專利名稱：淀粉代謝途徑經(jīng)過修飾的作物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明描述了提高生物生產(chǎn)潛力的方法。特別地，本發(fā)明涉及作物淀粉代謝途徑 并提供具有修飾淀粉代謝途徑和生產(chǎn)潛力的作物，包括禾本科作物如小麥和大麥。本發(fā)明 描述了各種繁殖具有改進(jìn)的生產(chǎn)潛力，如提高的產(chǎn)率、生長、生物量、活力等的作物的方法， 以及由所述修飾的作物生產(chǎn)感興趣的產(chǎn)品的方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明中作者參考的出版物的詳細(xì)書目收錄于說明書末尾。本發(fā)明參考的任何在先出版物(或來自于該在先出版物的信息)或任何已知事 件，本發(fā)明涉及領(lǐng)域的公知常識的在先出版物(或來自于該在先出版物的信息)或已知事 件部分不應(yīng)被承認(rèn)或接受或給出任何形式的建議。作物是可重復(fù)使用能源的主要來源，提高給定作物生產(chǎn)潛力的方法是人們所熱衷 探索的。淀粉是作物中碳水化合物的主要儲備形式，也是人類膳食的主要能量供應(yīng)成分。淀 粉功能性對于最終產(chǎn)品例如食品品質(zhì)的重要性，逐漸被人們所認(rèn)識。淀粉的結(jié)構(gòu)性質(zhì)在工 業(yè)(非食品)應(yīng)用中也是重要的，例如淀粉用作凝膠劑、膨脹劑、水分保持劑或粘附劑。在谷物中，淀粉占成熟谷粒重量的約45-65%。淀粉僅由糖苷構(gòu)成，發(fā)現(xiàn)有兩種類 型的分子，直鏈淀粉和支鏈淀粉，可基于分子大小或其它性質(zhì)進(jìn)行區(qū)分。直鏈淀粉主要是由 α-1，4糖苷單位構(gòu)成的線性聚合體，而支鏈淀粉是帶有α_1，6糖苷鍵連接許多α_1，4糖 苷單位直鏈的高度分支的分子。支鏈淀粉由分子大小為數(shù)以萬計至數(shù)十萬計的帶有約5% α _1，6支鏈的葡萄糖單位的大分子組成。另一方面，直鏈淀粉由分子大小為數(shù)以百計至數(shù) 以千計的帶有不到支鏈的糖苷構(gòu)成的分子(參見Buleon等，1998)。典型的野生型谷物 淀粉含20-30%直鏈淀粉，其余為支鏈淀粉。淀粉起初在作物光合組織如葉片的葉綠體中以過渡淀粉的形式合成。其是在暗期 調(diào)動起來，以供應(yīng)碳運(yùn)輸至器官和能量代謝或貯藏在器官如籽?；驂K莖中。淀粉的合成和 長期貯藏產(chǎn)生于貯藏器官的淀粉質(zhì)體中，其中淀粉以直徑達(dá)100 μ m的半結(jié)晶顆粒存在。顆 粒包含直鏈淀粉和支鏈淀粉，前者在天然淀粉顆粒中為典型的無定形物質(zhì)，后者通過線性 核苷鏈的堆積呈半結(jié)晶態(tài)。高等作物胚乳中淀粉的合成是由一組催化四個關(guān)鍵步驟的酶實(shí)現(xiàn)的。第一步，腺 苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶通過1-磷酸葡萄糖和三磷酸腺苷(ATP)合成腺苷二磷酸葡萄 糖活化淀粉單體前體。第二步，在淀粉合酶的作用下，將活化的葡萄糖基供體，腺苷二磷酸 葡萄糖轉(zhuǎn)移至α _1，4鍵的非還原末端。第三步，淀粉分支酶通過向α_1，4連接的葡聚糖的 分開區(qū)引入分支點(diǎn)，接著將分開的鏈轉(zhuǎn)移至受體鏈，形成新的α-1，6鍵。淀粉分支酶是唯 一的可以將α-1，6鍵引入α-葡聚糖的酶，因此在支鏈淀粉的形成中起重要作用。最后， 淀粉去分支酶去除一些分支鍵，但其作用機(jī)制尚且未知。已經(jīng)清楚至少這四步反應(yīng)對于高等作物中普通淀粉顆粒合成是必須的，在高等作 物的胚乳中發(fā)現(xiàn)各步反應(yīng)的多亞型，基于突變分析或用轉(zhuǎn)基因方法進(jìn)行基因表達(dá)水平的修飾，提出各亞型的特殊作用(Abel等，1996，Jobling等，1999，Schwall等，2000)。然而，每 步反應(yīng)各亞型對淀粉生物合成所起的精確作用尚且未知，這些作用在種間差異顯著。在谷 類胚乳中，存在兩種亞型的腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶，一種亞型存在于淀粉質(zhì)體中，一 種亞型位于細(xì)胞質(zhì)中(Denyer等，1996，Thorb jornsen等，1996)。在谷類胚乳中發(fā)現(xiàn)四類淀 粉合酶，一種亞型單獨(dú)存在于淀粉顆粒中，顆粒結(jié)合淀粉合成酶(GBSS)是直鏈淀粉合成必 須的，兩種形式分別位于顆粒和可溶部分之間(SSI，Li等，1999a，SSII，Li等，1999b)，第四 種形式完全位于可溶部分，SSIII (Cao等2000，Li等，1999b, Li等，2000)。SSII和SSIII 中的突變已證明改變支鏈淀粉結(jié)構(gòu)(Gao等，1998，Craig等，1998)。沒有確定SSI活性作 用突變的描述。在谷類胚乳中表達(dá)三種形式的分支酶，分支酶I (SBEI)，分支酶IIa(SBEIIa)和分 支酶 IIb(SBEIIb) (Hedman 和 Boyer，1982, Boyer 和 Preiss，1978,Mizuno 等，1992，Sun 等， 1997)。水稻(Nakamura 和 Yamanouchi，1992)，玉米(Baba 等，1991 ；Fisher 等，1993 ；Gao 等，1997)和小麥(R印ellin等，1997 ；Nair等，1997 Rahman等，1997)的基因組和cDNA序列 已測定。核苷酸和氨基酸水平上的序列比對顯示出高度的序列相似性，將分支酶分為SBEI、 SBEIIa和SBEIIb。SBEIIa和SBEIIb —般具有約80%的序列一致性，特別是所述基因的中 間區(qū)域。在高等作物中存在兩種類型的去分支酶，是基于其作用底物的專一性確定的，異 淀粉酶型去分支酶和支鏈淀粉酶型去分支酶(Myers等，2000)。玉米和水稻中的糖_1突變 (Sugary-1 mutations)與兩種去分支酶的缺失有關(guān)(James等，1995，Kubo等，1999)，然而 因果突變圖譜(causal mutation maps)與異淀粉酶型去分支酶基因的位置相同。從幾乎所有作物中提取的淀粉為一定程度上磷酸化的淀粉。磷酸化程度通常為 核苷殘基的0. 1-0.4%，其是在碳3或碳6的葡萄糖基磷酸化作為磷酸單脂(Blermow等， 2000a)。典型地，約80%的磷酸基團(tuán)結(jié)合在C-6位置，約20%結(jié)合在C-3位置。然而，不同 作物的磷酸化程度差異顯著。馬鈴薯塊莖中的淀粉為平均25nmol葡萄糖-6-磷酸/mg淀 粉，而谷類貯藏的淀粉中僅為十分之一該量的葡萄糖-6-磷酸。淀粉中磷酸基團(tuán)的存在影 響到凝膠化后淀粉糊的水分吸收能力及粘性。淀粉磷酸化是由屬于二激酶家族的一組酶催化的。在馬鈴薯和擬南芥中鑒定出 兩種實(shí)現(xiàn)淀粉磷酸化的酶，命名為α “葡聚糖水二激酶(GWD，EC 2. 7. 9. 4，即已知的Rl蛋 白或OKI)和磷酸多糖水二激酶(PWD，EC 2. 7. 9. 5)。前者催化轉(zhuǎn)移ATP的β -磷酸至葡萄 糖基的C-3或C-6位置，將γ -磷酸轉(zhuǎn)移至水分子，釋放正磷酸，而后者催化轉(zhuǎn)移磷酸至磷 酸多糖(已經(jīng)過GWD磷酸化)和水(Baunsgaard等，2005 ；Kotting等，2005)。近來，Ritte 等建議淀粉中葡萄糖基的3位或6位上的磷酸化是由PWD和GWD分別催化的(Ritte G等， 2006)。馬鈴薯中編碼GWD基因的反義抑制使結(jié)合磷酸的淀粉含量下降至80% ( VikSO -Nielsen等，2001)。此外，擬南芥中指定Sexl這tarch gxcess表型)基因的突變?nèi)コ说?粉磷酸化，表明GWD是主要的酶(Zeeman和Rees，1999)。此外，擬南芥突變株和轉(zhuǎn)基因反義 馬鈴薯的葉片中顯示出淀粉過量的表型，表明GWD在過渡淀粉分解中的作用。除了淀粉的 磷酸化抑制，沒有觀察到那些作物中淀粉結(jié)構(gòu)的修飾。然而，GWD反義馬鈴薯塊莖中顯示出 減低的“低溫糖化”(〃 cold sweetening")以及葉片中顯示出淀粉過量的表型(Lorberth
