因此，本發(fā)明簡(jiǎn)單地通過(guò)將根 據(jù)本發(fā)明的酶步驟并入本發(fā)明方法中，使得經(jīng)發(fā)酵的奶的商業(yè)生產(chǎn)者能夠制造含有提高的 和標(biāo)準(zhǔn)化的生物活性三肽(例如IPP、VPP和LPP)量的產(chǎn)物?！半摹被颉肮央摹痹诒疚闹斜欢x為通過(guò)肽鍵結(jié)合起來(lái)的至少兩個(gè)氨基酸的鏈。術(shù) 語(yǔ)“肽”和“寡肽”被認(rèn)為是同義詞(如通常所認(rèn)識(shí)的那樣)，根據(jù)上下文需要，每個(gè)術(shù)語(yǔ)可 互換使用?！吧锘钚浴彪谋硎灸軌蛟诓溉閯?dòng)物中調(diào)節(jié)生理過(guò)程的肽。用本發(fā)明的方法生產(chǎn) 的優(yōu)選的生物活性肽是羧基端具有脯氨酸的肽。其它優(yōu)選的生物活性肽是具有降血壓效應(yīng) 的肽。最優(yōu)選的生物活性肽是IPP、LPP和VPP。“多肽”在本文中被定義為包含超過(guò)30個(gè)氨基酸殘基的鏈。本文中所有(寡)肽和 多肽式或序列都是從左至右按照從氨基端到羧基端的方向書寫的，與通常實(shí)踐一致。本文 中使用的單字母氨基酸代碼在本領(lǐng)域中是公知的，其可以在Sambrook，et al. (Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2nd, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)中找至丨J。
奶蛋白質(zhì)表示奶、脫脂奶、無(wú)脂肪奶、酪乳(butter milk)、酸奶、在水中溶解至期 望的蛋白質(zhì)濃度的奶粉，還表示在水中溶解至期望的蛋白質(zhì)濃度的酪蛋白酸鹽，任選地，必 須理解，含有乳清蛋白的酪蛋白酸鹽溶液或糖巨肽(GMP)溶液或這些成分的組合應(yīng)被術(shù)語(yǔ) 奶蛋白質(zhì)涵蓋。經(jīng)發(fā)酵的奶制品表示通過(guò)乳酸細(xì)菌或通過(guò)Bifidobacterium或通過(guò)這類菌株的 組合發(fā)酵的奶蛋白質(zhì)。水解產(chǎn)物(或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物或經(jīng)水解的蛋白質(zhì))表示通過(guò)蛋白質(zhì)的酶促水解形 成的產(chǎn)物，可溶于酸的水解產(chǎn)物是蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的可溶級(jí)分，其在本文中也被描述為含 有可溶的含肽組合物或包含可溶肽的組合物，或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物和可溶于酸的水解產(chǎn)物的 混合物。因此，水解產(chǎn)物是含肽組合物，并且在本發(fā)明的情況下是含有三肽IPP和VPP的組 合物。生物活性肽組合物表示通過(guò)本發(fā)明的方法(藉此在酶促水解和蛋白質(zhì)的發(fā)酵后) 形成的產(chǎn)物?？扇苡谒岬纳锘钚噪慕M合物是生物活性肽組合物的可溶級(jí)分，其在本文中 也描述為可溶的含有生物活性肽的組合物或包含可溶的生物活性肽的組合物，或生物活性 肽組合物和可溶于酸的、生物活性肽組合物的混合物。對(duì)所有酶進(jìn)行分類和命名的、來(lái)自IUMB的國(guó)際承認(rèn)的體系包括蛋白酶。用于蛋 白酶EC號(hào)碼的更新的IUMB文本可在互聯(lián)網(wǎng)站點(diǎn)http //www. chem. qmw/ac. uk/iubmb/ enZyme/EC3/4/ll/找到。在該系統(tǒng)中，按照其催化單一反應(yīng)的事實(shí)對(duì)酶進(jìn)行定義。這具 有下述重要暗示若干種不同的蛋白質(zhì)均被描述為同一種酶，而能催化超過(guò)一種反應(yīng)的蛋 白質(zhì)卻被當(dāng)作不止一種酶。該系統(tǒng)將蛋白酶分為內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶。術(shù)語(yǔ)“蛋白 酶”(protease)、“蛋白水解酶” (proteinase)和“肽酶”在本文中可互換使用。內(nèi)切蛋白酶 是催化內(nèi)部肽鍵水解的那些酶，外切蛋白酶則水解與末端a-氨基鄰近的肽鍵(“氨肽酶”)， 或末端羧基與倒數(shù)第二個(gè)氨基酸之間的肽鍵(“羧肽酶”)。內(nèi)切蛋白酶基于催化機(jī)制被分 為多個(gè)亞-亞組。存在有下述亞-亞組絲氨酸內(nèi)切蛋白酶(EC 3. 4. 21)、半胱氨酸內(nèi)切蛋 白酶(E.C 3. 4. 22)、天冬氨酸內(nèi)切蛋白酶(EC 3. 4. 23)、金屬內(nèi)切蛋白酶(EC 3.4.24)和蘇 氨酸內(nèi)切蛋白酶(EC 3.4.25)。氨肽酶在3. 4. 11組中。亞分組基于除去20種不同氨基酸的相對(duì)效率?？蓞^(qū)分開 具有窄的和寬的特異性的氨肽酶。氨肽酶可從蛋白質(zhì)和肽底物順序除去單個(gè)的氨基末端 氨基酸。具有窄特異性的氨肽酶展示出對(duì)于在Pi位置上從底物肽釋放的氨基酸殘基類型 的強(qiáng)烈偏好。寬特異性的氨肽酶能在N-末端或Pl位置釋放一定范圍的不同氨基酸(按 照 Schechter 的命名法Schechter，I. And Berger, Α. 1967. Biochem Biophys Res Commun 27:157-162)。羧肽酶能從蛋白質(zhì)和肽底物順序除去單個(gè)的羧基末端氨基酸。與內(nèi)切蛋白 酶的情況相當(dāng)，羧肽酶基于催化機(jī)制被分為多個(gè)亞-亞組。絲氨酸型羧肽酶處于EC 3.4. 16 組，金屬羧肽酶處于EC 3.4. 17組，半胱氨酸型羧肽酶處于EC 3.4. 18組。針對(duì)蛋白酶的EC 表的值用于提供針對(duì)多種類型的蛋白酶活性的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)，尤其用于向每種蛋白酶分配獨(dú)特 的身份號(hào)碼以及推薦名稱。WO 02/45524描述了能夠得自Aspergillus niger的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶， 其可有利地用于本發(fā)明中。衍生自A. niger的酶優(yōu)先在脯氨酸的羧基端切割，但是也可以 在羥基脯氨酸的羧基端切割，并且以更低的效率在丙氨酸的羧基端切割。WO 2002/45524還教導(dǎo)了在該來(lái)自A.niger的酶和來(lái)自其它微生物或哺乳動(dòng)物來(lái)源的已知的脯氨酰寡肽酶 之間不存在清楚的同源性。與已知的脯氨酰寡肽酶相反，A. niger酶具有酸性pH最適度。分 泌型A. niger酶似乎是絲氨酸肽酶的S28家族成員，而不是大部分胞質(zhì)脯氨酰寡肽酶都?xì)w 入的 S9 家族(Rawlings，N. D. and Barrett, AJ. ；Biochim. Biophys. Acta 1298(1996) 1—3)。 優(yōu)選地，衍生自A. niger的酶制劑作為純凈的酶使用。結(jié)果獲得特征是脯氨酸含量非常高 的濃縮的ACE抑制性肽混合物。特別適合本發(fā)明的是下述酶，所述酶·具有脯氨酸_特異性內(nèi)切蛋白酶活性和·具有與WO 2002/45523的SEQ ID NO :2相同的氨基酸序列，或具有與WO 2002/45523的SEQ ID NO :2的氨基酸1到526具有至少80%、優(yōu)選至少90%氨基酸序列 同一性的氨基酸序列。氨基酸序列之間的同一性水平通過(guò)WO 2002/45523中第15頁(yè)提到 的方法測(cè)定。WO 2006/005757中描述了氨肽酶從奶蛋白質(zhì)中獲得三肽IPP和VPP但不與發(fā) 酵步驟組合的用途。在WO 2006/005757中，提到了三種具有氨肽酶活性的商業(yè)酶制劑， 即 Flavourzyme 1000L (Novozymes，丹麥)、Sumizyme FP (Shin Nihon,日本)和 Corolase LAP Ch. :4123(AB Enzymes，UK)。所有這三種酶制劑得自 Aspergillus 物種。 已知Flavourzyme 和Sumizyme FP 二者是除了非特異性內(nèi)切蛋白水解活性和羧肽水 解活性以外還含有若干氨肽水解酶活性的復(fù)合酶制劑。Corolase LAP代表一種相對(duì)純凈 的、克隆和過(guò)表達(dá)的亮氨酸氨肽酶活性。與脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶組合時(shí)，所有三種提 到的酶制劑能夠最大化從酪蛋白酸鹽到降血壓三肽IPP和VPP的產(chǎn)量。然而，同樣可使用相 對(duì)富含氨肽水解活性的其它酶制劑，例如酶制劑如P印tidase 436P-P436P和P印tidase 433P-P433P，二者均可從Biocatalysts (Wales，UK)商業(yè)獲得。另外，經(jīng)克隆和過(guò)表達(dá)的氨 肽酶〃 ZBH"來(lái)自A.niger(見WO 02/068623的序列號(hào)57，本文中稱作〃 ZBH")。還已知 氨肽酶由除Aspergilli之外的其它微生物生產(chǎn)，例如已知Bacilli和Lactobacilli生產(chǎn) 多種氨肽酶。然而，對(duì)根據(jù)本發(fā)明的方法而言，得自Aspergilli的氨肽酶是優(yōu)選的。有效的ACE抑制性肽可能在肽的羧基端并入一個(gè)或兩個(gè)脯氨酸殘基。相同的結(jié) 構(gòu)要求也孵育肽針對(duì)蛋白水解降解的提高的抗性，從而提高了完整的肽會(huì)在血流中終結(jié)的 可能性。為了獲得在其羧基端具有至少一個(gè)但是優(yōu)選多個(gè)脯氨酸殘基的肽，使用能夠在脯 氨酸殘基的羧基端一側(cè)切割的蛋白酶提供了一種有趣的選項(xiàng)。所謂的脯氨酰寡肽酶(EC 3. 4. 21. 26)具有優(yōu)先在脯氨酸殘基羧基側(cè)切割肽的獨(dú)特可能性。在所有從哺乳動(dòng)物以及微 生物來(lái)源分離的充分表征的脯氨酸特異性蛋白酶中，鑒定了獨(dú)特的肽酶結(jié)構(gòu)域，其在酶的 活性位點(diǎn)處排斥大的肽。事實(shí)上，這些酶不能夠降解含有多于約30個(gè)氨基酸殘基的肽，從 而這些酶目前被稱作“脯氨酸寡肽酶”(Fulop等Cell，Vol. 94，161-170，July 24，1998)。 因此，這些脯氨酰寡肽酶在展現(xiàn)其水解作用之前需要用其它內(nèi)切蛋白酶徹底預(yù)水解。然而， 如TO 02/45523中所述，甚至脯氨酰寡肽酶與這類另一內(nèi)切蛋白酶的組合也會(huì)導(dǎo)致下述水 解產(chǎn)物，所述水解產(chǎn)物的特征是具有羧基端脯氨酸殘基的肽的比例顯著提高。因此，這類 水解產(chǎn)物或經(jīng)發(fā)酵的水解產(chǎn)物形成分離下述肽的極佳的起點(diǎn)，所述肽具有體外ACE抑制效 應(yīng)以及改進(jìn)的對(duì)胃腸蛋白水解降解的抗性。盡管有這些可能的益處，但是我們不知道有申 請(qǐng)闡述脯氨酸特異性蛋白酶與發(fā)酵過(guò)程組合用于回收ACE抑制性肽的用途，更不要說(shuō)三肽IPP> VPP和LPP的選擇性生產(chǎn)了。