專利名稱：靶向雄激素受體的lna拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供調(diào)節(jié)雄激素受體的表達(dá)的化合物、組合物和方法。特別是，本發(fā)明涉及 寡聚化合物(寡聚物)，其在細(xì)胞中靶向雄激素受體mRNA，導(dǎo)致雄激素受體的表達(dá)減少。雄 激素受體表達(dá)的減少有利于一系列醫(yī)學(xué)病癥，如癌癥，特別是前列腺癌或乳腺癌。相關(guān)案件本申請根據(jù)35 U. S. C. § 119(e)要求2007年11月26日提交的U. S.臨時(shí)申請序 列號60/990，125的優(yōu)先權(quán)，其公開以其整體在此引入作為參考。背景雄激素受體(AR)為一類細(xì)胞核受體，其通過結(jié)合雄激素睪酮或二氫睪酮而活化。 雄激素受體的主要功能是作為調(diào)節(jié)基因表達(dá)的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子。然而，雄激素受體也具 有獨(dú)立于DNA結(jié)合的其它功能。雄激素受體與孕酮受體最密切相關(guān)，且較高劑量的孕酮可 阻斷雄激素受體。盡管人的AR基因?yàn)閱慰截惽野l(fā)現(xiàn)于X染色體的Xql 1_12位置上，但受體本身存在 兩種同工型(A和B)。AR-A為缺少前187個(gè)氨基酸(N-端切斷)的87kDa蛋白質(zhì)。同工型 AR-B 全長為 llOkDa。雄激素與雄激素受體的結(jié)合誘導(dǎo)受體的構(gòu)象變化，導(dǎo)致熱休克蛋白的解離、細(xì)胞 溶膠向細(xì)胞核的二聚和轉(zhuǎn)運(yùn)，在細(xì)胞核中雄激素受體二聚物結(jié)合至特異的DNA序列-稱為 激素效應(yīng)元素。根據(jù)與其它核蛋白質(zhì)的相互作用，該AR控制基因表達(dá)，增加或減少特異基 因的轉(zhuǎn)錄，如胰島素樣生長因子I (IGF-I)。盡管在細(xì)胞質(zhì)中具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，雄激素受體也可具有胞質(zhì)活性。結(jié)合至細(xì)胞 質(zhì)雄激素受體的雄激素可引起不依賴基因轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞功能的快速轉(zhuǎn)變，例如離子轉(zhuǎn)運(yùn)，以 及基因轉(zhuǎn)錄的間接影響，例如通過介導(dǎo)其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而影響其它轉(zhuǎn)錄因子的活性。雄激素受體的過表達(dá)，或突變的雄激素受體基因的表達(dá)已在多種疾病中指征，如 癌癥，包括前列腺癌和乳腺癌，以及其它病癥如聚谷氨酸(polyglutamate)疾病(Monks等 人，PNAS 2007年11月2日，公開于網(wǎng)上)脫發(fā)，良性前列腺增生，脊髓性肌萎縮和Kennedy 疾病。W097/11170報(bào)道了治療診斷為患有良性前列腺增生或前列腺癌的患者的方法，其 包括給藥選擇性雜交至雄激素受體mRNA的反義寡核苷酸。公開了 27-29個(gè)核苷酸的三個(gè) 反義寡核苷酸序列。US 6，733，776和EP 0 692 972報(bào)道了治療雄激素性脫發(fā)的方法，其通過施加包 含雜交至雄激素受體基因的反義核酸的脂質(zhì)體。沒有提供具有具體序列且靶向雄激素受體 的反義分子。US 2005/0164970報(bào)道了使用靶向雄激素受體mRNA的siRNA復(fù)合物治療前列腺癌 的方法。WO 2005/027833報(bào)道了治療前列腺癌的方法，其包括向患者給藥長度為12_40個(gè) 嗎啉代亞單元的嗎啉代寡核苷酸。
WO 2001/083740報(bào)道了反義化合物，其具有靶向人雄激素受體的18至20個(gè)連續(xù) 單元的不帶電(uncharged)嗎啉代主鏈。嗎啉代反義化合物通過結(jié)合至核酸靶以阻斷其它分子接近mRNA而工作，所述其 它分子如mRNA剪接或翻譯起始中涉及的分子。US 7，067，256報(bào)道了一種核酶，其明顯介導(dǎo)雄激素受體的滅活。提供了與雄激素 受體mRNA的對應(yīng)區(qū)反義的19個(gè)核苷酸的RNA分子。然而，盡管使用siRNA、嗎啉代反義和核酶，上述雄激素受體抑制劑沒有一種成功 地在體內(nèi)和以藥理可接受的劑量有效地減量調(diào)節(jié)雄激素_受體。在一個(gè)示例方面，本發(fā)明提供一類新的雄激素受體拮抗劑，其基于使用LNA化學(xué)， 和/或通過選擇雄激素受體mRNA上的特別有效的靶點(diǎn)而選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供長度為10-50，如10-30個(gè)核苷酸的寡聚物，其包含總共10_50，如 10-30個(gè)核苷酸的連續(xù)核苷酸(contiguous nucleotide)序列，其中所述連續(xù)核苷酸序列 與對應(yīng)于以下的區(qū)至少80% (例如，85%，90%，95%，98%，或99% )同源編碼哺乳動(dòng) 物雄激素受體的核酸的反向補(bǔ)體(reverse complement)，如哺乳動(dòng)物雄激素受體基因或 mRNA JBSEQ ID NO 1或其天然存在的變體。因此，例如，該寡聚物雜交至具有SEQ ID NO: 1的(相應(yīng))部分的序列的單鏈核酸分子。本發(fā)明提供綴合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的寡聚物，和至少一種共價(jià)連接至所述寡 聚物的非核苷酸或非多核苷酸部分。本發(fā)明提供藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的寡聚物或綴合物，和藥物可接受的 稀釋劑、載體、鹽或佐劑。本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的寡聚物或綴合物，其用作藥物，如用于治療本文公開的 疾病或醫(yī)學(xué)病癥，如過度增生性疾病，如癌癥。本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的寡聚物或綴合物，用于制備用于治療本文公開的疾病或 醫(yī)學(xué)病癥，如過度增生性疾病，如癌癥的藥物中的用途。本發(fā)明提供治療本文公開的疾病或醫(yī)學(xué)病癥，如過度增生性疾病，如癌癥的方法， 所述方法包括向患有或可能患有所述疾病或醫(yī)學(xué)病癥的患者給藥根據(jù)本發(fā)明的寡聚物、綴 合物或藥物組合物。本發(fā)明提供在表達(dá)該雄激素受體的細(xì)胞中抑制雄激素受體的方法，所述方法包括 向所述細(xì)胞給藥根據(jù)本發(fā)明的寡聚物或綴合物以實(shí)現(xiàn)在所述細(xì)胞中時(shí)雄激素受體的抑制。本發(fā)明提供長度為10-50個(gè)核堿基的寡聚物，其包括總共10-50個(gè)核堿基的連續(xù) 核堿基序列，其中所述連續(xù)核堿基序列與編碼哺乳動(dòng)物雄激素受體的核酸的對應(yīng)區(qū)至少 80%同源。本發(fā)明提供長度為10-50個(gè)核堿基的寡聚物，其包括總共10-50個(gè)核堿基的連續(xù) 核堿基序列，其中所述連續(xù)核堿基序列與編碼哺乳動(dòng)物雄激素受體的核酸的靶區(qū)的反向補(bǔ) 體至少80%相同(identical)。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含根據(jù)本發(fā)明的寡聚物的綴合物，如以下綴合物，其除了包 含寡聚物的核堿基序列，還包含共價(jià)連接至本發(fā)明的寡聚物的至少一個(gè)非核苷酸或非多核苷酸部分(“綴合的部分”)。本發(fā)明提供藥物組合物，其包含本發(fā)明的寡聚物或綴合物，和藥物可接受的稀釋 劑、載體、鹽或佐劑。本發(fā)明進(jìn)一步提供本發(fā)明的寡聚物，其用于藥物。本發(fā)明進(jìn)一步提供本發(fā)明的寡聚物在制備用于治療本文涉及的一種或多種疾病 的藥物中的用途，該疾病如選自以下的疾病癌癥如乳腺癌或前列腺癌，脫發(fā)，良性前列腺 增生，骨髓性肌萎縮(spinal and muscular atrophy)，Kennedy疾病和聚谷氨酸疾病。本發(fā)明進(jìn)一步提供本發(fā)明的寡聚物，用于治療本文涉及的一種或多種疾病，如選 自以下的疾病癌癥如乳腺癌或前列腺癌，脫發(fā)，良性前列腺增生，骨髓性肌萎縮，Kennedy 疾病和聚谷氨酸疾病。還提供包含本發(fā)明的寡聚物的藥物和其它組合物。進(jìn)一步提供減量調(diào)節(jié)AR在細(xì) 胞或組織中的表達(dá)的方法，其包括將所述細(xì)胞或組織，體外或體內(nèi)，與一種或多種本發(fā)明的 寡聚物、綴合物或組合物接觸。還公開了為治療懷疑患有或傾向于(易于)患有與AR的表達(dá)或過表達(dá)相關(guān)的疾 病或病癥的非人動(dòng)物或人的方法，其通過向該輔助動(dòng)物或人給藥治療或預(yù)防有效量的一種 或多種本發(fā)明的寡聚物、綴合物或藥物組合物。而且，提供了使用寡聚物抑制AR的表達(dá)，和 治療與AR的活性相關(guān)的疾病的方法。本發(fā)明提供治療選自癌癥如乳腺癌如乳腺癌或前列腺癌，脫發(fā)，良性前列腺增 生，骨髓性肌萎縮，Kennedy疾病和聚谷氨酸疾病的疾病的方法，該方法包括向需要的患者 給藥(有效量的)本發(fā)明的一種或多種寡聚物、綴合物或其藥物組合物。本發(fā)明提供在細(xì)胞或組織中抑制或減少雄激素受體的表達(dá)的方法，如通過減量調(diào) 節(jié)，該方法包括將所述細(xì)胞或組織與有效量的本發(fā)明的一種或多種寡聚物、或其綴合物或 藥物組合物接觸的步驟，以使雄激素受體的表達(dá)被抑制或減少。本發(fā)明提供，在一些實(shí)施方案中，由10至30個(gè)連續(xù)單體組成的寡聚物，其中相 鄰單體通過磷酸酯基(phosphate group)或硫代磷酸酯基共價(jià)連接，其中所述寡聚物包 括至少10個(gè)連續(xù)單體的第一區(qū)；其中所述第一區(qū)的至少一個(gè)單體為核苷類似物；其中所 述第一區(qū)的序列與哺乳動(dòng)物雄激素受體基因或哺乳動(dòng)物雄激素受體mRNA的最佳排列的 (best-aligned)靶區(qū)的反向補(bǔ)體至少80%相同。在一方面，本發(fā)明的寡聚物選自 其中大寫字母表示β -D-氧基-LNA單體且小寫字母表示DNA單體，下標(biāo)“S”表示 硫代磷酸酯連接，且feC表示含5-甲基胞嘧啶堿基的β -D-氧基-LNA單體。附圖簡述

