專(zhuān)利名稱(chēng)：研究v(d)j組合多樣性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及體外分析個(gè)體中T和/或B淋巴 細(xì)胞庫(kù)多樣性的方法及其用途，特別是在治療隨訪過(guò)程中或者對(duì)某些病理狀況的診斷和/ 或預(yù)后過(guò)程中。
背景技術(shù)：
淋巴細(xì)胞要發(fā)揮功能必須具有抗原特異性識(shí)別系統(tǒng)。該因素很重要它決定了 T 或B細(xì)胞的特定功能。在T淋巴細(xì)胞分化的早期階段，編碼TCR受體克隆型鏈的位點(diǎn)發(fā)生 重排，使得能夠表達(dá)功能性受體。類(lèi)似地，在B淋巴細(xì)胞中，編碼免疫球蛋白(Ig)鏈的位點(diǎn) 發(fā)生重排，使得能夠表達(dá)功能性Ig。V(D) J重排機(jī)制對(duì)于T和B淋巴細(xì)胞而言是特異性的。編碼TCR的V、D和J基因 沿不同TCR位點(diǎn)內(nèi)的長(zhǎng)胚系部分分布。為了表達(dá)蛋白，這些基因必須通過(guò)被稱(chēng)為V (D) J重 組的基因重排過(guò)程聯(lián)合成外顯子。重組的原理是基于對(duì)V(D) J基因特異性的RSS序列的識(shí) 別，以及對(duì)插入到兩個(gè)重排基因間染色體區(qū)域的去除。每個(gè)V和J基因在其一端都具有重 組信號(hào)序列(RSS)。D基因則兩端都有。RSS是被特異性表達(dá)于淋巴細(xì)胞中的特異性重組酶 RAG I和RAG II所識(shí)別的序列。這些蛋白是基因重排的主要參與者。一旦與HMG(高遷移 性基團(tuán))蛋白結(jié)合，RAG酶通過(guò)其同源異型結(jié)構(gòu)域識(shí)別RSS九聚體，并誘導(dǎo)V、D、J基因片段 和七聚體之間的切割，從而產(chǎn)生編碼末端和信號(hào)末端。重排在連接V和J編碼末端后完成。 TdT酶和核酸酶作用于V-J連接處會(huì)使這一步驟提前發(fā)生。一旦發(fā)生重排，新生成的基因即 被轉(zhuǎn)錄，隨后剪接成mRNA并被翻譯成膜蛋白。給定的TCR特異性識(shí)別有限數(shù)量的不同抗原肽。因此，需要大量的受體庫(kù)，以使個(gè) 體抵御其環(huán)境中可能遇到的多種感染。為此，免疫系統(tǒng)發(fā)展出了對(duì)基因組中不連續(xù)分布的 大量V、D、J基因片段進(jìn)行組合的機(jī)制。該“組合”機(jī)制被稱(chēng)為V(D) J重組，其獨(dú)立于各細(xì)胞 并且可以獲得編碼TCR的單個(gè)“片段”。該系統(tǒng)可以利用中等數(shù)量的基因產(chǎn)生大量不同的受 體。每個(gè)細(xì)胞依據(jù)精確的規(guī)則利用基因片段的組合，并獲得潛在獨(dú)特的TCR鏈。有四種主要機(jī)制有助于產(chǎn)生庫(kù)多樣性1)與V片段(D片段)和J片段間重排之 第一步相對(duì)應(yīng)的組合多樣性；幻經(jīng)重排的基因片段間連接所產(chǎn)生的連接多樣性；幻經(jīng)重排 之V-J和V-D-J基因的體細(xì)胞超突變；4)蛋白二聚體TCRa XTCR^或TCR γ X TCR δ的配 對(duì)多樣性。產(chǎn)生多樣性的第一步是基于V(D)J基因重排原理(

圖1)。固定數(shù)量的V、D和 J基因配對(duì)所產(chǎn)生的組合形成了組合多樣性。該多樣性的計(jì)算在于估計(jì)可能的組合數(shù)目 mVXnDXpJ。調(diào)節(jié)V(D) J重組的機(jī)制并非是隨機(jī)的它在個(gè)體發(fā)生過(guò)程中受空間和時(shí)間上 的調(diào)節(jié)(Aude-Garcia 等，2001 Jouvin-Marche 等，1998 ；Pasqual 等，2002 ；Rytkonen 等， 1996)。因此，簡(jiǎn)單的乘法運(yùn)算不足以估計(jì)預(yù)期基因組合的總數(shù)目。產(chǎn)生多樣性的此第一步 決定了庫(kù)的數(shù)量級(jí)。這是因?yàn)榧词惯@一步僅產(chǎn)生中等的組合多樣性(與所估計(jì)的最大理論 庫(kù)值IO15相比僅幾千個(gè)可能組合的數(shù)量級(jí)(Davis和Bjorkman，1988))，組合多樣性的最大值也是與原始可獲得的V、D和J基因的數(shù)目直接相關(guān)產(chǎn)生多樣性的其他兩個(gè)步驟使最初 庫(kù)的多樣性呈指數(shù)式增長(zhǎng)。連接多樣性可在與抗原肽接觸的受體CDR3區(qū)域水平上產(chǎn)生大的可變性。