在發(fā)酵步驟中，可以根據(jù)本發(fā)明的方法使用許多工業(yè)利用或可商業(yè)獲得的乳起 始培養(yǎng)物(dairy starter culture)和所謂的添加(adjunct)培養(yǎng)物。乳酸細(xì)菌包括 Lactobacillus 屬的成員例如 Lactobacillus helveticus、Lactobacillus plantarum、 Lactobacillus rhamnosus禾口Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus,Lactococcus 例 如 Lactococcus lactis, Leuconostoc, Pediococcus 禾口 Streptocoocus。 來(lái) 自 Bifidobacterium和Lactobacillus的物種的微生物在益生菌制劑中頻繁使用。乳酸細(xì)菌 的蛋白水解系統(tǒng)由與細(xì)胞壁結(jié)合的內(nèi)切蛋白酶和大量不同的細(xì)胞內(nèi)肽酶(包括內(nèi)切肽酶) 和大量不同的氨肽酶(包括二-氨肽酶和三-氨肽酶)組成。非常令人驚訝的是乳酸細(xì)菌并 不利用羧肽酶。在奶發(fā)酵中用作起始物時(shí)，Iactobacilli的蛋白水解系統(tǒng)水解奶蛋白質(zhì)，從 而在培養(yǎng)基中形成若干種類的肽。因?yàn)檫@些肽不全被細(xì)菌用于其生長(zhǎng)，所以部分這些肽在 發(fā)酵期間累積。然而，已知蛋白水解能力在多種乳酸細(xì)菌間大幅變化(參閱例如Yamamoto 等，Biosci. Biotech. Biochem.，58 (4)，776-778，1994)。已知在傳統(tǒng)發(fā)酵奶制品(例如瑞士 多孔干酪(Emmental cheese))的制造中廣泛用作乳起始物的Lactobacillus helveticus 具有相對(duì)高的蛋白水解活性?，F(xiàn)有技術(shù)涉及大量高度蛋白水解的Lactobacillus helveticus 菌株，例如 CNRZ 244(Centre National de recherches Zootechniques, Jouy-en-Josas,法國(guó))、LKB-16H(US6890529)、 R211 和 R389(Institut Rossell, Montreal，加拿大)、CM4(US6534304)、JCM 1006 和 JCM1004(Japanese Collection of Microorganisms, Saitama,日本)、CHCC637 禾口 CHCC641 (Chr. Hansen Culture Collection, Horsholm，丹麥)。為了達(dá)到ACE-抑制性肽的可接受的水平，可要求Lactobacillus helveticus菌株具有異常高的蛋白水解活性。這類菌株的篩選已在大量出版物中報(bào)道。最 公知的 ACE-抑制性肽 Val-Pro-Pro (VPP) ,Leu-Pro-Pro (LPP)和 Ile-Pro-Pro (IPP)已在用 這類高度蛋白水解的Lactobacillus helveticus菌株發(fā)酵的奶中鑒定。另外，這類乳酸細(xì) 菌對(duì)免疫調(diào)節(jié)的、抗氧化和抗微生物的肽的生產(chǎn)以及這類乳酸細(xì)菌趨向于維持胃腸、粘膜 表面健康微生物區(qū)系的功能同樣已被描述(http://en. wikipedia. org/wiki/Lactic acid bacteria)。屬于Lactobacillus和Bifidobacterium屬的細(xì)菌也被用作益生菌。益生菌 被定義為“以足量被使用時(shí)賦予宿主健康益處的活的微生物”。因此，益生菌制劑應(yīng)當(dāng)含有 大量有活力的微生物。在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的申請(qǐng)中，通過(guò)中度熱處理使添加的酶活 性失活。因?yàn)檫@樣的熱處理同樣會(huì)使存在的微生物失活，顯然對(duì)于益生菌產(chǎn)物或需要大量 有活力的Iactobacilli的其它產(chǎn)物而言，酶溫育最好在微生物發(fā)酵之前進(jìn)行。首先，在例 如本發(fā)明實(shí)施例3中所述條件下進(jìn)行奶蛋白質(zhì)的酶水解。然后通過(guò)溫和的熱處理(例如 120°C下熱交換器中2到7秒)使酶失活，其中在冷卻和任選地過(guò)濾后，可以用合適的益生 菌菌株接種液體，并培養(yǎng)直至獲得益生菌產(chǎn)物所需的高滴度，典型地為每mllO9到IOki個(gè)菌 落形成因子(CFU)。這一途徑的更詳細(xì)的信息可參閱本申請(qǐng)的實(shí)施例5。盡管乳酸細(xì)菌生產(chǎn)許多種蛋白酶并且使用高蛋白水解性Iactobacilli進(jìn)行降血 壓肽的商業(yè)生產(chǎn)，但是我們發(fā)現(xiàn)在所述過(guò)程的酶處理期期間補(bǔ)充脯氨酸特異性蛋白酶(任 選地與氨肽酶組合)進(jìn)一步提高ACE-抑制性肽IPP、VPP和LPP的產(chǎn)量。特別地，在目標(biāo)是 產(chǎn)生益生菌活性的口味、質(zhì)感的發(fā)酵過(guò)程中(其中使用具有有限的蛋白水解能力的乳酸細(xì) 菌或Bifidobacteria)，補(bǔ)充脯氨酸特異性蛋白酶(任選地與氨肽酶組合)會(huì)導(dǎo)致大幅增強(qiáng)
9的ACE-抑制性肽的水平。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，氨肽酶與脯氨酸-特異性蛋白酶同 時(shí)添加，在另一實(shí)施方式中，使用氨肽酶的溫育與使用脯氨酸-特異性蛋白酶的溫育獨(dú)立 完成。通常，使用氨肽酶的溫育之前是使用脯氨酸-特異性蛋白酶的溫育。奶發(fā)酵，特別是使用具有非最優(yōu)的蛋白水解活性的乳酸細(xì)菌進(jìn)行的奶發(fā)酵，容易 由于部分蛋白質(zhì)水解而導(dǎo)致苦的異味。脯氨酸_特異性蛋白酶以及氨肽酶已被描述為最小 化這類苦的異味。因此，這些酶的使用可不僅導(dǎo)致增強(qiáng)的ACE-抑制性三肽水平，而且也可 有利地導(dǎo)致更少的苦味發(fā)酵產(chǎn)物。這類可能的苦味減少可展示于本發(fā)明的實(shí)施例5中。使用根據(jù)本發(fā)明的脯氨酸特異性蛋白酶的優(yōu)點(diǎn)可以通過(guò)將在包含奶蛋白的發(fā)酵 液中培養(yǎng)的乳酸細(xì)菌或Bifidobacteria的發(fā)酵與用脯氨酸-特異性蛋白酶對(duì)該發(fā)酵液的 溫育組合來(lái)獲得。后一酶溫育可以在發(fā)酵過(guò)程之前，或者可在發(fā)酵過(guò)程期間發(fā)生。因?yàn)閮?yōu) 選的脯氨酸_特異性內(nèi)切蛋白酶有非常低的PH最適度，所以酶溫育甚至可以在發(fā)酵完成后 進(jìn)行，即在完全被酸化的發(fā)酵液中或已去除不溶物質(zhì)(例如細(xì)菌或凝固的奶蛋白質(zhì))的完 全酸化的發(fā)酵液中進(jìn)行。酶溫育甚至可以在額外的發(fā)酵液濃縮步驟后發(fā)生。在所有這些過(guò) 程中，酶溫育可導(dǎo)致高并且標(biāo)準(zhǔn)化的ACE-抑制性三肽水平。根據(jù)本發(fā)明的方法通常具有少 于24小時(shí)的酶溫育時(shí)間，優(yōu)選地，所述溫育時(shí)間少于10小時(shí)，更優(yōu)選地少于4小時(shí)。如果 酶溫育與發(fā)酵步驟獨(dú)立地完成，則溫育溫度通常在30°C和60°C之間，優(yōu)選地高于30°C，更 優(yōu)選地高于40°C，最優(yōu)選地高于50°C。乳酸細(xì)菌或Bifidobacteria培養(yǎng)或發(fā)酵時(shí)間通常在3和30小時(shí)之間，優(yōu)選地在 6和16小時(shí)之間。培養(yǎng)或發(fā)酵溫度通常在20 V和42 V之間，優(yōu)選地在25 V和38 V之間。 通常在發(fā)酵開始時(shí)，含有蛋白質(zhì)的發(fā)酵液的pH在6和7之間。通常在發(fā)酵開始時(shí)，每ml 含蛋白質(zhì)的發(fā)酵液中會(huì)存在優(yōu)選地在IO5和IO9之間、更優(yōu)選在IO5和IO7之間個(gè)乳酸細(xì)菌 (或Bifidobacteria)細(xì)胞。這些細(xì)菌通常得自用選擇的乳酸細(xì)菌(或Bifidobacteria) 接種的預(yù)孵育培養(yǎng)基。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，細(xì)胞數(shù)典型地在IO8和IOltl細(xì)胞/ml之間。在乳制 品工業(yè)中，所謂的“起始”培養(yǎng)物主要負(fù)責(zé)奶的酸化。這類起始培養(yǎng)物的典型的例子包括 用于乳酷生產(chǎn)的Lactococcus lactis，禾口用于傳統(tǒng)酸奶的Streptococcus thermophilus 和 Lactobacillus delbruckii subspecies bulgaricus。所謂的“添加”培養(yǎng)物在乳制品 工業(yè)中用于對(duì)終產(chǎn)物提供特定的屬性，例如風(fēng)味、質(zhì)感或外觀(eye-formation)。添加培養(yǎng) 物的典型例子是 Lactobacillus helveticus、Propionibacterium ssp 禾口 Lactobacillus acidophilus。胃用胃的胃舌 Lactobacillus reuteri、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus rhamnosus 禾口 Bifidobacterium ssp。推薦在每天的基石出上 消耗約IO9個(gè)這類益生菌培養(yǎng)物的有活力的細(xì)胞。在IPP和VPP的生產(chǎn)期間，有利地還形成ACE-抑制性三肽LPP。優(yōu)選地，奶制品蛋 白質(zhì)序列中存在的至少40%、更優(yōu)選地至少50%、或進(jìn)一步更優(yōu)選地至少60%、最優(yōu)選地 至少70%的-I-P-P-序列被轉(zhuǎn)化為三肽IPP。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)序列中存在的至少40%、更優(yōu) 選地至少50%、或進(jìn)一步更優(yōu)選地至少60%、最優(yōu)選地至少70%的-V-P-P-序列被轉(zhuǎn)化為 三肽VPP。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)序列中存在的至少40%、更優(yōu)選地至少50%、或進(jìn)一步更優(yōu)選地 至少60%、最優(yōu)選地至少70%的-L-P-P-序列被轉(zhuǎn)化為三肽LPP。脯氨酸特異性蛋白酶優(yōu) 選地能夠水解大的蛋白質(zhì)分子如多肽以及寡肽。除了涉及具有降血壓活性的食物產(chǎn)品以外，本發(fā)明還涉及這些肽組合物用于制造