圖1.對表3中存在的寡核苷酸使用實(shí)時(shí)PCR評價(jià)其在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)在濃度1、4 和16ηΜ在MCF7細(xì)胞中敲低(knock down)雄激素受體mRNA的潛能。所有結(jié)果對于GAPDH 標(biāo)準(zhǔn)化，且AR mRNA的抑制顯示為未處理的對照的百分比。所示結(jié)果為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。圖2.對表3中存在的寡核苷酸使用實(shí)時(shí)PCR評價(jià)其在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)在濃度1、4 和16nM在A549細(xì)胞中敲低雄激素受體mRNA的潛能。所有結(jié)果對于GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化，且AR mRNA的抑制顯示為未處理的對照的百分比。所示結(jié)果為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。圖3.人雄激素受體mRNA序列(Genbank登記號NM_000044)和小鼠雄激素受體 mRNA序列(Genbank登記號NM_0134769)的序列比對。圖4.根據(jù)本發(fā)明的寡聚物靶向的人AR mRNA(cDNA)的優(yōu)選靶區(qū)的位置。盡管顯 示了 16聚體靶點(diǎn)，在一些實(shí)施方案中，這些靶區(qū)可包含在所示區(qū)域的5’或3’的另外4個(gè) 堿基_即為最多24個(gè)連續(xù)核苷酸的靶區(qū)。圖5. SEQ ID NO=I人雄激素受體(二氫睪酮受體；睪丸女性化；脊髓延髓肌萎縮； Kennedy 病)(AR)，轉(zhuǎn)錄變體 1，mRNA。(Genbank 登記號 NM_000044)。圖6. SEQ ID NO 81 小鼠雄激素受體mRNA序列。圖7. SEQ ID NO 82 獼猴雄激素受體mRNA序列。圖8. SEQ ID NO 83 人雄激素受體蛋白氨基酸序列。圖9. SEQ ID NO 84 小鼠雄激素受體蛋白氨基酸序列。圖10. SEQ ID NO 85 獼猴雄激素受體蛋白氨基酸序列。圖11 轉(zhuǎn)染后24小時(shí)LNCaP中的AR mRNA圖12 轉(zhuǎn)染后24小時(shí)A549中的AR mRNA圖13 細(xì)胞增殖測試-A549，轉(zhuǎn)染后時(shí)程圖14 細(xì)胞增殖測試-轉(zhuǎn)染后時(shí)程圖15 轉(zhuǎn)染后24，48或72小時(shí)LNCaP細(xì)胞中的Caspase 3/7活性。圖16 轉(zhuǎn)染后24，48或72小時(shí)A549細(xì)胞中的Caspase 3/7活性。圖17 體內(nèi)寡聚物處理后血漿中的平均PSA。圖18 腫瘤生長的體內(nèi)抑制發(fā)明詳述寡聚物本發(fā)明使用寡聚化合物(本文稱為寡聚物)，用于調(diào)節(jié)編碼哺乳動(dòng)物雄激素受體 的核酸分子，如SEQ ID NO 1中所示的雄激素受體核酸，和這種編碼哺乳動(dòng)物雄激素受體的 核酸分子天然存在的變體的功能。本發(fā)明中的術(shù)語“寡聚物”，是指兩個(gè)或多個(gè)核苷酸共價(jià) 連接形成的分子(即寡核苷酸)。在此，各單核苷酸，如本發(fā)明的寡聚物中存在的核苷酸，也 可稱為“單體”或“單元”。在一些實(shí)施方案中，該寡聚物由長度為10-30個(gè)核苷酸的連續(xù)核 苷酸序列組成或包含長度為10-30個(gè)核苷酸的連續(xù)核苷酸序列(即包含10-30個(gè)共價(jià)連接 的單體或由10-30個(gè)共價(jià)連接的單體組成)。在不同實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物不包含RNA(單元)。在不同實(shí)施方案中，根 據(jù)本發(fā)明的化合物為線性分子或合成為線性分子。在該實(shí)施方案中，該寡聚物為單鏈分子， 且通常不包含例如，至少3，4或5個(gè)連續(xù)核苷酸的短區(qū)，該短區(qū)與相同寡聚物內(nèi)的另一區(qū)互 補(bǔ)(即雙鏈體)_在這點(diǎn)上，在一些實(shí)施方案中，該寡聚物不為(實(shí)質(zhì)上)雙鏈的。在一些 實(shí)施方案中，該寡聚物實(shí)質(zhì)上不為雙鏈的，如不為siRNA。在不同實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚 物可整個(gè)由連續(xù)核苷酸區(qū)組成。因此，該寡聚物基本上不是自互補(bǔ)的。siRNAs包含2個(gè)互補(bǔ)的短RNA(或相當(dāng)?shù)暮藟A基單元)序列，如21至23nts長，通常在任一端具有2nt 3’突 出端。為增強(qiáng)體內(nèi)攝取，siRNAs可為綴合的，如綴合至固醇，如膽固醇基團(tuán)(通常在一條或 兩條鏈的3’或5’端)。本發(fā)明進(jìn)一步提供AR mRNA或基因中的靶序列，或其等位變體，特別是相應(yīng)于SEQ ID NOS :2-22的那些，其中相應(yīng)于所述靶序列的反義寡核苷酸能減量調(diào)節(jié)AR。例如，相應(yīng) 于反義寡核苷酸序列SEQ ID NOS 2-22的靶序列分別示于圖4 (粗體和下劃線的，且相應(yīng) 寡聚物SEQ ID NOS如上所示)。變體序列，例如但不限于該靶序列的等位變體(如基因座 Xqll-12處存在的(AR)基因)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。變體序列可具有與AR中的靶序列至 少60 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至 少91 %，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%的序列同源性。通常，對應(yīng)于所述變體 序列的本發(fā)明的寡聚物還能減量調(diào)節(jié)AR。也公開了 LNA寡核苷酸的具體設(shè)計(jì)，例如示于SEQ ID NOS 44-80的那些。本發(fā)明 的寡聚物認(rèn)為是雄激素受體mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的有效的抑制劑。革巴哺乳動(dòng)物雄激素受體優(yōu)選選自人或小鼠雄激素受體。優(yōu)選該哺乳動(dòng)物雄激素受體 為人雄激素受體，如SEQ ID NO 1所示的核酸編碼的雄激素受體。進(jìn)一步的哺乳動(dòng)物雄激 素受體基因(靶)和它們相應(yīng)的蛋白質(zhì)示于下表 應(yīng)認(rèn)識到人的雄激素受體基因顯示一定程度的等位變異，且?guī)追N多態(tài)性識別以上 公開的核酸的GenBank登記號是指cDNA序列而不是指mRNA序列本身。成熟mRNA的序列 可直接從對應(yīng)cDNA序列衍生，此時(shí)胸腺嘧啶堿基(T)被尿嘧啶堿基(U)替換。應(yīng)認(rèn)識到人的雄激素受體基因顯示一定程度的等位變異，且?guī)追N多態(tài)性與疾病表 型相關(guān)(Mooney等人，NAR 15 ;31 (8) 2003)。例如，CAG重復(fù)擴(kuò)增與聚谷氨酰胺擴(kuò)增疾病 (polyglutamine expansion disorder)相關(guān)，其它表征的等位變體包括(GGC)n三核苷酸 重復(fù)，且已鑒定了 R726L、T887A和L710H單核苷酸多態(tài)性，且后兩個(gè)顯示與AR受體對其它 類固醇配體的增強(qiáng)的混雜相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中，η的范圍可為5至31。小于22的CAG 的重復(fù)與African American男性增高的前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，且因此這可能為優(yōu)選的等位變 體。在一些實(shí)施方案中，該靶核酸為包含一個(gè)或多個(gè)單核苷酸多態(tài)性(包括R726L、 T887A和L710H)的AR等位變體。因此，在一些實(shí)施方案中，該靶為包含(CAG) η三核苷酸重復(fù)或(GGC) η三核苷酸重 復(fù)的AR等位變體。
