專利名稱：檢測基因組核酸中遺傳異常的測定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因組核酸的檢測。
背景技術(shù)：
提供下面的描述來協(xié)助讀者理解。提供的信息或引用的參考文獻(xiàn)都不被承認(rèn)為本 發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。遺傳異常例如重復(fù)、缺失、染色體易位、點(diǎn)突變常常導(dǎo)致病理狀態(tài)。一些疾病，諸如癌癥，歸因于生命過程中少數(shù)細(xì)胞中后天獲得的遺傳異常；而在其 它的疾病中，遺傳異常存在于機(jī)體的所有細(xì)胞中，并且從受孕時(shí)就存在。為了檢測遺傳異常，有必要檢測含有異常的基因組核酸。檢測遺傳異常諸如非整 倍性、易位、重復(fù)和缺失的方法是本領(lǐng)域熟知的。一種這樣的方法包括細(xì)胞遺傳學(xué)分析，其 中染色體的中期伸展被染色和顯影。中期染色體顯示出在染色體帶型中顯現(xiàn)的特殊的明暗 染色模式。分子細(xì)胞遺傳學(xué)方法的發(fā)展提供了具有更大靈敏度的測定法。這些技術(shù)將DNA雜 交與放射標(biāo)記的或熒光標(biāo)記的探針相結(jié)合。例如，在熒光原位雜交(FISH)分析中，熒光探 針與中期或分裂間期染色體雜交。然后用熒光顯微鏡檢測雜交的探針。然而，這些方法需 要完整的細(xì)胞或完整的或部分完整的細(xì)胞核。檢測染色體異常的非原位雜交方法在本領(lǐng)域也是已知的。美國專利公開 2006/0292576描述了通過在固相支持體上雜交、捕獲和檢測基因組DNA來檢測染色體異常 的方法。這種方法利用了對基因組核酸有特異性的兩個(gè)探針。一個(gè)探針錨定在固相支持體 上，另一個(gè)探針是可檢測到地標(biāo)記的。第一個(gè)探針與基因組核酸的雜交將基因組核酸捕獲 在固相支持體上，而來自第二個(gè)探針的可檢測標(biāo)記的信號(hào)用于檢測基因組核酸。這種方法 需要通過核酸雜交將基因組核酸捕獲到固相支持體上。一種檢測單核苷酸多態(tài)性的方法是通過動(dòng)力等位特異性雜交(DASH)。這種方法利 用錯(cuò)配堿基對的不穩(wěn)定性導(dǎo)致的DNA解鏈溫度(Tm)的差異。基因組片段例如通過PCR被擴(kuò) 增，并粘附在固相支持體上。在結(jié)合于雙鏈DNA時(shí)發(fā)熒光的分子存在的情況下，加入等位基 因特異的寡核苷酸。隨著溫度升高測量強(qiáng)度，直到Tm被確定。突變會(huì)導(dǎo)致較預(yù)期低的Tm， 從而可以與野生型序列區(qū)分開來。另一種檢測單核苷酸多態(tài)性的方法是通過微陣列技術(shù)?；蚪M核酸最初被擴(kuò)增， 然后通過與錨定在固相表面的探針雜交而被捕獲到固相表面上。通過使用帶有可檢測標(biāo)記 的第二探針的雜交來檢測基因組核酸。發(fā)明概述本發(fā)明提供了檢測測試樣品中感興趣的基因組核酸的方法，該方法沒有擴(kuò)增，也 不需要完整的細(xì)胞或細(xì)胞核。大體上，使基因組核酸與標(biāo)記的探針雜交并通過與核酸雜交 不同的方式錨定在固相支持體上。通過檢測固相支持體上的雜交復(fù)合體中的標(biāo)記來檢測基 因組核酸。該方法可用于檢測遺傳異常，例如點(diǎn)突變、基因重復(fù)或缺失以及染色體易位。該 方法還可用于疾病的診斷或預(yù)后。
一方面，本發(fā)明提供一種檢測基因組核酸中的靶序列的方法，其如下實(shí)施a.將含有靶序列的基因組核酸樣品與對所述靶序列有特異性的探針相接觸，且在 固相支持體上形成包含所述基因組核酸和雜交到所述靶序列的探針的復(fù)合體，其中所述探 針含有可檢測標(biāo)記，所述基因組核酸通過除核酸雜交外的方式被錨定在固相支持體上，且 所述基因組核酸的靶序列還未被擴(kuò)增；和b.通過檢測標(biāo)記與固相支持體的關(guān)聯(lián)(或締合，association)來檢測基因組核酸 中靶序列的存在。另一方面，本發(fā)明提供一種檢測基因組核酸中遺傳異常存在或不存在的方法，其 如下實(shí)施a.將基因組核酸樣品與對遺傳異常有特異性的探針相接觸，如果在基因組核酸中 存在遺傳異常，則在固相支持體上形成包含基因組核酸和探針的復(fù)合體，基因組核酸通過 除核酸雜交外的方式被錨定在固相支持體上，且基因組核酸的靶序列還未被擴(kuò)增；b.通過檢測標(biāo)記與固相支持體的關(guān)聯(lián)來檢測遺傳異常的存在。另一方面，本發(fā)明提供一種檢測基因組核酸中遺傳異常的方法，其如下實(shí)施a.將含有遺傳異常的基因組核酸樣品與對遺傳異常有特異性的第一探針相接觸， 且在固相支持體上形成包含基因組核酸和第一探針的第一復(fù)合體，其中探針含有可檢測標(biāo) 記，基因組核酸通過除核酸雜交外的方式被錨定在固相支持體上且基因組核酸的靶序列還 未被擴(kuò)增；b.將基因組核酸樣品與對參考核酸有特異性的第二探針相接觸，且在固相支持體 上形成包含參考核酸和第二探針的第二復(fù)合體，其中第二探針含有可檢測標(biāo)記；和c.通過檢測與第一復(fù)合體相關(guān)的第一探針的可檢測標(biāo)記來測量形成的第一復(fù)合 體的量，以及通過檢測與第二復(fù)合體相關(guān)的第二探針的可檢測標(biāo)記來測量形成的第二復(fù)合 體的量；和d.將第一復(fù)合體的量與第二復(fù)合體的量比較，其中兩個(gè)復(fù)合體的量的差異指示遺 傳異常。在一個(gè)任何上述方面的實(shí)施方式中，基因組核酸和參考核酸來自同一樣品。在另 一個(gè)任何上述方面的實(shí)施方式中，基因組核酸和參考核酸來自不同樣品，其可來自相同或 不同的個(gè)體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，用相同的固相支持體測定第一復(fù)合體的量和第二復(fù)合 體的量，且第一探針和第二探針的可檢測標(biāo)記是不同的。另一方面，本發(fā)明提供一種檢測基因組核酸中遺傳異常的方法，其如下實(shí)施a.將含有遺傳異常的基因組核酸樣品與對該遺傳異常有特異性的第一探針相接 觸，且在固相支持體上形成包含基因組核酸和第一探針的第一復(fù)合體，其中探針含有可檢 測標(biāo)記，基因組核酸通過除核酸雜交外的方式被錨定在固相支持體上，且基因組核酸的靶 序列還未被擴(kuò)增；b.將基因組核酸樣品與對參考核酸有特異性的第二探針相接觸，且在固相支持體 上形成包含參考核酸和第二探針的第二復(fù)合體，其中第二探針含有可檢測標(biāo)記；和c.通過檢測與第一復(fù)合體相關(guān)的第一探針的可檢測標(biāo)記來測量形成的第一復(fù)合 體的量，和通過檢測與第二復(fù)合體相關(guān)的第二探針的可檢測標(biāo)記來測量形成的第二復(fù)合體 的量；和
d.獲得第一與第二復(fù)合體的量之比；和e.將獲得的比與使用來自參考樣品的基因組核酸而同樣獲得的比進(jìn)行比較，其中 比值的差異指示遺傳異常。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，基因組核酸和參考核酸通過生物素和抗生物素蛋白的相互 作用被錨定在固相支持體上。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，固相支持體是珠子。在另一個(gè) 優(yōu)選的實(shí)施方式中，用流式細(xì)胞術(shù)來檢測第一和第二復(fù)合體。在本發(fā)明的所有方面的優(yōu)選實(shí)施方式中，遺傳異常是點(diǎn)突變、染色體易位、重復(fù)或 缺失。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種檢測HER-2基因重復(fù)的方法。另一方面，本發(fā)明提供一種在個(gè)體中診斷的方法，其如下實(shí)施a.將來自個(gè)體的基因組核酸樣品和與對疾病有特異性的核酸序列互補(bǔ)的探針相 接觸，如果基因組核酸含有對疾病有特異性的核酸序列，則在固相支持體上形成包含基因 組核酸和探針的復(fù)合體，其中探針含有可檢測標(biāo)記，基因組核酸通過除核酸雜交外的方式 被錨定在固相支持體上，且基因組核酸的靶序列還未被擴(kuò)增；和b.通過檢測與支持體相關(guān)的可檢測標(biāo)記的量來測量在固相支持體上形成的復(fù)合 體的量；和c.將形成的復(fù)合體的量和使用來自在相似條件下檢測的參考樣品的基因組核酸 形成的復(fù)合體的量進(jìn)行比較，其中從所述個(gè)體形成的復(fù)合體的量與參考樣品相比的差異對 疾病有診斷價(jià)值。在一個(gè)實(shí)施方式中，參考樣品可從假定為沒有疾病的個(gè)體獲得。在另一個(gè)實(shí)施方 式中，參考樣品可從已知患有疾病的個(gè)體獲得。在另一個(gè)實(shí)施方式中，參考樣品從獲得第一 個(gè)樣品后的同一個(gè)體獲得。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法可用于測量懷疑患有癌癥的個(gè)體的 腫瘤負(fù)荷。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該方法可用于疾病的預(yù)后?；蚪M核酸可被共價(jià)或非共價(jià)地錨定在固相支持體上。在本發(fā)明的所有方面的一 些實(shí)施方式中，基因組核酸可通過“結(jié)合對”被非共價(jià)地錨定在固相支持體上，在本文“結(jié)合 對”是指通過特異性相互作用形成復(fù)合體的兩個(gè)分子。因此，基因組核酸能通過連接到基因 組核酸的結(jié)合對的一個(gè)成員與偶聯(lián)到固相支持體的結(jié)合對的另一個(gè)成員之間的相互作用 被捕獲在固相支持體上。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，結(jié)合對是生物素和抗生物素蛋白，或抗生物素蛋白的變體 例如鏈霉抗生物素和NeutrAvidin 。在其它實(shí)施方式中，結(jié)合對可以是配體_受體、激素_受體、抗原_抗體。在本發(fā)明的所有方面的一些實(shí)施方式中，基因組核酸可通過共價(jià)連接被錨定在固 相支持體上。在一個(gè)實(shí)施方式中，基因組核酸與固相支持體的共價(jià)連接是通過光活化基團(tuán) 例如疊氮基、疊氮苯甲酰甲基、4-硝基苯基3-重氮丙酮酸鹽、補(bǔ)骨脂素(psolarens)、補(bǔ)骨 脂素衍生物來完成的。在另一個(gè)實(shí)施方式中，基因組核酸能通過UV交聯(lián)而交聯(lián)到各種固相 表面。在另一個(gè)實(shí)施方式中，基因組核酸可通過使用化學(xué)連接體的化學(xué)偶聯(lián)被錨定在固相 支持體上。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，基因組核酸是基因組DNA。在另一個(gè)實(shí)施方式中，參 考核酸是持家基因或染色體中的單拷貝序列。在本發(fā)明的所有方面的一個(gè)實(shí)施方式中，分別含有基因組核酸和參考核酸的測試