9等，1998)。馬鈴薯作物還顯示出塊莖數(shù)量的增加伴隨著各塊莖重量的降低，但沒有顯示出 塊莖中對淀粉積累的其它影響。過渡淀粉代謝途徑受影響的擬南芥Sexl突變體還改變了 碳水化合物代謝途徑，使生長緩慢，開花延遲(Yu等，2001)。淀粉分解和淀粉磷酸含量之間的關(guān)系尚不清楚。馬鈴薯的反義系產(chǎn)生的淀粉顯示 出高度的抵御淀粉酶分解的能力，表明淀粉磷酸化可能是淀粉酶分解的必要條件。 磷酸化殘基可能是該酶的靶信號，以在暗期分解淀粉。一些研究表明，α-淀粉酶和Rl蛋 白(GWD)與淀粉顆粒結(jié)合后，淀粉開始分解。萌發(fā)谷類籽粒如小麥中的淀粉分解和磷酸化較少被了解，其是包括組織退化和水 解酶誘導(dǎo)以及淀粉分解的高度專一化系統(tǒng)。小麥?zhǔn)窃S多國家的主要食物產(chǎn)品，為世界總?cè)丝谔峁┝耸澄锏募s20%千焦的熱 量。小麥的加工特性決定了它用于主要以谷類為主的加工產(chǎn)品，如面包、通心面和面條， 是優(yōu)選的原料。隨著小麥產(chǎn)量的增加，其消耗也在世界范圍內(nèi)增加。面包小麥(Triticum aestivum)是具有三個不同基因組的六倍體，A、B和D，小麥中大部分已知基因有三個，每個 基因組含有一個。面包小麥基因組六倍體這一性質(zhì)，使得在三個基因組的各基因組中發(fā)現(xiàn) 和結(jié)合基因突變成為挑戰(zhàn)。與二倍體物種中易于鑒定的突變相比，三個基因組的存在通過 隱藏各基因組中的突變而產(chǎn)生緩沖效果。與玉米或水稻中可獲得的變化形式相比，小麥中 淀粉結(jié)構(gòu)的已知變化形式是有限的。另一個原因是由于小麥的轉(zhuǎn)化效率滯后于其它谷類。 可以認(rèn)為，小麥淀粉磷酸化中包含的基因及其影響之前未被研究，對雙子葉作物馬鈴薯和 擬南芥中淀粉磷酸化的影響是否與單子葉作物如小麥中的相似。發(fā)明概述本發(fā)明一部分是基于作物中內(nèi)源淀粉磷酸化和/或分解的修飾改變作物生產(chǎn)能 力這一發(fā)現(xiàn)做出的。在一些實(shí)施例中，與對照作物相比，促進(jìn)了生產(chǎn)潛力的提高，比如但不 限于提高的或增加的生物量、活力、萌發(fā)、幼苗活力、生長率、高度、總?cè)~面積、單位葉面積的 光合速率、單株葉片數(shù)量、單株花冠數(shù)量、單株分蘗數(shù)量、單株籽粒數(shù)量、單一花冠籽粒數(shù) 量、平均籽粒重量、單株籽粒總重、籽?；驂K莖的淀粉含量或組成、莖厚度、節(jié)間數(shù)量、分枝 數(shù)量、開花數(shù)量、花的大小或形狀、花色、單株豆莢數(shù)量、豆莢大小、單一豆莢籽粒數(shù)量、單株 結(jié)實(shí)數(shù)量、坐果、果實(shí)大小、果實(shí)形狀、果實(shí)顏色、果實(shí)品質(zhì)、抵御疾病、根系質(zhì)量、生根量、根 系長度和/或產(chǎn)率和/或延遲衰老。在其它實(shí)施例中，與對照作物相比，提高了作物的內(nèi)源 轉(zhuǎn)葡糖基酶和/或消化率。因此，在一個實(shí)施例中，本發(fā)明描述了通過修飾作物中內(nèi)源淀粉磷酸化和/或淀 粉分解，提高作物生產(chǎn)潛力的方法。在一些實(shí)施例中，該方法包括獲取與對照作物相比，生 產(chǎn)潛力提高的遺傳修飾的作物。在一些實(shí)施例中，該方法包括步驟i)獲取大量作物，其中 至少一株基因組內(nèi)含有異源多聚核苷酸，ii)從大量作物中鑒定一株與對照作物相比，生產(chǎn) 潛力提高且含有異源多聚核苷酸的作物。在一些實(shí)施例中，該方法包括iii)篩選遺傳修飾 的作物，其中所述多聚核苷酸含有與編碼修飾作物內(nèi)源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子 的核酸序列可操作連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明描述了獲取與對照作物相比，內(nèi)源轉(zhuǎn)葡糖基酶提高的 遺傳修飾的作物的方法。在一些實(shí)施例中，該方法包括該方法包括步驟i)獲取大量作物， 其中至少一株基因組內(nèi)含有異源多聚核苷酸，ii)從大量作物中鑒定一株與對照作物相比，
10轉(zhuǎn)葡糖基酶提高且含有異源多聚核苷酸的遺傳修飾的作物。在一些實(shí)施例中，該方法包括 iii)篩選遺傳修飾的作物，其中所述多聚核苷酸含有與編碼修飾作物內(nèi)源淀粉磷酸化和/ 或淀粉分解的因子的核酸序列可操作連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明描述了獲取與對照作物相比，至少某一部位的消化率 提高的遺傳修飾的作物的方法，該方法包括步驟i)獲取大量作物，其中至少一株基因組內(nèi) 含有異源多聚核苷酸，ii)從大量作物中鑒定一株與對照作物相比，至少某一部位的消化率 提高且含有異源多聚核苷酸的遺傳修飾的作物。在一些實(shí)施例中，該方法包括iii)篩選遺 傳修飾的作物，其中所述多聚核苷酸含有與編碼修飾作物內(nèi)源淀粉磷酸化和/或淀粉分解 的因子的核酸序列可操作連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。在另一個相關(guān)實(shí)施例中，本發(fā)明描述了測定與對照作物相比，遺傳修飾的作物，其 生產(chǎn)潛力、內(nèi)源轉(zhuǎn)葡糖基酶或至少某一部位的消化率是否提高的方法，該方法包括步驟i) 獲取一株或多株基因組內(nèi)含有異源多聚核苷酸的作物，以及ii)測定與對照作物相比，所 述一株或多株作物，其生產(chǎn)潛力、內(nèi)源轉(zhuǎn)葡糖基酶或至少某一部位的消化率是否提高，其中 所述多聚核苷酸含有與編碼修飾作物內(nèi)源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列 可操作連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。優(yōu)選地，步驟ii)直接鑒定或測定提高的生產(chǎn)潛力、提高的內(nèi)源轉(zhuǎn)葡糖基酶活性 或提高的消化率，包括評價其表型，和/或鑒定作物，其具有修飾的淀粉含量或組成如淀粉 磷酸化水平、與對照作物相比提高的生產(chǎn)潛力、至少一些細(xì)胞或器官中提高的內(nèi)源轉(zhuǎn)葡糖 基酶或至少某一部位提高的消化率。本發(fā)明還描述了鑒定與對照作物相比，使作物生產(chǎn)潛力提高的基因的方法，該方 法包括步驟i)獲取大量作物，每株基因組內(nèi)含有異源多聚核苷酸， )測定與對照作物 相比，每株的生產(chǎn)潛力以及任意地其內(nèi)源轉(zhuǎn)葡糖基酶或至少某一部位的消化率是否提高， iii)鑒定生產(chǎn)潛力提高的作物，以及iv)鑒定其中的異源多聚核苷酸，從而鑒定基因，其中 所述多聚核苷酸含有與編碼修飾作物內(nèi)源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列 可操作連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。本發(fā)明進(jìn)一步描述了鑒定與對照作物相比，能夠提高作物生產(chǎn)潛力，提高作物內(nèi) 源轉(zhuǎn)葡糖基酶或提高作物至少某一部位的消化率的多聚核苷酸的方法，該方法包括步驟i) 獲取一個或多個多聚核苷酸，每個核苷酸含有與編碼修飾作物內(nèi)源淀粉磷酸化和/或淀粉 分解的因子的核酸序列可操作連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，ii)將所述異源多聚核苷酸引入前體 細(xì)胞、組織、器官、種子或作物，iii)繁殖大量上述作物，iv)測定與對照作物相比，至少一 株含有異源多聚核苷酸的作物是否提高了生產(chǎn)潛力、提高了內(nèi)源轉(zhuǎn)葡糖基酶或至少某一部 位的消化率，以及ν)篩選所述多聚核苷酸。