編碼哺乳動(dòng)物雄激素受體的核酸在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中為，人雄激素受體cDNA 序列顯示為SEQ ID NO 1和/或小鼠雄激素受體cDNA序列顯示為SEQ ID NO 81，或其等位 變體。根據(jù)本發(fā)明的寡聚物為反義寡核苷酸。因此，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物的‘靶’為雄激素受體mRNA。該寡聚物當(dāng)引入表達(dá)該雄 激素受體基因的細(xì)胞時(shí)，導(dǎo)致雄激素受體mRNA水平的減少，導(dǎo)致細(xì)胞中雄激素受體的表達(dá) 水平的減少。已知雄激素受體調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，如選自以下的基因蛋白質(zhì)激酶 C5 (PRK⑶)，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶9 2(GSTT2)，瞬時(shí)型受體潛在陽離子通道亞家族V成員 3 (TRPV3)，吡咯啉-5-羧酸還原酶1 (PYCRl)或鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(OAT)-這些基因在此稱 為雄激素受體靶，且因此，在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物可用于調(diào)節(jié)一種或多種 雄激素受體靶在細(xì)胞中的表達(dá)，該細(xì)胞表達(dá)或能表達(dá)(即緩解細(xì)胞中雄激素受體靶的抑制 (通過AR)的情況下)所述雄激素受體靶。靶向雄激素受體mRNA的寡聚物可雜交至沿著靶mRNA核酸的任何位點(diǎn)，如5'未翻 譯的前導(dǎo)序列(leader)、外顯子、內(nèi)含子和3'未翻譯的尾部。然而，優(yōu)選靶向雄激素受體 mRNA的寡聚物雜交至該靶核酸的成熟mRNA形式。適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明的寡聚物能減量調(diào)節(jié)雄激素受體基因的表達(dá)。在這點(diǎn)上，通常在哺 乳動(dòng)物如人細(xì)胞中，本發(fā)明的寡聚物可實(shí)現(xiàn)對雄激素受體的抑制。在一些實(shí)施方案中，本 發(fā)明的寡聚物結(jié)合至該靶核酸且相比于正常表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)至少10%或20%的表達(dá)抑制， 更優(yōu)選相比于正常表達(dá)水平(如緊接給藥寡聚物之前)至少30%，40%，50%，60%，70%， 80%，90%或95%抑制。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)使用0. 04至25nM，如0. 8至20nM濃度的本 發(fā)明的化合物時(shí)觀察到該調(diào)解。在相同或不同實(shí)施方案中，表達(dá)的抑制小于100%，如小于 98 %抑制，小于95 %抑制，小于90 %抑制，小于80 %抑制，如小于70 %抑制。表達(dá)水平的調(diào) 解可通過測量蛋白質(zhì)水平而確定，例如通過以下方法，如SDS-PAGE，然后使用針對該靶蛋白 產(chǎn)生的合適的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。或者，表達(dá)水平的調(diào)解可通過測量mRNA水平確定，例 如通過RNA印跡法或定量的RT-PCR。當(dāng)通過mRNA水平測量，當(dāng)使用合適的劑量，如0. 04至 25nM，如0. 8至20nM濃度時(shí)，減量調(diào)節(jié)的水平在一些實(shí)施方案中通常達(dá)到?jīng)]有本發(fā)明的化 合物的情況下的正常水平的10-20 %的水平。因此本發(fā)明提供在表達(dá)該雄激素受體蛋白和/或mRNA的細(xì)胞中減量調(diào)節(jié)或抑制 雄激素受體蛋白和/或mRNA的表達(dá)的方法，所述方法包括向所述細(xì)胞給藥或使所述細(xì)胞接 觸根據(jù)本發(fā)明的寡聚物或綴合物(合適地以有效量)以在所述細(xì)胞中減量調(diào)節(jié)或抑制雄激 素受體蛋白和/或mRNA的表達(dá)。適當(dāng)?shù)卦摷?xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞如人細(xì)胞。在一些實(shí)施方 案中，給藥或接觸可在體外發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，給藥或接觸可在體內(nèi)發(fā)生。本文使用的術(shù)語“靶核酸”是指編碼哺乳動(dòng)物雄激素受體多肽，如人雄激素受體的 DNA或RNA，如SEQ ID NO :1。編碼雄激素受體的核酸或其天然存在的變體，和從其衍生的 RNA核酸，優(yōu)選mRNA，如前mRNA，盡管優(yōu)選成熟mRNA。在一些實(shí)施方案中，例如當(dāng)在研究或 診斷學(xué)中使用時(shí)，“靶核酸”可為cDNA或衍生自上述DNA或RNA核酸靶的合成的寡核苷酸。 根據(jù)本發(fā)明的寡聚物優(yōu)選能雜交至靶核酸。應(yīng)認(rèn)識到SEQ ID N0:1為cDNA序列，且同樣 地，相應(yīng)于成熟mRNA靶序列，盡管在cDNA序列中尿嘧啶被胸苷替換。術(shù)語“其天然存在的變體”是指核酸序列的雄激素受體多肽的變體，其天然存在于限定的分類群中，如哺乳動(dòng)物，如小鼠、猴，且優(yōu)選人。通常，當(dāng)涉及多核苷酸的“天然存在的 變體”時(shí)，該術(shù)語還可包括任何編碼基因組DNA (其通過染色體易位或復(fù)制存在于染色體X 66. 68-66. 87Mb)和RNA(如其衍生的mRNA)的雄激素受體的等位變體?！疤烊淮嬖诘淖凅w” 還可包括衍生自雄激素受體mRNA的選擇剪接的變體。當(dāng)涉及具體多肽序列時(shí)，例如，該術(shù) 語還包括天然存在形式的蛋白質(zhì)，因此其可進(jìn)行加工，例如通過共翻譯_或翻譯后修飾，如 信號肽裂解、蛋白水解剪切、糖基化等。寡聚物序列該寡聚物包含以下連續(xù)核苷酸序列或由以下連續(xù)核苷酸序列組成，該連續(xù)核苷酸 序列相應(yīng)于SEQ ID NO :1中存在的核苷酸序列的反向補(bǔ)體。因此，該寡聚物可包含或由選 自SEQ ID NOS :2-22和86-106的序列組成，其中所述寡聚物(或其連續(xù)核苷酸部分)相對 所述選擇的序列可任選具有1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)錯(cuò)配。該寡聚物可包含以下連續(xù)核苷酸序列或由以下連續(xù)核苷酸序列組成，該連續(xù)核苷 酸序列完全互補(bǔ)(完美互補(bǔ))于編碼哺乳動(dòng)物雄激素受體的核酸(例如，SEQ ID NO 1)的 等效區(qū)。因此，該寡聚物可包含反義核苷酸序列或由反義核苷酸序列組成。然而，在一些實(shí)施方案中，當(dāng)寡聚物與靶序列雜交且還足以與靶結(jié)合以顯示所需 作用(即下調(diào)靶)時(shí)，該寡聚物可包括1，2，3，或4(或更多)個(gè)錯(cuò)配。錯(cuò)配可通過，例如，增 加寡聚物核苷酸序列的長度和/或增加核苷酸序列中存在的核苷酸類似物(如LNA)的數(shù) 量而補(bǔ)償。在一些實(shí)施方案中，該連續(xù)核苷酸序列當(dāng)雜交至靶序列，如雜交至編碼哺乳動(dòng)物 雄激素受體的核酸的對應(yīng)區(qū)時(shí)，包含不多于3個(gè)，如不多于2個(gè)錯(cuò)配。在一些實(shí)施方案中，該連續(xù)核苷酸序列當(dāng)雜交至靶序列，如雜交至編碼哺乳動(dòng)物 雄激素受體的核酸的對應(yīng)區(qū)時(shí)，包含不多于一個(gè)錯(cuò)配。本發(fā)明的寡聚物的核苷酸序列或連續(xù)核苷酸序列優(yōu)選與選自SEQ ID NOS :2_22 和86-106的相應(yīng)序列至少80%同源，如至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少 93%，至少94%，至少95%，至少96%同源，如100%同源(相同)。本發(fā)明的寡聚物的核苷酸序列或連續(xù)核苷酸序列優(yōu)選與SEQ ID NO :1中存在的 相應(yīng)序列的反向補(bǔ)體至少80%同源，如至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少 93%，至少94%，至少95%，至少96%同源，至少97%同源，至少98%同源，至少99%同源， 如100%同源(相同)。本發(fā)明的寡聚物的核苷酸序列或連續(xù)核苷酸序列優(yōu)選與SEQ ID NO :1中存在的子 序列至少80 %互補(bǔ)，如至少85 %，至少90 %，至少91%，至少92 %，至少93 %，至少94 %，至 少95%，至少96%互補(bǔ)，至少97%互補(bǔ)，至少98%互補(bǔ)，至少99%互補(bǔ)，如100%互補(bǔ)(完
美互補(bǔ))。在一些實(shí)施方案中，該寡聚物(或其連續(xù)核苷酸部分)選自，或包含，選自SEQ ID NOS :2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21和22 的序列之一，或其至 少10個(gè)連續(xù)核苷酸的子序列，其中所述寡聚物(或其連續(xù)核苷酸部分)當(dāng)與所述序列比較 時(shí)可任選包含1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)錯(cuò)配。在一些實(shí)施方案中，該寡聚物(或其連續(xù)核苷酸部分)選自，或包含，選自SEQ ID NOS=86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100，101，102，103，104，105和 106 的序列之一，或其至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的子序列，其中所述寡聚物(或其連續(xù)核苷酸部分) 當(dāng)與所述序列比較時(shí)可任選包含1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)錯(cuò)配。其它優(yōu)選寡聚物包括(連續(xù))核苷酸序列，如長度為12，13，14，15或16個(gè)連續(xù)核 苷酸的序列，其具有選自以下的核苷酸序列選自SEQ ID No 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12， 13，14，15，16，17，18，19，20，21和22的序列，其中所述寡聚物(或其連續(xù)核苷酸部分)相對 所述選擇的序列可任選包含1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)錯(cuò)配。