10營(yíng)養(yǎng)藥物(優(yōu)選藥物)，用于改善健康或預(yù)防和/或治療疾病，或用于制造用于治療或預(yù)防 血壓高(高血壓)、心力衰竭、前糖尿病或糖尿病、肥胖癥、腎衰竭、血流循環(huán)收縮、葡糖耐量 受損或緊張的營(yíng)養(yǎng)藥物(優(yōu)選藥物)的用途。優(yōu)選地，本發(fā)明的肽組合物以膳食補(bǔ)充劑的形 式，以個(gè)人護(hù)理應(yīng)用(包括洗劑、凝膠或乳液形式的局部應(yīng)用)的形式，或作為食物、飲料、 飼料或?qū)櫸锸澄锍煞侄褂谩１景l(fā)明還公開了-適用于治療高血壓的肽組合物，其通過(guò)酸沉淀方法獲得并得下述肽組合物，所述 肽組合物具有以干物質(zhì)為基礎(chǔ)15%到30% (w/w)、優(yōu)選地高于18% (w/w)、更優(yōu)選地高于 20% (w/w)的脯氨酸含量。-包含5到20mg/gVPP (基于干物質(zhì)和基于蛋白質(zhì))，5到20mg/gIPP (基于干物質(zhì) 和基于蛋白質(zhì))和任選地5到20mg/g LPP(基于干物質(zhì)和基于蛋白質(zhì))的肽組合物，和-肽組合物，其包含15到50%(wt干物質(zhì))含有至少一個(gè)羧基端脯氨酸的肽，并 且包含至少5mg/g VPP (基于干物質(zhì)和基于蛋白質(zhì))、至少5mg/g IPP (基于干物質(zhì)和基于蛋 白質(zhì))和任選地至少5mg/g LPP(基于干物質(zhì)和基于蛋白質(zhì))。另外，本發(fā)明涉及生產(chǎn)包含可溶肽的組合物的方法，所述可溶肽通過(guò)用脯氨酸特 異性蛋白酶將蛋白質(zhì)水解至5-38%的水解度(DH)來(lái)生產(chǎn)。根據(jù)本發(fā)明，獲得大量三肽IPP 和VPP的方法可以優(yōu)選地在10和38之間的DH下、更優(yōu)選地在15和35之間的DH下、最優(yōu) 選地在20和30之間的DH下獲得。本發(fā)明方法中使用的蛋白質(zhì)優(yōu)選地是奶蛋白質(zhì)，更優(yōu)選 地是酪蛋白或酪蛋白酸鹽。因?yàn)橐阎c在高血壓中起作用，所以生產(chǎn)ACE抑制性肽的優(yōu)選 的底物是這些蛋白質(zhì)的銨鹽、鈣鹽、鎂鹽和鉀鹽而不是鈉鹽。有利地，奶蛋白質(zhì)在本發(fā)明的方法中使用之前不發(fā)酵，并且可以通過(guò)將脯氨 酸-特異性蛋白酶與氨肽酶組合來(lái)進(jìn)行酶促處理。任選地，氨肽酶僅在隔離了經(jīng)水解的蛋 白質(zhì)的不溶部分之后添加。優(yōu)選地，在選定的PH條件下將經(jīng)水解的蛋白質(zhì)的不溶部分與可 溶部分隔離。在EP 1 231 279中描述了從奶酪蛋白中回收三肽VPP和IPP的純酶促的方法。 該申請(qǐng)要求保護(hù)通過(guò)用蛋白水解酶和肽酶消化含有奶酪蛋白的材料，經(jīng)由所謂的“中間產(chǎn) 物肽”生產(chǎn)三肽的方法，所述“中間產(chǎn)物肽”選自由下述兩種肽組成的組，第一種肽含有序 列Val-Pro-Pro但是除該序列中的Pro之外不含Pro，第二種肽含有序列Ile-Pro-Pro但 是除該序列中的Pro之外不含Pro。如EP 1 231 279的實(shí)施例中所述，所述方法涉及兩步 驟的過(guò)程。首先生產(chǎn)包含Val-Pro-Pro或Ile-Pro-Pro的中間產(chǎn)物肽。這通過(guò)用根據(jù)實(shí)施 例之一的合適的蛋白水解酶在37°C下溫育12小時(shí)來(lái)完成。然后通過(guò)將所述第一水解產(chǎn)物 在100°C下加熱3分鐘使所述蛋白水解酶失活，再次冷卻后，添加另一酶制劑(事實(shí)上具有 外切蛋白水解活性的制劑)。在37°C下用這一其它酶制劑再溫育12小時(shí)后，可以驗(yàn)證三肽 Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro的存在。為了獲得這些ACE抑制性肽的更高產(chǎn)量，EP 1 231279 還提出在與外切蛋白水解活性接觸之前純化并濃縮所述中間產(chǎn)物肽。EP 1 231 279還提 出在獲得中間產(chǎn)物肽之后和將中間產(chǎn)物肽與肽酶接觸之前，在程序中可任選地進(jìn)行多種操 作，例如通過(guò)例如在5000到20000rpm下離心3到10分鐘去除未反應(yīng)的蛋白質(zhì)。因此期望 的三肽在工業(yè)上相當(dāng)難操作的兩步驟酶促過(guò)程中獲得。因?yàn)槊看蚊笢赜稍?. 5到7. O的 PH下和25°C到50°C的溫度下耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)12小時(shí)，所以顯然這一程序從微生物觀點(diǎn)來(lái)看也是不可接受的。上述長(zhǎng)的溫育時(shí)間與25至50°C的低溫育溫度的組合可能容易導(dǎo)致含蛋白質(zhì) 的溶液被感染。因此，根據(jù)本發(fā)明，不對(duì)中間產(chǎn)物加以純化來(lái)生產(chǎn)生物活性肽如IPP和VPP。 EP 1 231 279描述了當(dāng)用蛋白酶對(duì)奶蛋白進(jìn)行消化時(shí)中間產(chǎn)物肽的形成，該中間產(chǎn)物肽除 了(分別地)Ile-Pro-Pro或Val-Pro-Pro之外不含Pro。隨后，用另一種酶將該中間產(chǎn)物 肽分別轉(zhuǎn)化為IPP或VPP。為了獲得高產(chǎn)率，在轉(zhuǎn)化為三肽之前用色譜對(duì)該中間產(chǎn)物肽進(jìn)行 純化。根據(jù)本發(fā)明，無(wú)需對(duì)中間產(chǎn)物肽進(jìn)行純化即可獲得高產(chǎn)率。 在W007/013426中描述了用于生產(chǎn)ACE-抑制性肽VPP、IPP和YP的兩步驟方法。 在這一途徑中，通過(guò)將通過(guò)乳酸細(xì)菌的發(fā)酵過(guò)程與酶促溫育組合最大化ACE抑制性肽的產(chǎn) 量。該酶溫育可以在發(fā)酵過(guò)程之前或者與發(fā)酵過(guò)程同時(shí)進(jìn)行。選擇的酶是木瓜蛋白酶、菠 蘿蛋白酶或與木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶具有相似活性的蛋白酶?；旧纤羞@些酶是屬 于IUBMB種類EC 3. 4. 22的所謂的半胱氨酸蛋白酶。用這一具體類別的酶溫育的目的是 促進(jìn)奶蛋白質(zhì)的分解，從而便于Iactobacilli生產(chǎn)的蛋白酶形成ACE-抑制性肽。通過(guò)比 較IPP和VPP的最終產(chǎn)量，這些半胱氨酸內(nèi)切蛋白酶選自大量其它可商業(yè)獲得的酶。半胱 氨酸內(nèi)切蛋白酶因?yàn)樗鼈儚V泛的切割特異性而已知，但是具有切割C-端氨基酸殘基Arg， Lys, Phe and Tyr (“Zj^'O 白勺{i女子(Adler-Nissen, J. In Enzymatic Hydrolysis of Food Proteins,第一版；Adler-Nissen, J. , Ed. , Elsevier App1. Sci Publ. , London, UK, 1986)。重要的是注意，與根據(jù)本發(fā)明的脯氨酸-特異性蛋白酶不同，這些半胱氨酸內(nèi)切蛋 白酶不具有或僅具有可忽略的切割脯氨酸殘基C-端蛋白質(zhì)或肽的能力。反之亦然，與半胱 氨酸內(nèi)切蛋白酶不同，根據(jù)本發(fā)明的脯氨酸_特異性蛋白酶對(duì)切割A(yù)rg、Lys、Phe和Tyr殘 基的C-端展示出可忽略的偏好。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法區(qū)別在于脯氨酸_特異性內(nèi)切活 性的活性，其為具有中性PH最適度的脯氨酸_特異性寡肽酶或是具有酸性PH最適度的脯 氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶。在這兩種情況下均可額外使用氨肽酶。來(lái)自A.niger的谷氨 酸-特異性內(nèi)切蛋白酶的PH最適度在4. 3左右。因?yàn)樵摰蚿H最適度，所以用來(lái)自A. niger 的脯氨酰內(nèi)切蛋白酶溫育牛奶酪蛋白酸鹽是不證自明的。另一方面，如果PH降至低于6. O 則牛奶酪蛋白酸鹽會(huì)沉淀，在所述PH值下脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶能夠展開其完全活 性，底物沉淀并且不易被影響；另一方面，在高于6.0的pH值下，可以期望脯氨酸-特異性 內(nèi)切蛋白酶被部分去穩(wěn)定化，并且僅具有微小活性。在本文中我們展示，在兩種相當(dāng)不利的 條件下，用來(lái)自A. niger的脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶溫育可產(chǎn)生若干ACE抑制性肽或其 前題。根據(jù)本發(fā)明，ACE抑制性三肽IPP和LPP各自以對(duì)應(yīng)于酪蛋白中理論存在量的至少 30%、有利地至少40%、更優(yōu)選地至少50%的產(chǎn)量生產(chǎn)。本發(fā)明的另一方面是從奶蛋白質(zhì) 水解產(chǎn)物中濃縮ACE抑制肽的方法。與W007/013426中遵循的途徑不同，這樣的奶蛋白質(zhì) 水解產(chǎn)物優(yōu)選地由非-半胱氨酸蛋白酶、更優(yōu)選地由絲氨酸蛋白酶、進(jìn)一步更優(yōu)選地由脯 氨酸-特異性蛋白酶水解。半胱氨酸內(nèi)切肽酶被理解為包括屬于IUBMB種類EC 3. 4. 22的 所有酶。部分被根據(jù)本發(fā)明的脯氨酸_特異性蛋白酶水解的奶蛋白質(zhì)會(huì)在所選擇的PH條 件下沉淀。濃縮方法包括從發(fā)酵液中去除部分沉淀的經(jīng)水解的蛋白質(zhì)，從而將沉淀的蛋白 質(zhì)與溶液中的ACE抑制肽隔離。在ACE抑制肽的有效和便利的回收的又一個(gè)實(shí)施方式中， 將發(fā)酵液的PH值調(diào)節(jié)為更中性的pH值，從而使形成的酪蛋白沉淀物部分再溶解，改進(jìn)脯氨 酸-特異性蛋白酶的可用性并提高任選地添加的氨肽酶的效力。如本發(fā)明中所例證的，兩 種效應(yīng)均導(dǎo)致提高的ACE-抑制性三肽的產(chǎn)量。為了進(jìn)一步優(yōu)化得到的用于治療遭受過(guò)高血壓的個(gè)體的發(fā)酵液體，在隨后的處理期間可以去除任何剩余的未溶解的物質(zhì)，然后通過(guò) 例如納米過(guò)濾處理來(lái)去除小分子如單糖、乳酸、鈉和氯化物。需要時(shí)，可以用降血壓離子如 鈣、鉀和鎂補(bǔ)充納米過(guò)濾的滲余物。雖然在乳酪制作工藝和乳酪熟化中使用了同樣的原理(發(fā)酵與酶促處理組合) 來(lái)從乳清蛋白中分離酪蛋白凝乳，但在乳酪制作工藝中，僅使用天冬氨酸內(nèi)切蛋白酶(EC 3. 4. 23)。該組酶包括公知的乳酪制作酶，例如凝乳酶以及多種胃蛋白酶，例如哺乳動(dòng)物胃 蛋白酶以及多種微生物胃蛋白酶，例如曲霉胃蛋白酶(aspergillopepsins)以及毛霉胃蛋 白酶(mucorp印sins)。在本申請(qǐng)中，乳酪制作工藝中的凝乳生產(chǎn)或乳酪制作被定義為不被 本發(fā)明的方法包括。優(yōu)選地，脯氨酸-特異性蛋白酶不含污染性的內(nèi)切蛋白酶活性。任選地，氨肽水解 活性與脯氨酸特異性蛋白酶組合存在，并且可以以至多100%的產(chǎn)量生產(chǎn)VPP以及IPP。