8樣品或參考樣品可從細(xì)胞、組織、體液、血漿、血清、尿液、中樞神經(jīng)系統(tǒng)液體、糞便、膽管、石 蠟包埋的組織、細(xì)胞裂解物、組織裂解物等等獲得或在其中得到。測試和參考核酸可從任何 數(shù)目的來源通過任何方法獲得。在本發(fā)明的所有方面的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，探針可以是寡核苷酸、人工染色 體、片段化人工染色體、基因組DNA、RNA、重組核酸、肽核酸(PNA)、發(fā)夾寡核苷酸或雜環(huán)寡 聚體。在一個(gè)實(shí)施方式中，探針優(yōu)選是大片段DNA ( > 20kb，包括粘粒、YAC或BAC克隆)。在本發(fā)明的所有方面的優(yōu)選的實(shí)施方式中，與探針相關(guān)的可檢測標(biāo)記可以是熒光 團(tuán)、納米顆粒、同位素、化學(xué)發(fā)光化合物、酶或半抗原。在本發(fā)明的所有方面的優(yōu)選的實(shí)施方式中，可檢測標(biāo)記可通過標(biāo)記的試劑被檢測 到。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，標(biāo)記的試劑可以是能檢測到與探針相關(guān)的標(biāo)記的標(biāo)記抗體。 在另一個(gè)實(shí)施方式中，標(biāo)記的試劑是能檢測到與探針相關(guān)的標(biāo)記的一抗/ 二抗對，且一抗 或二抗或兩者與可檢測標(biāo)記相關(guān)。在本發(fā)明的所有方面的一些實(shí)施方式中，錨定到固相支持體的基因組核酸、具有 可檢測標(biāo)記并雜交到基因組核酸的探針的復(fù)合體用流式細(xì)胞術(shù)來檢測。在本發(fā)明的所有方面的一些實(shí)施方式中，基因組核酸首先與帶有可檢測標(biāo)記的探 針在溶液中雜交，然后雜交的復(fù)合體可被錨定在固相支持體上。在本發(fā)明的所有方面的一些實(shí)施方式中，探針可以是至少50個(gè)核苷酸長度。在 其它的實(shí)施方式中，一個(gè)或更多個(gè)探針的長度大于約1，000,1, 500,2, 000,2, 500,3, 000、 4，000,5, 000,7, 500、10，000,20, 000,50, 000、100，000 或更多個(gè)核苷酸。除非另外說明，本文使用的單數(shù)形式“一 (a) ”、“一 (an) ”和“所述(the) ”包括復(fù) 數(shù)的指示物。因此，例如，提及“一個(gè)寡核苷酸”包括多個(gè)寡核苷酸分子，提及固相支持體是 指一個(gè)或更多個(gè)固相支持體，提及標(biāo)記是指一個(gè)或更多個(gè)標(biāo)記，提及探針是指一個(gè)或更多 個(gè)探針，提及“一個(gè)核酸“是指一個(gè)或更多個(gè)多核苷酸。本文使用的術(shù)語“基因組核酸”指細(xì)胞中的核酸，它存在于生物體的細(xì)胞染色體 (一個(gè)或更多個(gè))中，含有編碼該生物體的細(xì)胞的各種蛋白質(zhì)的基因?；蚪M核酸還指提 供病毒信息的病毒核酸?；蚪M核酸通常是DNA，也可以是RNA，諸如在mRNA或RNA中，諸 如在一些病毒中?；蚪M核酸的優(yōu)選的類型是存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞核中的核酸?；蚪M 核酸可以是雙鏈或單鏈、或部分雙鏈、或部分單鏈或發(fā)夾分子?；蚪M核酸可以是完整的或 片段化的(例如用限制性內(nèi)切酶消化、或用超聲或應(yīng)用剪切力用本領(lǐng)域已知的方法)。在 某些情況下，基因組核酸可包括來自單個(gè)基因的全部或一部分的序列或來自多個(gè)基因的序 列、來自一個(gè)或更多個(gè)染色體的序列或來自細(xì)胞所有染色體的序列。眾所周知，基因組核酸 包括基因編碼區(qū)、內(nèi)含子、5'和3'非翻譯區(qū)、5'和3'側(cè)翼DNA和結(jié)構(gòu)區(qū)段諸如端粒和著 絲粒DNA、復(fù)制起點(diǎn)和基因間DNA。代表基因組的全部核酸的基因組核酸被稱為“總基因組 核酸”?；蚪M核酸可通過從細(xì)胞提取/純化的方法獲得，這是本領(lǐng)域熟知的。獲得基因 組核酸的細(xì)胞可以是正常的細(xì)胞或可以是在基因組核酸中含有一個(gè)或更多突變例如重復(fù)、 缺失、易位和顛換的細(xì)胞?；蚪M核酸可直接從細(xì)胞提取或可以是從細(xì)胞提取的核酸的拷 貝。從基因組核酸含義中排除的是已經(jīng)受擴(kuò)增步驟的基因組核酸，相對于基因組核酸中的 其它核酸序列，所述擴(kuò)增步驟增加想要檢測的感興趣靶序列的數(shù)量。
基因組核酸可以是約10個(gè)堿基、約20個(gè)堿基、約50個(gè)堿基、約100個(gè)堿基、約500 個(gè)堿基、約1，000個(gè)堿基、約2，000個(gè)堿基、2，500個(gè)堿基、約3，000個(gè)堿基、約3，500個(gè)堿 基、約4，000個(gè)堿基、約5，000個(gè)堿基、約7，500個(gè)堿基、約10，000個(gè)堿基、約20，000個(gè)堿 基、約30，000個(gè)堿基、約40，000個(gè)堿基、約50，000個(gè)堿基、約75，000個(gè)堿基、約100，000 個(gè)堿基、約1，000, 000個(gè)堿基、約2，000, 000個(gè)堿基、5，000, 000個(gè)堿基或更多。本文使用的術(shù)語“參考核酸”指為了與研究的基因組核酸比較而要被鑒定的核酸。 參考核酸可以是DNA或RNA，天然的或合成的。在一些情況下，參考核酸可含有相對不變的 序列即持家基因或基因座或其它基因，或不預(yù)期在變化的條件下(例如正常狀態(tài)或疾病狀 態(tài))改變的染色體中的其它序列。參考核酸還可表示正?；蛞吧蜖顟B(tài)中的核酸，即缺少 點(diǎn)突變、易位、缺失或重復(fù)。在另一個(gè)情況下，參考核酸可表示帶有點(diǎn)突變、易位、缺失或重 復(fù)的核酸序列。在一些情況下，研究的基因組核酸和參考核酸可從同一樣品獲得。在其它 的情況下，基因組核酸和參考核酸可從不同樣品獲得。在一些情況下，參考核酸可從與基因 組核酸不同的來源獲得。在一些情況下，參考核酸可從與基因組核酸不同的生物體獲得。術(shù)語“靶核酸”和“靶序列”在本文中可互換地使用，指代意圖被鑒定的核酸序列。 靶序列可以是DNA或RNA?！鞍行蛄小笨梢允腔蚪M核酸。靶序列可包括野生型序列，含有點(diǎn) 突變、缺失或重復(fù)的核酸序列，來自單個(gè)基因的全部或一部分的序列或來自多個(gè)基因的序 列，來自一個(gè)或更多個(gè)染色體的序列或任何其它的感興趣序列。靶序列可代表特定基因的 可選序列或等位基因。靶序列可以是雙鏈或單鏈、或部分雙鏈、或部分單鏈或發(fā)夾分子。靶 序列可以是約1-5個(gè)堿基、約10個(gè)堿基、約20個(gè)堿基、約50個(gè)堿基、約100個(gè)堿基、約500 個(gè)堿基、約1，000個(gè)堿基、約2，000個(gè)堿基、2，500個(gè)堿基、約3，000個(gè)堿基、約3，500個(gè)堿 基、約4，000個(gè)堿基、約5，000個(gè)堿基、約7，500個(gè)堿基、約10，000個(gè)堿基、約20，000個(gè)堿 基、約30，000個(gè)堿基、約40，000個(gè)堿基、約50，000個(gè)堿基、約75，000個(gè)堿基、約100，000 個(gè)堿基、約1，000, 000個(gè)堿基或更多。除非另外說明，本文使用的“約”表示加或減10%。術(shù)語“同一性”和“相同的”指序列之間的同一性程度?？梢杂胁糠滞恍曰蛲耆?同一性。部分相同的序列是與另一個(gè)序列少于100%相同的序列。優(yōu)選地，部分相同的序 列具有至少70%或至少75%、更優(yōu)選地至少80%或至少85%、最優(yōu)選地至少90%或至少 95%的總體同一性。在檢測來自可檢測標(biāo)記的信號(hào)來表明基因組核酸在樣品中的存在的上下文中，本 文使用的術(shù)語“檢測”不需要該方法提供100%的靈敏度和/或100%的特異性。眾所周知， “靈敏度”是如果那個(gè)人具有基因組核酸序列，則測試是陽性的概率；而“特異性”是如果那 個(gè)人不具有基因組核酸序列，則測試是陰性的概率。至少50%的靈敏度是優(yōu)選的，盡管至 少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %和至少99 %的靈敏度是顯然更優(yōu)選的。至少50 % 的特異是優(yōu)選的，盡管至少60%、至少70%、至少80%、至少90%和至少99%的特異性是 顯然更優(yōu)選的。檢測還包括帶有假陽性和假陰性的測定。假陰性率可以是1%、5%、10%、 15%、20%或甚至更高。假陽性率可以是1%、5%、10%、15%、20%或甚至更高。在基因片段或染色體片段的上下文中，“片段”指至少約10個(gè)核苷酸、至少約20個(gè) 核苷酸、至少約25個(gè)核苷酸、至少約30個(gè)核苷酸、至少約40個(gè)核苷酸、至少約50個(gè)核苷酸、 至少約100個(gè)核苷酸、至少約250個(gè)核苷酸、至少約500個(gè)核苷酸、至少約1，000個(gè)核苷酸、
10至少約2，000個(gè)核苷酸、至少約5，000個(gè)核苷酸、至少約10，000個(gè)核苷酸、至少約20，000 個(gè)核苷酸、至少約50，000個(gè)核苷酸、至少約100，000個(gè)核苷酸、至少約500，000個(gè)核苷酸、 至少約1，000, 000個(gè)核苷酸或更多個(gè)核苷酸的核苷酸殘基序列。在某些實(shí)施方式中，分離的或純化的分子可為優(yōu)選的。本文使用的術(shù)語“分離的”、 “純化的”或“基本上純化的”指核酸或氨基酸序列分子，它們從其自然環(huán)境被去除，是分離 的或單獨(dú)的，并且至少60%、優(yōu)選75%、最優(yōu)選90%不含與它們天然地相關(guān)的其它成分。分 離的分子因此是基本上純化的分子。本文使用的術(shù)語“測試樣品”指含有基因組核酸的樣品或用做用于本發(fā)明方法的 基因組核酸來源的樣品。本文使用的術(shù)語“參考樣品”指含有參考核酸的樣品或用做用于本發(fā)明方法的參 考核酸來源的樣品。術(shù)語“固相支持體”和“固相表面”在本文可互換地使用，指珠子、微粒、微球、平的 或包含孔或淺的凹陷或凹槽的板、微孔表面、載玻片、玻璃表面、涂層玻璃表面、反應(yīng)器的表 面、層析柱、膜、過濾器、微芯片、石英、硅石、紙、塑料、硝化纖維素、尼龍、聚丙烯、聚苯乙烯 或其它聚合物等等，它們錨定基因組核酸。本文使用的術(shù)語“探針”指能雜交到基因組核酸或參考核酸的至少一部分的物體。 探針可以是寡核苷酸、人工染色體、片段化人工染色體、基因組核酸、片段化基因組核酸、 RNA、重組核酸、片段化重組核酸、肽核酸(PNA)、鎖定核酸、環(huán)狀雜環(huán)寡聚體或核酸偶聯(lián)物。探針可以是約10個(gè)堿基、約20個(gè)堿基、約30個(gè)堿基、約40個(gè)堿基、約50個(gè)堿 基、約75個(gè)堿基、約100個(gè)堿基、約200個(gè)堿基、約300個(gè)堿基、約400個(gè)堿基、約500個(gè)堿 基、約750個(gè)堿基、約1，000個(gè)堿基、約1，500個(gè)堿基、約2，000個(gè)堿基、約2，500個(gè)堿基、 約3，000個(gè)堿基、約3，500個(gè)堿基、約4，000個(gè)堿基、約5，000個(gè)堿基、約7，500個(gè)堿基、約 10，000個(gè)堿基、約15，000個(gè)堿基、約20，000個(gè)堿基、約25，000個(gè)堿基、約30，000個(gè)堿基、約 40，000個(gè)堿基、約50，000個(gè)堿基、約75，000個(gè)堿基、約100，000個(gè)堿基、約500，000個(gè)堿基、 1，000, 000個(gè)堿基、約2，000, 000個(gè)堿基、約5，000, 000個(gè)堿基或更多。長度約1，OOO(Ikb) 至約5，000，000 (5Mb)或更多核苷酸的較長探針可來自含有感興趣的核酸區(qū)段的染色體或 人工染色體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，探針優(yōu)選是大的DNA片段(> 20kb，包括粘粒、 YAC或BAC克隆)。本文使用的術(shù)語“可檢測標(biāo)記”指與探針相關(guān)的分子或化合物或一組分子或一組 化合物，它們用于鑒定雜交到基因組核酸或參考核酸的探針。在一些情況下，可檢測標(biāo)記可被直接地檢測。在其它情況下，可檢測標(biāo)記可以是結(jié) 合對的一部分，它可然后被接著檢測。來自可檢測標(biāo)記的信號(hào)可通過各種方式被檢測，并將 依賴于可檢測標(biāo)記的性質(zhì)。檢測可檢測標(biāo)記的方式的例子包括但并不限于分光鏡的、光化 學(xué)的、生物化學(xué)的、免疫化學(xué)的、電磁的、放射化學(xué)的或化學(xué)的方式，諸如熒光、化學(xué)熒光或 化學(xué)發(fā)光或任何其它的合適方式。本文使用的術(shù)語“雜交”指通過互補(bǔ)堿基對之間的氫鍵形成，基本上互補(bǔ)的核苷酸 序列(核酸鏈)配對形成雙鏈體或異源雙鏈體。它是兩個(gè)互補(bǔ)多核苷酸之間的特異的、即 非隨機(jī)的相互作用。雜交和雜交的強(qiáng)度(即核酸之間的連接強(qiáng)度)受諸如核酸之間的互補(bǔ) 程度、所涉及條件的嚴(yán)格性和所形成雜交體的Tm的因素的影響。