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了繁殖與對照作物相比，其生產(chǎn)潛力、內(nèi)源轉(zhuǎn)葡糖基 酶或至少某一部位的消化率提高的遺傳修飾的作物的方法。在一些實(shí)施例中，該方法包括 步驟i)獲取異源多聚核苷酸，其含有與編碼修飾作物內(nèi)源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的 因子的核酸序列可操作連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，ii)將所述異源多聚核苷酸引入前體細(xì)胞、組 織、器官、種子或作物，iii)獲取大量上述作物，至少其一基因組內(nèi)含有所述異源多聚核苷 酸，iv)從所述大量作物中鑒定與對照作物相比，其生產(chǎn)潛力、內(nèi)源轉(zhuǎn)葡糖基酶或至少某一 部位的消化率提高的且含有所述異源多聚核苷酸的作物，以及ν)篩選該作物，從而繁殖該遺傳修飾的作物。在另一個實(shí)施例中，該方法包括步驟i)誘變前體細(xì)胞、組織、器官、種子 或作物， )從中獲取大量作物，至少其一基因組內(nèi)含有異源多聚核苷酸，其含有與編碼修 飾作物內(nèi)源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，以 及iii)從所述大量作物中鑒定與對照作物相比，其生產(chǎn)潛力、內(nèi)源轉(zhuǎn)葡糖基酶或至少某一 部位的消化率提高的作物?？赏ㄟ^任何適當(dāng)?shù)姆椒▽⒛康漠愒炊嗑酆塑账嵋胱魑?。在一些?shí)施例中，該方 法包括將所述異源多聚核苷酸引入前體細(xì)胞、組織、器官、種子或作物并繁殖所述大量作物 的步驟。在其它實(shí)施例中，所述步驟包括轉(zhuǎn)化和/或誘變所述前體細(xì)胞、組織、器官、種子或 作物。在一些實(shí)施例中，所述目的因子下調(diào)在內(nèi)源淀粉磷酸化和/或淀粉分解中包含的 酶的編碼基因的表達(dá)或其功能活性。在特定的實(shí)施例中，所述因子下調(diào)作物內(nèi)源淀粉磷酸 化。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明方法進(jìn)一步包括檢測來自作物的核酸樣本以得到在淀粉 分解和/或淀粉磷酸化中包含的多肽的編碼基因的突變。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源淀粉磷酸化和/或淀粉分解是通過改變在淀粉分解和/或 淀粉磷酸化中包含的一種或多種酶或調(diào)控蛋白的表達(dá)或活性進(jìn)行修飾的，典型的酶選自 下述組，所述組包括α-淀粉酶(EC3.2. 1. 1)、β -淀粉酶(EC 3.2. 1.2)、葡萄糖淀粉酶 (EC 3. 2. 1. 3)、淀粉磷酸化酶(EC2. 4. 1. 1)、轉(zhuǎn)葡糖基酶(EC 3. 1. 33)、蔗糖酶-異麥芽糖酶 (EC3. 2. 10)、淀粉麥芽糖酶(EC 2. 4. 1. 25)、麥芽糖酶(EC 3. 2. 1. 20)、異淀粉酶和α -葡 聚糖水二激酶(α -glucan，water dikinase，GffD, EC 2. 7. 9. 4)。在特定的實(shí)施例中，內(nèi)源 淀粉磷酸化和/或淀粉分解是通過提高α“淀粉酶或β“淀粉酶的表達(dá)活性，和/或降低 GffD的表達(dá)活性進(jìn)行修飾的。在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括降低磷酸多糖水二激酶 (phosphoglycan，water dikinase, PffD, EC 2.7.9.5)的表達(dá)活性。在優(yōu)選實(shí)施例中，所述 調(diào)控蛋白不是擬南芥和/或馬鈴薯中sexl和/或sex4基因編碼的蛋白。在一些實(shí)施例中，所述目的因子表達(dá)于作物的貯藏器官，如發(fā)育的籽粒、根、塊莖 或莖中。在特定的實(shí)施例中，所述因子表達(dá)于作物的光合活性組織中。在其它特定的實(shí)施 例中，所述內(nèi)源淀粉磷酸化和/或淀粉分解是過渡淀粉的。在一些典型的與提高內(nèi)源轉(zhuǎn)葡糖基酶有關(guān)的實(shí)施例中，所述轉(zhuǎn)葡糖基酶為α-淀 粉酶、β “淀粉酶、葡萄糖淀粉酶或轉(zhuǎn)葡糖基酶或它們的組合。本發(fā)明描述的方法不限于特定作物類型。參考作物包括選自下述作物草、蔬菜、 谷類、豆類和結(jié)實(shí)或開花作物。在一些實(shí)施例中，所述谷類為小麥、谷物(玉米)、大麥、水 稻、黑麥、燕麥、小米、高粱、黑小麥、蕎麥、福尼奧米、茱藜、斯佩爾特小麥、硬粒小麥、面包小 麥、單粒小麥、莧菜、野生稻或畫眉草。在上述方法的一些實(shí)施例中，所述目的遺傳修飾的作物進(jìn)一步含有異源多聚核苷 酸，其編碼的因子下調(diào)α-淀粉酶或β-淀粉酶的表達(dá)或活性，或α-淀粉酶或β-淀粉酶 編碼基因的突變。在一些實(shí)施例中，作物選自至少一種作物器官中α-淀粉酶或β-淀粉酶 的表達(dá)或活性降低的作物。在一些實(shí)施例中，所述因子表達(dá)于貯藏器官中或所述α-淀粉 酶或淀粉酶編碼基因表達(dá)于貯藏器官中。在其它實(shí)施例中，所述因子為下調(diào)二激酶表 達(dá)的RNA分子。在一些實(shí)施例中，轉(zhuǎn)葡糖基酶結(jié)合下調(diào)表達(dá)，如α-淀粉酶和β-淀粉酶。
另一方面，本發(fā)明提供通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的作物、作物部分和作物產(chǎn)品，它們的 應(yīng)用以及作物、作物部分和作物產(chǎn)品的加工。所述作物或作物部分可根據(jù)本發(fā)明描述的任 一方法或它們的任意組合進(jìn)行修飾。因此，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明方法獲取的、生產(chǎn)的或 鑒定的遺傳修飾的作物。參考作物或作物部分包括作物的籽粒、葉片、莖、根、塊莖、花、果 實(shí)、豆莢或從作物得到的插條部分。更具體地，本發(fā)明描述了遺傳修飾的作物，其基因組內(nèi)含有異源多聚核苷酸，其含 有與編碼修飾作物內(nèi)源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作連接的轉(zhuǎn)錄 調(diào)控序列，其中所述作物特征在于，與對照作物相比，其具有修飾的淀粉磷酸化和/或淀粉 分解，此外其具有提高的生產(chǎn)潛力、提高的內(nèi)源轉(zhuǎn)葡糖基酶和/或至少某一部位提高的消化率。因此，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了遺傳修飾的作物，其基因組內(nèi)含有引入的突 變，該突變基因編碼內(nèi)源淀粉磷酸化多肽和/或淀粉分解酶，其中所述作物特征在于，與對 照作物相比，其具有提高的生產(chǎn)潛力、提高的內(nèi)源轉(zhuǎn)葡糖基酶和/或至少某一部位提高的 消化率。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供了遺傳修飾的作物，其基因組內(nèi)含有一個或多個異 源多聚核苷酸，各多聚核苷酸含有與編碼修飾作物內(nèi)源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子 的核酸序列可操作連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，其中所述作物特征在于，與對照作物相比，至少所 述作物的一部分具有降低的淀粉磷酸化和/或淀粉分解，作物成熟籽粒中提高的或降低的 轉(zhuǎn)葡糖基酶，優(yōu)選為淀粉酶的表達(dá)和/或活性，以及提高的生產(chǎn)潛力。在其它實(shí)施例中，所 述的作物其至少在作物的第一器官中顯示出靶淀粉磷酸化多肽和/或淀粉分解酶降低的 水平且任意地，至少在作物的第二器官中顯示出靶淀粉磷酸化多肽和/或淀粉分解酶升高 的水平，其中第一或第二器官為相同的或不同的器官。