優(yōu) 選地，氨肽水解活性也不含污染性的內(nèi)切蛋白酶活性。本發(fā)明涉及含有水解產(chǎn)物或肽的組合物，所述組合物用作食物產(chǎn)品，或用作可以 被加入食物產(chǎn)品中從而在這樣的食物產(chǎn)品中獲得期望的ACE-抑制活性水平的濃縮物?；?者，根據(jù)本發(fā)明的含有水解產(chǎn)物或肽的組合物被用作營(yíng)養(yǎng)藥物，優(yōu)選用作藥物。本發(fā)明還涉 及本發(fā)明的含有水解產(chǎn)物或肽的組合物作為營(yíng)養(yǎng)藥物(優(yōu)選藥物)的用途，涉及本發(fā)明的 含有水解產(chǎn)物或肽的組合物用于制造營(yíng)養(yǎng)藥物(優(yōu)選藥物)的用途，涉及本發(fā)明的含有水 解產(chǎn)物或肽的組合物用于改善健康或預(yù)防和/或治療疾病的用途，涉及本發(fā)明的含有水解 產(chǎn)物或肽的組合物用于制造營(yíng)養(yǎng)藥物(優(yōu)選藥物)的用途，涉及本發(fā)明的含水解產(chǎn)物或肽 的組合物用于治療或預(yù)防心血管疾病如高血壓和心力衰竭的用途，涉及本發(fā)明的含有水解 產(chǎn)物或肽的組合物用于治療或預(yù)防腎衰竭的用途，涉及本發(fā)明的含有水解產(chǎn)物或肽的組合 物(其中本發(fā)明的含有水解產(chǎn)物或肽的組合物是膳食補(bǔ)充劑的形式)的用途，涉及本發(fā)明 的含有水解產(chǎn)物或肽的組合物用于制造用于治療性治療緊張效應(yīng)的功能性食物產(chǎn)品的用 途，涉及本發(fā)明的含有水解產(chǎn)物或肽的組合物在局部應(yīng)用(優(yōu)選個(gè)人護(hù)理應(yīng)用)中的用途， 和涉及本發(fā)明的含有水解產(chǎn)物或肽的組合物在飼料和寵物食物中的用途。另外，本發(fā)明涉及治療1型和2型糖尿病的方法，和用于預(yù)防頻繁伴隨著2型糖尿 病的心血管并發(fā)癥、患有前糖尿病的個(gè)體或葡糖耐量受損(IGT)的方法，所述方法包括對(duì) 需要這類治療的受試者施用本發(fā)明的含水解產(chǎn)物或肽的組合物，還涉及治療或預(yù)防遭受高 血壓或心力衰竭的人的方法，所述方法包括對(duì)需要這類治療的受試者施用本發(fā)明的含水解 產(chǎn)物或肽的并因此顯示降血壓效應(yīng)的組合物。對(duì)ACE的抑制導(dǎo)致血管收縮減少，血管舒張 增加，鈉和水排出提高，其反過(guò)來(lái)導(dǎo)致外周血管抵抗(periphral vascular resistance)降 低以及血壓降低，以及局部血流改善。因此，本發(fā)明的包含肽的水解產(chǎn)物對(duì)于預(yù)防和治療可 受ACE抑制影響的疾病特別有用，所述疾病包括但不限于，高血壓、心力衰竭、心絞痛、動(dòng)脈 梗塞、中風(fēng)、外周動(dòng)脈障礙疾病、動(dòng)脈硬化、腎病、腎功能不全、勃起障礙、內(nèi)皮功能障礙、左 心室肥大、糖尿病血管并發(fā)癥、液體潴留(fluid retention)以及醛固酮增多癥。通常認(rèn)為，緊張相關(guān)疾病，以及緊張對(duì)身體的負(fù)面影響對(duì)于很多人有顯著的作用。 近年來(lái)，在藥物和科學(xué)界，緊張的影響，以及其對(duì)于多種疾病和病況發(fā)展的作用已獲得了更 廣泛的接受。消費(fèi)者現(xiàn)在逐漸認(rèn)識(shí)到這些潛在的問(wèn)題，并開始對(duì)于減少或預(yù)防緊張對(duì)其健 康的可能的負(fù)面作用產(chǎn)生逐漸增加的興趣。因此，本發(fā)明的另一方面是提供適合用于幫助身體應(yīng)付緊張影響的食物產(chǎn)品，或可被包括進(jìn)其中的成分。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一 種食物產(chǎn)品，其包括提供健康益處(諸如幫助身體應(yīng)付緊張的負(fù)面影響)的本發(fā)明的含水 解產(chǎn)物或肽的組合物。術(shù)語(yǔ)“營(yíng)養(yǎng)藥物”在本文中指在營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域及制藥領(lǐng)域應(yīng)用中的有用性。因此，所述 新穎的營(yíng)養(yǎng)藥物組合物可作為食物和飲料的補(bǔ)充劑，也可作為藥物制劑用于腸道或非腸道 應(yīng)用，所述制劑可以是固體制劑，例如膠囊或片劑，或是液體制劑，例如溶液或懸浮液。從前 文明顯可知，術(shù)語(yǔ)“營(yíng)養(yǎng)藥物組合物”還包含食物和飲料，其包含本發(fā)明的含水解產(chǎn)物或肽 的組合物以及可選地碳水化合物，以及包含前述活性成份的補(bǔ)充性組合物，例如膳食補(bǔ)充 劑。術(shù)語(yǔ)膳食補(bǔ)充劑在本文中指含有用以對(duì)膳食加以補(bǔ)充的“膳食成分”的、通過(guò)嘴攝 取的產(chǎn)品。這些產(chǎn)品中“膳食成分”可包括維生素、礦物質(zhì)、草本物質(zhì)或其它植物性藥材 (botanical)、氨基酸和酶、器官組織、腺體(glandular)和代謝產(chǎn)物等物質(zhì)。膳食補(bǔ)充劑可 以是提取物或濃縮物，其可以以多種形式出現(xiàn)，例如片劑、膠囊、軟明膠(softgels)、明膠膠 囊(gelcaps)、液體或粉末。它們還可以是其它形式，例如條棒狀，但是如果它們是的話，膳 食補(bǔ)充劑標(biāo)簽上的信息通常將不把產(chǎn)品標(biāo)示為傳統(tǒng)食品或餐食或膳食重的唯一項(xiàng)目。本發(fā)明中的營(yíng)養(yǎng)藥物組合物中還可以加入復(fù)合維生素及礦物質(zhì)補(bǔ)充劑，以獲得足 夠數(shù)量的必需營(yíng)養(yǎng)物，所述營(yíng)養(yǎng)物在某些膳食中是缺乏的或已知相對(duì)較少。復(fù)合維生素及 礦物質(zhì)補(bǔ)充劑還可用于疾病預(yù)防和防止?fàn)I養(yǎng)缺乏及缺陷，所述營(yíng)養(yǎng)缺乏及缺陷是由于生活 方式以及通常不充分的飲食模式造成的，這有時(shí)可見于糖尿病。此外，氧化應(yīng)激也已被暗示 與胰島素抗性的發(fā)展有牽連。活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species)可能通過(guò)擾亂胰島 素受體信號(hào)級(jí)聯(lián)過(guò)程來(lái)破壞由胰島素激發(fā)的葡萄糖吸收。用抗氧化劑，例如α -生育酚(維 生素Ε)、抗壞血酸(維生素C)，來(lái)控制氧化應(yīng)激對(duì)于治療糖尿病來(lái)說(shuō)可能是有價(jià)值的。因 此，復(fù)合維生素補(bǔ)充劑可添加到上述活性物質(zhì)中，以保持良好的平衡營(yíng)養(yǎng)。此外，本發(fā)明的含水解產(chǎn)物或肽的組合物與礦物質(zhì)，例如鎂(Mg2+)、鈣(Ca2+)和/ 或鉀(K+)的組合可用于改善健康以及預(yù)防和/或治療疾病，包括但不限于心血管疾病和糖 尿病。 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，本發(fā)明的水解產(chǎn)物或營(yíng)養(yǎng)藥物組合物含有本發(fā)明的含 肽組合物。IPP和VPP適合以向?qū)⒈皇┯璧膫€(gè)體提供每kg體重大約0. OOlg至每kg體重大 約Ig的每日劑量的量存在于根據(jù)本發(fā)明的組合物中。食物或飲料適合分別含有每份大約 0. 05g至每份大約50g的IPP和VPP。如果營(yíng)養(yǎng)藥物組合物是藥物制劑，此類制劑可以按每 個(gè)劑量單位，例如每個(gè)膠囊或片劑計(jì)，分別包含大約0. OOlg至大約Ig的量的IPP和VPP， 或者，對(duì)液體制劑而言，按每份每日劑量計(jì)，分別包含大約0. 035g至大約70g的量的IPP 和VPP。本發(fā)明的含水解產(chǎn)物或肽的組合物適合以向?qū)⒈皇┯璧膫€(gè)體提供每kg體重大約 0. Olg至每kg體重大約3g的每日劑量的量存在于根據(jù)本發(fā)明的組合物中。食物或飲料適 合含有每份大約0. Ig至每份大約IOOg的生物活性肽。如果營(yíng)養(yǎng)藥物組合物是藥物制劑， 此類制劑可以按每個(gè)劑量單位，例如，每個(gè)膠囊或片劑計(jì)，包含大約0. Olg至大約5g的量的 含水解產(chǎn)物或肽的組合物，或者，對(duì)液體制劑而言，按每份每日劑量計(jì)，包含大約0. 7g至大 約210g的量的含肽組合物。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方面，組合物包含前面指出的本發(fā)明的肽以及可選地，碳水化合物。碳水化合物適合以向?qū)⒈皇┯璧膫€(gè)體提供每kg體重大約0. Olg至每kg體重大 約7g的每日劑量的量存在于根據(jù)本發(fā)明的組合物中。食物或飲料適合含有每份大約0. 5g 至每份大約200g的碳水化合物。如果營(yíng)養(yǎng)藥物組合物是藥物制劑，此類制劑可以按每個(gè)劑 量單位，例如，每個(gè)膠囊或片劑計(jì)，包含大約0. 05g至大約IOg的量的碳水化合物，或者，對(duì) 液體制劑而言，以每份每日劑量計(jì)，包含大約0. 7g至大約490g的量的碳水化合物。劑量范圍(對(duì)70kg的人而言)VPP 和 IPP 0. 005-70g/ 天(每種)生物活性肽組合物0. 07-210g/天未水解蛋白質(zhì)0. 07-210g/天碳水化合物0. l-490g/天本發(fā)明的一個(gè)目的是提供可用于向消耗其的個(gè)體提供健康益處的可食用物質(zhì)。另 一個(gè)目的是提供可以以經(jīng)分離形式或被包括進(jìn)食物產(chǎn)品的、可被方便地?cái)z取的此類可食用 物質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供適合用于體重控制程序的食物產(chǎn)品，或可被包括進(jìn)所 述產(chǎn)品的成分。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供適合用于幫助保持心血管健康(例如，通過(guò)ACE抑制) 的食物產(chǎn)品，或可被包括進(jìn)所述產(chǎn)品的成分。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供具有可接受的穩(wěn)定性和/或感官性質(zhì)，特別是好的 味道，例如不存在不可接受水平的苦味的食物產(chǎn)品，或可被包括進(jìn)所述產(chǎn)品的成分。本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供一種食物產(chǎn)品，其具有高濃度的下述成分，所述成分 提供健康益處，例如協(xié)助預(yù)防肥胖/體重控制和/或幫助保持心血管健康。令人吃驚地，根據(jù)本發(fā)明，使用本發(fā)明的含水解產(chǎn)物或肽的組合物用于制備消耗 后提供健康益處的食物產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)了這些目的中的一個(gè)或多個(gè)。