本文關(guān)于多核苷酸(即，核苷酸諸如寡核苷酸或基因組核酸的序列)使用的術(shù)語 “互補(bǔ)物”、“互補(bǔ)的”或“互補(bǔ)性”與堿基配對原則有關(guān)。本文使用的核酸序列的互補(bǔ)物指 寡核苷酸，當(dāng)與核酸序列對齊以便一個(gè)序列的5'端與另一個(gè)序列的3'端配對時(shí)，該寡核 苷酸處在“反向平行關(guān)聯(lián)”中。例如，序列“5' -A-G-T-3”是與序列“3' -T-C-A-5’”互補(bǔ) 的。在天然的核酸中通常不被發(fā)現(xiàn)的某些堿基可包括在本發(fā)明的核酸中，包括例如肌苷和 7-脫氮鳥嘌呤。互補(bǔ)性不需要是完全的，穩(wěn)定的雙鏈體可含有錯(cuò)配的堿基對或不匹配的堿 基。核酸技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員能經(jīng)驗(yàn)性地考慮許多變量來確定雙鏈體穩(wěn)定性，所述變量包 括例如，寡核苷酸的長度、寡核苷酸的堿基組成和序列、離子強(qiáng)度和錯(cuò)配堿基對的發(fā)生率?；パa(bǔ)性可以是“部分的”，其中只有核酸堿基中的一些根據(jù)堿基配對原則是匹配 的?；蛘?，核酸之間可以有“完全的”、“全體的”或“全部的”互補(bǔ)性。本文使用的術(shù)語“嚴(yán)格性”指溫度、離子強(qiáng)度和其它化合物存在的條件，在這個(gè)條 件下進(jìn)行核酸雜交。在高度嚴(yán)格性條件下，核酸堿基配對將只發(fā)生在具有高頻率互補(bǔ)堿基 序列的核酸之間。本文使用的術(shù)語“遺傳異常”指核酸序列與野生型或正常的遺傳序列的偏差。遺 傳異常可反映生物體或其任何部分的完全遺傳互補(bǔ)與該生物體中的所有染色體的正常的 完全遺傳互補(bǔ)相比之間的差別。例如，遺傳異?？砂ㄈ旧w拷貝數(shù)(例如非整倍性)或 其部分(例如缺失、重復(fù)、擴(kuò)增)的改變；或染色體結(jié)構(gòu)的改變(例如易位、點(diǎn)突變)。遺傳 異常可以是遺傳的，即世代相傳；或非遺傳的。遺傳異常可存在于生物體的一些細(xì)胞中或該 生物體的所有細(xì)胞中。本文使用的術(shù)語“非整倍體細(xì)胞”或“非整倍性”指在分裂間期具有異常數(shù)目的至 少一條染色體的細(xì)胞。“試驗(yàn)值”是通過在含有雜交到可檢測探針的來自測試樣品的基因組核酸的固相 支持體上形成的復(fù)合體的量的測定而獲得的。在一個(gè)實(shí)施方式中，來自測試樣品的基因組 核酸被懷疑具有遺傳異常。在一個(gè)實(shí)施方式中，試驗(yàn)值還可通過檢測參考樣品中的同一染 色體或基因序列來獲得。“對照值”是通過在含有雜交到可檢測探針的來自參考樣品的基因組核酸的固相 支持體上形成的復(fù)合體的量的測定而獲得的。在一個(gè)實(shí)施方式中，雜交的靶被懷疑不具有 遺傳異常。在另一個(gè)實(shí)施方式中，雜交的靶已知具有遺傳異常。在一個(gè)實(shí)施方式中，測試樣 品和參考樣品是相同的?！皡⒖贾怠敝敢驯魂P(guān)聯(lián)于一些其它特性的值。一組參考值可被用作標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)值或?qū)φ罩悼杀槐磉_(dá)為復(fù)合體的“量”或拷貝數(shù)。復(fù)合體的量可以是與摻入 的標(biāo)記的檢測水平(例如熒光強(qiáng)度)相應(yīng)的單個(gè)值或一定范圍的值。例如，一定范圍的值 可用于產(chǎn)生形成的復(fù)合體量與一些其它量(例如腫瘤負(fù)荷)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)聯(lián)。試驗(yàn)值或?qū)φ罩悼杀槐磉_(dá)為一種復(fù)合體的量對另一種復(fù)合體的量的“相對量”或 “比率”。在本發(fā)明方法的某些實(shí)施方式中，使用同一靶基因可獲得兩種復(fù)合體，其中第二 復(fù)合體的量代表歷史值或在平行測定中獲得的值。在其它的實(shí)施方式中，使用兩種不同的 基因獲得兩種復(fù)合體，第一個(gè)是感興趣的基因，第二個(gè)是不期望改變的基因(例如持家基 因)。相對的量可以是單個(gè)值或一定范圍的值。例如，一定范圍的值可用于產(chǎn)生形成的復(fù)合 體的相對量與一些其它量(例如腫瘤負(fù)荷)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)聯(lián)。
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術(shù)語“等位基因”和“等位基因變體”在本文可互換地使用。等位基因是同一基因 的許多可選形式或序列中的任何一個(gè)，該基因占據(jù)染色體上給定的基因座或位置。每個(gè)基 因座的單個(gè)等位基因從每個(gè)親本獨(dú)立地遺傳，導(dǎo)致每個(gè)基因有兩個(gè)等位基因。具有特定基 因的同一等位基因的兩個(gè)拷貝的個(gè)體在那個(gè)基因座是純合的，而具有特定基因的兩個(gè)不同 等位基因的個(gè)體是雜合的。本文使用的術(shù)語“診斷(diagnose) ”或“診斷(diagnosis) ”指通過評價(jià)疾病或病 癥的體征和癥狀來鑒定或確定生物體或植物中的疾病或狀況或疾病或狀況的原因的行為 或過程。通常，疾病或病癥的診斷基于一個(gè)或更多個(gè)指示疾病的因子和/或癥狀的評價(jià)。 即，診斷可以基于指示疾病或狀況的存在或不存在的因子的存在、缺乏或量而作出。被認(rèn)為 指示特定疾病的診斷的每個(gè)因子或癥狀不需要與特定的疾病唯一相關(guān)；即，可能存在可從 診斷因子或癥狀推論出的鑒別診斷。同樣，可能有這樣的情況，其中指示特定疾病的因子或 癥狀存在于不具有該特定疾病的個(gè)體中。本文使用的術(shù)語“預(yù)后”指臨床狀況或疾病的可能的過程和結(jié)果的預(yù)測?；颊叩?預(yù)后通常是通過評價(jià)疾病的因子或癥狀而作出的，該因子或癥狀指示疾病的有利或不利的 過程或結(jié)果。本文使用的術(shù)語“確定預(yù)后”指技術(shù)人員能預(yù)測患者狀況的過程或結(jié)果的過程。術(shù) 語“預(yù)后”不是指100%準(zhǔn)確度地預(yù)測狀況的過程或結(jié)果的能力。而是技術(shù)人員會(huì)理解，術(shù) 語“預(yù)后”指某些過程或結(jié)果會(huì)發(fā)生的概率增加；即，與沒有表現(xiàn)給定狀況的那些個(gè)體相比， 過程或結(jié)果更有可能在表現(xiàn)給定狀況的患者中發(fā)生。預(yù)后可表示為患者可預(yù)期存活的時(shí)間 量?？蛇x地，預(yù)后可指疾病減輕的可能性或指疾病可預(yù)期保持減輕的時(shí)間量。預(yù)后可以多 種方式表示；例如預(yù)后可被表示為患者一年后、五年后、十年后或類似時(shí)間后會(huì)生存的機(jī)會(huì) 百分比?？蛇x地，預(yù)后可被表示為作為狀況或疾病的結(jié)果患者可預(yù)期生存的平均年數(shù)?；?者的預(yù)后可被認(rèn)為是相對論的表示，許多因素影響最終的結(jié)果。例如，對于具有某些狀況的 患者，預(yù)后可被適當(dāng)?shù)乇硎緸闋顩r可能是可治療的或可治愈的可能性或疾病會(huì)減輕的可能 性，而對于具有更嚴(yán)重狀況的患者，預(yù)后可被更適當(dāng)?shù)乇硎緸樘囟〞r(shí)間段的生存可能性。預(yù)后經(jīng)常通過檢查一個(gè)或更多個(gè)預(yù)后因子或指示物來確定。它們是標(biāo)記物，諸如 特定染色體易位的存在，其在患者(或從患者獲得的樣品)中的存在或量發(fā)出給定過程或 結(jié)果會(huì)發(fā)生的概率的信號(hào)。技術(shù)人員會(huì)理解，將預(yù)后指示物與不利結(jié)果的傾向相關(guān)聯(lián)可涉 及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本文使用的術(shù)語“腫瘤負(fù)荷”指個(gè)體中腫瘤的體積或質(zhì)量的量。這個(gè)量可以在一 個(gè)位點(diǎn)，諸如原發(fā)性腫瘤，或可以是來自多個(gè)位點(diǎn)諸如原發(fā)灶和/或轉(zhuǎn)移灶的總計(jì)量。發(fā)明詳述本發(fā)明提供檢測固相支持體上的未擴(kuò)增的基因組核酸的方法，其不需要完整的細(xì) 胞或細(xì)胞核。該方法可用于檢測測試樣品中的遺傳異常，諸如點(diǎn)突變、易位、缺失和重復(fù)。該 方法還可用于疾病的診斷或預(yù)后。遺傳異常類型、相關(guān)的疾病遺傳異常可反映生物體的完全遺傳互補(bǔ)或其任何部分與該生物體中的所有染色 體的正常的完全遺傳互補(bǔ)相比之間的差別。例如，遺傳異常可包括染色體拷貝數(shù)(例如非 整倍性)或其部分(例如缺失、重復(fù)、擴(kuò)增)的改變；或染色體結(jié)構(gòu)的改變(例如易位、點(diǎn)突變)。遺傳異常可導(dǎo)致病理狀態(tài)。盡管一些疾病諸如癌癥歸因于生命過程中少數(shù)細(xì)胞中后 天獲得的遺傳異常，但術(shù)語“遺傳性疾病”最通常地指在身體的所有細(xì)胞中存在并且從受孕 起就存在的疾病。遺傳異常可以是遺傳的或非遺傳的。遺傳重復(fù)是基因組序列的區(qū)域的任何重復(fù)。它可作為錯(cuò)誤發(fā)生在同源重組、逆轉(zhuǎn) 錄轉(zhuǎn)座事件或整個(gè)染色體復(fù)制中。基因重復(fù)與多種疾病相關(guān)聯(lián)，諸如一些畸形性骨炎骨肉 瘤的病例與MYC基因的重復(fù)相關(guān)聯(lián)(Sarcoma, vol. 1，no. 3-4，pp. 131-134，1997)，一些乳腺 癌的病例與 HER-2/neu 基因的重復(fù)相關(guān)聯(lián)(Ann Oncol.，12 (suppl 1) :S3_S8，2001)，一些 膀胱腫瘤的病例與c-erb-2基因的重復(fù)相關(guān)聯(lián)(Cancer Res.，55，2422-2430，1995)。缺失(也被稱作基因缺失、缺陷或缺失突變)是遺傳畸變，其中部分染色體或DNA 序列丟失。缺失是遺傳物質(zhì)的喪失。任何數(shù)目的核苷酸都可被缺失，從單個(gè)堿基到染色體 的整個(gè)片段。缺失可由減數(shù)分裂過程中染色體交換中的錯(cuò)誤引起。缺失與一組遺傳病相關(guān) 聯(lián)，包括一些男性不育癥的病例和三分之二的迪謝內(nèi)肌營養(yǎng)不良的病例，5號(hào)染色體部分短 臂的缺失導(dǎo)致被稱作貓叫樣哭泣(Cri du chat)的綜合征，也被稱為“貓樣哭泣”綜合征。染色體“易位”是異源染色體之間的部分互換。它通常是通過受累細(xì)胞的細(xì)胞遺傳 學(xué)或核型分析來檢測的。有兩種主要的類型相互易位，其中全部的染色體物質(zhì)都被保留； 羅伯遜易位，其中一些染色體物質(zhì)丟失。此外，易位可以是平衡的(在沒有額外的或丟失的 遺傳信息的物質(zhì)均等互換中)或不平衡的(其中染色體物質(zhì)的互換是不均等的，導(dǎo)致額外 的或丟失的基因)。9號(hào)染色體和22號(hào)染色體之間的相互易位導(dǎo)致被稱作費(fèi)城染色體的細(xì)胞遺傳學(xué) 不同的近端著絲粒染色體。這種易位融合了 22號(hào)染色體的BCR基因座和9號(hào)染色體的原癌 基因 ABL基因座，形成bcr/abl 致癌蛋白(Tefferi et a 1. Mayo Clin Proc80 (3) :390_402， 2005)。盡管費(fèi)城染色體最初與CML相關(guān)，但是現(xiàn)在它被已知為其它血液病諸如急性淋巴母 細(xì)胞白血病(ALL)中預(yù)后的指示物。易位已與其它疾病相關(guān)。例如，通過11號(hào)和16號(hào)染色體之間的易位的、16號(hào)染 色體的CBP基因與11號(hào)染色體的MLL基因的融合已與白血病相關(guān)聯(lián)(Zhang et al. Genes Chromosomes Cancer 41 (3) :257_65，2004)。相似地，導(dǎo)致 AMLl 和 ETO 基因的融合的 8號(hào)和21號(hào)染色體之間的易位涉及幾乎15%的急性髓性白血病(AML)病例(Zhang et al. Science 305 1286-9, 2004) 0此外，許多染色體易位已在多種形式的淋巴瘤中被鑒定。 例如，涉及c-myc基因的8號(hào)和14號(hào)染色體之間的易位被報(bào)道存在于大約80-85%的伯基 特淋巴瘤 / 白血病病例中(Vega ct al. Arch Pathol Lab Medl27 :1148_1160，2003)。突變可以是點(diǎn)突變插入或缺失。點(diǎn)突變或置換是引起單個(gè)堿基核苷酸被另一核苷 酸替換的突變類型。插入和缺失包括單個(gè)堿基對的插入或缺失?；蚧蛉旧w中的突變常 常與疾病諸如鐮狀細(xì)胞性貧血、囊性纖維化、血友病、苯丙酮尿、脊柱裂等相關(guān)聯(lián)。遺傳變異的診斷包括含有與野生型序列的序列變異的基因組核酸序列的鑒定。在 優(yōu)選的實(shí)施方式中，含有基因組核酸的測試樣品被收集，且基因組核酸的存在被鑒定，其中 基因組核酸的存在或不存在是有診斷價(jià)值的。生物樣品收集和制備測試樣品和參考樣品測試樣品和參考樣品分別含有基因組核酸和參考核酸。測 試樣品和參考樣品可以是人類或非人類來源。測試樣品和參考樣品可以從真核或原核生物