在一些實(shí)施方案中，該子序列可由11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23， 24，25，26，27，28，或29個(gè)連續(xù)核苷酸組成，如12-22個(gè)，如12-18個(gè)核苷酸。適當(dāng)?shù)?，在?些實(shí)施方案中，該子序列與本發(fā)明的寡聚物的連續(xù)核苷酸序列的長度相同。然而，認(rèn)識到，在一些實(shí)施方案中寡聚物的核苷酸序列可包含另外的5’或3’核 苷酸，如，獨(dú)立地，1，2，3，4或5個(gè)另外的核苷酸5’和/或3’，它們不互補(bǔ)于靶序列。在該 方面，本發(fā)明的寡聚物在一些實(shí)施方案中可包含在5’和或3’側(cè)翼有另外的核苷酸的連續(xù) 核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中該另外的5’或3’核苷酸為天然存在的核苷酸，如DNA或 RNA。在一些實(shí)施方案中，該另外的5’或3’核苷酸可表示本文的缺口聚物(gapmer)寡聚 物涉及的D區(qū)。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下核苷酸序列組成或包含以下核苷 酸序列根據(jù)SEQ ID NO 2的核苷酸序列，如SEQ ID NO 44，或其至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的 子序列，如其11，12，13，14，15或16個(gè)連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下核苷酸序列組成或包含以下核苷 酸序列根據(jù)SEQ ID 3的核苷酸序列，如SEQ ID 45，或其至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的子序列， 如其11，12，13，14，15或16個(gè)連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下核苷酸序列組成或包含以下核苷 酸序列根據(jù)SEQ ID 4的核苷酸序列，如SEQ ID NO 46，或其至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的子序 列，如其11，12，13，14，15或16個(gè)連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下核苷酸序列組成或包含以下核苷 酸序列根據(jù)SEQ ID 5的核苷酸序列，如SEQ ID NO 47，或其至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的子序 列，如其11，12，13，14，15或16個(gè)連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下核苷酸序列組成或包含以下核苷 酸序列根據(jù)SEQ ID 6的核苷酸序列，如SEQ ID NO 48，49或50，或其至少10個(gè)連續(xù)核苷 酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16個(gè)連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下核苷酸序列組成或包含以下核苷 酸序列根據(jù)SEQ ID 7的核苷酸序列，如SEQ ID NO 51，52，或53，或其至少10個(gè)連續(xù)核苷 酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16個(gè)連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下核苷酸序列組成或包含以下核苷 酸序列根據(jù)SEQ ID 8的核苷酸序列，如SEQ ID 54，55或56，或其至少10個(gè)連續(xù)核苷酸 的子序列，如其11，12，13，14，15或16個(gè)連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下核苷酸序列組成或包含以下核苷 酸序列根據(jù)SEQ ID 9的核苷酸序列，如SEQ ID 57，或其至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的子序列， 如其11，12，13，14，15或16個(gè)連續(xù)核苷酸。
在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下核苷酸序列組成或包含以下核苷 酸序列根據(jù)SEQ ID 10的核苷酸序列，如SEQ ID 58，59，或60，或其至少10個(gè)連續(xù)核苷酸 的子序列，如其11，12，13，14，15或16個(gè)連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下核苷酸序列組成或包含以下核苷 酸序列根據(jù)SEQ ID 11的核苷酸序列，如SEQ ID 61，或其至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的子序列， 如其11，12，13，14，15或16個(gè)連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下核苷酸序列組成或包含以下核苷 酸序列根據(jù)SEQ ID 12的核苷酸序列，如SEQ ID 62，或其至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的子序列， 如其11，12，13，14，15或16個(gè)連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下核苷酸序列組成或包含以下核苷 酸序列根據(jù)SEQ ID 13的核苷酸序列，如SEQ ID 63，64或65，或其至少10個(gè)連續(xù)核苷酸 的子序列，如其11，12，13，14，15或16個(gè)連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下核苷酸序列組成或包含以下核苷 酸序列根據(jù)SEQ ID 14的核苷酸序列，如SEQ ID 66，或其至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的子序列， 如其11，12，13，14，15或16個(gè)連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下核苷酸序列組成或包含以下核苷 酸序列根據(jù)SEQ ID 15的核苷酸序列，如SEQ ID 67，或其至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的子序列， 如其11，12，13，14，15或16個(gè)連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下核苷酸序列組成或包含以下核苷 酸序列根據(jù)SEQ ID 16的核苷酸序列，如SEQ ID 68，或其至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的子序列， 如其11，12，13，14，15或16個(gè)連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下核苷酸序列組成或包含以下核苷 酸序列根據(jù)SEQ ID 17的核苷酸序列，如SEQ ID 69，70或71，或其至少10個(gè)連續(xù)核苷酸 的子序列，如其11，12，13，14，15或16個(gè)連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下核苷酸序列組成或包含以下核苷 酸序列根據(jù)SEQ ID 18的核苷酸序列，如SEQ ID 72，或其至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的子序列， 如其11，12，13，14，15或16個(gè)連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下核苷酸序列組成或包含以下核苷 酸序列根據(jù)SEQ ID 19的核苷酸序列，如SEQ ID 73，74或75，或其至少10個(gè)連續(xù)核苷酸 的子序列，如其11，12，13，14，15或16個(gè)連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下核苷酸序列組成或包含以下核苷 酸序列根據(jù)SEQ ID 20的核苷酸序列，如SEQ ID 76，或其至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的子序列， 如其11，12，13，14，15或16個(gè)連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下核苷酸序列組成或包含以下核苷 酸序列根據(jù)SEQ ID 21的核苷酸序列，如SEQ ID 77，78或79，或其至少10個(gè)連續(xù)核苷酸 的子序列，如其11，12，13，14，15或16個(gè)連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下核苷酸序列組成或包含以下核苷 酸序列根據(jù)SEQ ID 22的核苷酸序列，如SEQ ID 80，或其至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的子序列， 如其11，12，13，14，15或16個(gè)連續(xù)核苷酸。