根據(jù)第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的含水解產(chǎn)物或肽的組合物用于生產(chǎn)用于 預(yù)防肥胖或用于體重控制的功能性食物產(chǎn)品的用途。根據(jù)第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的含水解產(chǎn)物或肽的組合物用于生產(chǎn)用于 心血管健康保持的功能性食物產(chǎn)品的用途。根據(jù)本發(fā)明尤其優(yōu)選的是，心血管健康保持包括抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化(ACE)酶和 /或控制血液葡萄糖水平。根據(jù)第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了能向其消耗者提供健康益處的功能性食物產(chǎn)品， 所述健康益處選自預(yù)防肥胖、體重控制以及心血管健康保持，并且，所述功能性食物產(chǎn)品 包含本發(fā)明的含水解產(chǎn)物或肽的組合物。根據(jù)本發(fā)明的含水解產(chǎn)物或肽的組合物的另一優(yōu)點(diǎn)是，該含水解產(chǎn)物或肽的組合 物可被方便地包括食物產(chǎn)品，以生產(chǎn)出功能性食物產(chǎn)品，并且不會(huì)以不可接受的程度影響 到其穩(wěn)定性和/或感官性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的“健康益處試劑”是當(dāng)被攝取時(shí)提供健康益處的物質(zhì)，S卩，對(duì)健康的 某些方面具有正面影響，或者幫助保持良好健康的某些方面的物質(zhì)，良好健康的這些方面 是預(yù)防肥胖、體重控制和心血管健康保持?！敖】狄嫣帯敝笇?duì)于健康的某些方面具有正面作 用，或者能幫助保持良好健康的某些方面。
根據(jù)本發(fā)明的“功能性食物產(chǎn)品”被定義為適合人類消耗的食物產(chǎn)品(為避免疑 惑，其包括飲料)，其中，本發(fā)明的含水解產(chǎn)物或肽的組合物以有效量用作為其成分，使得所 述食物產(chǎn)品的消費(fèi)者獲得顯著的健康益處。術(shù)語(yǔ)“包含”在本文中使用時(shí)表示不限于任何隨后指出的要素，而是表示包括具有 大的或小的功能重要性的未指出的要素。換句話說(shuō)，列出的步驟、元素或選項(xiàng)不必是窮竭 的。當(dāng)使用詞語(yǔ)“包括”或“具有”時(shí)，這些術(shù)語(yǔ)與上面定義的“包含”等同。本發(fā)明方法的制品可以原樣使用，或作為營(yíng)養(yǎng)藥物或營(yíng)養(yǎng)制品的成分(任選地在 干燥后)使用。對(duì)本發(fā)明的另一方面而言，本發(fā)明方法的產(chǎn)物可以被進(jìn)一步濃縮或純化?？衫?將產(chǎn)物緩慢酸化，以將PH降低至4. 5或者至少低于5. 0。在該pH下，來(lái)自蛋白質(zhì)底物如酪 蛋白酸鹽的所有大的肽都沉淀，從而僅有較小的肽留在溶液中。優(yōu)選地，將經(jīng)酸化的混合物 在低溫下保持?jǐn)?shù)小時(shí)，以沉淀盡可能多的蛋白質(zhì)和大肽。因?yàn)槿菀淄ㄟ^(guò)傾析或過(guò)濾步驟或 低速(即，低于5000rpm)離心去除沉淀的肽和蛋白質(zhì)，所以水相含有相對(duì)于存在的蛋白的 量而言高比例的生物活性肽。按照Kjedahl數(shù)據(jù)，通過(guò)低速離心步驟除去了 80至70%的蛋 白質(zhì)，這暗示對(duì)生物活性肽的四至五倍的純化?？蛇x地，通過(guò)隨后的超濾步驟進(jìn)一步增進(jìn)純 化。在營(yíng)養(yǎng)藥物應(yīng)用以及食物和飲料應(yīng)用中，有利地使用本發(fā)明的產(chǎn)物。生物活性肽、 其酸可溶性水解產(chǎn)物及其混合物可用于營(yíng)養(yǎng)藥物應(yīng)用、食物應(yīng)用或飲料。優(yōu)選地，在營(yíng)養(yǎng)藥 物應(yīng)用、食物應(yīng)用或飲料中使用酸可溶性的生物活性肽，因?yàn)榇嬖诟吆康幕钚噪?。在傾析、過(guò)濾或低速離心以除去發(fā)酵過(guò)程中形成的沉淀之后，可回收含有生物活 性肽的上清液。隨后的蒸發(fā)，可選地，結(jié)合額外的過(guò)濾步驟，以及之后接著的噴霧干燥步驟 將產(chǎn)生用于獲得具有高度生物活性以及良好的水溶解度的食品級(jí)糊狀物或粉末的經(jīng)濟(jì)途 徑。在額外的濃縮步驟之前或之后獲得的生物活性肽可原樣使用，或可用于加入食物 產(chǎn)品中，所述食物產(chǎn)品是基于常規(guī)被廣泛消耗的。此類產(chǎn)品的例子是植物黃油、涂抹醬、多 種乳制品(例如黃油或酸奶或奶或含乳清飲料，優(yōu)選地，基于酸奶或奶的產(chǎn)品，例如酸奶和 奶)。此外，在其它飲料，例如水果飲品或大豆飲品或甚至礦物質(zhì)水或酒(Shots)中也可使 用本發(fā)明的生物活性肽。另一選擇是在健康產(chǎn)品，例如水果條棒、蛋白質(zhì)條棒、能量條棒，基 于谷物的產(chǎn)品(例如早餐谷類)中使用水解產(chǎn)物。優(yōu)選地，食物或飲料產(chǎn)品或膳食補(bǔ)充劑 選自植物黃油、涂抹醬、黃油、乳制品或含乳清飲料的組，優(yōu)選地，基于酸奶或奶的產(chǎn)品，例 如酸奶或奶，其中，所述食物或飲料產(chǎn)品或膳食補(bǔ)充劑包含上文指出的量的生物活性肽。特別優(yōu)選的是用于減輕人類高血壓的上文所述的食物或飲料產(chǎn)品或膳食補(bǔ)充劑。 食物或飲料或膳食補(bǔ)充劑的優(yōu)選份大小為，例如，每份5-350克，例如，5至150克。優(yōu)選地， 每天份數(shù)為1-10，例如2至5。雖然此類組合物典型地施予人類，它們也可施予動(dòng)物，優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物，以減輕 高血壓。此外，獲得的產(chǎn)品中高濃度的生物活性肽使得這些產(chǎn)品非常有用于被包括進(jìn)丸劑、 片劑或高度濃縮的溶液或糊狀物或粉末形式的膳食補(bǔ)充劑。將確保生物活性肽持續(xù)釋放的 緩釋膳食補(bǔ)充劑令人有著特別的興趣。根據(jù)本發(fā)明的生物活性肽可作為干粉被配制進(jìn)，例 如，丸劑、片劑、顆粒、小袋(sachet)或膠囊。或者，根據(jù)本發(fā)明的生物活性肽可作為液體被
16配制進(jìn)例如糖漿或膠囊。用于多種制劑并且含有根據(jù)本發(fā)明的生物活性肽的組合物還可 包括生理上可接受的載體、佐劑、賦形劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑以及稀釋劑構(gòu)成的組中的至少一 種化合物，這些術(shù)語(yǔ)按照它們普通的含義來(lái)使用，以表示協(xié)助包裝、運(yùn)送、吸收、穩(wěn)定或者在 佐劑的情況下增加酶的生理作用的物質(zhì)。可以與粉末形式的根據(jù)本發(fā)明的酶組合使用的 多種化合物的相關(guān)背景可在“Pharmaceutical Dosage Forms”，第二版，1、2和3卷，ISBN 0-8247-8044-2 Marcel Dekker，Inc中找到。雖然作為干粉配制的根據(jù)本發(fā)明的ACE抑制 肽可貯藏相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，但是應(yīng)通過(guò)選擇合適的包裝，例如，鋁泡罩(aluminium blister) 來(lái)避免與水分或潮濕空氣的接觸。相對(duì)新的口服應(yīng)用形式是使用多種類型的明膠膠囊或基 于明膠的片劑?？紤]到天然ACE抑制肽與對(duì)抗高血壓的相關(guān)性，本發(fā)明的新的、成本效率高的途 徑提供了針對(duì)溫和降血壓食品或者甚至獸用產(chǎn)品的有吸引力的起點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的方法可用任何脯氨酸特異性寡肽酶或內(nèi)切蛋白酶來(lái)完成。根據(jù)本發(fā) 明的或根據(jù)本發(fā)明使用的脯氨酸特異性寡蛋白酶表示屬于EC 3. 4. 21. 26的酶。根據(jù)本發(fā) 明的或根據(jù)本發(fā)明使用的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶表示W(wǎng)O 02/45524的權(quán)利要求1_5、11 和13中提到的多肽。優(yōu)選地，所述多肽是經(jīng)分離的形式。根據(jù)本發(fā)明的方法可以使用能夠釋放纈氨酸(“V”)殘基以及谷氨酰胺(“Q”)和天 冬酰胺(“N”)殘基的任何氨肽水解酶制劑。測(cè)量這類酶活性的檢驗(yàn)明確于WO 2006/005757 的實(shí)施例12中。優(yōu)選地，氨肽水解活性得自Aspergillus物種。Aspergillus屬的菌株具有食品級(jí)狀態(tài)，從這些微生物獲得的酶已知能形成無(wú)可 質(zhì)疑的食品級(jí)來(lái)源。根據(jù)另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，酶由其生產(chǎn)細(xì)胞分泌，而并非是非分泌 的所謂胞質(zhì)酶。以這種方式，可從細(xì)胞培養(yǎng)液中回收處于基本上純的狀態(tài)的酶，而無(wú)需昂貴 的純化步驟。優(yōu)選地，酶在通常的PH和溫度條件下具有對(duì)其底物的高親和性。


圖1.在如實(shí)施例2中所述條件下發(fā)酵的脫脂奶中IPP濃度的提高。水平軸表示 發(fā)酵時(shí)間段后用脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶溫育的時(shí)間段，以小時(shí)為單位。指出的單位表 示PPU' s/g奶蛋白質(zhì)。圖2.在如實(shí)施例2中所述條件下發(fā)酵的脫脂奶中LPP濃度的提高。水平軸表示 發(fā)酵時(shí)間段后用脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶溫育的時(shí)間段，以小時(shí)為單位。指出的單位表 示PPU' s/g奶蛋白質(zhì)。圖3.在如實(shí)施例3中所述條件下從酪蛋白酸鹽溶液中釋放的IPP。水平軸表示用 脯氨酸_特異性內(nèi)切蛋白酶溫育的時(shí)間段，以小時(shí)為單位。垂直軸提供了以微克/毫升溫 育液體為單位的IPP濃度。指出的單位表示PPU' s/g奶蛋白質(zhì)。圖4.在如實(shí)施例3中所述條件下從酪蛋白酸鹽溶液中釋放的LPP。水平軸表示用 脯氨酸_特異性內(nèi)切蛋白酶溫育的時(shí)間段，以小時(shí)為單位。垂直軸提供了以微克/毫升溫 育液體為單位的LPP濃度。指出的單位表示PPU' s/g奶蛋白質(zhì)。圖5.如實(shí)施例3中所述條件下從GMP溶液中釋放的IPP。水平軸表示用脯氨酸-特 異性內(nèi)切蛋白酶溫育的時(shí)間段，以小時(shí)為單位。垂直軸提供了以微克/毫升溫育液體為單 位的IPP濃度。指出的單位表示PPU' s/g奶蛋白質(zhì)。