14體、或植物、或環(huán)境獲得。測試樣品和參考樣品可以是固體、液體、半固體、氣體，帶有或沒有 任何細(xì)胞或組織。測試樣品和參考樣品可包括但并不限于羊水、活組織檢查物、血液、血細(xì) 胞、骨髓、腦脊液、糞便樣品、排泄物、細(xì)針活組織檢查樣品、腹膜液、血漿、胸水、支氣管肺泡 灌洗液、支氣管沖洗液、唾液、精液、血清、痰、眼淚、頰拭子、組織、組織勻漿、冷凍的組織、組 織的石蠟切片、組織培養(yǎng)基、細(xì)胞、細(xì)胞裂解物、來自培養(yǎng)物的細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)上清、胎兒、胚 胎、尿、微生物、病毒、支原體。在一個(gè)實(shí)施方式中，測試樣品可以從懷疑患有疾病或具有遺傳異常的個(gè)體獲得。 在另一個(gè)實(shí)施方式中，測試樣品可以從假定未患疾病或沒有遺傳異常的健康個(gè)體獲得。樣品收集獲得測試樣品和參考樣品的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括佰并 不限于吸出、組織切片、抽血或抽取其它液體、手術(shù)或針刺活組織檢查、石蠟包埋組織的收 集、體液的收集、糞便的收集等等。發(fā)明的方法可使用任何類型的含有胚胎或胎兒細(xì)胞或核酸體液用于進(jìn)行產(chǎn)前診 斷。胎兒細(xì)胞可通過懷孕女性或從胚胎樣品獲得。因此，胎兒細(xì)胞存在于通過羊膜腔穿刺 術(shù)獲得的羊水、通過注射器吸出的絨毛膜絨毛、經(jīng)皮臍帶血、胎兒皮膚活組織檢查、來自四 細(xì)胞或八細(xì)胞階段胚胎的卵裂球(植入前)、或來自胚泡的滋養(yǎng)外胚層樣品(植入前或通過 子宮灌洗)中?；蚪M核酸在一個(gè)實(shí)施方式中，基因組核酸可以是完整的。在另一個(gè)實(shí)施方式 中，基因組核酸可以是片段化的(例如用限制性內(nèi)切酶消化的，或用超聲處理或應(yīng)用剪切 力用本領(lǐng)域已知的方法片段化)。樣品制備核酸(DNA或RNA)可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何方法從樣品中分 離。需要時(shí)，樣品可通過離心等被收集或濃縮。樣品可進(jìn)行裂解，諸如用酶、加熱、表面活性 劑、超聲破碎或其組合來處理。為了獲得足夠量的核酸，進(jìn)行裂解處理。樣品可進(jìn)行液相色 譜來部分地純化基因組核酸。適合的DNA分離方法包括酚氯仿提取。參見Maniatis et al. , Molecular Cloning, ALaboratory Manual,2d, Cold Spring Harbor Laboratory Press, page 16. 54(1989)。很多商品化試劑盒也生產(chǎn)合適的DNA，包括但并不限于QIAamp 小型血 液試齊[J 盒、Agencourt Genfind 、Roche Cobas Roche MagNA Pure 或使用 Eppendorf PhaseLock Gels 的酚氯仿提取?？侱NA(例如基因組的、線粒體的、微生物的、病毒的)可使用商業(yè)上可買到的試劑 盒例如來自Qiagen的QIAamp DNA和QIAamp DNA Blood小型試劑盒從任何生物樣品諸如全 血、血漿、血清、血沉棕黃層、骨髓、其它的體液、淋巴細(xì)胞、培養(yǎng)的細(xì)胞、組織和法醫(yī)樣本中 純化。病毒RNA可使用商業(yè)上可買到的試劑盒例如QIAamp病毒RNA小型試劑盒從全血、血 漿、血清、血沉棕黃層、骨髓、其它的體液、淋巴細(xì)胞、培養(yǎng)的細(xì)胞、組織和法醫(yī)樣本中純化?；蚪MDNA可使用標(biāo)準(zhǔn)的方法從細(xì)胞或組織中分離，參見Sambrook，et al., 1989, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY。在另一個(gè)實(shí)施方式中，基因組核酸可以是mRNA或從mRNA產(chǎn)生的cDNA，或可以使 用總RNA。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從細(xì)胞或組織樣品中分離RNA，參見例如Sambrook，et al.，1989. Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Second Edition,Cold SpringHarbor Press,Plainview, NY0此外，分離mRNA和合成cDNA的試劑盒是商業(yè)上可買到的，例如來自Qiagen 的 RNeasy Protect Mini i式劑盒、RNeasy Protect Cell Mini i式劑盒。在一個(gè)實(shí)施方式中，基因組核酸是從石蠟包埋的組織中分離的DNA。從石蠟包埋的 組織中提取DNA的方法是本領(lǐng)域熟知的，例如，收集含有組織的石蠟塊、用二甲苯處理來脫 蠟、用蛋白酶處理以去除蛋白污染物、然后用酚和氯仿最后提取、接下來乙醇沉淀。可選地， 來自石蠟包埋的組織的DNA可用商業(yè)上可買到的試劑盒分離，例如，可使用來自Qiagen的 EZl DNA試劑盒、QIAamp DNA Mini試劑盒從石蠟包埋的組織分離DNA。核酸不需要提取，但是可通過合適的細(xì)胞或組織處理諸如美國專利申請 11/566169中描述的那樣被制成可利用的。固相支持體固相支持體可用于通過共價(jià)的或非共價(jià)的方式錨定基因組核酸。在優(yōu)選的實(shí)施 方式中，固相支持體是珠子。在一些實(shí)施方式中，珠子或微粒是基本上相同尺寸的。在其 它的實(shí)施方式中，珠子或微粒是一種或更多種尺寸的。在一個(gè)實(shí)施方式中，珠子或微粒可 以是磁性的。這些珠子或微粒可由例如聚苯乙烯或乳膠組成。珠子或微粒可以是直徑大約 0. 1 μ m-10 μ m或可以是直徑大如50 μ m-100 μ m,但是，較小的和較大的珠子尺寸也是可能 的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，固相表面是鏈霉抗生物素包被的珠子。鏈霉抗生物素包被 的珠子是商業(yè)上可買到的，例如來自Bang實(shí)驗(yàn)室(目錄號(hào)214、217)、EMDBiosciences (目 錄號(hào) 70716-3,70716-4)、來自 Invitrogen Corporation 的 Dynal 珠子(目錄號(hào) 658-0ID、 602-10)。在一些實(shí)施方式中，固相表面可具有能直接或間接地通過化學(xué)連接體共價(jià)地連接 基因組核酸的官能團(tuán)。官能團(tuán)的例子包括但并不限于聚L賴氨酸、氨基硅烷、環(huán)氧硅烷、醛 類、氨基、環(huán)氧基、氰基、乙烯基、羥基、硫羥基。核酸在固相支持體上的錨定基因組核酸或參考核酸對固相支持體的錨定可在基因組核酸或參考核酸與帶有 可檢測標(biāo)記的探針雜交之前、之后或同時(shí)進(jìn)行。核酸可被共價(jià)地或非共價(jià)地錨定到載體上。非共價(jià)地錨定核酸到固相表面的優(yōu)選方法是通過“結(jié)合對”，它在本文是指通過特 異性相互作用形成復(fù)合體的兩個(gè)分子。因此，核酸可通過與核酸連接的結(jié)合對的一個(gè)成員 和與固相支持體偶聯(lián)的結(jié)合對的另一個(gè)成員之間的相互作用被捕獲在固相支持體上。在優(yōu)選的實(shí)施方式中。結(jié)合對是生物素和抗生物素蛋白、或抗生物素蛋白的變體 諸如鏈霉抗生物素，NeutrAvidin 。固相表面包含鏈霉抗生物素或其變體，且基因組核酸 被修飾以包含生物素。對核酸進(jìn)行生物素化的方法是本領(lǐng)域已知的(例如，通過用來自 Pierce Chemical Co.的EZ-連接補(bǔ)骨脂素-PEO生物素的光交叉連接，通過使用來自Minis Bio Corp.的 Label IT pArray Biotin Labeling Kit、來自 Pierce Chemical Co.的 PFP Biotin的化學(xué)偶聯(lián)，通過使用來自Invitrogen公司的BioNick DNA標(biāo)記系統(tǒng)的切口 平移，或通過使用商業(yè)上可買到的試劑盒例如來自Pierce的Biotin 3-末端標(biāo)記試劑盒的 3'-末端標(biāo)記)。在其它的實(shí)施方式中，結(jié)合對包含配體-受體、激素-受體、抗原_抗體。這樣的 結(jié)合對的例子包括但并不限于地高辛配基和抗地高辛配基抗體；6-(2，4-二硝基苯基)氨基己酸和抗二硝基苯基抗體；5-溴-dUTP (BrdUTP)和抗BrdUTP抗體；N-乙?；?-氨基芴 (AAF)和抗AAF抗體。這些情況中的固相表面包含抗體，且基因組核酸被修飾以含有抗原。 將地高辛配基、2，4- 二硝基苯基、5-溴-dUTP基摻入到DNA中的方法可通過切口平移或通 過末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)，其例子在本領(lǐng)域被詳細(xì)地記錄或可通過使用商業(yè)上可買到的試 劑盒例如來自Roche Applied Sciences的試劑盒DIG DNA標(biāo)記試劑盒而實(shí)現(xiàn)。地高辛配 基可用地高辛配基-NHS-酯化學(xué)偶聯(lián)到核酸上。N-乙?；?-氨基芴(AAF)可被共價(jià)地偶 聯(lián)到基因組核酸上。在另一個(gè)實(shí)施方式中，基因組核酸可通過使用化學(xué)連接體的化學(xué)偶聯(lián)被共價(jià)地錨 定到固相支持體上。如果基因組核酸與表面之間的共價(jià)結(jié)合是期望的，固相表面將通常是 官能化的或可以被官能化。用于連接的官能團(tuán)的例子包括但并不限于羧酸、醛、氨基、氰
基、乙烯基、羥基、硫羥基。在一些實(shí)施方式中，固相支持體可包被有環(huán)氧基、氨基、巰基、聚賴氨酸。包被的 固相支持體是商業(yè)上可買到的，例如包被有官能團(tuán)的珠子可從InvitrogenCorpotation、 BD Biosciences買到；包被有官能團(tuán)的載玻片可從Pierce、Asper Biotech、Full Moon Biosystems、ThermoFisher 買至丨J。基因組核酸可被修飾以含有官能團(tuán)。基因組核酸的5'磷酸基可用碳二亞胺交聯(lián) 劑EDC (Pierce產(chǎn)品no. 22980)和咪唑偶聯(lián)于含伯胺分子。核酸的5'磷酸基可被修飾以 含有胺基，其應(yīng)用過量的乙二胺并應(yīng)用碳二亞胺交聯(lián)劑EDC(Pierce產(chǎn)品no. 22980)和咪 唑，如在Pierce Technote no. 30中描述的。依賴使用的含有胺的分子，交聯(lián)策略能適于以 許多方式直接或間接地修飾、標(biāo)記或結(jié)合基因組核酸。例如，為了產(chǎn)生光活化(隨機(jī)-反應(yīng) 的)的核酸，對-疊氮苯甲酰基酰胼(ABH，PierCe目錄號(hào)21510)可用于代替默認(rèn)反應(yīng)中的 乙二胺。為了產(chǎn)生巰基_反應(yīng)性核酸，[N-e-馬來酰亞胺己酸]酰胼、三氟乙酸鹽(EMCH， Pierce目錄號(hào)22106)、n-[k_馬來酰亞胺4^一烷酸]酰胼(KMUH，Pierce目錄號(hào)22111)、 或4-(4-N-馬來酰亞胺苯基)丁酸酰胼鹽酸鹽(MPBH，Pierce目錄號(hào)22305)可用于代替 默認(rèn)反應(yīng)中的乙二胺。為了獲得可逆的巰基交聯(lián)，3-(2_吡啶基二硫代)丙酰酰胼(PDPH， Pierce目錄號(hào)22301)可用于代替乙二胺。這個(gè)策略對將基因組核酸連接到含有巰基的固 相支持體上是有用的。為了在基因組核酸上產(chǎn)生巰基，胱胺(nh2-ch2-ch2-s-s-ch2-ch2-nh2) 可被用于代替默認(rèn)反應(yīng)中的乙二胺，然后用DTT或相似的試劑還原二硫鍵。這個(gè)策略對共 價(jià)地偶聯(lián)到馬來酰亞胺活化的固相支持體上是有用的。為了將核酸固定到飾以珠子的親和 載體上，UltraLinkHydrazide (Pierce目錄號(hào)53149)可用于代替默認(rèn)反應(yīng)中的乙二胺?；蚪M核酸可被酶促修飾以含有官能團(tuán)諸如氨基，例如通過切口平移或通過末端 轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)摻入氨基烯丙基dUTP。將多樣的官能團(tuán)彼此連接的方式是熟知的并且在文獻(xiàn)中被詳細(xì)舉例說明。