兩個(gè)機(jī) 制有助于增加連接多樣性1)第一個(gè)機(jī)制是由于P(即回文)核苷酸的加入，其由經(jīng)重排之 片段的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的解開(kāi)而產(chǎn)生(Fugmarm等，2000)。所產(chǎn)生的多樣性沒(méi)有涉及末端脫氧核 苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)的第二個(gè)機(jī)制所產(chǎn)生的多樣性那么多；2)TdT通過(guò)向每個(gè)編碼片段的3， 端隨機(jī)加入N核苷酸產(chǎn)生大量的多樣性，而無(wú)需基因組模板的存在(Bogue等，199 。對(duì) TdT-/-小鼠的研究可估計(jì)這些動(dòng)物中TCRa β庫(kù)僅占正常庫(kù)的5%到10%，因此TdT負(fù)責(zé) 產(chǎn)生TCRa β全部多樣性的90%。此外，這些結(jié)果表明，與TCRa轉(zhuǎn)錄體的⑶R3不同，TCR β 轉(zhuǎn)錄體中⑶R3的長(zhǎng)度明顯減少。如所預(yù)期地那樣，這一觀察結(jié)果證實(shí)了 TdT對(duì)V-D-J重組 的貢獻(xiàn)比對(duì)V-J重排的貢獻(xiàn)要大(Cabaniols等，2001)。第二次重排的機(jī)制有助于“保留”多樣性連接多樣性是增加庫(kù)多樣性的最重要因 素，但是如果沒(méi)有第二次重排機(jī)制拯救2/3的讀碼框已中斷之淋巴細(xì)胞，則其多樣性方面 的益處將意味著機(jī)體的巨大代價(jià)，甚至是在陽(yáng)性選擇步驟前情況也如此。這些非增殖性重 排不能產(chǎn)生功能性TCR蛋白。細(xì)胞隨后有可能?chē)L試基因座位上仍然存在的V(D) J基因的第 二次重排。由于細(xì)胞進(jìn)行的第一次重排發(fā)生在彼此靠近的V-J基因?qū)χg，因此TRAD座位 集中開(kāi)放的特性促進(jìn)此過(guò)程，使細(xì)胞有最可能完成重排的機(jī)會(huì)(Huang和Kanagawa，2001 ； Pasqual等，2002 ；Wang等，1998)。如果第一次重排是無(wú)效重排，則細(xì)胞有可能?chē)L試其第二 染色體上的重排，或者利用第一次重排任意一側(cè)可獲得的V和J基因。因此，第二次重排使 大量在第一次無(wú)效重排結(jié)束時(shí)本應(yīng)被清除的細(xì)胞存活下來(lái)。體細(xì)胞超突變(SHM)在有抗原接觸時(shí)淋巴結(jié)中B細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)生(Berek等， 1985)。SHM位于免疫球蛋白經(jīng)重排之V-J和V(D) J基因的“熱點(diǎn)基序”中(Chaudhuri等， 2003 ；Oprea和Kepler, 1999)，但在某些情況下也位于TCR經(jīng)重排之V-J和V (D) J基因中 (Kotani等，2005)。如果T淋巴細(xì)胞過(guò)表達(dá)通常B細(xì)胞特有的AID (活化誘導(dǎo)胞嘧啶核苷脫 氨酶，activation-induced cytidine diaminase)酶，那么 TCR 可以是可變基因中 SHM 的 靶位點(diǎn)。正常情況下，TCR不經(jīng)歷SHM，因?yàn)門(mén)淋巴細(xì)胞并不合成AID。但是，如果T淋巴細(xì) 胞開(kāi)始表達(dá)AID，則由于TCR含有該酶作用的所有序列，TCR對(duì)該酶與對(duì)BCR—樣敏感?？?之，文獻(xiàn)表明這一機(jī)制誘導(dǎo)產(chǎn)生了為目標(biāo)1000倍的額外多樣性，以增加識(shí)別抗原的機(jī)會(huì)。由TCRa鏈和TCRii鏈之間配對(duì)所產(chǎn)生的多樣性可以通過(guò)將TCRa鏈的不同組合 數(shù)乘以TCRii鏈的可能組合數(shù)而進(jìn)行估算。這一機(jī)制所產(chǎn)生的多樣性直接取決于重排過(guò) 程中所獲得的原始組合的數(shù)目。具體而言，如果計(jì)算小鼠中原始TCRy δ組合數(shù)時(shí)沒(méi)有將 連接多樣性計(jì)算在內(nèi)，那么結(jié)果僅僅是40TCR δ (= IOV * 2D * 2J) X28TCRy ( = 7V * 4J) = 1120種不同組合，而對(duì)TCRa β進(jìn)行相同計(jì)算得到了 5.6Χ106種組合(計(jì)算如下 102Va * 60Ja * 33Vβ * 2D β * 14J3)。