在一些實(shí)施例中，所述靴多肽或酶選 自由下述物質(zhì)組成的組α “淀粉酶、β “淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、淀粉磷酸化酶、轉(zhuǎn)葡糖基 酶、蔗糖酶_異麥芽糖酶、淀粉麥芽糖酶、麥芽糖酶、異淀粉酶和α “葡聚糖水二激酶。在典型的實(shí)施例中，所述因子下調(diào)在內(nèi)源淀粉磷酸化和/或淀粉分解中包含的酶 的表達(dá)或功能活性。在一些實(shí)施例中，所述因子下調(diào)二激酶的水平或功能活性。在一些實(shí) 施例中，所述二激酶為GWD或GWD和PWD。在一些實(shí)施例中，所述因子表達(dá)于作物的貯藏器官中。在其它實(shí)施例中，所述因子 表達(dá)于作物的光合活性組織中。在典型的實(shí)施例中，所述淀粉磷酸化和/或淀粉分解是過 渡淀粉的。本發(fā)明還提供葉片和/或谷粒中降低的淀粉磷酸化以及谷粒中升高的轉(zhuǎn)葡糖基 酶的谷粒。除了提高作物生產(chǎn)力之外，兩個特征的結(jié)合給谷粒的應(yīng)用帶來了特殊的益處。與 對照作物相比，二者的結(jié)合使淀粉磷酸化下降至至少50%，優(yōu)選至少70%，至少80%，至少 90%或至少95%。與對照作物相比，二者的結(jié)合使轉(zhuǎn)葡糖基酶，優(yōu)選為α-淀粉酶升高至至 少100 %，優(yōu)選至少200 %，至少300 %或更優(yōu)選500 %。本發(fā)明中描述的作物組合物不限于特定的作物類型。參考作物包括作物選自被 子作物、單子葉作物、雙子葉作物、草、蔬菜、谷類、豆類和結(jié)實(shí)或開花作物或這些類別的任 意組合形成的亞類。在一些實(shí)施例中，修飾的雙子葉作物被改良。在特定的實(shí)施例中，禾本 科單子葉作物如谷類作物、甘蔗、甜菜、高粱、黑麥等生產(chǎn)力增加。
在一些實(shí)施例中，谷類為小麥、谷物(玉米)、大麥、水稻、黑麥、燕麥、小米、高粱、 黑小麥、蕎麥、福尼奧米、茱藜、斯佩爾特小麥、硬粒小麥、面包小麥、單粒小麥、莧菜、野生稻 或畫眉草。小麥可以是面包小麥(六倍體小麥)、硬粒小麥或黑小麥。玉米優(yōu)選為馬齒型玉 米，可以是白玉米或黃玉米。在一些實(shí)施例中，作物并非擬南芥和/或玉米。在一些實(shí)施例中，所述表達(dá)調(diào)控序列優(yōu)先調(diào)控貯藏器官中和/或作物光合活性組 織中多聚核苷酸的表達(dá)。在其它實(shí)施例中，所述作物進(jìn)一步含有多聚核苷酸，其可操作地連接于編碼下調(diào) 淀粉酶活性的因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。在其它實(shí)施例中，所述作物部分特征在于與對照作物部分相比，具有修飾的淀粉 含量或組成，提高的生產(chǎn)潛力，提高的內(nèi)源轉(zhuǎn)葡糖基酶或提高的消化率。在特定的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了含淀粉的籽粒，其中籽粒淀粉中葡萄糖-6-磷 酸的水平低于lOng/mg淀粉，籽粒粉中淀粉酶活力水平至少為4個單位/g粉。本發(fā)明涉及遺傳修飾的作物的產(chǎn)品。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供產(chǎn)品，其為加工的谷物、面粉、全麥粉或至少部分純 化的淀粉，其中所述產(chǎn)品與對照作物的產(chǎn)品相比，具有修飾的淀粉含量或總淀粉組成。本發(fā)明公開了生產(chǎn)產(chǎn)品的方法，包括使作物生長和/或收獲作物或部分遺傳修飾 的作物。在一些實(shí)施例中，所述方法用于從遺傳修飾的作物中生產(chǎn)加工的谷物、面粉、全麥 粉或至少部分純化的淀粉，包括加工作物局部如谷粒。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)食物產(chǎn)品的方法，包括將所述作物或部分或 所述產(chǎn)品與另一食物成分混合，并任意烹調(diào)、烘烤、油煎、蒸煮、煮沸、擠壓或其它加工所述 混合物的方法。在另一個實(shí)施例中，所述產(chǎn)品為發(fā)酵產(chǎn)品，本發(fā)明描述了發(fā)酵產(chǎn)品的方法，所述產(chǎn) 品為加工的谷物、面粉、全麥粉或至少部分純化的淀粉，其中所述產(chǎn)品與對照作物的產(chǎn)品相 比，具有修飾的淀粉含量或修飾的總淀粉組成，或通過從遺傳修飾的作物中加工作物局部 如谷粒生產(chǎn)的面粉或淀粉。在一些實(shí)施例中，所述發(fā)酵產(chǎn)品為乙醇。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供供給人類或動物食物的方法，包括將此處或上述 遺傳修飾的作物、作物部分、產(chǎn)品或通過所述方法生產(chǎn)的產(chǎn)品提供給人類或動物。在一些實(shí) 施例中，本發(fā)明提供通過上述或此處方法生產(chǎn)的產(chǎn)品。另一方面，本發(fā)明公開了應(yīng)用異源多聚核苷酸生產(chǎn)與對照作物相比，生產(chǎn)潛力提 高、內(nèi)源轉(zhuǎn)葡糖基酶提高或其籽?；蚱淦鞴俚闹辽僖徊糠窒侍岣叩淖魑?，其中所述多 聚核苷酸含有與編碼修飾作物內(nèi)源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作 連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供此處或上述遺傳修飾的含淀粉的作物或其部分的 應(yīng)用，生產(chǎn)食物產(chǎn)品或非食物產(chǎn)品，或作為動物飼料以增強(qiáng)動物的生長或健康。在一些實(shí)施 例中，所述產(chǎn)品為乙醇。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明公開了應(yīng)用作物或其部分生產(chǎn)人類消耗的食物，其中 作物或其部分通過引入至少兩個異源多聚核苷酸進(jìn)行遺傳修飾，其中作物特征在于，其生 產(chǎn)潛力提高，作物葉片中的淀粉磷酸化和/或淀粉分解降低，作物籽粒中的內(nèi)源轉(zhuǎn)葡糖基 酶降低，其中各異源多聚核苷酸含有與編碼修飾作物內(nèi)源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了鑒定或使用與對照作物相比，作物生產(chǎn)潛力、提 高的內(nèi)源轉(zhuǎn)葡糖基酶或籽?；蛑辽僮魑锏牟课幌侍岣叩姆肿訕?biāo)記的方法，該方法包括 獲取作物的核酸樣本，鑒定編碼作物GWD基因的多態(tài)性或其遺傳連接。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了測定作物的方法，包括獲取作物的核酸樣本，處 理樣本以測定GWD基因中選擇核苷酸的同一性，并鑒定任何與作物生產(chǎn)潛力有關(guān)的核苷 酸。本發(fā)明提供新的核酸分子。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明描述了含有編碼α-葡聚糖 水二激酶多肽或與其互補(bǔ)的核苷酸序列的分離的或嵌合的核酸分子，所述α “葡聚糖水二 激酶多肽含有如SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列或其生物活性部分或至少具有SEQ ID NO 3序列90%同源性的變化形式。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了含有與SEQ ID NO :2或SEQ IDNO :5或SEQ ID NO :8 或 SEQ ID NO :9 或 SEQ ID NO 10 (水稻 GWD)或 SEQ ID NO :11，12，13 或 14(高粱 GWD)所示核苷酸序列或其編碼蛋白或其生物活性部分或與SEQ ID NO :2(小麥GWD)或SEQ ID N0:5(小麥 GWD)或 SEQ ID NO :8，9 或 10 (水稻 GWD)或 SEQ ID NO: 11，SEQID NO :12， SEQ ID N0:13或SEQ ID NO 14 (高粱GWD)所示核苷酸序列或其蛋白編碼區(qū)90%序列同源 性的變化形式一致或互補(bǔ)的核苷酸序列的分離的或嵌合的核酸分子。