在一個(gè) 實(shí)施方式中，化學(xué)連接體可用于共價(jià)地連接兩個(gè)官能團(tuán)，一個(gè)在固相支持體上，另一個(gè)在基 因組核酸上?；瘜W(xué)連接體可以是單官能的、雙官能的、多官能的、異_雙官能的、或異_多官 能的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，化學(xué)連接體可具有間隔臂以避免位阻。將氨基偶聯(lián)到氨基的 化學(xué)連接體的例子包括但并不限于乙二醇雙[琥珀酰亞胺基琥珀酸鹽]、雙琥珀酰亞胺基 辛二酸鹽、1，5- 二氟-2，4- 二硝基苯。將硫羥基偶聯(lián)到硫羥基的化學(xué)連接體的例子包括但 并不限于1，4_雙-[3' -(2' _吡啶基二硫代)_丙酰胺基]丁烷、二巰代-雙馬來酰亞胺基乙烷。多樣的合適的交聯(lián)劑和交聯(lián)的方法可購自Pierce。在另一個(gè)實(shí)施方式中，基因組核酸通過光活化部分被錨定到固相支持體上。在一 個(gè)實(shí)施方式中，固相表面可錨定能通過光活化作用偶聯(lián)基因組核酸的光活化部分。在另一 個(gè)實(shí)施方式中，基因組核酸的5'磷酸基可被結(jié)合到能光交聯(lián)到固相表面上的官能團(tuán)的光 活化基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，基因組核酸可通過連接體被錨定于固相表面，該連接體具 有兩個(gè)或更多個(gè)光活化部分，每端有一個(gè)或更多個(gè)，其中用合適波長的輻射在連接體存在 的情況下暴露固相表面和基因組核酸后，連接體偶聯(lián)到固相表面和基因組核酸。光活化部 分的例子包括但并不限于疊氮化物、芳基疊氮化物、疊氮苯甲酰甲基、4-硝基苯基3-重氮 丙酮酸鹽、補(bǔ)骨脂素(psolarens)、補(bǔ)骨脂素衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，基因組核酸可通過暴露固相表面和基因組核酸于紫外輻射 而被交聯(lián)到尼龍、硝基纖維素、或尼龍加強(qiáng)的硝基纖維素膜、包被的玻璃表面。核酸交聯(lián)結(jié) 合到各種表面的方式是熟知的，并且在文獻(xiàn)中被詳細(xì)地舉例說明(例如使用Stratagene紫 外交聯(lián)劑)。Mt探針能雜交到基因組核酸的至少一部分。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸探針來自 BAC Resource Consortium編譯的細(xì)菌人工染色體(BACs)的概要提供的一個(gè)、幾個(gè)或所有 的人類基因組核酸區(qū)段。這些探針通常在本領(lǐng)域通過它們的RPI或CTB克隆名被提及，參 見Cheung等，Nature 409 =953-958, 2001 該概要含有人基因組草圖序列中的7，600個(gè) 細(xì)胞遺傳學(xué)定義的界標(biāo)(參見McPherson等，Nature 409 =934-41, 2001) 這些界標(biāo)是大 的插入克隆，通過熒光原位雜交繪制到染色體帶上，每個(gè)含有定位到基因組序列上的序列 標(biāo)簽。這些克隆代表所有24條人類染色體，分辨率約1Mb。BAC基因組收集的來源包括 BACPAC Resources Center(CH0RI-Children‘ s HospitalOakland Research Institute)、 ResGen (Research Genetics，Invitrogen)禾口 The Sanger Center(UK)0探針包括一個(gè)可檢測標(biāo)記或多個(gè)可檢測標(biāo)記。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，與探針 相關(guān)的可檢測標(biāo)記可直接產(chǎn)生可檢測的信號(hào)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，與探針相關(guān)的可檢測 標(biāo)記可使用試劑被間接地檢測，其中該試劑包括可檢測標(biāo)記，并結(jié)合到與探針相關(guān)的標(biāo)記 上。在一個(gè)實(shí)施方式中，包括可檢測標(biāo)記的試劑是標(biāo)記的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，包 括可檢測標(biāo)記的試劑是一抗/ 二抗對，其中可檢測標(biāo)記可以在一抗中或在二抗中或在兩者 中。^^核酸鏈之間的互補(bǔ)性的程度對核酸鏈之間的雜交效率和強(qiáng)度具有顯著的影響。這 在依賴核酸之間的結(jié)合的檢測方法中具有特別的重要性。在一個(gè)實(shí)施方式中，探針和基因 組核酸之間的互補(bǔ)性可以是“部分的”，其中核酸堿基中只有一些根據(jù)堿基配對原則是配對 的。在另一個(gè)實(shí)施方式中，探針和基因組核酸之間的互補(bǔ)性可以是“完全的”、“全體的”或 “全部的”。為了進(jìn)行DNA雜交，本發(fā)明的方法可結(jié)合所有已知的方法和手段及其變化，參見， 例如 Sambrook等，1989，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Second Edition, Cold Spring Harbor Press，Plainview, NY?；蚪M核酸和參考核酸和為核酸選擇的探針在雜交條件下相接觸。在本發(fā)明的方
18法中的核酸雜交條件是本領(lǐng)域熟知的。例如，雜交條件可以是高嚴(yán)格性、中嚴(yán)格性或低嚴(yán)格 性條件。理想地，核酸將只與樣品中的互補(bǔ)核酸雜交而不會(huì)與其它非互補(bǔ)核酸雜交。雜交 條件可以被改變以改變雜交的嚴(yán)格性并降低背景信號(hào)，這是本領(lǐng)域已知的。例如，如果雜交 條件是高嚴(yán)格性條件，核酸將以非常高度的互補(bǔ)性可檢測地結(jié)合到核酸靶序列上。低嚴(yán)格 性雜交條件會(huì)允許帶有一些程度的序列趨異的序列雜交。雜交條件將會(huì)依賴生物樣品以及 核酸的類型和序列而變化。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)知道如何優(yōu)化雜交條件來實(shí)施本發(fā)明的方 法。示例性的雜交條件如下。高嚴(yán)格性通常指只允許那些在65°C、0.018M NaCl中形 成穩(wěn)定雜交體的核酸序列雜交的條件。高嚴(yán)格性條件可被提供，例如，通過在42°C在50% 甲酰胺、5XDenhardt' s液、5XSSC(檸檬酸鈉鹽水)0. 2% SDS(十二烷基硫酸鈉)中雜 交，接下來在65°C在0. IX SSC和0. 1% SDS中沖洗。中嚴(yán)格性指與在42°C在50%甲酰胺、 5XDenhardt' s 液、5XSSC、0. 2% SDS 中雜交，接下來在 65°C在 0. 2XSSC、0. 2% SDS 中沖 洗相等的條件。低嚴(yán)格性指與在10%甲酰胺、5XDenhardt' s液、6XSSC、0. 2% SDS中雜 交，接下來在50°C在1 XSSC、0. 2% SDS中沖洗相等的條件。可檢測標(biāo)記本文使用的術(shù)語“可檢測標(biāo)記”指與探針相關(guān)的分子或化合物或一組分子或一組 化合物，它用于鑒定雜交到基因組核酸或參考核酸上的探針?？蓹z測標(biāo)記包括但并不限于熒光團(tuán)、同位素(例如，吁、呷、353、3!1、14(、1251、1311)、電 子致密試劑(例如，金、銀)、納米顆粒、在ELISA中通常使用的酶(例如，辣根過氧化物酶、 β -半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶)、化學(xué)發(fā)光化合物、比色標(biāo)記(例如，膠體金)、磁性 標(biāo)記(例如，Dynabeads )、生物素、地高辛配基、半抗原、可得到其抗血清或單克隆抗體的 蛋白質(zhì)、配體、激素、能與相應(yīng)的互補(bǔ)寡核苷酸形成復(fù)合體的寡核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，可檢測標(biāo)記是熒光團(tuán)。本文使用的術(shù)語“熒光團(tuán)”指在特定 的波長(激發(fā)頻率)吸收光，隨后響應(yīng)發(fā)出不同波長、一般為較長波長(激發(fā)頻率)的光的 分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，可檢測標(biāo)記是緊密接近猝滅劑部分的供體熒光團(tuán)。合適的熒光部分包括但并不限于單獨(dú)或聯(lián)合起作用的下列熒光團(tuán)4_乙酰胺 基-4'-異硫氰酸根合均二苯乙烯_2，2' 二磺酸；吖啶及其衍生物吖啶、吖啶異硫氰酸 鹽；Alexa Fluors =Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647(分子探針)；5-(2 ‘-氨 乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS) :4_氨基-N-[3-乙烯磺?；?苯基]萘二甲酰亞胺_3， 5 二磺酸鹽(Lucifer Yellow VS) ；N-(4_苯胺基萘基)馬來酰亞胺；氨茴內(nèi)酐酰胺 (anthranilamide) ；Black Hole Quencher (BHQ )染料(biosearch Technologies)； BODIPY染料BODIPY R-6G、BOPIPY 530/550、BODIPY FL ；Brilliant Yellow ；香豆素 及衍生物香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，Coumarin 120)、7_氨基-4-三氟醚甲基 香豆素(Coumarin 151) ；Cy2 、Cy3 、Cy3.5 、Cy5 、Cy5.5 ;焰紅染料(cyanosine)； 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) ；5'，5〃 - 二溴連苯三酚-磺酞(Bromopyrogallol Red) ；7-二乙氨基-3-(4'-異硫氰酸根合苯基)-4_甲基香豆素；二乙烯三胺五乙酸酯； 4,4' - 二異硫氰酸根合二氫-均二苯乙烯_2，2' -二磺酸；4，4' - 二異硫氰酸根合均二 苯乙烯_2，2' -二磺酸；5-[二甲氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-(4' - 二甲氨
19基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL) ；4-二甲氨基苯基偶氮苯基-4'-異硫氰酸酯(DABITC)； Ecl ipse (Epoch Biosciences Inc.)；伊紅及衍生物伊紅、伊紅異硫氰酸酯；赤蘚紅 及衍生物赤蘚紅B、赤蘚紅異硫氰酸酯；二氨乙苯啡啶(ethidium)；熒光素及衍生物 5-羧基熒光素爾六1)、5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基熒光素(01六朽、2'，V - 二甲氧 基-4' 5' -二氯-6-羧基熒光素(JOE)、熒光素、異硫氰酸熒光素(FITC)、六氯-6-羧 基熒光素(HEX)、QFITC(XRITC)、四氯熒光素(TET)；熒光胺；IR144 ;IR1446 ；鑭發(fā)光體 (lanthamide phosphors)；孔雀綠(Malachite Green)異硫氰酸酯；4~甲基傘形酮；鄰甲 酚酞；硝基酪氨酸；副品紅；酚紅(Phenol Red) ；B-藻紅蛋白、R-藻紅蛋白；別藻藍(lán)蛋白； 鄰_苯二甲醛；Oregon Green ；碘化丙啶；芘和衍生物芘、芘丁酸鹽、琥珀酰亞胺基1_芘 丁酸鹽；QSY 7 ;QSY 9 ;QSY 21 ;QSY 35(分子探針)Reactive Red 4(Cibacron Brilliant Red3B-A)；羅丹明及衍生物6_羧基-X-羅丹明(ROX)、6_羧基羅丹明(R6G)、麗 絲胺羅丹明B磺酰氯、羅丹明(Rhod)、羅丹明B、羅丹明123、羅丹明綠、羅丹明X異硫氰酸 酯、核黃素、玫紅酸、磺基羅丹明B、磺基羅丹明101、磺基羅丹明101的磺酰氯衍生物(Texas Red)；鋱螯合衍生物；N，N，N' ,N'-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)；四甲基羅丹明；四甲 基羅丹明異硫氰酸酯(TRITC)。其它的熒光核苷酸類似物可以被使用，參見，例如，Jameson, Meth. Enzymo 1. 