最近，對(duì)人類(lèi)基因組和小鼠的完全測(cè)序使得可以獲得每個(gè)TCR座位的確切圖譜， 因此有可能產(chǎn)生揭示調(diào)節(jié)重組機(jī)制的新的遺傳學(xué)方法。每個(gè)細(xì)胞有4個(gè)能夠重排TCR基因 的座位。在人和小鼠中，TCRa和TCR δ鏈在相同的14號(hào)染色體的兩個(gè)相關(guān)聯(lián)座位上發(fā)生 重排。人的TCRy和TCRii座位分別在7號(hào)染色體(或在小鼠中為13號(hào)染色體)和7號(hào) 染色體(或在小鼠中為6號(hào)染色體)上(見(jiàn)表1)。
權(quán)利要求
1.一種體外分析個(gè)體中T和/或B淋巴細(xì)胞庫(kù)多樣性的方法，其對(duì)來(lái)源于所述個(gè)體之 生物樣品的基因組DNA進(jìn)行分析，包括以下步驟A)利用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增所述基因組DNA的片段，其中所述多重聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中至少之一是η > 2的η重PCR，其使用至少3種引物的組合，組成具有以下特性 的至少2對(duì)引物(i)每對(duì)引物由與給定V或D基因的上游和/或內(nèi)部特異性雜交的引物以及與給定J 基因的下游和/或內(nèi)部特異性雜交的引物組成，從而允許擴(kuò)增以?xún)煞N不同V(D) J或D-J重 排為特征的至少兩個(gè)片段；( )所述引物是熱力學(xué)相容的；(iii)對(duì)引物進(jìn)行選擇，使得所述第一對(duì)引物擴(kuò)增的片段與所述第二對(duì)引物擴(kuò)增的片 段能區(qū)分開(kāi)；B)檢測(cè)步驟A)中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物；C)解釋結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其用于分析至少一個(gè)基因座位上V(D)J重排的組合多樣性， 所述基因座位選自TRA、TRB、TRG、TRD、IgH, IgK和IgL座位。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中每對(duì)引物中的至少1條引物被標(biāo)記。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中步驟B)包括對(duì)DNA片段的擴(kuò)增進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè) 定的步驟；且步驟C)按照以下方式進(jìn)行(i)如果數(shù)量少于曲線總數(shù)一半的一條或幾條曲線與其他曲線相比表現(xiàn)出偏移，以至 于其他曲線在第一條曲線的拐點(diǎn)后至少2個(gè)循環(huán)、優(yōu)選至少3或4個(gè)循環(huán)才出現(xiàn)拐點(diǎn)，或者 顯示為無(wú)擴(kuò)增，那么該結(jié)果表明存在克隆性或寡克隆性淋巴細(xì)胞增殖；( )相反地，如果所有曲線在同一循環(huán)出現(xiàn)拐點(diǎn)，或者最多偏移2或3個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，那 么該結(jié)果可以排除由與所擴(kuò)增片段相對(duì)應(yīng)的重排之一而致的克隆淋巴細(xì)胞增殖的假設(shè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其還包括確認(rèn)淋巴細(xì)胞增殖的步驟，其中在溫度從40°C上 升至95°C的過(guò)程中對(duì)每個(gè)管中的熒光進(jìn)行連續(xù)測(cè)定，若觀察到優(yōu)勢(shì)峰則表示存在優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增 子并因此存在淋巴細(xì)胞增殖，而相反地，若觀察到相似大小的幾個(gè)峰則表示存在淋巴細(xì)胞 多樣性。