材料和方法酪蛋白酸鉀得自DMV International (荷蘭)，糖巨肽(〃 Bio-PURE GMP “) 來(lái)自 Davisco Foods International, Inc. (US)。UHT 脫脂奶、Yakult 禾Π Vifit 產(chǎn)品 (后兩者分別來(lái)自Yakult，荷蘭和Campina，荷蘭)得自本地超市。氨肽酶Corolase LAP Ch. :4123(〃 LAP")得自AB Enzymes (UK)，具有高氨肽酶活性的制劑P印tidase 436P(" P436P")得自 Biocatalysts Ltd，Wales，UK)。氨肽酶〃 ZBH"的過(guò)量生產(chǎn)描述于 WO 02/068623和WO 98/46772中。其色譜純化通過(guò)Q_s印harose FF XK上進(jìn)行的陰離子交 換色譜和之后在SP-S^harose XK上進(jìn)行的陽(yáng)離子色譜實(shí)現(xiàn)。來(lái)自Aspergillus niger的 脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶(〃 PSE")的過(guò)量生產(chǎn)及其色譜純化如WO 02/45524中所述完 成。酶活性在PH 4. 6的檸檬酸/磷酸二鈉緩沖液中，于37攝氏度，在合成肽Z-Gly-Pro-pNA 上檢測(cè)。在405nm處通過(guò)分光光度方法監(jiān)測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物。一個(gè)單位(PPU)被定義為在上述檢 測(cè)條件下每分鐘釋放出Iymol對(duì)硝基苯胺(p-nitroanilide)的酶的量。一個(gè)PPU的來(lái)自 A. niger的脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶對(duì)應(yīng)于IOmg酶蛋白質(zhì)。Kjeldahl 氮通過(guò)Flow Injection分析來(lái)測(cè)量總Kjeldahl氮。使用裝備有TKN Method Cassette 5000-040, Pentinum 4 計(jì)算機(jī)(帶 SOFIA 軟件)和 Tecator 5027 Autosampler 的 Tecator FIASTAR 5000 Flow Injection System，在 590nm 處對(duì)從含蛋白質(zhì)溶液中釋放 出的氨進(jìn)行定量。將對(duì)應(yīng)于該方法動(dòng)力學(xué)范圍(0. 5-20mg Ν/1)的樣品量與95-97%的硫酸 一起放置于消化管中，用Kjeltab對(duì)200攝氏度下30分鐘，接著360攝氏度下90分鐘的消 化程序進(jìn)行處理。注射后，在FIASTAR 5000系統(tǒng)中測(cè)量氮峰，由其可推導(dǎo)出測(cè)量的蛋白的 量。氨基酸分析將精確稱重的蛋白質(zhì)材料樣品溶解于稀的酸中，通過(guò)在Eppendorf離心機(jī)中離心 來(lái)除去沉淀。氨基酸分析在清澈的上清液上進(jìn)行，這按照Amino Acid Analysis System of Waters (Mi lford MA, USA)的操作者手冊(cè)指出的PicoTag方法來(lái)進(jìn)行。為達(dá)到該目的，從 液體獲得合適的樣品，然后干燥，對(duì)其進(jìn)行蒸汽相酸水解，使用異硫氰酸苯酯衍生化。使用 HPLC方法對(duì)存在的多種經(jīng)衍生化氨基酸定量，加起來(lái)計(jì)算出稱重樣品中游離氨基酸的總水 平。氨基酸Cys和Trp不包括在該分析獲得的數(shù)據(jù)內(nèi)。LC/MS/MS 分析使用偶聯(lián)到P4000 泵(Thermoquest ，Breda，the Netherlands)上的離子阱質(zhì) 譜儀(Thermoquest , Breda，the Netherlands)的HPLC被用于對(duì)目標(biāo)肽進(jìn)行定量，包括 通過(guò)創(chuàng)造性的酶混合物生產(chǎn)的酶促蛋白水解產(chǎn)物中的三肽IPP、LPP和VPP。使用Inertsil 3 ODS 3，3mm，150*2. Imm 柱(Varian Belgium, Belgium)結(jié)合 Milli Q 水中的 0.1% 甲酸 (Millipore，Bedford，MA，USA ；溶液A)和乙腈中的0.1%甲酸(溶液B)梯度用于洗脫，來(lái) 分離形成的肽。梯度起始自100%的溶液A，保持5分鐘，10分鐘內(nèi)線性增加至5%溶液B， 接著在30分鐘內(nèi)線性增加至45%溶液B，緊接著回到起始條件，保持15分鐘以穩(wěn)定。所使 用的注射體積為50微升，流率為每分鐘200微升，柱溫保持為55°C。注射樣品的蛋白濃度 為大約50微克/毫升。關(guān)于各種肽的詳細(xì)信息通過(guò)使用針對(duì)目標(biāo)肽的專門MS/MS來(lái)獲得，其中使用大約30%的最優(yōu)碰撞能。對(duì)各種肽的定量使用外部校正來(lái)進(jìn)行，其中使用MS/MS模式中觀察到 的最豐富的片段離子來(lái)進(jìn)行。三肽LPP (M = 325. 2)被用于在MS模式中針對(duì)最優(yōu)敏感度進(jìn)行微調(diào)，在MS/MS模 式中針對(duì)最優(yōu)片段化進(jìn)行微調(diào)，其具有5mg/ml的恒定注入率，導(dǎo)致在MS模式中產(chǎn)生質(zhì)子化 分子，在MS/MS模式中產(chǎn)生大約30%的最優(yōu)碰撞能，產(chǎn)生B-和Y-離子系列。在LC/MS/MS之前，在環(huán)境溫度和13000rpm下對(duì)酶促蛋白水解產(chǎn)物或生物活性肽 組合物進(jìn)行10分鐘離心，經(jīng)過(guò)0.22μπι過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，用MilliQ水對(duì)上清液進(jìn)行1 100 的稀釋。水解程度使用快速 OPA 測(cè)試(Nielsen, P. Μ. ；Petersen, D. ；Dambmann, C. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis. Journal of Food Science 2001, 66,642-646)，對(duì)與多種蛋白水解混合物進(jìn)行溫育期間獲得的水解程度(DH)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。水 解程度是肽鍵被酶促水解反應(yīng)破壞的程度的度量。
實(shí)施例實(shí)施例1誦i寸用_氡,酸-特異件溫育脫J旨奶(仵詵地,與Lactobacillus發(fā)酵鉬合) 來(lái)釋放降血壓的三肽為了測(cè)試來(lái)自Aspergillus niger的脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶對(duì)已知的降血壓 肽IPP、VPP和LPP釋放的影響，在六種不同的條件下溫育脫脂奶。在第一組三個(gè)實(shí)驗(yàn)中， 用脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶或脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶和純氨肽酶的組合對(duì)原樣的 脫脂奶進(jìn)行溫育。在第二組三個(gè)實(shí)驗(yàn)中，首先在37°C下用高度蛋白水解的Lactobacillus helveticus菌株(LKB-16H)溫育脫脂奶，然后將pH被降低至約為5. 7時(shí)，添加脯氨酸-特 異性內(nèi)切蛋白酶或脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶與純氨肽酶的組合，并將溫育再搖動(dòng)繼續(xù) 24小時(shí)。在所有這些實(shí)驗(yàn)中使用相對(duì)高的酶濃度來(lái)預(yù)防過(guò)低的酶劑量導(dǎo)致酶添加無(wú)影響 的結(jié)論。酶反應(yīng)終止后，將凝固的反應(yīng)混合物離心并過(guò)濾上清液，之后通過(guò)LC/MS(參閱 材料和方法)對(duì)三肽定量。添加氨肽酶的有益影響解釋于W02006/005757中。簡(jiǎn)言之， 牛奶酪蛋白包括數(shù)種不同蛋白，包括beta酪蛋白和kappa酪蛋白。根據(jù)已知的氨基酸 序列，beta酪蛋白包含ACE抑制三肽IPP、VPP和LPP。在beta酪蛋白中，IPP被含有于 序列-P71-O72-N73-I74-P75-P76-中，VPP 被含有于序列-P81-V82-V83-V84-P85-P86-中，LPP 被含 有于序列-P15tl-L151-P152-P153-中。κ酪蛋白以幾乎為beta酪蛋白濃度的50%的摩爾濃 度存在于酸沉淀的酪蛋白酸鹽制劑中，其僅包含IPP。kappa酪蛋白中，IPP被含有于序 列-Aiot-I1C18-P1C19-P11CT中。因?yàn)楦彼醎特異性內(nèi)切蛋白酶能夠在脯氨酸和丙氨酸的C-端 切割肽鍵(但是在P-P序列內(nèi)則不)，所以用脯氨酸_特異性內(nèi)切蛋白酶溫育脫脂奶從 κ-酪蛋白中釋放IPP以及從β-酪蛋白中釋放LPP。另外，分別整合IPP和VPP的五肽 QNIPP和VVVPP從β -酪蛋白生產(chǎn)。為了從這些五肽中釋放IPP和VPP，需要氨肽酶活性。 理論上氨肽酶活性可以通過(guò)裂解發(fā)酵過(guò)程中生產(chǎn)的Iactobacilli來(lái)提供。然而，這類氨肽 酶活性可能過(guò)低，使得根據(jù)本發(fā)明可以作為外部酶提供活性。在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中，以商品 Corolase LAP的形式提供所述氨肽酶活性。
如在表1中可以看到的，在無(wú)Lactobacillus helveticus的溫育中，脯氨 酸-特異性內(nèi)切蛋白酶和氨肽酶的組合導(dǎo)致最高水平的三種降血壓三肽。此外，在存在 Lactobacillus helveticus菌株時(shí)，與添加的額外的內(nèi)切蛋白酶和氨肽酶組合時(shí)IPP、LPP 和VPP水平最高。補(bǔ)充了額外的脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶和氨肽酶的Lactobacillus helveticus菌株的存在導(dǎo)致最高水平的三種降血壓三肽的事實(shí)顯示，高度蛋白水解的 Lactobacillus helveticus菌株單獨(dú)提供的蛋白水解酶活性不足以在奶發(fā)酵期間最大化 降血壓三肽的產(chǎn)量。表1 以mg/g奶蛋白質(zhì)為單位的降血壓三肽的濃度