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明描述了含有在嚴(yán)格條件下與SEQ IDNO :2或SEQ ID NO 5 或SEQ ID NO :8，9或10所示核苷酸序列或其編碼蛋白或其生物活性部分或與SEQ ID NO 2 (小麥 GWD)或 SEQ IDNO :5(小麥 GWD)或 SEQ ID N0:8，SEQ ID NO :9 或 SEQ ID N0:10(水 稻 GWD)或 SEQ ID NO 11 或 SEQ ID NO 12 或 SEQ ID NO 13 或 SEQ ID NO :14(高粱 GWD) 所示核苷酸序列或其蛋白編碼區(qū)90%序列同源性的變化形式雜交的核苷酸序列的分離的 或嵌合的核酸分子。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了含有與轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列可操作連接的核酸分子的嵌 合核酸構(gòu)型。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了能夠降低谷類作物中編碼具有GWD活性的多 肽的基因表達(dá)的分離的或嵌合的核酸分子。在一些實(shí)施例中，所述的核酸分子為或編碼反 義RNA、共抑制RNA、雙鏈RNA、發(fā)夾RNA或核酶。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明描述了應(yīng)用分離的或嵌合的核酸分子降低谷類作物中編 碼具有GWD活性的多肽的基因的表達(dá)。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了含有20個連續(xù)核苷酸的單鏈核酸探針，其中所 述20個核苷酸的核苷酸序列與含有SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :5或SEQ ID N0:8，9或 10 (水稻 PWD)或 SEQ ID N0:11 或 SEQ ID N0:12 或 SEQ ID N0:13 或 SEQ ID N0:14(高粱 GWD)所示核苷酸序列或其編碼蛋白或其生物活性部分或與SEQ ID NO :2(小麥GWD)或SEQ ID N0:5(小麥 GWD)或 SEQ ID N0:8，SEQ ID NO :9 或 SEQ ID NO 10 (水稻 PWD)或 SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQID N0:13 或 SEQ ID N0:14(高粱 GWD)所示核苷酸序列或其蛋 白編碼區(qū)90%序列同源性的變化形式的核酸分子的補(bǔ)體序列相同。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了含有20個連續(xù)核苷酸的單鏈核酸探針，其中所 述20個核苷酸的核苷酸序列與含有在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :8，SEQ ID NO 9 或 SEQ IDNO :10(水稻 PWD)或 SEQ ID NO :11，SEQ ID NO :12，SEQ
15ID N0:13或SEQ ID NO :14(高粱GWD)所示核苷酸序列或其編碼蛋白或其生物活性部分或 與 SEQ ID NO 2(小麥 GffD)或 SEQ ID NO 5(小麥 GffD)或 SEQ ID NO :8，SEQ ID NO 9 或 SEQ ID NO :10(水稻 PWD)或 SEQ ID NO :11，SEQ ID NO :12，SEQ ID NO 13 或 SEQ ID NO 14(高粱GWD)所示核苷酸序列或其蛋白編碼區(qū)90%序列同源性的變化形式雜交的核苷酸 序列的核酸分子序列相同。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了含有20個連續(xù)核苷酸的單鏈核酸探針，其中所 述20個核苷酸的核苷酸序列與含有編碼α-葡聚糖水二激酶多肽的含有如SEQ ID NO 3 所示的核苷酸序列或其生物活性部分或至少90% SEQ ID NO :3序列同源性的變化形式的 核酸分子的補(bǔ)體序列相同。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了附著于固體支持物的核酸分子陣列，該陣列含
有的寡核苷酸選擇性地與含有谷類作物中編碼具有GWD活性的多肽的基因的核酸分子雜 、-父。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了含有上述分離的或嵌合的核酸分子或含有與轉(zhuǎn) 錄調(diào)控序列可操作連接的所述核酸分子的構(gòu)型的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、作物細(xì)胞、作物局 部、作物或籽粒。在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)型表達(dá)于宿主細(xì)胞、作物細(xì)胞、作物、作物局部或 籽粒中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)谷類GWD多肽或其變化形式的方法，或生產(chǎn)生物活性片段或其 變化形式的方法，所述方法包括在宿主細(xì)胞、作物細(xì)胞、作物、作物局部或籽粒中表達(dá)該構(gòu) 型。因此，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了改良作物的方法，該方法包括步驟i)獲取 大量作物，其中至少一株基因組內(nèi)含有異源多聚核苷酸，ii)從大量作物中鑒定一株與對照 作物相比，生產(chǎn)潛力提高且含有異源多聚核苷酸的作物，以及iii)篩選遺傳修飾的作物， 其中所述多聚核苷酸含有與編碼修飾作物內(nèi)源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸 序列可操作連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，其中所述遺傳修飾的作物與對照作物相比，提高了生產(chǎn) 潛力。在另一個相關(guān)實(shí)施例中，本發(fā)明描述了改良作物的方法，該方法包括步驟i)獲取 大量作物，其中至少一株基因組內(nèi)含有異源多聚核苷酸，ii)從大量作物中鑒定一株與對照 作物相比，轉(zhuǎn)葡糖基酶提高且含有異源多聚核苷酸的遺傳修飾的作物，以及iii)篩選遺傳 修飾的作物，其中所述多聚核苷酸含有與編碼修飾作物內(nèi)源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的 因子的核酸序列可操作連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，其中所述遺傳修飾的作物與對照作物相比， 提高了內(nèi)源轉(zhuǎn)葡糖基酶。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明描述了改良作物的方法，該方法包括步驟i)獲取大量 作物，其中至少一株基因組內(nèi)含有異源多聚核苷酸，ii)從大量作物中鑒定一株與對照作物 相比，至少某一部位的消化率提高且含有異源多聚核苷酸的遺傳修飾的作物，以及iii)篩 選遺傳修飾的作物，其中所述多聚核苷酸含有與編碼修飾作物內(nèi)源淀粉磷酸化和/或淀粉 分解的因子的核酸序列可操作連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，其中所述遺傳修飾的作物與對照作物 相比，提高了至少某一部位的消化率。