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或權(quán)利要求5的方法，其還包括通過(guò)以下方式測(cè)定所述擴(kuò)增子的分 子多樣性而對(duì)所觀察之重排片段的分子多樣性進(jìn)行測(cè)定的步驟(i)在擴(kuò)增子95°C去雜交后，使擴(kuò)增產(chǎn)物的溫度快速降回到30°C或以下；( )重雜交過(guò)程中定期、優(yōu)選連續(xù)地測(cè)定熒光；(iii)快速的重雜交表示存在優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增子并因此存在克隆性或寡克隆性淋巴細(xì)胞增 殖，而較慢的重雜交則表示有更好的分子多樣性。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中檢測(cè)所述擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟B)包括將所述 產(chǎn)物根據(jù)其大小進(jìn)行分離的步驟。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中選擇每個(gè)η> 2的η重PCR反應(yīng)中使用的 引物對(duì)，使得一對(duì)引物擴(kuò)增得到的至少一些產(chǎn)物與其他引物對(duì)擴(kuò)增得到的產(chǎn)物大小不同。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中利用至少3條引物的組合進(jìn)行至少一個(gè) η彡2的η重PCR反應(yīng)，所述引物的組合組成至少2對(duì)引物，其包含與給定V基因的上游和/或內(nèi)部特異性雜交的共用正義引物，且每對(duì)引物還包含與給定J基因的下游和/或內(nèi)部特 異性雜交的反義引物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中利用多個(gè)三聯(lián)引物進(jìn)行幾個(gè)2重PCRs，所述每組三聯(lián) 引物均由與給定V基因的上游和/或內(nèi)部特異性雜交的正義引物以及與兩個(gè)不同J基因的 下游和/或內(nèi)部特異性雜交的兩條反義引物組成。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的方法，其中利用至少3條引物的組合進(jìn)行至少一 個(gè)η > 2的η重PCR反應(yīng)，所述引物的組合組成至少2對(duì)引物，其包含與給定J基因的下游 和/或內(nèi)部特異性雜交的共用反義引物，且每對(duì)引物還包含與給定V基因的上游和/或內(nèi) 部特異性雜交的正義引物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法，其中進(jìn)行至少一個(gè)η彡2的η重PCR反應(yīng)， 以分析TRB座位的特定重排，其中利用至少3條引物的組合組成至少2對(duì)具有以下特征的 引物(i)這2對(duì)引物包含與給定V基因的上游和/或內(nèi)部特異性雜交的共用正義引物，且每 對(duì)引物還包含與給定J基因的下游和/或內(nèi)部特異性雜交的反義引物；( )所述2條反義引物與Jy和Jz兩個(gè)基因的下游和/或內(nèi)部特異性雜交，所述兩個(gè) 基因?qū)儆赥RB座位上J基因的兩個(gè)不同的組；和(iii)所述Jy基因特異性反義引物的雜交區(qū)與所述Jy基因起始點(diǎn)之間的距離大于所 述Jz基因特異性反義引物的雜交區(qū)與所述Jz基因所屬組中所述第一 J基因起始點(diǎn)之間的 距離。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中利用至少3條引物的組合進(jìn)行至少一個(gè)η> 2的η 重PCR反應(yīng)，以分析人TRB座位的特定重排，所述引物的組合包含引物hTRBJl. 6 (CTTGGTGC ATGGCTATGTAATCCTG, SEQID No 1)、hTRBJ2. 7 (CTCGCCCTCTGCTCAGCTTTCC, SEQ ID No 2)以 及與給定V基因的上游和/或內(nèi)部特異性雜交的正義引物。
14.根據(jù)權(quán)利要求12和權(quán)利要求13的方法，其用于分析人TRB座位的V(D)J重排，其 中利用至少3條引物的組合進(jìn)行M個(gè)η > 2的η重PCR反應(yīng)，每個(gè)引物組合包含如權(quán)利要 求13定義的hTRBJl. 6和hTRBJ2. 7引物，以及至少1條選自以下表2所定義之引物的hTRBV 引物表2