肽不添加酶添加PSE添加PSE+氨肽酶脫脂奶IPP0.00.110.18VPP0.00.050.56LPP0.00.090.10脫脂奶 + IactobacilliIPP0.010.100.29VPP0.040.051.13LPP0.00.190.26PSE =來(lái)自A. niger的脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶，其以4PPU/g蛋白質(zhì)的濃度存 在氨肽酶=CorolaseLAP Ch. :4123(AB Enzymes, UK)，其以 125 微升/g 蛋白質(zhì)的 濃度存在實(shí)施例2完成lactobacillus發(fā)酵后添加脯氨酸-特異件內(nèi)切蛋白酶的影響如實(shí)施例1中所示，在用高度蛋白水解的Lactobacillus helveticus菌株發(fā)酵期 間變得可用的蛋白水解活性事實(shí)上不足以從奶中高效釋放降血壓三肽。還如實(shí)施例1中所 示，脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶(或優(yōu)選脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶加合適的氨肽酶)的 添加能夠?qū)Υ诉M(jìn)行補(bǔ)償。所述脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶(或優(yōu)選脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋 白酶加合適的氨肽酶)可以在發(fā)酵過(guò)程之前、期間或之后添加，從而增強(qiáng)降血壓三肽的產(chǎn) 量，和獲得可再現(xiàn)的終產(chǎn)物(見實(shí)施例4和5)。本實(shí)施例闡述了在完成發(fā)酵過(guò)程后添加脯 氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶的影響。在37°C的脫脂奶發(fā)酵結(jié)束后，首先熱處理得到的經(jīng)酸化的奶制品從而殺死存在的 Iactobacilli，之后通過(guò)添加KOH使懸浮液的pH提高至4. 7或5. 9。并入pH 5. 9調(diào)節(jié)來(lái)測(cè) 試隨后的酶溫育期間更高的PH條件是否會(huì)有助于許多酪蛋白凝塊的溶解，所述酪蛋白凝 塊由于發(fā)酵期間奶的酸化而形成。pH調(diào)節(jié)后，以0. 5或3. OPPU/g奶蛋白質(zhì)的濃度添加來(lái)自 A. niger的脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶，并在50°C下將溫育繼續(xù)2、4、6或23小時(shí)。在每個(gè) 溫育時(shí)間段結(jié)束時(shí)，通過(guò)在95°C下10分鐘的熱處理使內(nèi)切蛋白酶失活，并通過(guò)離心去除不 溶材料。根據(jù)材料和方法章節(jié)中描述的LC/MS程序，測(cè)量澄清的上清液中降血壓三肽IPP 和LPP的濃度。根據(jù)結(jié)果(見圖1和2)可以得出結(jié)論，作為酶溫育的結(jié)果，特別是LPP的產(chǎn)量(圖2)顯著提高。用最高的PH值溫育導(dǎo)致最高LPP產(chǎn)量的事實(shí)提出，事實(shí)上酪蛋白 凝塊的溶解而不是提高的酶活性在起作用，因?yàn)楦彼?特異性酶在這類相對(duì)高的PH值下 活性較低。對(duì)IPP生產(chǎn)(圖1)而言得到了類似但是較不極端的觀察結(jié)果。獲得的數(shù)據(jù)還 證明，盡管高酶劑量(3PPU/g奶蛋白質(zhì))導(dǎo)致更高的LPP和IPP產(chǎn)量，但是用幾乎十倍更低 的酶劑量(0. 5PPU/g奶蛋白質(zhì))獲得的差異是微小的，因?yàn)槭褂玫兔竸┝靠赡芨映杀居?效。實(shí)施例3從酪蛋白酸鹽和糖巨肽中釋放最大水平的降血壓肽需要的酶劑量詳述于本申請(qǐng)中的本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以從不同的含奶蛋白質(zhì)的產(chǎn)物開始并 使用不同的發(fā)酵菌株制造多種產(chǎn)物，從存在的所述奶蛋白質(zhì)得到最大量的降血壓肽。為了 獲得關(guān)于肽產(chǎn)量的最佳結(jié)果，必須針對(duì)使用的底物類型和發(fā)酵方法優(yōu)化酶劑量。然而，一旦 被優(yōu)化則獲得高度可再現(xiàn)的生產(chǎn)方法，其中低水平的外源酶滿足生產(chǎn)最高量降血壓肽的要 求。從脫脂奶中生產(chǎn)最大量IPP、VPP和LPP水平所需的酶劑量列于實(shí)施例1和實(shí)施例2中。 本實(shí)施例顯示從酪蛋白酸鉀以及糖巨肽中釋放相關(guān)的降血壓肽，并例證了優(yōu)化肽產(chǎn)量所需 的酶/奶蛋白質(zhì)比例。實(shí)施例1中提到了理論上存在于每種這些底物中的降血壓肽。糖巨 肽(GMP)是在用凝乳酶切割后從κ-酪蛋白中釋放并且并入單個(gè)IPP序列(Iltl8-P1Cl9-P11Cl) 的可溶片段。為了專注于添加的酶的影響，在該實(shí)驗(yàn)中不用微生物接種酪蛋白酸鹽和GMP 溶液，從而不發(fā)生發(fā)酵。將酪蛋白酸鉀(DMV，荷蘭)溶于水中，獲得加入約8% (w/w)蛋白質(zhì)并具有約6. 6 的PH的液體。然后將pH降低至5. 9，將液體分布于大量搖瓶中，以每克存在的奶蛋白質(zhì)5、 7. 5和IOmg酶蛋白質(zhì)的濃度添加純脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶。溫育于55°C下?lián)u動(dòng)進(jìn)行 多達(dá)24小時(shí)的時(shí)間段。以規(guī)則的間隔采樣并在90°C下加熱30分鐘，以終止所有微生物和 酶活性。然后將這些經(jīng)加熱的樣品在Eppendorf離心管中于6000rpm離心10分鐘，之后通 過(guò)〃 Vivaspin"離心濃縮器(Vivascience，Sartorius Biolab Products，德國(guó))進(jìn)一步純 化，并在搖動(dòng)式轉(zhuǎn)子(swing-out rotor)中于3200g下離心30分鐘。通過(guò)LC/MS直接分析 得到的滲透物，以定量存在于每種樣品中的IPP、VPP和LPP的水平。得自IPP的結(jié)果展示 于圖3中，得自LPP的結(jié)果展示于圖4中。在GMP的情況下遵循類似的途徑。將GMP溶于水中達(dá)到7 % (w/w)的濃度，之后將 PH調(diào)節(jié)至5. 9。以每克存在的奶蛋白質(zhì)5、7. 5和IOmg酶蛋白質(zhì)的濃度用純脯氨酸-特異 性內(nèi)切蛋白酶溫育，溫育于55°C下?lián)u動(dòng)進(jìn)行多達(dá)8小時(shí)的時(shí)間段。如所述針對(duì)酪蛋白酸鹽 采樣并分析IPP和LPP濃度，得到圖5中所示結(jié)果。基于獲得的結(jié)果可以得出結(jié)論，相對(duì)存 在的每克(奶)蛋白質(zhì)而言約IOmg脯氨酸-特異性蛋白酶的劑量足以釋放存在的所有降 血壓肽。實(shí)施例4在存在多種 時(shí)通丄寸多種微勿發(fā)酵的脫J旨奶、SSg白Il鉀禾Π_巨肽溶液Φ的降 血壓肽如實(shí)施例1和2中所示，即便是使用所選擇的高度蛋白水解的lactobacillus物 種也不能保證在發(fā)酵期間釋放所有降血壓肽。這意味著在含奶蛋白質(zhì)的底物上培養(yǎng)時(shí)，則 具有更低的蛋白水解能力的許多微生物會(huì)完全不能產(chǎn)生降血壓肽。然而，用這類微生物發(fā)酵奶蛋白質(zhì)在其它方面可能是期望的，例如因?yàn)檫@些微生物適合用作益生菌，或者它們?cè)?質(zhì)感或口味方面改善產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的酶促途徑，從奶蛋白質(zhì)釋放降血壓肽不再依賴于 使用的發(fā)酵菌株的性質(zhì)。因此，根據(jù)本發(fā)明的酶途徑允許在單個(gè)產(chǎn)物中組合若干益處，即與 降血壓活性組合的改善的口味、質(zhì)感、益生菌活性。在本實(shí)施例中，我們會(huì)例證根據(jù)本發(fā)明的方法釋放降血壓肽是高度可再現(xiàn)的， 在涉及不同的含奶蛋白質(zhì)的底物時(shí)也是如此。另外，我們例證了降血壓肽可以在所有這 些情況下和與大量多種工業(yè)上使用的微生物組合產(chǎn)生。這一實(shí)驗(yàn)中使用的乳酸細(xì)菌或 Bifidobacteria的身份和特征詳述于表2中。表2:測(cè)試的微生物 代碼100H、CY-221、MY-721 和 UX-21 B 表示可從 DSM-Food Specialities (Delft, 荷蘭)商業(yè)獲得的初始培養(yǎng)物。“Yakult”和“Vifit”是指從以這些名字出售的商品中獲得 的接種物。將使用的菌株在25ml UHT脫脂奶中于37°C下預(yù)孵育22小時(shí)的時(shí)間段，向其中添加0. 酵母提取物。用菌株UX-21B接種的液體總是在30°C下溫育。通過(guò)接種0. 5ml可 商業(yè)獲得的產(chǎn)物獲得“Yakult”和“Vifit”菌株。就實(shí)際的測(cè)試而言，制備加入不同奶蛋白質(zhì)組分的三種不同的生長(zhǎng)培養(yǎng)基UHT 脫脂奶、去礦物質(zhì)化水中35g/l酪蛋白酸鉀溶液和去礦物質(zhì)化水中35g/l GMP溶液。通過(guò) 添加額外的0.1% (w/w)酵母提取物富集所有三種液體。向酪蛋白酸鹽和GMP溶液中還添 加 0. (w/w)乳糖。通過(guò)在90°C下預(yù)加熱15分鐘然后在85°C下30分鐘，在水浴中對(duì)酪蛋白酸鹽和 GMP溶液巴氏消毒。然后將UHT奶、酪蛋白酸鹽和GMP培養(yǎng)基各自分成三份不添加酶、添加 脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶(15mg酶蛋白質(zhì)/g奶蛋白質(zhì))和添加脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋 白酶加氨肽酶(Corolase LAP) (125微升/g奶蛋白質(zhì))。將由此獲得的九種蛋白質(zhì)/酶培 養(yǎng)基樣品均個(gè)別地用表2中所列六種菌株中的每一種的0. 5ml預(yù)培養(yǎng)物接種(每50ml生 長(zhǎng)培養(yǎng)基0. 5ml預(yù)培養(yǎng)物)。九種培養(yǎng)基中每一種的一個(gè)樣品不接種而是用作參照。將培 養(yǎng)基在37°C下站立溫育24小時(shí)；用菌株UX-21 B接種的培養(yǎng)基在30°C下溫育。溫育結(jié)束時(shí)，從每個(gè)溫育管中采取小樣，并在90°C下加熱30分鐘，以終止所有微 生物和酶活性。然后如實(shí)施例3中所述處理這些經(jīng)加熱的樣品，并通過(guò)LC/MS分析來(lái)定量 每個(gè)樣品中存在的三肽IPP、VPP和LPP的水平。獲得的結(jié)果展示于表3 (UHT奶)、表4 (酪 蛋白酸鉀)和表5(GMP)中。在后面三個(gè)表中展示的結(jié)果的基礎(chǔ)上可以得出結(jié)論，根據(jù)本發(fā) 明的酶和發(fā)酵技術(shù)的組合提供了制備奶蛋白質(zhì)的一種有效方式，所述奶蛋白質(zhì)以加入高水 平降血壓肽的消費(fèi)者產(chǎn)品為基礎(chǔ)。表3 原樣溫育后，用多種微生物接種后，添加脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶(PSE) 后，添加氨肽酶(LAP)后或添加微生物和酶的組合后，UHT脫脂奶中以微克/ml為單位的降 血壓三肽的濃度。溫育混合物中省略菌株或酶用“_”表示。 表4:原樣溫育后，用多種微生物接種后，添加脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶(PSE) 后，添加氨肽酶(LAP)后或添加微生物和酶的組合后，酪蛋白酸鉀溶液中以微克/ml為單位 的降血壓三肽的濃度。溫育混合物中省略菌株或酶用“_”表示。