在另外的實(shí)施例中，本發(fā)明描述了改良作物的方法，該方法包括步驟i)獲取一株 或多株基因組內(nèi)含有異源多聚核苷酸的作物，以及ii)測定與對照作物相比，所述一株或 多株作物，其生產(chǎn)潛力、內(nèi)源轉(zhuǎn)葡糖基酶或至少某一部位的消化率是否提高，其中所述多聚核苷酸含有與編碼修飾作物內(nèi)源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作連 接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，其中所述遺傳修飾的作物與對照作物相比，提高了生產(chǎn)潛力，提高了內(nèi) 源轉(zhuǎn)葡糖基酶或提高了至少某一部位的消化率。在另外的實(shí)施例中，本發(fā)明描述了改良作物的方法，該方法包括步驟i)獲取異源 多聚核苷酸，其含有與編碼修飾作物內(nèi)源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可 操作連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，ii)將所述異源多聚核苷酸引入前體細(xì)胞、組織、器官、種子或作 物，iii)獲取大量上述作物，至少其一基因組內(nèi)含有所述異源多聚核苷酸，iv)從所述大量 作物中鑒定與對照作物相比，其生產(chǎn)潛力、內(nèi)源轉(zhuǎn)葡糖基酶或至少某一部位的消化率提高 的且含有所述異源多聚核苷酸的作物，以及V)篩選該作物，從而繁殖該遺傳修飾的作物， 其中所述遺傳修飾的作物與對照作物相比，提高了生產(chǎn)潛力，提高了內(nèi)源轉(zhuǎn)葡糖基酶或提 高了至少某一部位的消化率。在另外的實(shí)施例中，本發(fā)明描述了改良作物的方法，該方法包括步驟i)誘變前體 細(xì)胞、組織、器官、種子或作物，ii)從中獲取大量作物，至少其一基因組內(nèi)含有異源多聚核 苷酸，其含有與編碼修飾作物內(nèi)源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作連 接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，以及iii)從所述大量作物中鑒定與對照作物相比，其生產(chǎn)潛力、內(nèi)源 轉(zhuǎn)葡糖基酶或至少某一部位的消化率提高的且含有所述異源多聚核苷酸的作物，其中所述 遺傳修飾的作物與對照作物相比，提高了生產(chǎn)潛力，提高了內(nèi)源轉(zhuǎn)葡糖基酶或提高了至少 某一部位的消化率。


圖1圖表顯示了 rsGWD轉(zhuǎn)基因小麥系的谷物淀粉中葡萄糖_6_磷酸G6P含量。圖2圖表顯示了 rsGWD轉(zhuǎn)基因小麥的谷物淀粉中淀粉酶含量。圖3圖表數(shù)據(jù)顯示了 rsGWD轉(zhuǎn)基因小麥的谷物淀粉的溶脹力。圖4圖表數(shù)據(jù)顯示了 rsGWD轉(zhuǎn)基因小麥的谷物淀粉(或者是不含α -淀粉酶抑制 劑的全麥粉，或者是含有α-淀粉酶抑制劑的純化淀粉)的糊化性質(zhì)(淀粉粘性)。圖5數(shù)據(jù)顯示了與對照相比，提高的rsGWD轉(zhuǎn)基因小麥籽粒的α _淀粉酶活力。圖6圖片顯示了 rsGWD轉(zhuǎn)基因小麥提高的活力、生物量和產(chǎn)率。圖7圖表數(shù)據(jù)顯示了 rsGWD轉(zhuǎn)基因小麥系的過渡(葉片)淀粉中降低的G6P含量 水平。圖8圖表數(shù)據(jù)顯示了不同遺傳背景的轉(zhuǎn)基因小麥系中每株增加的穗狀花序量。圖9圖表數(shù)據(jù)顯示了與對照相比，rsGWD轉(zhuǎn)基因小麥籽粒提高的α _淀粉酶活力。表格說明表1提供了本發(fā)明SEQ ID NOs的說明。表2提供了氨基酸亞類。表3提供了典型的氨基酸取代。表4提供了 rsGWD轉(zhuǎn)基因小麥的粘度值。表5提供了 rsGWD轉(zhuǎn)基因小麥的生長分析(籽粒重量、籽粒產(chǎn)率)結(jié)果。表6提供了 rsGWD轉(zhuǎn)基因小麥的生長分析(葉面積、分蘗、花冠)結(jié)果。表7提供了與水稻GWD相比，小麥的外含子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。
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優(yōu)選實(shí)施方式詳述下文中所有說明書和權(quán)利要求中，除非上下文中有要求，術(shù)語“包含(comprise)” 及其變體，如“包含(comprises) ”和“含有(comprising) ”應(yīng)該被理解為表示包含規(guī)定的整 數(shù)或步驟或整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其它的整數(shù)或步驟或整數(shù)或步驟的組。不論短 語“由...組成(consisting of) ”跟隨的是什么，“由...組成(consisting of)，，的含義 都為“包括(including)”且僅限于。因此短語“由...組成(consisting of)”表示列出
的成分是必須的或強(qiáng)制性的，并且沒有其它成分存在。“基本由......組成(consisting
essentially of)"表示包含短語后列出的任何成分，并限于那些不會對公開的列出成分 的活性或特定功能有干擾或貢獻(xiàn)的其它成分。因此，短語"基本由...組成(consisting essentially of)“表示列出的成分是必須或強(qiáng)制性的，但可選擇性地有其它成分，其根據(jù) 它們是否會影響列出成分的活性或功能而出現(xiàn)或不出現(xiàn)。除非有特別規(guī)定，否則本說明書中的每個具體實(shí)施方式
均可通過適當(dāng)變動而變成 其它的具體實(shí)施方式
。核苷酸及氨基酸序列用序列標(biāo)識碼(SEQ ID NO )表示。SEQ IDNos對應(yīng)序列標(biāo) 識中的數(shù)字，<400>1(SEQ ID NO 1), <400>2 (SEQ IDNO :2)，等。序列標(biāo)識的說明見實(shí)施例 后的表1。權(quán)利要求書后給出了序列列表。除非進(jìn)行定義，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本領(lǐng)域技術(shù)人員 對其適合于發(fā)明的一般理解的含義相同。盡管任何與本文中描述的相類似或等價的方法和 物質(zhì)都可以用于實(shí)施或測試本發(fā)明，但是本文描述了優(yōu)選的方法和物質(zhì)。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明 的目的，下文對下列術(shù)語進(jìn)行了定義。本文中使用的冠詞“一 (a) ”和”一種/ 一個(an) ”是指一件或多于一件(即至少 一件)的文章的語法對象。例如，“成分”是指一種成分或多于一種成分。本文中使用的術(shù)語“約(about)”是指數(shù)量、水平、價值、尺度、長度、位置、尺寸或 含量在所述數(shù)量、水平、價值、尺度、長度、位置尺寸或含量水平的30%左右范圍變化，優(yōu)選 20%范圍左右，更優(yōu)選10%范圍左右。淀粉本發(fā)明是基于如下發(fā)現(xiàn)的，植物中特別是葉片中淀粉磷酸化和淀粉降解中的基因 的改性表達(dá)與植物的產(chǎn)量參數(shù)，如谷物產(chǎn)量的驚人影響相關(guān)。由于之前的研究已經(jīng)表明，改 性淀粉的合成或貯藏會導(dǎo)致產(chǎn)量的降低，因此其是令人驚訝的。通常不期望葉片中過渡淀 粉磷酸化或降解減少，其包括將固定碳聚集到植物的其它部分，會導(dǎo)致產(chǎn)量增加?！暗矸邸痹诒疚闹斜欢x為基本上由α-吡喃葡萄糖構(gòu)成的多糖。淀粉是植物， 如谷物包括小麥中貯存的主要碳水化合物。淀粉被合成為淀粉體并以顆粒形式形成且貯 藏在生長中的貯藏器官，如谷物中；本文中指“貯藏淀粉”。它包括直鏈淀粉，基本上線性 (<0. 的分支)的α-1，4-D-吡喃葡萄糖聚合體，和支鏈淀粉，其具有α-D-吡喃葡萄 糖的短鏈單元，其是預(yù)先通過α-1，4鍵與α _1，6連接分支連接的。