278 363-390，1997 ；Zhu, Nucl. Acids Res. 22 :3418_3422，1994。美國專利第 5，652，099 和 6，268，132號(hào)也描述了通過酶或化學(xué)合成而結(jié)合到核酸，例如DNA和/或RNA或寡核苷酸中 的核苷酸類似物，以產(chǎn)生熒光寡核苷酸。美國專利5，135，717描述了作為熒光標(biāo)記使用的 酞菁和四苯并三氮雜卟啉試劑?？蓹z測標(biāo)記可被摻入到、締合或結(jié)合到核酸上。標(biāo)記可通過具有各種長度的間隔 臂被連接，以減少潛在的位阻或賦予其它有用的或期望的性質(zhì)。參見，例如，Mansfield, MoI. Cell. Probes 9:145-156,1995?？蓹z測標(biāo)記可通過共價(jià)的或非共價(jià)方式，例如通過轉(zhuǎn)錄諸如通過使用Klenow聚 合酶的隨機(jī)引物標(biāo)記、或切口平移或擴(kuò)增或本領(lǐng)域已知的等同方法被摻入到核酸探針中。 例如，核苷酸堿基被結(jié)合到可檢測的部分，諸如熒光染料，例如Cy3 或Cy5 ，然后在核酸合 成或擴(kuò)增過程中被摻入到核酸探針中。當(dāng)用與未標(biāo)記的dCTP混合的Cy3 _或Cy5 -dCTP 結(jié)合物合成時(shí)，核酸探針可因此被標(biāo)記。核酸探針可通過使用PCR或切口平移在存在標(biāo)記的前體核苷酸時(shí)被標(biāo)記。例如， 通過將烯丙胺-dUTP偶聯(lián)到熒光染料或半抗原(諸如生物素或地高辛配基)的琥珀酰亞胺 酯衍生物而合成的修飾的核苷酸可被使用；這種方法允許最常見的熒光核苷酸的定制，參 見，例如，Henegariu，Nat. Biotechnol. 18 345-348, 2000 核酸探針可通過本領(lǐng)域已知的非共價(jià)方式被標(biāo)記。例如，Kreatech Biotechnology 的 Universal Linkage System (ULS )提供了非酶促標(biāo)記技術(shù)，其中鉬基 通過結(jié)合到鳥苷的N7位置與DNA、RNA或核苷酸形成配位鍵。這種技術(shù)還可通過結(jié)合到含 有氮和硫的氨基酸側(cè)鏈上而用于標(biāo)記蛋白質(zhì)。參加，例如，美國專利5，580，990、5，714，327 和5，985，566號(hào)及歐洲專利0539466號(hào)。用可檢測標(biāo)記加標(biāo)記還可包括與另一個(gè)生物分子諸如核酸，例如寡核苷酸或以 莖環(huán)結(jié)構(gòu)形式作為“分子信標(biāo)(molecular beacon) ”或“適體信標(biāo)(aptamer beacon)”的核酸連接的核酸。作為可檢測的部分的分子信標(biāo)是本領(lǐng)域熟知的；例如，SokoKProc. Natl. Acad. ScL USA 95:11538-11543,1998)合成了“分子信標(biāo)”報(bào)告分子寡脫氧核苷酸， 其在5'和3'端帶有匹配的熒光供體和受體生色團(tuán)。在缺少互補(bǔ)核酸鏈的情況下，分子 信標(biāo)保持在莖環(huán)構(gòu)象中，其中熒光共振能量轉(zhuǎn)移阻止信號(hào)釋放。與互補(bǔ)的序列雜交時(shí)，莖 環(huán)結(jié)構(gòu)打開，增加供體和受體部分之間的物理距離，因此減少熒光共振能量轉(zhuǎn)移并在信標(biāo) 被適當(dāng)波長的光激活時(shí)允許可檢測信號(hào)被發(fā)出。也參見，例如Antony (Biochemistry 40 9387-9395，2001)，其描述了包含形成寡脫氧核苷酸的富含G的18-mer三鏈體的分子信標(biāo)。 也參見美國專利第6，277，581和6，235，504號(hào)。適體信標(biāo)與分子信標(biāo)相似；參見，例如，Hamaguchi, Anal. Biochem. 294 :126_131， 2001 ；Poddar, Mol.Cell. Probes 15 161-167,2001 ；Kaboev, Nucl. Acids Res. 28 :E94， 2000。適體信標(biāo)可采用兩個(gè)或更多個(gè)構(gòu)象，其中之一允許配體結(jié)合。熒光猝滅對用于報(bào)告配 體結(jié)合引起的構(gòu)象改變。也參見，例如Yamamoto，Genes Cells 5 389-396, 2000 ；Smimov, Biochemistry 39 :1462_1468，2000。核酸探針可通過肽被間接地可檢測地標(biāo)記。肽可通過插入被次級報(bào)告分子(例 如，亮氨酸拉鏈對序列、二抗的結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄激活因子多肽、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表位標(biāo)簽) 識(shí)別的預(yù)定的多肽表位被制成可檢測的。標(biāo)記還可通過與第一個(gè)肽相互作用(例如，S-S締 合)的第二個(gè)肽被連接。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地知曉，含有雜交到標(biāo)記探針的基因組核酸的復(fù)合體的 檢測可通過抗探針標(biāo)記的標(biāo)記抗體的使用來實(shí)現(xiàn)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，探針用地高辛配 基標(biāo)記并用熒光標(biāo)記的抗地高辛配基抗體來檢測。在另一個(gè)實(shí)施方式中，探針用FITC標(biāo)記 并用熒光標(biāo)記的抗FITC抗體來檢測。這些抗體是商業(yè)上容易買到的。在另一個(gè)實(shí)施方式 中，探針用FITC標(biāo)記并用抗FITC抗體的一抗和標(biāo)記的抗-抗FITC 二抗來檢測?；蚪M核酸和探針復(fù)合體的檢測摻入到雜交的基因組核酸、探針和固相支持體復(fù)合體中的可檢測標(biāo)記探針的檢測 方法是本領(lǐng)域已知的，并隨著標(biāo)記的性質(zhì)而改變。熒光染料通過將標(biāo)記暴露于由外源諸如白熾燈或激光提供的一個(gè)波長能量的光 子，引起熒光團(tuán)轉(zhuǎn)化為激發(fā)態(tài)而被檢測。熒光團(tuán)然后在比激發(fā)波長長的波長下釋放吸收的 能量，該能量可作為熒光被含有熒光檢測器的標(biāo)準(zhǔn)儀器測量。示例性的熒光儀器包括熒光 分光光度計(jì)和小平板讀數(shù)器、熒光顯微鏡、熒光掃描儀和流式細(xì)胞儀。用于多熒光團(tuán)的檢測的裝置和方法是本領(lǐng)域熟知的，參見，例如美國專利第 5, 539, 517,6, 049, 380,6, 054, 279,6, 055, 325 和 6, 294, 331 號(hào)。任何已知的裝置和方 法或其變化都可用于或適于實(shí)施本發(fā)明的方法，包括陣列讀數(shù)或“掃描”裝置，諸如掃 描和分析多色熒光圖像；參見，例如，美國專利第6，294，331,6, 261,776,6, 252,664、 6，191，425,6，143，495,6，140，044,6，066，459,5，943，129,5，922，617,5，880，473, 5，846，708,5, 790，727號(hào)和本文的陣列論述中引用的專利。還參見公開的美國專利申請 第 2001/0018514、2001/0007747 號(hào)和公開的國際專利申請第 W0/0146467A、W0/9960163A、 W0/0009650A, W0/0026412A, W0/0042222A, W0/0047600A 和 W0/0101144A 號(hào)。電荷耦合器件或CCDs在微陣列掃描系統(tǒng)中使用，包括實(shí)施本發(fā)明的方法。顏色辨 別也可基于3色CCD視頻影像，這些可通過測量色調(diào)值來進(jìn)行。色調(diào)值被引入以便用數(shù)字詳細(xì)說明顏色。計(jì)算是基于相機(jī)的分離通道記錄的紅、綠和藍(lán)光(RGB)的強(qiáng)度。然而，用于 將RGB值轉(zhuǎn)換為色調(diào)的公式簡化了數(shù)據(jù)，而且沒有對光的真實(shí)的物理性質(zhì)進(jìn)行參考?？蛇x 地，光譜成像可被使用；它將光分析為每一波長的強(qiáng)度，這是唯一的量，通過它來正確地描 述光的顏色。此外，光譜成像可提供空間數(shù)據(jù)，因?yàn)樗袌D像中每個(gè)像素的光譜信息?？?選地，光譜圖像可使用亮視野顯微鏡制作。參見，例如，美國專利6，294，331號(hào)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用流式細(xì)胞儀檢測雜交的復(fù)合體。流式細(xì)胞術(shù)是本領(lǐng)域 熟知的技術(shù)。流式細(xì)胞儀水動(dòng)力地將顆粒(例如，細(xì)胞或合成的微?；蛑樽?的液體懸液 聚焦成基本上單行的顆粒流，這樣每個(gè)顆粒可被單獨(dú)分析。流式細(xì)胞術(shù)能測量與顆粒大小 相關(guān)的前向和側(cè)向光散射。因此，不同大小的顆?？赏瑫r(shí)用在本發(fā)明的方法中來檢測不 同的核酸片段。此外，一個(gè)或更多波長下的熒光可同時(shí)被測量。結(jié)果，顆?？砂创笮”环?類，且可為每個(gè)顆粒分析一個(gè)或更多個(gè)熒光標(biāo)記探針的熒光。示例性的流式細(xì)胞儀包括 Becton-Dickenson Immunocytometry Systems FACSCAN。等效的流式細(xì)胞儀也可在本發(fā)明 的方法中使用。在另一個(gè)實(shí)施方式中，含有錨定到固相支持體并與探針雜交的基因組核酸的復(fù)合 體可用表面等離子共振檢測。在本發(fā)明所有方面的一些實(shí)施方式中，方法適合大的異常，諸如涉及至少50個(gè)堿 基，更優(yōu)選至少100個(gè)堿基，更優(yōu)選至少200個(gè)堿基，更優(yōu)選至少500個(gè)堿基，更優(yōu)選至少 lkb，更優(yōu)選至少2kb，更優(yōu)選至少4kb，更優(yōu)選至少8kb，以及甚至更優(yōu)選至少IOkb或更多。 但是，較小的異?！ㄖ辽?個(gè)堿基、至少5個(gè)堿基、至少10個(gè)堿基、至少25個(gè)堿基、 至少25-50個(gè)堿基可通過探針和雜交條件的適當(dāng)調(diào)整被檢測到，這是本領(lǐng)域熟知的。檢測染色體區(qū)段或基因的重復(fù)或缺失的方法顯示在實(shí)施例1-4中。在這些具體實(shí) 施例中的感興趣的序列是人HER-2基因。HER-2基因的擴(kuò)增已被證明與乳腺癌相關(guān)。對于 測試實(shí)例，基因組DNA從被證明患有乳腺癌的個(gè)體的血清中分離出來。對于對照實(shí)例，基因 組DNA從證明沒患有乳腺癌的個(gè)體中分離出來?；蚪MDNA被生物素化，并與兩個(gè)探針雜 交。一個(gè)探針與HER-2基因的區(qū)域互補(bǔ)，并用FITC標(biāo)記。另一個(gè)探針與17號(hào)染色體特異 的單拷貝序列(17-SSC)區(qū)域互補(bǔ)，并用Cy5標(biāo)記。與兩個(gè)探針雜交的生物素化基因組DNA 然后被錨定到商業(yè)上可買到的鏈霉抗生物素包被的珠子上。來自HER-2探針的信號(hào)通過將 復(fù)合體結(jié)合到兔抗FITC/山羊抗兔Alcxa-488抗體而進(jìn)一步加強(qiáng)。流式細(xì)胞術(shù)被用來檢測 被捕獲到珠子上的雜交復(fù)合體。測量從HER-2探針/抗體對和從17-SSC獲得的信號(hào)的比 率。將來自測試實(shí)例的信號(hào)的比率與對照實(shí)例相比。較大的比率被認(rèn)為是HER-2基因的擴(kuò)
+飽
+曰ο現(xiàn)在將參考下面的非限制實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。實(shí)施例1基因組核酸的分離和生物素化基因組核酸的分離在本實(shí)施例中，基因組核酸是含有來自被證明為乳腺癌的個(gè)體或來自沒有乳腺 癌的對照個(gè)體的人HER-2基因序列的基因組DNA。DNA從個(gè)體的血清中提取，或使用來自 Qiagen的EZl DNA試劑盒從石蠟包埋的組織中分離基因組DNA。基因組DNA是從21個(gè)隨機(jī)選擇的具有乳腺癌的個(gè)體和52個(gè)沒有乳腺癌的對照個(gè)