當(dāng)確定本發(fā)明的寡聚物(或連續(xù)核苷酸序列)和編碼哺乳動(dòng)物雄激素受體的核酸 或其反向補(bǔ)體(如本文公開的那些)之間的“同源性”時(shí)，同源性可用本發(fā)明化合物的對應(yīng) 核苷酸序列和編碼哺乳動(dòng)物雄激素受體的核酸(或靶核酸)的對應(yīng)區(qū)或其反向補(bǔ)體通過簡 單比對(alignment)而確定，且同源性通過計(jì)數(shù)對齊(align)的堿基數(shù)并除以本發(fā)明的化 合物中的連續(xù)核苷酸的總數(shù)，再乘以100而確定。在該比較中，如果存在缺口(gaps)，優(yōu)選 該缺口僅為錯(cuò)配而不是下述區(qū)域，其中缺口內(nèi)核苷酸數(shù)在本發(fā)明的核苷酸序列和靶核酸之 間不同。術(shù)語"對應(yīng)于"和"相應(yīng)于"是指寡聚物的核苷酸序列或連續(xù)核苷酸序列(第 一序列)與另一序列的等效連續(xù)核苷酸序列的比較，該另一序列的等效連續(xù)核苷酸序列選 自i)核酸靶的反向補(bǔ)體的子序列，如編碼雄激素受體蛋白的mRNA JnSEQ ID而1，和/或 )本文提供的核苷酸的序列，如選自SEQ ID NOS :2_22和86-106，或其子序列。核苷酸類 似物直接與它們的等效或?qū)?yīng)核苷酸比較。在i)或ii)下對應(yīng)于另一序列的第一序列通 常在第一序列(如連續(xù)核苷酸序列)的整個(gè)長度上等同于該序列，或如本文所述，在一些實(shí) 施方案中，可與相應(yīng)序列至少80 %同源，如至少85 %，至少90 %，至少91 %，至少92 %，至少 93%，至少94%，至少95%，至少96%同源，至少97%同源，至少98%同源，至少99%同源， 如100%同源(相同)。術(shù)語"相應(yīng)核苷酸類似物"和"相應(yīng)核苷酸"是指核苷酸類似物和天然存在的 核苷酸中的核苷酸是相同的。例如，當(dāng)核苷酸的2-脫氧核糖單元連接至腺嘌呤時(shí)，該"相 應(yīng)核苷酸類似物"包含連接至腺嘌呤的戊糖單元(不同于2-脫氧核糖)。長度該寡聚物包含長度總共為10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，
25，26，27，28，29或30個(gè)連續(xù)核苷酸的連續(xù)核苷酸序列，或由上述連續(xù)核苷酸序列組成。在一些實(shí)施方案中，該寡聚物包含長度總共為10-22，如12-18，如13_17或12_16， 如13，14，15，16個(gè)連續(xù)核苷酸的連續(xù)核苷酸序列，或由上述連續(xù)核苷酸序列組成。在一些實(shí)施方案中，該寡聚物包含長度總共為10，11，12，13，或14個(gè)連續(xù)核苷酸 的連續(xù)核苷酸序列，或由上述連續(xù)核苷酸序列組成。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由不超過22個(gè)核苷酸，如不超過20個(gè)核 苷酸，如不超過18個(gè)核苷酸，如15，16或17個(gè)核苷酸組成。在一些實(shí)施方案中本發(fā)明的寡 聚物包含小于20個(gè)核苷酸。核苷酸類似物本文所用的術(shù)語“核苷酸”是指包含糖部分、堿基部分和共價(jià)連接的磷酸酯基的糖 苷，且包括天然存在的核苷酸和包含修飾的糖和/或堿基部分的非天然存在的核苷酸，該 天然存在的核苷酸如DNA或RNA，優(yōu)選DNA，包含修飾的糖和/或堿基部分的非天然存在的 核苷酸在此也稱為“核苷酸類似物”。非天然存在的核苷酸包括具有修飾的糖部分的核苷酸，如雙環(huán)核苷酸或2’修飾的 核苷酸，如2’取代的核苷酸?！昂塑账犷愃莆铩睘樘烊缓塑账崛鏒NA或RNA核苷酸的變體，其經(jīng)過在糖和/或 堿基部分的修飾。在寡核苷酸的情況下類似物可以原則上僅僅“沉默(silent)”或“等效 (equivalent) ”于天然核苷酸，即對于寡核苷酸抑制靶基因表達(dá)的作用方式?jīng)]有功能上的O=P-N ^ \
嗎啉代
2'-(3-羥基)丙基
3'-氨基騎酸酯 (Phosphoramidate)
O=P-BH3" 棚烷碌酸酯(Boranophosphates) 方案1因此該寡聚物可包含以下或由以下組成天然存在的核苷酸-優(yōu)選2’_脫氧核苷 酸(在此通常稱為“DNA”)的簡單序列，但也可為核糖核苷酸(在此通常稱為“RNA”)，或該 天然存在的核苷酸和一種或多種非天然存在的核苷酸(即核苷酸類似物)的組合。該核苷 酸類似物可適當(dāng)?shù)卦鰪?qiáng)寡聚物對于靶序列的親和力。合適的和優(yōu)選的核苷酸類似物的實(shí)例通過PCT/DK2006/000512提供或在其中涉及。在寡聚物中加入增強(qiáng)親和力的核苷酸類似物，如LNA或2’-取代的糖，可使特異結(jié) 合寡聚物的尺寸減小，還可將上限減少至非特異或異常結(jié)合發(fā)生前寡聚物的尺寸。在一些實(shí)施方案中，該寡聚物包含至少2個(gè)核苷酸類似物。在一些實(shí)施方案中，該 寡聚物包含3-8個(gè)核苷酸類似物，例如6或7個(gè)核苷酸類似物。在迄今最優(yōu)選的實(shí)施方案 中，所述核苷酸類似物的至少一個(gè)為鎖核酸(LNA)；例如至少3或至少4，或至少5，或至少 6，或至少7，或8個(gè)核苷酸類似物可為LNA。在一些實(shí)施方案中所有核苷酸類似物可為LNA。
影響。如果例如，它們更容易制備或制備更廉價(jià)，或?qū)Υ婊蛑苽錀l件更穩(wěn)定，或表示標(biāo)簽 或標(biāo)記，這種“等效”類似物還是可以使用的。然而，優(yōu)選地，該類似物將對寡聚物抑制表 達(dá)的方式有功能上的影響；例如通過產(chǎn)生增加的對靶的結(jié)合親和力和/或增加的對細(xì)胞內(nèi) 核酸酶的抗性和/或更方便性地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞。核苷類似物的具體實(shí)例描述于例如Freier & Altmann ；Nucl.Acid Res. ，1997，25，4429—4443 禾口 Uhlmann ；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3 (2)，293-213，和方案 1
疏代麟酸酯 (Phosphorthioate)
NH2
2'-AP
HNA
CeNA
PNA
B
O
(
O
KoV 0W
-B
/Wo
Y0T
應(yīng)認(rèn)識到當(dāng)提及優(yōu)選的核苷酸序列基序或核苷酸序列(其僅由核苷酸組成)，由 該序列限定的本發(fā)明的寡聚物可包含相應(yīng)的核苷酸類似物以代替所述序列中存在的一個(gè) 或多個(gè)核苷酸，如LNA單元或其它核苷酸類似物，其增加寡聚物/靶雙鏈體的雙鏈穩(wěn)定性/ Tffl (即增強(qiáng)親和力的核苷酸類似物)。在一些實(shí)施方案中，寡聚物的核苷酸序列和靶序列之間的任何錯(cuò)配優(yōu)選在增強(qiáng)親 和力的核苷酸類似物之外的區(qū)域，如在本文所述的B區(qū)內(nèi)，和/或在本文所述的D區(qū)內(nèi)，和/ 或在非修飾的位點(diǎn)如寡核苷酸中的DNA核苷酸，和/或在連續(xù)核苷酸序列的5’或3’的區(qū)。核苷酸的這些修飾的實(shí)例包括修飾糖部分以提供2’_取代基或產(chǎn)生橋接的(鎖核 酸)結(jié)構(gòu)，其增強(qiáng)結(jié)合親和力且也可提供增加的核酸酶抗性。優(yōu)選的核苷酸類似物為LNA，如氧基-LNA(如β-D-氧基-LNA，和α-L-氧 基-LNA)，和/或氨基-LNA (如β -D-氨基-LNA和α -L-氨基-LNA)和/或硫基-LNA (如 β -D-硫基-LNA和α -L-硫基-LNA)和/或ENA (如β -D-ENA和α -L-ENA)。最優(yōu)選的為 β -D-氧基-LNA。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚物中存在的核苷酸類似物(如在本文提及的A 和C區(qū)中)獨(dú)立地選自，例如2，-0_烷基-RNA單元，2，-氨基-DNA單元，2，-氟-DNA單元， LNA單元，阿糖核酸(ANA)單元，2，-氟-ANA單元，HNA單元，INA (嵌入核酸(intercalating nucleic acid) -Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 200230 :4918_4925，在此引入作為參 考)單元和2’ MOE單元。在一些實(shí)施方案中，僅有一種上述類型的核苷酸類似物存在于本 發(fā)明的寡聚物或其連續(xù)核苷酸序列中。在一些實(shí)施方案中，該核苷酸類似物為2’ -0-甲氧基乙基_RNA(2’ Μ0Ε)， 2’ -氟-DNA單體或LNA核苷酸類似物，因此本發(fā)明的寡核苷酸可包括獨(dú)立地選自這三種 類型類似物的核苷酸類似物，或可包括選自這三種類型類似物中的僅一種類型。在一些 實(shí)施方案中，所述核苷酸類似物的至少一種為2’ M0E-RNA，如2，3，4，5，6，7，8，9或10個(gè) 2’-MOE-RNA核苷酸單元。在一些實(shí)施方案中，所述核苷酸類似物的至少一種為2’-氟DNA， 如2，3，4，5，6，7，8，9或10個(gè)2，-氟-DNA核苷酸單元。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物包含至少一個(gè)鎖核酸(LNA)單元，如1， 2，3，4，5，6，7，或8個(gè)LNA單元，如3_7或4至8個(gè)LNA單元，或3，4，5，6或7個(gè)LNA單元。在 一些實(shí)施方案中，所有核苷酸類似物為LNA。在一些實(shí)施方案中，該寡聚物可包含β-D-氧 基-LNA和一種或多種以下LNA單元兩者β -D或α -L構(gòu)型的硫基-LNA、氨基-LNA、氧 基-LNA、和/或ENA或其組合。在一些實(shí)施方案中，所有LNA胞嘧啶單元為5’甲基-胞嘧 啶。在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，該寡聚物可包含LNA和DNA單元兩者。優(yōu)選LNA和DNA單 元的組合總共為10-25，優(yōu)選10-20，甚至更優(yōu)選12-16。在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，寡聚物 的核苷酸序列，如連續(xù)核苷酸序列由至少一個(gè)LNA組成，且剩余核苷酸單元為DNA單元。在 一些實(shí)施方案中，該寡聚物僅包含LNA核苷酸類似物和天然存在的核苷酸(如RNA或DNA， 最優(yōu)選DNA核苷酸)，任選具有修飾的核苷酸間連接如硫代磷酸酯(phosphorothioate)。術(shù)語“核堿基”是指核苷酸的堿基部分且包括天然存在的以及非天然存在的變體。 因此，“核堿基”不僅包括已知的嘌呤和嘧啶雜環(huán)，而且包括雜環(huán)類似物及其互變異構(gòu)體。核堿基的實(shí)例包括，但不限于腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶，胸苷，尿嘧啶，黃嘌呤，次黃 嘌呤，5-甲基胞嘧啶，異胞嘧啶，假異胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，6-氨基嘌呤，