表5 原樣溫育后，用多種微生物接種后，添加脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶(PSE) 后，添加氨肽酶(LAP)后或添加微生物和酶的組合后，GMP溶液中以微克/ml為單位的降血 壓三肽的濃度。溫育混合物中省略菌株或酶用“_”表示。不可檢出的LPP和VPP水平用nd表不。 實(shí)施例5經(jīng)發(fā)酵的脫脂奶水解產(chǎn)物中的降血壓肽根據(jù)本發(fā)明的酶途徑，從奶蛋白質(zhì)釋放降血壓肽不再依賴于使用的發(fā)酵菌株的性 質(zhì)。因此，根據(jù)本發(fā)明的酶途徑允許在單個(gè)產(chǎn)物中組合若干益處，即與降血壓活性組合的改 善的口味、質(zhì)感、益生菌活性(如由所選擇的發(fā)酵菌株帶來(lái))。酶促途徑使得整個(gè)過(guò)程多用 得多，因?yàn)槊副ＷC降血壓肽的高產(chǎn)量，使得發(fā)酵步驟變得靈活，即發(fā)酵過(guò)程可以在酶溫育之 前、期間或之后進(jìn)行。在發(fā)酵過(guò)程前用酶溫育含奶蛋白質(zhì)的底物是特別感興趣的，因?yàn)檫@允 許使酶失活，從而加入降血壓肽的最終產(chǎn)物可含有有活力的微生物。后一特征對(duì)益生菌產(chǎn) 物以及特殊的酸奶而言可以是重要的。在本實(shí)施例中我們描述了在脫脂奶的酶處理后進(jìn)行的發(fā)酵過(guò)程。另外，例證了多 種類型的氨肽酶對(duì)降血壓肽產(chǎn)量的影響。從可商業(yè)獲得的UHT脫脂奶中采取IOml樣品作
26為參照材料。向剩余的990ml脫脂奶中，首先添加35PPU的脯氨酸-特異性蛋白酶，并快速 混合。從該材料中獲得11部份，每部分10ml。根據(jù)表6中所說(shuō)明的列表，向這些部分中的 10個(gè)中添加氨肽酶制劑。剩余的部分作為參照，并且不添加氨肽酶。所有這些樣品的溫育 在55°C下?lián)u動(dòng)進(jìn)行4小時(shí)，之后通過(guò)95°C下10分鐘的熱處理使存在的酶失活。然后將每 部分的Iml樣品離心，如實(shí)施例3中所述處理上清液并通過(guò)LC/MS分析來(lái)定量每個(gè)樣品中 存在的IPP、VPP和LPP水平。獲得的結(jié)果展示于表6中，并且顯示在用單獨(dú)的脯氨酸_特 異性內(nèi)切蛋白酶(第2管)預(yù)溫育后，可以獲得顯著的降血壓肽水平。然而，添加氨肽酶活 性(第3到13管)將這些水平增強(qiáng)至釋放約90%第13管中理論存在的所有IPP。將剩余的9ml部分(第1到13管)冷卻，通過(guò)離心去除任何蛋白質(zhì)沉淀物，并用 傳統(tǒng)的酸奶培養(yǎng)物CY_340(可得自DSM-Food Specialities, Delft，荷蘭)接種剩余的所 有上清液。在37°C下溫育10小時(shí)后，在粘度、口味和細(xì)胞生長(zhǎng)方面評(píng)價(jià)多種終產(chǎn)物。除了 含有未經(jīng)蛋白酶處理的UHT奶的管(第1管)之外，多種溫育物的粘度均因?yàn)榘l(fā)酵而微小 地提高，這使得它們適合作為例如飲品酸奶。所有接種的產(chǎn)物均顯示可觀的微生物生長(zhǎng)，典 型的在109CfU/ml左右。另外，所有產(chǎn)物具有輕微的、酸奶樣的口味。只有用P436P酶產(chǎn)物 預(yù)處理的產(chǎn)物有苦味，推測(cè)是因?yàn)樗雒府a(chǎn)物除了其氨肽酶活性以外還包括顯著量的內(nèi)切 蛋白水解活性。表6 :UHT脫脂奶中以微克/ml為單位的降血壓三肽的濃度。
*使用的氨肽酶在材料和方法章節(jié)中說(shuō)明。為了保證相當(dāng)?shù)陌彪乃饣钚?，制?在活性檢驗(yàn)的基礎(chǔ)上被標(biāo)準(zhǔn)化的每種氨肽酶制劑的溶液，所述活性檢驗(yàn)使用Leu-pNA作為 底物。為此在PH 6. 5和37°C下用多種制劑溫育Leu-pNA的飽和溶液。使用Tecan-Genios MTP Reader (Salzburg，Vienna)在405nm處10分鐘的動(dòng)態(tài)測(cè)量中動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)每種制劑對(duì)pNA 的釋放。根據(jù)獲得的數(shù)據(jù)，ZBH濃縮物(14mg蛋白質(zhì)/ml)顯示與五倍稀釋的(2mg蛋白質(zhì)/ ml) Corolase LAP (批次8044)制劑和200mg/ml P436P粉末溶液可比較的氨肽酶活性。表 6中說(shuō)明的氨肽酶活性量是指從后三種酶溶液獲得的體積。
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權(quán)利要求
生產(chǎn)包含三肽IPP和/或三肽VPP的經(jīng)發(fā)酵的奶制品的方法，所述方法包括使用奶蛋白質(zhì)作為起始材料，其中使用合適的乳酸細(xì)菌或Bifidobacterium對(duì)所述奶蛋白質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵步驟，并使用脯氨酸 特異性內(nèi)切蛋白酶或脯氨酸特異性寡肽酶進(jìn)行酶溫育步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中使用得自Aspergillus，優(yōu)選地得自Aspergillus niger的脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述脯氨酸-特異性內(nèi)切蛋白酶或脯氨酸特異性 寡肽酶以基于奶蛋白質(zhì)0. 05襯％到1. 7wt%的量添加。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)的方法，其中在所述酶溫育步驟中還使用氨肽酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述氨肽酶得自Aspergillus。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，其中所述氨肽酶以基于奶蛋白質(zhì)少于的量添加。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)的方法，其中還生產(chǎn)LPP。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)的方法，其中所述經(jīng)發(fā)酵的奶制品具有5%到38%，優(yōu) 選10%到38%，更優(yōu)選15%到35%的水解度(DH)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的方法，其中在所述發(fā)酵步驟中所述乳酸細(xì)菌或 Bifidobacterium 是 Lactobacillus，例如 Lactobacillus helveticus、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus bulgaricus 或 Lactobacillus, delbrueckii ssp.Bulgaricus, Lactococcus， 例 如 Lactococcus Iactis, Leuconostoe, Pediococcus 或 Streptocoocus,或是 Bifidobacteria 的代表如 Bifidobacterium animalis、Bifidobacterium brevis、Bifidobacterium infantis 禾口 Bifidobacterium longum。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到9中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶步驟在所述發(fā)酵步驟之前。
11.根據(jù)權(quán)利要求1到9中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶步驟在所述發(fā)酵步驟期間發(fā)生。
12.根據(jù)權(quán)利要求1到9中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶步驟在所述發(fā)酵步驟后發(fā)生。
13.生產(chǎn)食物、飼料、寵物食物、營(yíng)養(yǎng)藥物或營(yíng)養(yǎng)成分或要用于食物、飼料、寵物食物或 營(yíng)養(yǎng)藥物中的成分的方法，所述方法包括在所述食物、飼料、寵物食物、營(yíng)養(yǎng)藥物或營(yíng)養(yǎng)成 分或其成分中加入包含三肽IPP和/或三肽VPP的經(jīng)發(fā)酵的奶制品，所述經(jīng)發(fā)酵的奶制品 用權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)。
14.能夠通過(guò)權(quán)利要求13的方法獲得的食物、飼料、寵物食物、營(yíng)養(yǎng)藥物或營(yíng)養(yǎng)成分或 要用于食物、飼料、寵物食物或營(yíng)養(yǎng)藥物中的成分。
15.通過(guò)權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的包含三肽IPP和/或VPP的經(jīng)發(fā)酵的 奶制品用于制備食物、飼料、寵物食物、營(yíng)養(yǎng)藥物或營(yíng)養(yǎng)成分或要用于食物、飼料、寵物食物 或營(yíng)養(yǎng)藥物中的成分的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)三肽IPP和/或三肽VPP的方法，所述方法包括使用蛋白質(zhì)作為初始材料，其中使用合適的乳酸細(xì)菌或Bifidobacterium對(duì)所述蛋白質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵步驟，并且使用脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶或脯氨酸特異性寡肽酶對(duì)所述蛋白質(zhì)進(jìn)行酶溫育步驟。
文檔編號(hào)A23L1/305GK101925674SQ200880125429
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2008年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月23日
發(fā)明者盧卡斯·希瑞爾·杰勒德·海丹·范德, 路泊·埃登斯 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司