22體的血清中獲得的。基因組DNA也從石蠟包埋的組織中被分離出來，基因組DNA是從92個(gè) 隨機(jī)選擇的具有乳腺癌的石蠟包埋的組織樣品和26個(gè)沒有乳腺癌的對照樣品中獲得的。QIAamp MinElute Virus Spin Kit (Qiagen，Valencia，CA)被用來從石賭包埋的組 織(FFPE)中提取DNA。簡要地，用二甲苯/乙醇脫蠟后，F(xiàn)FPE組織切片用蛋白酶K處理、加 熱失活(96°C，10min)，在二氧化硅膜填充的旋轉(zhuǎn)柱上純化DNA。來自血漿或血清(200 μ 1) 的無細(xì)胞循環(huán)DNA根據(jù)制造廠商的方案在相同的試劑盒上純化。用DpnII在37°C消化基因 組DNA 1小時(shí)。通過在65°C熱失活10分鐘來終止消化。分離DNA的牛物素化遵循試劑盒的說明書，使用Biotin-Nick TranslationMix (Roche Applied Science，Basel，瑞士)用生物素-16-dUTP 使 DNA 生物素 化?；旌衔镏猩锼?16-dUTP對dTTP的摩爾比率被調(diào)整為確保新合成的DNA中的每20-25 個(gè)核苷酸都被生物素標(biāo)記，這為檢測帶來了最高的靈敏度。在典型的切口平移反應(yīng)中獲得 的標(biāo)記的片段顯示了 200至500個(gè)堿基對的大小分布。使用標(biāo)準(zhǔn)的切口平移(NT)方案使來自上述步驟的分離的和片段化的DNA生物素 化。含有 ο μ 1 DNA的反應(yīng)混合物與NT酶、緩沖液和在65°C溫育的生物素-16-dUTP混 合1.5小時(shí)。加入0. 5M EDTA來終止反應(yīng)，混合物在65°C溫育10分鐘。通過在73°C溫育 7分鐘、然后在冰上溫育5分鐘，在變性液(70%的去離子甲酰胺，0.2XSSC)中對基因組 DNA(Iyg)進(jìn)行變性?？蛇x地，用商業(yè)上可買到的試劑盒(例如LabelIT pArray Biotin Labeling Kit)，用生物素直接地標(biāo)記分離的DNA。實(shí)施例2標(biāo)記的探針和生物素化的靶DNA的雜交與人HER-2基因的區(qū)域互補(bǔ)的FITC標(biāo)記的探針和Cy5標(biāo)記的17號(hào)染色體特異 的單拷貝序列(17-SSC)被用來與從血清或石蠟包埋的組織樣品分離的生物素化的基因組 DNA雜交。17-SSC的序列提供如下5' Cy5-TGTATTTATC CTCTCTCTAG CCATCCATAGC TGTAGCTGGCTCACTCACT 3' (SEQ ID NO 1)探針在Hybrisol VII 雜交液(MP Biomedicals, Solon, OH)中再懸浮，在 37°C溫 育30分鐘，并在73°C變性10分鐘。探針混合物然后在冰上被冷卻5分鐘。然后將變性液 (70%的去離子甲酰胺，0. 2XSSC)加入探針混合物。變性的探針混合物和變性的基因組DNA然后被結(jié)合并在37°C溫育過夜。實(shí)施例3固相支持體上雜交復(fù)合體的捕獲和用流式細(xì)胞術(shù)檢測含有生物素標(biāo)記的基因組DNA的雜交復(fù)合體被捕獲到鏈霉抗生物素包被的珠子 上。鏈霉抗生物素包被的微球(Bangs Laboratories, Fishers, IN)在結(jié)合前連續(xù)地用 BlockAid(Invitrogen, Carlsbad, CA)和剪切的鮭精DNA(100 μ g/mL)處理以減少非特異性 結(jié)合。用 100 μ 1 結(jié)合緩沖液(IOOmM Tris-HCL ；ρΗ 8. 0,0. 1% Tween 20 禾Π IM LiCl)清洗 5μ 1鏈霉抗生物素珠子(Bangs Lab, Fishers, IN) 一次，將其在20 μ 1的結(jié)合緩沖液中再 懸浮。5 μ 1探針-DNA復(fù)合體被加入到珠子中，且混合物在室溫震蕩下室溫溫育1小時(shí)以形
23成珠子-DNA復(fù)合體。偶聯(lián)的珠子用10%甲酰胺/0. 2 X SSC清洗一次，用0. 2 X SSC清洗2 次。珠子復(fù)合體在含有兔抗-FITC抗體(BD Bioscience)的溶液中再懸浮。珠子復(fù)合體用 在磷酸鹽緩沖液(PBS)中的2%BSA清洗三次，在4%的封閉奶中再懸浮，并用在PBS中的 2% BSA清洗一次。珠子復(fù)合體以1 500稀釋在含有Alexa-488標(biāo)記的山羊抗兔抗體(BD Bioscience)的溶液中再懸浮，并在暗處室溫旋轉(zhuǎn)30分鐘。珠子復(fù)合體然后用CW_2Cell清 洗器在PBS中的2% BSA清洗一次，以清洗并沉淀珠子。通過使用FITC/Alexa-488染料組合，來自FITC的熒光信號(hào)被進(jìn)一步地放大。來 自珠子上FITC/Alexa-488和Cy5的熒光信號(hào)被檢測為每個(gè)珠子的熒光改變，如遵循制造廠 商的說明書在流式細(xì)胞儀(Canto，BD San Jose, CA)上測量的。使用儀器(Diva)的軟件 (BD, San Jose, CA)，對每個(gè)樣品計(jì)算至少5000個(gè)事件的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。實(shí)施例4檢測基因組核酸中的遺傳異常的測定結(jié)果測量了來自FITC/Alexa-488和Cy-5的信號(hào)比率。這個(gè)比率代表HER-2 :17_SSC的 比率?；趶膶φ諅€(gè)體或?qū)φ諛悠帆@得的結(jié)果，2. 14(平均值士3SD)的比率被認(rèn)為是HER-2 基因的擴(kuò)增。將使用實(shí)施例4的方法獲得的結(jié)果與FISH、免疫組織化學(xué)(IHC)和ELISA方法獲 得的結(jié)果進(jìn)行比較。使用血清樣品，本方法與FISH和IHC的結(jié)果之間具有90. 5 %和90 %的一致 性。使用本方法從血清樣品獲得的HER-2水平進(jìn)一步與用ELISA方法并用12. 3ng/ml血 清作為截?cái)喃@得的HER-2水平相比較。兩種方法的結(jié)果之間具有52%的一致性。這種 一致性水平類似于報(bào)道的ELISA和IHC/基于細(xì)胞的檢測方法l)Kong SY, et al Serum HER-2concentration in patients with primary breast cancer J Clin Pathol 59373-736,2006 ；2)Former MN et al Serum HER_2extracellular domain in metastatic breast cancer patients treated with weekly trastuzumab and paclitaxel association with HER_2status by immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization and with response rate. Ann Oncol 16:234-239,2005。來自乳腺癌患者的石蠟包埋的組織樣品通過實(shí)施例4的方法、IHC和常規(guī)的FISH 方法檢測。只有IHC 3+或在常規(guī)的FISH中樣品與對照的信號(hào)比率大于2. 2的樣品才被認(rèn) 為是HER-2擴(kuò)增陽性的，而具有IHC 0/1+染色或在常規(guī)的FISH中樣品與對照的信號(hào)比率 小于1.8的情況被解釋為HER-2擴(kuò)增陰性。具有IHC 2+的樣品被分類為不確定的(或意 義不明確的)。在檢測的122個(gè)病例中，在103例中獲得了來自常規(guī)的FISH和實(shí)施例4的方法的 匹配的結(jié)果。在常規(guī)的FISH中比率大于2. 2的四例被發(fā)現(xiàn)用實(shí)施例4的方法為陰性，而根 據(jù)常規(guī)的FISH認(rèn)為是陰性(比率1.8或更小)的15例用實(shí)施例4的方法檢測為陽性?？?體上，常規(guī)的FISH與實(shí)施例4的方法之間的一致性是84. 4% (P < 0. 001)。在檢測的80例中，在63例中獲得了來自IHC和實(shí)施例4的方法的匹配的結(jié)果。 IHC方法認(rèn)為HER-2過表達(dá)陽性的8例被發(fā)現(xiàn)用實(shí)施例4的方法為陰性，而IHC方法認(rèn)為是 陰性的9例被發(fā)現(xiàn)用實(shí)施例4的方法為陽性。總體上，IHC與實(shí)施例4的方法之間的一致 性是 78. 8% (P < 0. 001)。
除非另有定義，本文使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員通常理解的意義相同的意義。本文提供的所有核苷酸序列都表示為5'至3'方 向。本文例證性地描述的發(fā)明可在缺少本文沒有具體公開的任何一個(gè)要素或更多個(gè) 要素、一個(gè)限制或更多個(gè)限制的情況下合適地實(shí)施。因此，例如，術(shù)語“包含”、“包括”、“含 有”等應(yīng)被可擴(kuò)展地閱讀并且沒有限制。此外，本文使用的術(shù)語和表述已被作為描述而非限 制性術(shù)語使用，使用這樣的術(shù)語和表述并不是要排除顯示和描述的這些特征或其部分的任 何等價(jià)物，而是認(rèn)為，各種修改在本發(fā)明要求保護(hù)的范圍內(nèi)是可能的。因此，應(yīng)理解為盡管本發(fā)明已通過優(yōu)選的實(shí)施方式和可選的特征被具體公開，但 是本文公開的其中體現(xiàn)的本發(fā)明的修改、改進(jìn)和變化可以被本領(lǐng)域的技術(shù)人員尋求，而且 這樣的修改、改進(jìn)和變化被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。這里提供的材料、方法和實(shí)例代表 優(yōu)選的實(shí)施方式，是示例性的，并不是要作為本發(fā)明范圍的限制。本發(fā)明已在本文中被概括地和一般性地描述。落入本一般性公開的每一較窄的種 類和亞類也形成本發(fā)明的一部分。這包括本發(fā)明的一般性描述，其帶有從所述種類中去除 任何主題的附加條件或負(fù)限定，不管所去除的物質(zhì)是否在本文中具體陳述。此外，在本發(fā)明的特征或方面針對馬庫什組描述的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì) 認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明從而還針對馬庫什組的任何個(gè)體成員或亞族成員進(jìn)行描述。本文提到的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻(xiàn)都以其全部做為參考明 確地并入，并入的程度與每一個(gè)被單獨(dú)地做為參考并入相同。在矛盾的情況下，以本說明書 為準(zhǔn)，包括定義在內(nèi)。其它的實(shí)施方式在所附權(quán)利要求書中提出。
權(quán)利要求
檢測基因組核酸中靶序列的方法，包括a.將包含所述靶序列的基因組核酸樣品與對所述靶序列有特異性的探針相接觸，并在固相支持體上形成含有所述基因組核酸和雜交于所述靶序列的所述探針的復(fù)合體，其中所述探針包含可檢測標(biāo)記，所述基因組核酸通過除核酸雜交外的方式被錨定在所述固相支持體上，并且所述基因組核酸的所述靶序列還未被擴(kuò)增；和b.通過檢測所述標(biāo)記與所述固相支持體的關(guān)聯(lián)來檢測所述基因組核酸中所述靶序列的存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固相支持體包含結(jié)合對的第一成員，并且所 述基因組核酸包含所述結(jié)合對的第二成員，其中所述結(jié)合對成員的結(jié)合將所述基因組核酸 錨定到所述固相支持體上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基因組核酸被共價(jià)地錨定到所述固相支持體上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述固相支持體是珠子、微孔板或玻璃表面。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述結(jié)合對是配體_受體、激素_受體或抗原_抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述結(jié)合對是生物素和鏈霉抗生物素或鏈霉抗生 物素的變體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述探針是寡核苷酸、人工染色體、片 段化人工染色體、基因組DNA、RNA或肽核酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的探針的長度是至少50個(gè)核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述可檢測標(biāo)記是熒光團(tuán)、納米顆粒、 同位素、化學(xué)發(fā)光化合物、酶或半抗原。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述復(fù)合體通過流式細(xì)胞術(shù)在所述 固相支持體上被檢測。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述復(fù)合體通過檢測結(jié)合到所述探 針的所述可檢測標(biāo)記的標(biāo)記試劑被檢測。