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其用于體外檢測(cè)基因座位中的不完全D-J重排，所述基因 座位選自TRB和IgH座位。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中進(jìn)行至少一個(gè)η彡2的η重PCR反應(yīng)，以分析人TRB 座位的不完全DJ重排，其中利用至少3條引物的組合組成至少2對(duì)具有以下特征的引物(i)所述2對(duì)引物包含與給定D基因的上游和/或內(nèi)部特異性雜交的共用正義引物，且 每對(duì)引物還包含與給定J基因的下游和/或內(nèi)部特異性雜交的反義引物；(ii)所述2條反義引物與Jy和Jz兩個(gè)基因的下游和/或內(nèi)部特異性雜交，其中所述 兩個(gè)基因?qū)儆赥RB座位上J基因的兩個(gè)不同組；和(iii)所述Jy基因特異性反 義引物的雜交區(qū)與所述Jy基因起始點(diǎn)之間的距離大于所 述Jz基因特異性反義引物的雜交區(qū)與所述Jz基因所屬組中所述第一 J基因起始點(diǎn)之間的距離。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中利用至少3條引物的組合進(jìn)行至少1個(gè)η> 2的η 重PCR反應(yīng)，以分析TRB座位的不完全重排，所述引物組合包含與給定D基因的上游和/或 內(nèi)部特異性雜交的正義引物，以及如權(quán)利要求13所定義的hTRBJl. 6和hTRBJ2. 7引物。
18.根據(jù)權(quán)利要求16和權(quán)利要求17的方法，其用于分析人TRB座位的所有不完全重 排，其通過(guò)以下進(jìn)行⑴利用由hTRBJl. 6和hTRBJ2. 7和hTRBDl引物組成的3聯(lián)引物組 進(jìn)行2重PCR ；以及(ii)利用由hTRBJ2. 7和hTRBD2引物組成的引物對(duì)進(jìn)行簡(jiǎn)單多重PCR， 其中所述hTRBDl和hTRBD2引物選自下表3所定義的引物
19.一種分析個(gè)體中TRB座位上重排之組合多樣性的方法，其利用權(quán)利要求12至14中 任一項(xiàng)的方法分析該座位的V(D) J重排，并聯(lián)合利用權(quán)利要求16至18中任一項(xiàng)的方法分 析該座位的不完全重排。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法，其用于分析在人TRA座位上95%的J基因 和同一座位上給定V基因之間的重排，其中在步驟A)中利用引物組合進(jìn)行6個(gè)2重PCR或3 個(gè)4重PCR反應(yīng)，所述每個(gè)引物組合由與所述V基因的上游和/或內(nèi)部雜交的引物以及1對(duì) 或2對(duì)反義引物組成，所述反義引物選自引物對(duì)(hTRAJ56，hTRAJ41)、(hTRAJ37, hTRAJ33)、 (hTRAJ48, hTRAJ29)、(hTRAJ24, hTRAJ18)、(hTRAJ53, hTRAJll)和(hTRAJ7, hTRAJ3)，所述 引物如下表4定義表4
21.一種分析TRA座位上VJ重排多樣性的方法，其中利用至少3條引物進(jìn)行權(quán)利要求 20的方法，所述引物與位于該座位上不同區(qū)域的3種不同V基因的上游和/或內(nèi)部雜交。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或權(quán)利要求21的方法，其中與所述TRA座位上V基因的上游和/ 或其內(nèi)部雜交的至少1條引物選自下表5中所定義的引物表5
23.根據(jù)權(quán)利要 求1至8和權(quán)利要求11中任一項(xiàng)的方法，其用于分析人TRG座位上所 有J基因與同一座位上至少2個(gè)給定基因Vx和Vy的重排，其中在步驟A)中利用3聯(lián)引物 進(jìn)行至少1個(gè)2重PCR，所述引物由2條與所述Vx和Vy基因的上游和/或內(nèi)部雜交的正義 引物以及1條與所述人TRG座位上J2基因雜交的反義引物hTRGJdo2 (ACATATGAGCCCTTTAT GGAAGTCCG, SEQ ID No. 62)組成。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中與人TRG座位上V基因的上游或內(nèi)部雜交的至少1 條引物選自如下表6中定義的引物表6