來自野生型植物的谷 物淀粉包括高達(dá)約20% -30%的直鏈淀粉和約70% -80%的支鏈淀粉。直鏈淀粉和支鏈淀 粉的另一個顯著不同在于聚合體的分子量。直鏈淀粉具有螺旋狀的構(gòu)造，具有IO4-IO6道 爾頓的分子量，而支鏈淀粉具有約IO7至IO8道爾頓的分子量。最近的研究表明，在直鏈淀 粉中可能存在約0.1%的α-1，6-糖苷分支點(diǎn)，因此其被稱為“基本上線性”?！爸辨湹矸邸痹诒疚闹斜欢x為包括基本線性分子的，連接有α-1，4糖苷(吡喃葡萄糖)單元，且直鏈 淀粉狀的長鏈支鏈淀粉(有時也被稱為“中間物質(zhì)”或“直鏈淀粉狀支鏈淀粉” Takeda等， 1993b ；Fergason, 1994)。本文中定義的淀粉中直鏈淀粉的比例是基于重量/重量(w/w)的， 即直鏈淀粉重量相對于谷物淀粉總重量的百分比。直鏈淀粉含量可以通過本領(lǐng)域已知的任 意方法測定，包括HPLC尺寸排除法，例如在90% (w/v)的DMSO中，刀豆素A法(Megazyme Int, Ireland)，或優(yōu)選通過碘量法，例如實(shí)施例1中所描述的。HPLC法可以包括淀粉的脫 支(Batey and Curtin，1996)或不包括脫支。淀粉是最初在葉子和植物的其它綠色組織中合成并累積作為光合作用的產(chǎn)物。本 文中的淀粉是指“過渡淀粉“或類似物，這是因為，與種子或塊莖中的淀粉相比，其白天在光 合作用組織中累積而至少在晚上降解。因此，合成酶和降解酶都會同時在細(xì)胞中存在，且系 統(tǒng)會每天進(jìn)行調(diào)節(jié)。在晚上，過渡淀粉被水解成糖，基本上是蔗糖，其從供源組織被傳送到 能源貯存組織而作為新陳代謝的能量來源被用于植物生長或作為貯藏淀粉被貯藏在組織 中。近來Zeeman等于2004研究了葉片中過渡淀粉的分解。該分解通過酶，如淀粉酶，脫支 酶，α-葡聚糖磷酸化酶和葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的功能實(shí)現(xiàn)。幾乎所有的植物淀粉都可被磷酸化成具有C3和C6羥基基團(tuán)長度的支鏈淀粉，但 是磷酸化作用的程度的變化取決于植物的種類。馬鈴薯塊莖淀粉通常在每mg淀粉中具有 2511!1101^的葡糖糖-6-磷酸，范圍在0.2-0.4% (w/w) 0馬鈴薯淀粉中的多數(shù)磷酸鹽基團(tuán) 是與支鏈淀粉連接的，僅有非常少的與直鏈淀粉連接。與馬鈴薯淀粉相比，谷物淀粉僅含有 0. 02-0. 04%的磷酸鹽。本文中使用的“磷酸化淀粉”是指那些在葡糖糖單位的C-3和/或 C-6位置連接有磷酸鹽基團(tuán)作為單酯的淀粉。淀粉樣品中磷酸鹽基團(tuán)的水平可以通過本領(lǐng) 域已知的方法測定，優(yōu)選通過實(shí)施例1中所描述的孔雀綠方法測定，其通常表示為每毫克 淀粉中的毫摩爾數(shù)。淀粉樣品中殘留的葡糖基-6-磷酸鹽可以通過實(shí)施例1中所描述的葡 糖苷酶測定法測定。淀粉的降解所有葉片和發(fā)芽種子中的淀粉降解的初始步驟包括內(nèi)切淀粉酶(α-淀粉酶， EC3. 2. 1. 1)，其在發(fā)芽種子中是由糊粉層分泌的，但是在葉片中其存在葉綠體中。該酶在特 定點(diǎn)攻擊淀粉的淀粉顆粒而使顆粒表面凹陷。對淀粉分子的進(jìn)一步攻擊通過α-葡聚糖 磷酸化酶(EC2. 4. 1. 1)，其由α -1，4葡聚糖鏈的非還原性末端產(chǎn)生葡萄糖磷酸鹽，以 及脫支酶，如異淀粉酶(EC3. 2. 1. 68)和支鏈淀粉酶(EC3. 2. 2. 142)進(jìn)行，它們?nèi)コ?-1， 6支點(diǎn)。其中包括的其它酶有，外切型淀粉酶，淀粉酶(EC3. 2. 1.2)，其從葡聚糖鏈的 非還原性末端釋放出麥芽糖，岐化酶(D-酶，EC2. 4. 1. 25)和α -葡糖苷酶(麥芽糖酶， EC3. 2. 1. 20)或麥芽糖磷酸化酶(EC2. 4. 1. 8)，其能作為直鏈。在擬南芥和其它雙子葉植物 中，β -淀粉酶的活性超過其它葡聚糖_代謝酶約一個數(shù)量級，且在葉綠體的內(nèi)部和外部都 有出現(xiàn)。葡聚糖，水二激酶(GWD，EC2. 7. 9. 4)能夠調(diào)節(jié)其它酶攻擊淀粉顆粒的程度。GWD將 ATP的β -磷酸轉(zhuǎn)移到支鏈淀粉中糖基單元的C6或C3位置，且該磷酸的存在可能是降解發(fā) 生的信號。我們認(rèn)為磷酸基團(tuán)的存在可能會改變葡聚糖鏈之間或與蛋白質(zhì)之間的靜電作 用，而使該過程開始。在淀粉降解期間，GWD是與葉片淀粉顆粒結(jié)合的(Ritte等，2000)，且 其在該階段具有更高的活性。至少在一些植物中，通過晝/夜的循環(huán)GWD自身的活性似乎 也被調(diào)節(jié)為晝夜模式的。
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減少馬鈴薯中GWD(也叫作Rl蛋白或OKI)表達(dá)的反義實(shí)驗減少了高達(dá)90%結(jié) 合了磷酸的淀粉(Viks0,-Nielsen等，2001)。Arabidopsis thaliana中同源基因的突變 (稱為淀粉過顯型sexl)與淀粉磷酸含量的抑制作用有關(guān)，并證實(shí)在淀粉的磷酸化中包含 GffD (Zeeman和Rees，1999)。此外，擬南芥突變體和馬鈴薯抑制系都表現(xiàn)出“淀粉過量”的表 型，其中累積的淀粉超過了葉片中的普通水平，證實(shí)了 GWD在過渡淀粉降解中的作用。在這 些研究中沒有觀察到這些植物中淀粉結(jié)構(gòu)的變化。馬鈴薯塊莖中淀粉磷酸含量的降低伴隨 著馬鈴薯塊莖的“低溫糖化”的減少(Lorberth等.，1998)，這表明淀粉酶或其它水解酶的 活性降低了。擬南芥sexl突變體影響其中過渡淀粉的代謝，也會改變碳水化合物的代謝， 使其生長緩慢并延遲開花(Yu等，2001)。2005年，Baunsgaard等定義了一種新類型的水二激酶，磷酸葡萄糖水二激 酶(PWD)。該酶既與GWD類似卻又不同，其會在之后的預(yù)磷酸化淀粉的磷酸化中被激活 (Kotting等，2005)。Ritte等提出，淀粉中C3或C6位置的葡萄糖殘基的磷酸化作用可通 過PffD和GffD分別催化(Ritte G.等，2006)。發(fā)芽谷物種子中淀粉的降解和磷酸化部分已知，但是其是包括組織退化和水解酶 誘導(dǎo)的高度專門的系統(tǒng)。在一些具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了通過改變植物中淀粉磷酸化和/或降解作 用而提高了植物的生產(chǎn)率或利用度，且其是基于對兩者聯(lián)系的觀測結(jié)果的。淀粉磷酸化和 /或降解的修飾可存在于過渡淀粉中，例如，在植物葉片中，或是在例如谷物的貯藏淀粉中， 或者存在于兩者中。根據(jù)本發(fā)明，植物的修飾，特別是谷類作物，包括卻不限于葉片和/或 胚乳中的一種或多種對淀粉磷酸化和/或降解(分解)酶的活性或含量的改變。本文中使用的“修飾”表示，對物質(zhì)或其功能的變化，其可以是產(chǎn)品數(shù)量、活性、比 例，鈍化率，分解率的增加或減少，開始延遲，開始提前，物質(zhì)增加或去除，突變或它們的任 意組合，只要最終是功能上的改變即可。本文中使用的“對功能水平的調(diào)節(jié)”或類似術(shù)語表 示，感興趣的基因或蛋白質(zhì)的功能水平的增加或降低?！肮δ芩健睉?yīng)該被理解為是指活性 蛋白的水平，in casu蛋白能夠進(jìn)行淀粉磷酸化或淀粉降解的水平。該功能水平是與宿主 細(xì)胞中存在的蛋白質(zhì)的實(shí)際水平和蛋白質(zhì)的特定活性相關(guān)的。因此，例如功能水平可以通 過增加或降低宿主細(xì)胞中的實(shí)際蛋白濃度來改變，其可以通過改變基因編碼蛋白的表達(dá)而 容易地實(shí)現(xiàn)。功能水平還可以通過調(diào)節(jié)蛋白的特定活性來改變。特定活性的增加或降低可 以通過用更高或更低的特定活性表達(dá)或通過用該變量的等位基因編碼代替相關(guān)蛋白的內(nèi) 源基因編碼來獲得。特定活性的增加或降低還可以通過效應(yīng)分子的表達(dá)來激活。