152-氨基嘌呤，肌苷，二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。在一些實(shí)施方案中，寡聚物中存在的核堿基的至少一個(gè)為修飾的核堿基，其選自 5_甲基胞嘧啶，異胞嘧啶，假異胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，6-氨基嘌呤，2-氨基 嘌呤，肌苷，二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。LNA術(shù)語“LNA”是指雙環(huán)核苷酸類似物，稱為“鎖核酸(Locked Nucleic acid)”。其 可表示LNA單體，或當(dāng)在“LNA寡核苷酸”的環(huán)境中使用時(shí)是指包含一種或多個(gè)該雙環(huán)核苷 酸類似物的寡聚物。本發(fā)明的寡核苷酸化合物中使用的LNA優(yōu)選具有通式I的結(jié)構(gòu)，及其堿加成鹽 (basic salts)和酸加成鹽 其中X 選自-0-、-S-、-N(Rn*)-、-C(R6R6*)-；B選自氫、任選取代的Cy-烷氧基、任選取代的CV4-烷基、任選取代的Cy-?；?氧基、核堿基、DNA嵌入劑、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、報(bào)道基(import groups) 和配體；P表示與在后的單體之間的核苷間連接的基團(tuán)位置，或5' _末端基團(tuán)，該核苷間 連接或5'-末端基團(tuán)任選包括取代基R5或等同適用取代基Rw ；P*表示與在前的單體的核苷間連接，或3'-末端基團(tuán)；R4*和R2* —起表示由1-4個(gè)選自下列的基團(tuán)/原子組成的二價(jià)基 團(tuán)-C (RaRb) -，-C (Ra) = C (Rb) -，-C (Ra) = N-, _0_，-Si (Ra) 2_，-S-, -SO2-, -N (Ra)-和〉C = Z,其中Z選自-0-、-S-和-N (Ra) _，且Ra和Rb各自獨(dú)立地選自氫、任選取代的C^12-烷 基、任選取代的C2_12-烯基、任選取代的c2_12-炔基、羥基、CV12-烷氧基、c2_12-烷氧基烷基、 c2_12-烯基氧基、羧基、CV12-烷氧基羰基、CV12-烷基羰基、甲?；?、芳基、芳基氧基-羰基、 芳基氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳基氧基-羰基、雜芳基氧基、雜芳基羰基、氨基、單和二 ((V6-烷基)氨基、氨基甲?；?、單和二(Cp6-烷基)-氨基-羰基、氨基-Cu-烷基-氨基羰 基、單和二(Cu-烷基)氨基-CV6-烷基-氨基羰基、CV6-烷基-羰基氨基、脲基、Cu-烷酰 基氧基、磺基(sulphono)、CV6-烷基磺?；趸?、硝基、疊氮基、硫基(sulphanyl)、Cp6-烷 基硫基、鹵素、DNA嵌入劑、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、報(bào)道基和配體，其中芳基 和雜芳基可任選被取代，且其中兩個(gè)成對的(geminal)取代基Ra和Rb—起可表示任選取代 的亞甲基(=CH2)，且存在的取代基R1*、R2、R3、R5、R8*、R6和R6*各自獨(dú)立地選自氫、任選取 代的CV12-烷基、任選取代的C2_12-烯基、任選取代的C2_12-炔基、羥基、Ci_12-烷氧基、C2_12-烷 氧基烷基、C2_12-烯基氧基、羧基、C1^12-烷氧基羰基、C1^12-烷基羰基、甲?；?、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳基氧基-羰基、雜芳基氧基、雜芳基羰基、氨基、 單和二((V6-烷基)氨基、氨基甲酰基、單和二沁_(dá)6-烷基)_氨基-羰基、氨基-Cp6-烷 基_氨基羰基、單和二沁_(dá)6_烷基)氨基-Cu-烷基_氨基羰基、C1^6-烷基_羰基氨基、脲 基、CV6-烷?；趸⒒腔?、Cp6-烷基磺酰基氧基、硝基、疊氮基、硫基(sulphanyl) ,C1^6-烷 基硫基、鹵素、DNA嵌入劑、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、報(bào)道基和配體、其中芳基 和雜芳基可任選被取代，且其中兩個(gè)成對的取代基一起可表示氧代、硫代、亞氨基或任選取 代的亞甲基，或一起可形成由1-5個(gè)碳原子亞烷基鏈組成的螺環(huán)二價(jià)基團(tuán)，所述亞烷基鏈 任選插入一個(gè)或多個(gè)雜原子/基團(tuán)和/或被一個(gè)或多個(gè)雜原子/基團(tuán)終止，所述雜原子/ 基團(tuán)選自-o-、-s-和-(NRn)-，其中『選自氫和CV4-烷基，且其中兩個(gè)相鄰的(非成對的) 取代基可表示另一鍵，導(dǎo)致形成雙鍵；且當(dāng)存在且不涉及二價(jià)基團(tuán)時(shí)，選自氫和CV4-烷 基；在一些實(shí)施方案中，R5*選自 H，-CH3, -CH2-CH3, -CH2-O-CH3 和-CH = CH2。在一些實(shí)施方案中，R4*和R2*—起表示二價(jià)基團(tuán)，其選自-C(RaRb)-O-, -C(RaRb)-C (RcRd) -0-，-C (RaRb) -C (RcRd) -C (ReRf) _0_，-C (RaRb) -O-C (RcRd) -，-C (RaRb) -O-C (RcRd) _0_，-C (RaR b) -C (RcRd) -，-C (RaRb) -C (RcRd) -C (ReRf) -，-C (Ra) = C (Rb) -C (RcRd) -，-C (RaRb) -N (Rc) -，-C (RaR b) -C (RcRd) -N (Re) -，-C (RaRb) -N (Rc) -0-和-C (RaRb) -S-, -C (RaRb) -C (RcRd) _S_，其中 Ra，Rb，Rc， Rd，Re和Rf各自獨(dú)立地選自氫，任選取代的Ch2-烷基，任選取代的C2_12-烯基，任選取代 的C2_12-炔基，羥基，C1^12-烷氧基，C2_12-烷氧基烷基，C2_12-烯基氧基，羧基，C1^12-烷氧基羰 基，C1^12-烷基羰基，甲?；?，芳基，芳基氧基_羰基，芳基氧基，芳基羰基，雜芳基，雜芳基氧 基-羰基，雜芳基氧基，雜芳基羰基，氨基，單和二((V6-烷基)氨基，氨基甲?；?，單和二 ((V6-烷基)_氨基-羰基，氨基-Ch-烷基-氨基羰基，單和二沁_(dá)6-烷基)氨基-Cu-烷 基_氨基羰基，C1^6-烷基-羰基氨基，脲基，C1^6-烷酰基氧基，磺基，CV6-烷基磺?；趸?， 硝基，疊氮基，硫基，Cp6-烷基硫基，鹵素，DNA嵌入劑，光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合 基、報(bào)道基和配體，其中芳基和雜芳基可任選被取代，且其中兩個(gè)成對的取代基Ra* Rb —起 可表示任選取代的亞甲基(=CH2)，在另一實(shí)施方案中，R4*和R2*—起表示二價(jià)基團(tuán)(bivalent group)，其選自-CH2-0-，-CH2-S-, -CH2-NH-, -CH2-N (CH3) _，-CH2-CH2-O-, -CH2-CH (CH3) _，-CH2-CH2-S-, -CH2-CH2-NH-,-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -CH2-CH2-CH (CH3)-,-CH = CH-CH2-, -CH2-O-CH2-O-, -CH2-NH-0-，-CH2-N(CH3) -0-, -CH2-O-CH2-, -CH(CH3) -0-, -CH(CH2-O-CH3) _0_。對于所有手性中心，不對稱的基團(tuán)可為R或S取向。優(yōu)選地，本發(fā)明的寡聚物中使用的LNA包括至少一個(gè)根據(jù)任一下式的LNA單元 其中Y為-0-、-O-CH2-, -S-、-NH-或N(Rh) ；Z和t獨(dú)立地選自核苷酸間連接、末 端基團(tuán)或保護(hù)基；B構(gòu)成天然或非天然核苷酸堿基部分，且Rh選自氫和Cy-烷基。