25.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法，其用于分析人TRD座位上所有J基因與同 一座位上給定V基因的重排，其中在步驟A)中利用3聯(lián)引物進(jìn)行2重PCR，所述引物由與所 述V基因的上游和/或內(nèi)部雜交的引物以及反義引物hTRDJldo5 (TGCCTCCTTAGATGGAGGATG CC, SEQ ID No. 67)和 hTRDJ3do2 (GCAAGGAGGCACGCATACTAGTTAGC, SEQ ID No. 68)組成。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，用于分析所述TRD座位上的VJ重排，其中利用至少3條引 物的組合進(jìn)行M個(gè)η彡2的η重PCR，每個(gè)引物組合包含反義引物hTRDJldo5和hTRDJ3do2 以及選自如下表7定義之引物的至少1條hTRDV或hTRAV 表7
27.根據(jù)權(quán)利要求1至8和權(quán)利要求11中任一項(xiàng)的方法，其用于分析人IgH座位上所 有J基因與同一座位上至少2個(gè)給定基因Vx和Vy的重排，其中在步驟A)中利用3聯(lián)引物 進(jìn)行至少1個(gè)2重PCR，所述引物由2條與所述Vx和Vy基因的上游和/或內(nèi)部雜交的正義 引物以及與所述IgHJ6基因的下游和/或內(nèi)部雜交的反義引物組成。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述反義引物是hIgHJ6do2引物 (GATCTTGCAGTCCTACAGACACCGC, SEQ ID No. 85)。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或權(quán)利要求觀的方法，其中與人IgH座位上V基因的上游或內(nèi)部 雜交的至少1條引物選自如下表8中定義的引物表8
30.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中利用至少3條引物的組合進(jìn)行至少1個(gè)η> 2的η 重PCR反應(yīng)，以分析人IgH座位上特定的不完全重排，所述引物組合構(gòu)成至少2對(duì)引物，其 包含與給定J基因的下游和/或內(nèi)部特異性雜交的共用反義引物，且每對(duì)引物還包含與給 定D基因的上游和/或內(nèi)部特異性雜交的正義引物。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述共用反義引物是權(quán)利要求觀中所定義的 HgHJ6do2 引物。
32.根據(jù)權(quán)利要求30或權(quán)利要求31的方法，其中與人IgH座位上D基因的上游或內(nèi)部 雜交的至少1條引物選自如下表9中定義的引物
33.一種分析個(gè)體中IgH座位上重排之組合多樣性的方法，其利用權(quán)利要求27至四中 任一項(xiàng)的方法分析該座位的V(D) J重排，并聯(lián)合利用權(quán)利要求30至32中任一項(xiàng)的方法分 析該座位的不完全重排。
34.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其用于分析至少2個(gè)基因座位上V(D)J重排的 組合多樣性，所述基因座位選自TRA、TRB、TRG、TRD、IgH、IgK和IgL座位。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其用于分析TRB座位上V(D) J重排的組合多樣性以及TRG 座位或TRD座位上VJ重排的組合多樣性。
36.根據(jù)權(quán)利要求34或權(quán)利要求35的方法，其還用于分析IgH座位上V⑶J重排的組合多樣性。
37.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中利用聚合酶進(jìn)行η重PCR反應(yīng)，所述聚合 酶具有以下特性(i)其能夠擴(kuò)增幾十1Λ的片段；( )其延伸速度為至少1 /分鐘；(iii)其穩(wěn)健性為平均每1Λ引入的錯(cuò)誤不多于1個(gè)。
38.根據(jù)權(quán)利要求7至36中任一項(xiàng)的方法，其中步驟C)包括對(duì)根據(jù)擴(kuò)增子大小將其分 離而獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行加工的步驟，所述數(shù)據(jù)加工通過(guò)計(jì)算機(jī)實(shí)施進(jìn)行，并且使得有可能將 相應(yīng)V(D) J重排的名字指派給每個(gè)所觀察到的擴(kuò)增子。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述數(shù)據(jù)加工還包括所觀察到的每個(gè)擴(kuò)增子的信號(hào) 強(qiáng)度，以便對(duì)相應(yīng)V(D) J重排的相對(duì)頻率進(jìn)行定量。