12.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述標(biāo)記試劑是對所述可檢測標(biāo)記有特異性的 標(biāo)記抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基因組核酸存在于測試樣品 中，并且其中所述測試樣品是細(xì)胞、組織、體液、糞便、石蠟包埋的組織、細(xì)胞裂解物或組織 裂解物。
14.檢測基因組核酸中遺傳變異的存在或不存在的方法，包括a.將基因組核酸樣品與對所述遺傳異常有特異性的探針相接觸，以及如果所述遺傳異 常存在于所述基因組核酸中，則在固相支持體上形成含有所述基因組核酸和所述探針的復(fù) 合體，其中所述基因組核酸通過除核酸雜交外的方式被錨定在所述固相支持體上，并且所 述基因組核酸的所述靶序列還未被擴(kuò)增；b.通過檢測所述標(biāo)記與所述固相支持體的關(guān)聯(lián)來檢測所述遺傳異常的存在。2
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述遺傳異常是染色體易位，并且所述探針的 第一部分雜交到所述易位的第一條染色體的區(qū)域，以及所述探針的第二部分雜交到所述易 位的第二條染色體的區(qū)域。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述遺傳異常是與特定的染色體區(qū)段或基因相 關(guān)的重復(fù)或缺失。
17.根據(jù)權(quán)利要求14-16的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述固相支持體包含結(jié)合對的第 一成員，并且所述基因組核酸包含所述結(jié)合對的第二成員，其中所述結(jié)合對成員的結(jié)合將 所述基因組核酸錨定到所述固相支持體上。
18.根據(jù)權(quán)利要求14-16的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基因組核酸被共價(jià)地錨定在 所述固相支持體上。
19.根據(jù)權(quán)利要求14-18的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基因組核酸是基因組DNA。
20.根據(jù)權(quán)利要求14-19的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述固相支持體是珠子、微孔板或玻璃表面。
21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述結(jié)合對是配體_受體、激素_受體或抗 原-抗體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述結(jié)合對是生物素和鏈霉抗生物素或鏈霉抗 生物素的變體。
23.根據(jù)權(quán)利要求14-22的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述探針是寡核苷酸、人工染色 體、片段化人工染色體、基因組DNA、RNA或肽核酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求14-23的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述探針的長度是至少50個(gè)核苷酸。
25.根據(jù)權(quán)利要求14-24的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述探針用熒光團(tuán)、納米顆粒、同 位素、化學(xué)發(fā)光化合物、酶或半抗原標(biāo)記。
26.根據(jù)權(quán)利要求14-25的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述復(fù)合體通過流式細(xì)胞術(shù)在所 述固相支持體上被檢測。
27.根據(jù)權(quán)利要求14-26的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述復(fù)合體通過檢測結(jié)合到所述 探針的所述可檢測標(biāo)記的標(biāo)記試劑被檢測。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述標(biāo)記試劑是對所述可檢測標(biāo)記有特異性的 標(biāo)記抗體。
29.根據(jù)權(quán)利要求14-28的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基因組核酸存在于測試樣品 中，并且其中所述測試樣品是細(xì)胞、組織、體液、糞便、石蠟包埋的組織、細(xì)胞裂解物或組織 裂解物。
30.檢測基因組核酸中遺傳變異的存在或不存在的方法，包括a.將含有所述遺傳異常的基因組核酸樣品與對所述遺傳異常有特異性的第一探針相 接觸，并且在固相支持體上形成包含所述基因組核酸和所述第一探針的第一復(fù)合體，其中 所述探針包含可檢測標(biāo)記，所述基因組核酸通過除核酸雜交外的方式被錨定在所述固相支 持體上，并且所述基因組核酸的所述靶序列還未被擴(kuò)增；b.將參考核酸與對所述參考核酸有特異性的第二探針相接觸，并且在固相支持體上形 成包含所述參考核酸和所述第二探針的第二復(fù)合體，其中所述第二探針包含可檢測標(biāo)記；和c.通過檢測與所述第一復(fù)合體相關(guān)的所述第一探針的所述可檢測標(biāo)記來測量形成的 所述第一復(fù)合體的量，通過檢測與所述第二復(fù)合體相關(guān)的所述第二探針的所述可檢測標(biāo)記 來測量形成的第二復(fù)合體的量；和d.將所述第一復(fù)合體的量與所述第二復(fù)合體的量進(jìn)行比較，其中兩個(gè)復(fù)合體的量的差 異指示遺傳異常。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述參考核酸是持家基因或染色體中的單拷貝 序列。
32.根據(jù)權(quán)利要求30-31的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基因組核酸和所述參考核酸從同一樣品獲得。
33.根據(jù)權(quán)利要求30-32的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基因組核酸和所述參考核酸 從不同的樣品獲得。
34.根據(jù)權(quán)利要求30-33的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一探針和所述第二探針的 可檢測標(biāo)記是不同的。
35.根據(jù)權(quán)利要求30-31和33-34的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一探針和所述第二 探針是相同的，并且其中所述基因組核酸和所述參考核酸從不同的樣品獲得。
36.檢測基因組核酸中遺傳異常的存在或不存在的方法，包括a.將含有所述遺傳異常的基因組核酸樣品與對所述遺傳異常有特異性的第一探針相 接觸，并且在固相支持體上形成包含所述基因組核酸和第一探針的第一復(fù)合體，其中所述 探針含有可檢測標(biāo)記，所述基因組核酸通過除核酸雜交外的方式被錨定在所述固相支持體 上，并且所述基因組核酸的所述靶序列還沒被擴(kuò)增；b.將基因組核酸樣品與對參考核酸有特異性的第二探針相接觸，并且在固相支持體上 形成包含所述參考核酸和第二探針的第二復(fù)合體，其中所述第二探針含有可檢測標(biāo)記；和c.通過檢測與所述第一復(fù)合體相關(guān)的所述第一探針的可檢測標(biāo)記來測量形成的所述 第一復(fù)合體的量，并通過檢測與所述第二復(fù)合體相關(guān)的所述第二探針的可檢測標(biāo)記來測量 形成的第二復(fù)合體的量；和d.獲得所述第一復(fù)合體與所述第二復(fù)合體的量之比；和e.將獲得的所述比與使用來自參考樣品的基因組核酸而同樣獲得的比進(jìn)行比較，其中 所述比的差異指示遺傳異常。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述遺傳異常是與特定的染色體區(qū)段或基因相 關(guān)的重復(fù)或缺失。
38.根據(jù)權(quán)利要求36-37的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一復(fù)合體和第二復(fù)合體通 過流式細(xì)胞術(shù)在所述固相支持體上被檢測。
39.根據(jù)權(quán)利要求36-38的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一探針或所述第二探針的 長度是至少50個(gè)核苷酸。
40.根據(jù)權(quán)利要求36-39的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述固相支持體包括結(jié)合對的第 一成員，并且所述基因組核酸包含所述結(jié)合對的第二成員，其中所述結(jié)合對成員的結(jié)合將 所述基因組核酸錨定到所述固相支持體上。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述結(jié)合對是生物素和鏈霉抗生物素或鏈霉抗生物素的變體。
42.根據(jù)權(quán)利要求36-41的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基因組核酸是基因組DNA。
43.根據(jù)權(quán)利要求36-42的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述參考核酸是持家基因或染色 體中的單拷貝序列。
44.個(gè)體中疾病的診斷方法，包括a.將來自所述個(gè)體的基因組核酸樣品和與對所述疾病有特異性的核酸序列互補(bǔ)的探 針相接觸，以及如果所述基因組核酸含有對所述疾病有特異性的核酸序列，則在固相支持 體上形成包含所述基因組核酸和所述探針的復(fù)合體，其中所述探針含有可檢測標(biāo)記，所述 基因組核酸通過除核酸雜交外的方式被錨定在所述固相支持體上，并且所述基因組核酸的 所述靶序列還未被擴(kuò)增；和b.通過檢測與所述支持體相關(guān)的可檢測標(biāo)記的量來測量在所述固相支持體上形成的 所述復(fù)合體的量；和c.將形成的復(fù)合體的量與使用來自在相似條件下分析的參考樣品的基因組核酸形成 的復(fù)合體的量進(jìn)行比較，其中從所述個(gè)體形成的復(fù)合體的量與所述參考樣品相比的差異對 所述疾病有診斷價(jià)值。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述參考樣品取自正常的個(gè)體。
46.根據(jù)權(quán)利要求44-45的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法用于測量懷疑患有癌癥 的個(gè)體中的腫瘤負(fù)荷。
47.根據(jù)權(quán)利要求44-46的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述參考樣品從獲得測試樣品之 后的同一個(gè)體獲得。
全文摘要
本發(fā)明提供了檢測錨定在固相支持體上的未擴(kuò)增的基因組核酸的方法。該方法對檢測與各種疾病相關(guān)的遺傳異常、診斷和預(yù)后是有用的。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101925677SQ200880125631
公開日2010年12月22日 申請日期2008年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月29日
發(fā)明者M·阿爾比塔 申請人:奎斯特診斷投資公司