在某個具 體實(shí)施方式中，酶的適當(dāng)編碼順序或活性或含量的表達(dá)水平是經(jīng)過選擇的，其比參照的表 達(dá)水平高出至少約10%，至少20%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少80% 或甚至至少約100%，至少200%，至少500%，或至少1000% ；或比其低至少約10%，至少 20%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少 92 %，至少94 %，至少96 %，至少97 %，至少98 %或至少99 %，或降低到無法檢測的水平。本文中使用的術(shù)語“修飾”，“改變”，“增加”，“減少”，“降低”，“已降低”，“抑制”，“突 變”或類似詞匯被認(rèn)為是相對性的術(shù)語，即與野生型或未改變型比較。本文中的野生型植物 也是指“對照植物”，且該術(shù)語可以轉(zhuǎn)換的?！暗鞍姿健笔侵柑囟ǖ鞍椎牧?，如GWD，其可以 通過本領(lǐng)域已知的任何方法測得，例如Western印跡分析法或其它免疫學(xué)方法?！懊富钚运健笔侵该笝z驗中測定的特定酶的量。如果生產(chǎn)了更多或更少的活性蛋白，但是卻不是蛋白 自身的表達(dá)水平(量)，則酶活性水平能在突變體中被改變就是我們所期望的。相反，蛋白 的量會被改變，而活性(每單位蛋白)卻保持不變。含量和活性都減少也是可能的，例如，當(dāng) 酶的基因編碼表達(dá)在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后被降低時。在某個具體實(shí)施方式
中，與葉片或未修飾的 谷物，如小麥胚乳中的蛋白水平或活性相比，例如GWD的蛋白水平或活性降低了至少40%， 或至少60%，或至少75%，至少90%或至少95%。蛋白水平或酶活性水平或基因表達(dá)水 平的減少可以在葉片、種子或谷物的生長的任何階段發(fā)生，特別是在白天，當(dāng)光合作用發(fā)生 時，或在谷物灌漿期，這時淀粉會在生長的胚乳中合成，或在谷物生長成熟過程中的所有階 段發(fā)生。本文中使用的術(shù)語“野生型”具有其在遺傳學(xué)領(lǐng)域的普通含義，且其包括植物、特別 是谷物，栽培作物或基因型，其在本文的教導(dǎo)中是未被修飾過的。公眾容易獲得的優(yōu)選“野 生型”品種有面包小麥(breadwheat)，品種 Bob White ；玉米(Zea mays)，Roundup Ready Corn 2 ；7jC禾S，Nipponbare ；高梁(Sorghum bicolor),品禾中 Sumac。在一個實(shí)施例中，植物葉片或胚乳中的改變包括GWD量和/或活性的減少，其會導(dǎo) 致在葉片和/或成熟種子，如谷粒的淀粉中的磷酸含量的降低。在另一個實(shí)施例中，修飾包 括PWD和GWD活性的降低。在其它的實(shí)施例中，修飾包括谷粒中的GWD的減少以及淀粉酶 活性的升高，尤其是α-淀粉酶。其它上述相關(guān)的淀粉降解酶也可能改變，包括淀粉 酶、磷酸化酶或淀粉脫支酶，如異淀粉酶或支鏈淀粉酶。改變可以是，例如，活性增加，活性 降低，活性作用的位置或時間改變。當(dāng)這些酶的改變聯(lián)合起來，除磷酸含量之外的淀粉的性 質(zhì)也會改變。在一個實(shí)施例中，改性植物，尤其是谷類植物，包括在胚乳中的多種淀粉降解 酶活性的改變，特別是包括了 GWD活性的降低，導(dǎo)致了谷類淀粉中磷酸含量的降低。在另 一個實(shí)施例中，在除胚乳或葉片之外的植物組織中的一種或多種的淀粉降解酶的活性會改 變，如胚乳中GWD的活性有可能會增加，其是為了補(bǔ)償由轉(zhuǎn)基因編碼的主要在葉片中表達(dá) 的GWD抑制分子引起的活性損失，或者是胚乳中淀粉酶尤其是α-淀粉酶的活性會降低。酶 活性的改變可能是量的增加或減少，也可能是表達(dá)時間的改變。淀粉的合成可以通過一種 或多種的淀粉生物合成酶的過表達(dá)并聯(lián)合GWD的降低來進(jìn)一步提高。編碼這些酶的基因可 以來自于本領(lǐng)域中已知的各種來源，如來源于細(xì)菌，谷類或其它來源，其被改造以改變催化 特性，如改變酶與溫度的關(guān)系(例見WO 94/09144)?？梢酝ㄟ^部分或完全抑制GWD基因，或GWD和PWD基因的表達(dá)來獲得經(jīng)過修飾的 表型。此處使用的“低淀粉磷酸含量”的表型等指的是從植物或植物部分(如葉片或谷粒) 中獲得的全部淀粉具有少于0. 02%的淀粉磷酸含量，或相對相應(yīng)的對照淀粉來說，減少至 少50%?；虮灰种频某潭仍谀撤N程度上決定了麥粒中淀粉的特性。從改造的小麥胚乳 中提取的蛋白的凝膠電泳結(jié)果顯示出GWD和/或PWD活性改變的本質(zhì)和程度。改變可以是 GffD活性的降低，或酶活性的完全喪失，或改變在葉片或胚乳中的GWD或其它酶的分布。例 如，可以通過影響胚乳中酶的分布而減少GWD或其它的活性，比如減少顆粒結(jié)合型淀粉的 酶水平。為實(shí)施檢測，從小麥胚乳中提取出淀粉并分析其中的蛋白(Rahman等，1995)。采 用本領(lǐng)域已知的技術(shù)如SDS-PAGE和免疫印跡對可溶性淀粉顆粒片段進(jìn)行了分析，其結(jié)果 用來確定植物或谷物中GWD或其它酶發(fā)生改變的位置?？梢酝ㄟ^向谷類，尤其小麥植株中導(dǎo)入一種或多種遺傳變異來獲取淀粉磷酸化或 降解酶的活性的改變。即，遺傳變異直接或間接地導(dǎo)致了植物局部在生長期或發(fā)育期的酶
21活性的改變，最終形成了上述的改性淀粉。遺傳變異可以是將異源多聚核苷酸通過如轉(zhuǎn)化 或誘變的方式引入植物或祖細(xì)胞中。遺傳變異隨后通過雜交引入不同的遺傳背景，此為已 知的植物育種技術(shù)。組織或植株部分中的GWD或淀粉酶的量或活性可以采用本領(lǐng)域任何已知的方法 測定，例如，通過酶分析，免疫檢測方法，Western印跡或ELISA分析，或相關(guān)的mRNA水平可 以通過如Northern印跡雜交技術(shù)或反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)來測定。在淀粉合成 過程中，也可以通過測定磷酸化淀粉的水平來顯示酶的水平。在其胚乳中具有改變的特殊 蛋白水平或酶活性的谷類作物或谷?？梢酝ㄟ^降低的蛋白水平或酶水平(直接檢測)來篩 選，也可以基于小麥植株的谷粒的表型如升高的或降低的磷酸水平、或植株或植株部分的 可視表型來篩選，其中可視表型例如為縮小的谷粒、或淀粉顆粒性質(zhì)改變或植株形態(tài)學(xué)改 變。此處使用的具有改變的淀粉性質(zhì)的小麥植株可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法鑒別，直 接檢測其中淀粉的性質(zhì)，或間接地，例如，檢測植株或谷粒中遺傳變異的存在。植株可以是 眾多小麥作物家族中的一株，例如，小麥育種家族中的一株。生產(chǎn)潛力本發(fā)明提供了增強(qiáng)生產(chǎn)特性的植物。可提高的生產(chǎn)特性包括但不限于，對栽培者 有益的特性如生長、產(chǎn)率、生物量和活力等，還有相關(guān)的特性，如抗壓、抗旱、抗害蟲或疾病、 或者改良的花或葉的感官質(zhì)量；對收獲自植物的農(nóng)產(chǎn)品的消費(fèi)者有益的特性，如在人類食 品或飲品或動物飼料中提高營養(yǎng)物質(zhì)或風(fēng)味物質(zhì)含量，或?qū)κ称窐I(yè)或加工業(yè)有益的特性， 如提高加工特性。在這些用途中，植物通常是為了其谷物、果實(shí)和其它植物部分的用途而生 長，其它植物部分包括葉、莖、殼、蔬菜部分和在人類或動物食物或飲料中作為部分動物飼 料用途或用于觀賞植物用途。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的植物材料具有作為青貯動物飼料 的新用途，例如在
發(fā)明者吉恩-菲利普·弗朗克斯·米歇爾·拉爾, 鐘儀·李, 馬修·肯尼迪·莫瑞爾 申請人:澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織;谷物研究開發(fā)公司