40.根據(jù)權(quán)利要求38或權(quán)利要求39的方法，其中步驟B)包括獲得有關(guān)擴(kuò)增子大小以 及每個(gè)擴(kuò)增子相應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度的數(shù)據(jù)，并且步驟C)包括以下步驟(i)通過(guò)確定每個(gè)擴(kuò)增子所對(duì)應(yīng)的作為其大小之函數(shù)的V(D) J重排而對(duì)每個(gè)擴(kuò)增子進(jìn) 行鑒定；( )根據(jù)每個(gè)擴(kuò)增子的信號(hào)強(qiáng)度確定具有相應(yīng)V(D)J重排之起始基因組DNA的比例； (iii)以三維圖形的形式顯示結(jié)果，所述圖形在一個(gè)軸上顯示Vx基因或Vx基因家族， 在另一個(gè)軸上顯示Jy基因，在第三個(gè)軸上顯示VxJy重排的頻率。
41.一種體外確定個(gè)體免疫缺陷程度的方法，其包括以下步驟A)利用來(lái)自所述個(gè)體的生物樣品，對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)；B)利用同一樣品或同時(shí)取自同一個(gè)體的另一樣品，通過(guò)實(shí)施前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的 方法，確定所述個(gè)體之淋巴細(xì)胞庫(kù)的組合多樣性程度；C)將步驟A)和B)中獲得的數(shù)據(jù)組合。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其還包括從圖形觀點(diǎn)對(duì)步驟C)所獲得之組合進(jìn)行解釋的 步驟，所述圖形將風(fēng)險(xiǎn)水平至少劃分為以下4個(gè)區(qū)域(i)計(jì)數(shù)低(< 1000淋巴細(xì)胞/y L)，V-J組合多樣性低(< 40% ):高感染風(fēng)險(xiǎn)，以 及由感染引起的高死亡風(fēng)險(xiǎn)；( )計(jì)數(shù)低(< 1000淋巴細(xì)胞/yL)，但V-J組合多樣性正常(>65%)低感染風(fēng)險(xiǎn)；(iii)計(jì)數(shù)正常(1000-3200淋巴細(xì)胞/μL)，V-J組合多樣性低(<40%)中等感染 風(fēng)險(xiǎn)；(iv)計(jì)數(shù)正常(1000-3200淋巴細(xì)胞/yL)，V-J組合多樣性正常(> 65% )免疫庫(kù)正常。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述圖形還包括以下2個(gè)區(qū)域(ν)計(jì)數(shù)高于正常(> 3200淋巴細(xì)胞/μ L)，V-J組合多樣性低(<40%)高淋巴細(xì) 胞增殖風(fēng)險(xiǎn)；(vi)計(jì)數(shù)高于正常(> 3200淋巴細(xì)胞/μ L)，V-J組合多樣性正常(>65%)中等 淋巴細(xì)胞增殖風(fēng)險(xiǎn)。
44.根據(jù)權(quán)利要求41至43中任一項(xiàng)的方法，其中步驟B)包括確定所述個(gè)體中T淋巴 細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞庫(kù)的組合多樣性程度。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中在步驟C)中通過(guò)三維圖形來(lái)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，所述圖形在 一條軸上顯示免疫球蛋白多樣性程度，在另一條軸上顯示TCR多樣性程度，在第三條軸上 顯示淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。
46.一種監(jiān)測(cè)個(gè)體中T和/或B淋巴細(xì)胞庫(kù)多樣性變化的方法，其包括以下步驟A)利用在兩個(gè)不同日期取自所述個(gè)體的兩個(gè)樣品，通過(guò)權(quán)利要求38至45中任一項(xiàng)的 方法測(cè)定所述個(gè)體中淋巴細(xì)胞庫(kù)的多樣性；B)通過(guò)以下評(píng)價(jià)比較所述兩個(gè)樣品(i)在所述兩個(gè)樣品中觀察到的重排的數(shù)目S ；( )在較晚樣品中觀察到但在較早樣品中未觀察到的重排的數(shù)目A ；(iii)在較早樣品中觀察到但在較晚樣品中未觀察到的重排的數(shù)目D；(iv)在所述兩個(gè)樣品中均未觀察到的重排的數(shù)目Z。