特別優(yōu)選的LNA單元示于方案2 方案2術(shù)語〃硫基-LNA"包括其中上述通式中的Y選自S或-CH2-S-的鎖核苷酸。硫 基-LNA可為β -D禾Π α -L-構(gòu)型。術(shù)語〃氨基-LNA 〃是指其中上述通式中的Y選自-N(H)-、N(R)-, CH2-N(H)-和-CH2-N(R)-(其中R選自氫和Ch-烷基)的鎖核苷酸。氨基-LNA可為β-D 和a-L-構(gòu)型。術(shù)語〃氧基-LNA〃是指其中上述通式中的Y表示-0-或-CH2-O-的鎖核苷酸。氧 基-LNA可為β -D禾Π α -L-構(gòu)型。術(shù)語〃 ΕΝΑ"是指其中上述通式中的Y為-CH2-O-(其中-CH2-O-的氧原子連接至 相對堿基B的2’ -位)的鎖核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，LNA選自β -D-氧基-LNA、α -L-氧基-LNA、β -D-氨基-LNA 和β -D-硫基-LNA，特別是β -D-氧基-LNA。RNAse 募集RNase介導(dǎo)的靶mRNA的降解起作用，如通過翻譯的 位阻，或其它方法，然而，本發(fā)明優(yōu)選的寡聚物能募集核糖核酸內(nèi)切酶(RNase) ^RNase H。優(yōu)選該寡聚物或連續(xù)核苷酸序列，包含至少6個(gè)，如至少7個(gè)連續(xù)核苷酸單元，如 至少8或至少9個(gè)連續(xù)核苷酸單元(殘基)，包括7，8，9，10，11，12，13，14，15或16個(gè)連續(xù) 核苷酸的區(qū)域，當(dāng)其與互補(bǔ)靶RNA形成雙鏈體時(shí)能募集RNase。能募集RNAse的連續(xù)序列可 為本文所述的缺口聚物(gapmer)段落中涉及的B區(qū)。在一些實(shí)施方案中，能募集RNAse的 連續(xù)序列(如B區(qū))的尺寸可更大，如10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20個(gè)核苷酸單兀。EP 1222309提供了體外測定RNaseH活性的方法，其可用于測定募集RNaseH的 能力。使用EP 1222309的實(shí)施例91-95提供的方法，如果當(dāng)提供互補(bǔ)RNA靶時(shí)具有的 初始速率(以pmol/1/min測量)為等效的僅含DNA的寡核苷酸(equivalent DNA only oligonucleotide)的至少1%，如至少5%，如至少10%或少于20%，該等效僅含DNA的寡 核苷酸沒有2’取代，且在寡核苷酸中的所有核苷酸間具有硫代磷酸酯連接基，則認(rèn)為該寡 聚物能募集RNaseH。在一些實(shí)施方案中，使用EP 1 222 309的實(shí)施例91_95提供的方法，如果當(dāng)提供 互補(bǔ)RNA靶和RNaseH時(shí)，該RNaseH初始速率(以pmol/1/min測量)少于使用等效僅含DNA 的寡核苷酸測定的初始速率的1%，如少于5%，如少于10%或少于20%，該等效僅含DNA 的寡核苷酸沒有2’取代，且在寡核苷酸中的所有核苷酸間具有硫代磷酸酯連接基，則認(rèn)為 該寡聚物基本不能募集RNase H。在其它實(shí)施方案中，使用EP 1 222 309的實(shí)施例91_95提供的方法，如果當(dāng)提供 互補(bǔ)RNA靶和RNaseH時(shí)，該RNaseH初始速率(以pmol/1/min測量)，為使用等效僅含DNA 的寡核苷酸測定的初始速率的至少20 %，如至少40 %，如至少60 %，如至少80 %，該等效僅 含DNA的寡核苷酸，沒有2’取代，且在寡核苷酸中的所有核苷酸間具有硫代磷酸酯連接基， 則認(rèn)為該寡聚物能募集RNase H。通常，形成連續(xù)核苷酸單元的寡聚物的區(qū)域，當(dāng)與互補(bǔ)靶RNA形成雙鏈體時(shí)，能募 集由核苷酸單元(其與RNA靶形成DNA/RNA狀的雙鏈體)組成的RNase-且包括α -L構(gòu)型 的DNA單元和LNA單元，特別優(yōu)選為α -L-氧基LNA。本發(fā)明的寡聚物可包含核苷酸序列，其包括核苷酸和核苷酸類似物，且可為缺口 聚物(gapmer)、頭聚物(headmer)或混合聚物(mixmer)的形式。頭聚物如下定義在5’ -端的連續(xù)的一段非_募集RNase的核苷酸類似物，接著 直到3’-端的連續(xù)的一段可由RNAse識別和裂解的DNA或修飾的核苷酸單元(如至少7個(gè) 該核苷酸)，而尾聚物(tailmer)如下定義在5’-端的連續(xù)的一段可由RNAse識別和裂解 的DNA或修飾的核苷酸(如至少7個(gè)該核苷酸)，接著直到3’ -端的連續(xù)的一段非_募集 RNase的核苷酸類似物。其它根據(jù)本發(fā)明的嵌合體，稱為“混合聚物”，其由下述交替組分構(gòu) 成可由RNAse識別和裂解的DNA或修飾的核苷酸，和非-募集RNase的核苷酸類似物。一 些核苷酸類似物也能介導(dǎo)RNaseH結(jié)合和裂解。因?yàn)棣?L-LNA募集RNaseH活性到一定程 度，可能需要可由RNaseH識別和裂解的DNA或修飾的核苷酸的較小缺口區(qū)(gap)用于缺口 聚物構(gòu)建體，且混合聚物構(gòu)建中會引入更多的柔性(flexibility)。缺口聚物設(shè)計(jì)
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優(yōu)選地，本發(fā)明的寡聚物是缺口聚物。缺口聚物寡聚物是包含一段連續(xù)的核苷酸 的寡聚物(該核苷酸能募集RNAse，如RNAseH)，如至少6或7個(gè)DNA核苷酸的區(qū)域，在本文 稱為B區(qū)，其中B區(qū)在5’和3’都側(cè)翼有增強(qiáng)親和力的核苷酸類似物的區(qū)域，如1-6個(gè)核苷 酸類似物，5’和3’連接至一段連續(xù)的能募集RNAse的核苷酸-這些區(qū)分別稱為A區(qū)和C 區(qū)。優(yōu)選該缺口聚物包含下式的(多)核苷酸序列(5’至3’)A-B_C，或任選A-B-C-D 或D-A-B-C，其中；A區(qū)(5’區(qū))由以下組成或包含以下至少一個(gè)核苷酸類似物，如至少一 個(gè)LNA單元，如1-6個(gè)核苷酸類似物，如LNA單元，和；B區(qū)由以下組成或包含以下至少5 個(gè)能募集RNAse (當(dāng)與互補(bǔ)RNA分子，如mRNA靶形成雙鏈體時(shí))的連續(xù)核苷酸，如DNA核苷 酸，和；C區(qū)(3’區(qū))由以下組成或包含以下至少一個(gè)核苷酸類似物，如至少一個(gè)LNA單 元，如1-6個(gè)核苷酸類似物，如LNA單元，和；D區(qū)，當(dāng)存在時(shí)由以下組成或包含以下1，2或 3個(gè)核苷酸單元，如DNA核苷酸。在一些實(shí)施方案中，A區(qū)由1，2，3，4，5或6個(gè)核苷酸類似物(如LNA單元)組成， 如2-5個(gè)核苷酸類似物，如2-5個(gè)LNA單元，如3或4個(gè)核苷酸類似物，如3或4個(gè)LNA單 元；和/或C區(qū)由1，2，3，4，5或6個(gè)核苷酸類似物(如LNA單元)組成，如2_5個(gè)核苷酸類 似物，如2-5個(gè)LNA單元，如3或4個(gè)核苷酸類似物，如3或4個(gè)LNA單元。在一些實(shí)施方案中，B由以下組成或包含以下5，6，7，8，9，10，11或12個(gè)能募集 RNAse的連續(xù)核苷酸，或6-10，或7-9，如8個(gè)能募集RNAse的連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方案 中，B區(qū)由以下組成或包含以下至少一個(gè)DNA核苷酸單元，如1-12個(gè)DNA單元，優(yōu)選4_12 個(gè)DNA單元，更優(yōu)選6-10個(gè)DNA單元，如7_10個(gè)DNA單元，最優(yōu)選8，9或10個(gè)DNA單元。在一些實(shí)施方案中，A區(qū)由3或4個(gè)核苷酸類似物(如LNA)組成，B區(qū)由7，8， 9或10個(gè)DNA單元組成，且C區(qū)由3或4個(gè)核苷酸類似物(如LNA)組成。這些設(shè)計(jì)包括 (A-B-C)3-10-3，3-10-4，4-10-3，3—9—3，3—9—4，4—9—3，3—8—3，3—8—4，4—8—3，3—7—3，3—7—4， 4-7-3，且可進(jìn)一步包括D區(qū)，其可具有1個(gè)或2個(gè)核苷酸單元，如DNA單元。其它缺口聚物設(shè)計(jì)公開于W02004/046160且在此引入作為參考。美國臨時(shí)申請，60/977409，在此引入作為參考，涉及‘短聚物(shortmer)，缺口聚 物寡聚物，在一些實(shí)施方案中，其可為本發(fā)明的缺口聚物寡聚物。在一些實(shí)施方案中，該寡聚物由總共10，11，12，13或14個(gè)核苷酸單元的連續(xù)核苷 酸序列組成，其中該連續(xù)核苷酸序列為式(5’ -3’)，A-B-C，或任選A-B-C-D或D-A-B-C，其 中；A由1，2或3個(gè)核苷酸類似物單元(如LNA單元)組成；B由7，8或9個(gè)連續(xù)核苷酸單 元組成，當(dāng)與互補(bǔ)RNA分子(如mRNA靶)形成雙鏈體時(shí)，所述核苷酸單元能募集RNAse ；且 C由1，2或3個(gè)核苷酸類似物單元(如LNA單元)組成。當(dāng)存在時(shí)，D由單一 DNA單元組 成。在一些實(shí)施方案中，A由1個(gè)LNA單元組成。在一些實(shí)施方案中，A由2個(gè)LNA單元 組成。在一些實(shí)施方案中，A由3個(gè)LNA單元組成。在一些實(shí)施方案中，C由1個(gè)LNA單元組 成。在一些實(shí)施方案中，C由2個(gè)LNA單元組成。在一些實(shí)施方案中，C由3個(gè)LNA單元組 成。在一些實(shí)施方案中，B由7個(gè)核苷酸單元組成。在一些實(shí)施方案中，B由8個(gè)核苷酸單 元組成。在一些實(shí)施方案中，B由9個(gè)核苷酸單元組成。在一些實(shí)施方案中，B包含1-9個(gè) DNA單元，如2，3，4，5，6，7或8個(gè)DNA單元。在一些實(shí)施方案中，B由DNA單元組成。在一些