47.實(shí)施前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)之方法的試劑盒，其包含前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所定 義的引物組合，以及用于進(jìn)行PCR的試劑。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的試劑盒，其包含具有下列特性的聚合酶(i)其能夠擴(kuò)增幾十1Λ的片段；( )其延伸速度為至少1 /分鐘；(iii)其穩(wěn)健性為平均每1Λ引入的錯(cuò)誤不多于1個(gè)。
49.根據(jù)權(quán)利要求47或權(quán)利要求48的試劑盒，其包含多孔板，其中每個(gè)孔含有不同的 引物組合。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中所述多孔板包含擴(kuò)增至少一個(gè)座位上至少50%的 V-J重排所必需的所有引物組合，所述至少一個(gè)座位選自TRA、TRB、TRG、TRD和IgH座位。
51.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法或試劑盒的用途，用于研究人源化轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和/ 或淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物中TCR和/或IgH庫(kù)的建立和質(zhì)量。
52.權(quán)利要求1至48中任一項(xiàng)的方法或試劑盒用于體外篩選治療性分子的用途。
53.一種評(píng)估疫苗接種方案之效力的方法，包括以下步驟A)利用權(quán)利要求1至48中任一項(xiàng)的方法或試劑盒測(cè)定進(jìn)行該方案之前和之后淋巴細(xì) 胞的數(shù)量和多樣性；B)比較步驟A)中的測(cè)定結(jié)果；和C)對(duì)結(jié)果進(jìn)行解釋?zhuān)臃N后淋巴細(xì)胞多樣性減少至少10%、優(yōu)選至少15%表明該疫苗 接種方案是有效的。
54.根據(jù)權(quán)利要求53的方法，其中在步驟A)中還測(cè)定接種前和接種后調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞 的數(shù)量，并且在步驟C)中接種后調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的數(shù)量減少> 2倍表明該方案是有效的。
55.一種比較兩種疫苗接種方案之效力的方法，包括以下步驟A)測(cè)定兩個(gè)組接種前和接種后調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和免疫多樣性；B)比較組與組之間的結(jié)果，其中最有效的方案是誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞減少最多和/或淋巴細(xì)胞多樣性降低最多 的方案。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分析個(gè)體中T和/或淋巴細(xì)胞庫(kù)多樣性的方法，其基于通過(guò)n重PCR(n≥2)從樣品中擴(kuò)增基因組DNA片段，其中利用至少3條引物的組合組成至少2對(duì)引物，每對(duì)引物包括與給定V或D基因的上游和/或內(nèi)部特異性雜交的引物以及與給定J基因的下游和/或內(nèi)部特異性雜交的引物，以擴(kuò)增每個(gè)引物對(duì)的以?xún)煞N不同V-J或D-J重排為特征的至少2個(gè)片段。本發(fā)明還涉及該方法的用途，特別是其在某些疾病的治療隨訪或者診斷和/或預(yù)后中的用途。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102083999SQ200880125800
公開(kāi)日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2008年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月26日
發(fā)明者塞巴斯蒂安·韋斯布赫, 尼古拉斯·貝呂耶 申請(qǐng)人:免疫技術(shù)有限公司, 原子能與替代能源委員會(huì)