20實(shí)施方案中，B包含至少一個(gè)0-14勾型的11^單元，如2，3，4，5，6，7，8或9個(gè)α-L-構(gòu)型的 LNA單元。在一些實(shí)施方案中，B包含至少一個(gè)α-L-氧基LNA單元或其中所有α-L-構(gòu)型 的LNA單元為α-L-氧基LNA單元。在一些實(shí)施方案中，A_B_C中存在的核苷酸數(shù)選自(核 苷酸類似物單元-B區(qū)-核苷酸類似物單元):1-8-1，1-8-2，2-8-1，2-8-2，3-8-3，2-8-3， 3-8-2，4-8-1，4-8-2，1-8-4,2-8-4，或；1—9—1，1—9—2，2—9—1，2—9—2，2—9—3，3—9—2，1—9—3， 3-9-1,4-9-1,1-9-4，或；1-10-1,1_10_2，2-10—1，2-10—2，1_10_3，3-10-1。在一些實(shí)施方 案中，A-B-C 中的核苷酸數(shù)選自-.2-7-1,1-7-2，2-7-2，3-7-3，2-7-3，3-7-2，3-7-4 和 4-7-3。 在一些實(shí)施方案中，A和C各自都由兩個(gè)LNA單元組成，且B由8或9個(gè)核苷酸單元，優(yōu)選 DNA單元組成。核苷酸間連接術(shù)語〃連接基〃或“核苷酸間連接(internucleotide linkage) ”是指能將兩個(gè)核 苷酸、兩個(gè)核苷酸類似物、以及核苷酸和核苷酸類似物等共價(jià)結(jié)合在一起的基團(tuán)。具體且優(yōu) 選的實(shí)例包括磷酸酯基(phosphate group)和硫代磷酸酯基(phosphorothioate)。本發(fā)明的寡聚物或其連續(xù)核苷酸序列的核苷酸通過連接基結(jié)合在一起。合適地， 各核苷酸通過連接基連接至3’鄰近的核苷酸。合適的核苷酸間連接包括列于PCT/DK2006/000512的那些，例如列于PCT/ DK2006/000512的第34頁第一段的核苷酸間連接(在此引入作為參考)。也就是說，在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選將核苷酸間連接從其正常磷酸二酯修飾為對 核酸酶攻擊更有抗性的基團(tuán)，如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯(boranophosphate)-這兩個(gè)可 被RNase H裂解，也產(chǎn)生在減少靶基因的表達(dá)中反義抑制的途徑。本文提供的合適的含硫(S)核苷酸間連接可為優(yōu)選的。硫代磷酸酯核苷酸間連接 也是優(yōu)選的，尤其對于缺口聚物的缺口(gap)區(qū)(B)。硫代磷酸酯連接也可用于側(cè)翼區(qū)(A 和C，和用于將A或C連接至D，和在D區(qū)內(nèi)，視情況而定)。然而A、B和C區(qū)可包含除硫代磷酸酯外的其它核苷酸間連接，如磷酸二酯連接，特 別地，例如當(dāng)使用核苷酸類似物防止A和C區(qū)內(nèi)的核苷酸間連接被內(nèi)切核酸酶降解-如當(dāng) A和C區(qū)包含LNA核苷酸時(shí)。寡聚物中的核苷酸間連接可為磷酸二酯、硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯以使得RNase H裂解靶向的RNA。優(yōu)選硫代磷酸酯，這是由于改善的核酸酶抗性和其它原因，如易于制備。在本發(fā)明的寡聚物的一個(gè)方面，該核苷酸和/或核苷酸類似物通過硫代磷酸酯基 彼此連接。應(yīng)認(rèn)識到將磷酸二酯連接，如一個(gè)或兩個(gè)連接，加入到其它硫代磷酸酯寡聚物，特 別是介于核苷酸類似物單元之間或相鄰于核苷酸類似物單元(典型地在A區(qū)和或C區(qū))，可 修飾寡聚物的生物利用度和/或生物分布_參見W02008/053314，在此引入作為參考。在一些實(shí)施方案中，如上述實(shí)施方案，其中適當(dāng)且非具體表明，所有剩余的連接基 為磷酸二酯或硫代磷酸酯，或其混合物。在一些實(shí)施方案中，所有核苷酸間連接基為硫代磷酸酯。當(dāng)涉及具體的缺口聚物寡核苷酸序列時(shí)，如那些在此提供的，應(yīng)理解在多種實(shí)施 方案中，當(dāng)該連接為硫代磷酸酯連接時(shí)，可使用如那些在此公開的其它連接，例如可使用磷 酸酯(磷酸二酯)連接，特別是用于核苷酸類似物，如LNA單元之間的連接。同樣，當(dāng)涉及具體缺口聚物寡核苷酸序列時(shí)，如在此提供的那些，當(dāng)C殘基注釋為5’甲基修飾的胞嘧啶 時(shí)，在多種實(shí)施方案中，寡聚物中存在的一個(gè)或多個(gè)C可為未修飾的C殘基。寡聚化合物(o ligomeri c compound)本發(fā)明的寡聚物，例如，可選自22-43和44至80。綴合物在本文中術(shù)語"綴合物(conjugate)“是表示通過將本文所述的寡聚物共價(jià)連接 (“綴合”)至一個(gè)或多個(gè)非核苷酸或非多核苷酸部分而形成的異源(heterogenous)分子。 非核苷酸或非多核苷酸部分的實(shí)例包括大分子試劑如蛋白質(zhì)、脂肪酸鏈、糖殘基、糖蛋白、 聚合物或其組合。典型的蛋白質(zhì)可為靶蛋白的抗體。典型聚合物可為聚乙二醇。因此，在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚物可包含多核苷酸區(qū)和另一非核苷酸區(qū) 兩者，該多核苷酸區(qū)通常由核苷酸的連續(xù)序列組成。當(dāng)涉及本發(fā)明的由連續(xù)核苷酸序列組 成的寡聚物，該化合物可包含非核苷酸組分，如綴合物組分。在本發(fā)明多種實(shí)施方案中，該寡聚化合物連接至配體/綴合物，其可用于例如增 加寡聚化合物的細(xì)胞吸收。W02007/031091提供了合適的配體和綴合物，其在此引入作為參考。本發(fā)明還提供綴合物，其包含本文所述的根據(jù)本發(fā)明的化合物和至少一個(gè)共價(jià)連 接至所述化合物的非核苷酸或非多核苷酸部分。因此，在多種實(shí)施方案中，其中本發(fā)明的化 合物由特定的核酸或核苷酸序列組成，如本文所公開，該化合物也可包含至少一個(gè)非核苷 酸或非多核苷酸部分(例如不包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸或核苷酸類似物)共價(jià)連接至所述化 合物。綴合(至綴合物部分)可增強(qiáng)本發(fā)明的寡聚物的活性、細(xì)胞分布(cellular distribution)或細(xì)胞吸收。這些部分包括，但不限于，抗體、多肽、脂質(zhì)部分如膽固醇部 分、膽酸、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇、硫膽固醇(thiocholesterol)、脂肪鏈，例如， 十二烷二醇或十一烷基殘基、磷脂，例如，二 _十六烷基-rac-甘油或1，2- 二 十六烷 基-rac-甘油-3-h-膦酸三乙基銨、聚胺或聚乙二醇鏈、金剛烷乙酸、棕櫚基部分、十八烷基 胺或己基氨基_羰基-氧基膽固醇部分。本發(fā)明的寡聚物還可綴合至活性藥物物質(zhì)，例如，阿司匹林，布洛芬，磺胺藥物，抗 糖尿病藥，抗菌素或抗生素。在一些實(shí)施方案中，該綴合的部分為固醇，如膽固醇。在多種實(shí)施方案中，該綴合的部分包含或由以下組成帶正電荷的聚合物，如帶正 電荷的肽，例如長度為1-50，如2-20如3-10個(gè)氨基酸殘基，和/或聚環(huán)氧烷如聚乙二醇 (PEG)或聚丙二醇-參見WO 2008/034123，在此引入作為參考。合適地，該帶正電荷的聚合 物，如聚環(huán)氧烷可通過連接基連接至本發(fā)明的寡聚物，如描述于WO 2008/034123的可釋放 的連接基。作為實(shí)例，以下綴合物部分可用于本發(fā)明的綴合物 活化的寡聚物本文所用的術(shù)語“活化的寡聚物”，是指共價(jià)連接(即，官能化)至至少一個(gè)官能 部分(functional moiety)的本發(fā)明的寡聚物，該官能部分允許寡聚物共價(jià)連接至一個(gè)或 多個(gè)綴合的部分(即本身不為核酸或單體的部分)，以形成本文描述的綴合物。典型地， 官能部分將包含能通過以下共價(jià)連接至寡聚物的化學(xué)基團(tuán)例如，腺嘌呤堿基的3’ -羥基 或環(huán)外NH2基，優(yōu)選親水性的間隔基(spacer)和能結(jié)合至綴合的部分的末端基團(tuán)(例如， 氨基、巰基或羥基)。在一些實(shí)施方案中，末端基團(tuán)未被保護(hù)，例如，為NH2基團(tuán)。在其它實(shí) 施方案中，末端基團(tuán)被保護(hù)，例如，被任何合適的保護(hù)基，如描述于Theodora W Greene和 Peter G M Wuts,第三版(John Wiley & Sons, 1999)的"Protective Groups in Organic Synthesis"的那些保護(hù)。合適的羥基保護(hù)基的實(shí)例包括酯如乙酸酯，芳烷基如芐基，二苯 基甲基，或三苯基甲基和四氫吡喃基。合適的氨基保護(hù)基的實(shí)例包括芐基，α-甲基芐基，二 苯基甲基，三苯基甲基，芐基氧基羰基，叔丁氧基羰基和?；缛纫阴；蛉阴；?。 在一些實(shí)施方案中，該官能部分是自裂解的(self-cleaving)。在其它實(shí)施方案中，該官能 部分為生物可降解的。參見例如，美國專利號7，087，229，其以其整體在此引入作為參考。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚物在5’端官能化以使綴合的部分共價(jià)連接至寡 聚物的5’端。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚物可在3’端官能化。在其它實(shí)施方案中， 本發(fā)明的寡聚物可沿著主鏈或在雜環(huán)堿基部分上官能化。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡 聚物可在多于一個(gè)位置官能化，所述位置獨(dú)立地選自5’端、3’端、主鏈和堿基。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的活化的寡聚物通過在合成過程中摻入一個(gè)或多個(gè)共 價(jià)連接至官能部分的單體而合成。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的活化的寡聚物使用未被官 能化的單體合成，且該寡聚物在合成完成后官能化。在一些實(shí)施方案中，該寡聚物使用含氨 基烷基連接基的位阻酯(hindered ester)官能化，其中該烷基部分具有式(CH2)w，其中w為 1至10的整數(shù)，優(yōu)選約6，其中烷基氨基的烷基部分可為直鏈或支鏈的鏈，且其中該官能團(tuán) 通過酯基(-O-C(O)-(CH2)wNH)連接至寡聚物。在其它實(shí)施方案中，該寡聚物使用含(CH2)W-巰基(SH)連接基的位阻酯官能化， 其中w為1至10的整數(shù)，優(yōu)選約6，其中烷基氨基的烷基部分可為直鏈或支鏈的鏈，且其中 該官能團(tuán)通過酯基(-O-C(O)-(CH2)wSH)連接至寡聚物。在一些實(shí)施方案中，巰基-活化的寡核苷酸與聚合物部分如聚乙二醇或肽綴合 (通過二硫鍵的形成)。上述包含位阻酯的活化的寡聚物可通過本領(lǐng)域已知的任何方法合成，且特別是通 過公開于PCT
發(fā)明者杰斯珀·沃姆 申請人:桑塔里斯制藥公司;安佐制藥股份有限公司