專利名稱：生產(chǎn)具有低酒精含量葡萄酒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)具有低酒精含量葡萄酒的方法，包括以葡萄糖氧化酶和葡萄糖異 構(gòu)酶處理未發(fā)酵的葡萄汁。
背景技術(shù)：
由于全球變暖，全世界的葡萄包含更多糖。該糖在酒精性發(fā)酵中被轉(zhuǎn)化成酒精，導(dǎo) 致產(chǎn)生具有提高水平酒精的葡萄酒。因?yàn)榇耍?dāng)今葡萄酒工業(yè)的主要問(wèn)題之一是高乙醇水平。15-16% (V/V)水平的乙 醇破壞了葡萄酒的感官質(zhì)量，并且有時(shí)將葡萄酒置于比所預(yù)期更高的納稅分類中。在過(guò)去 十幾年觀察到的提高的乙醇水平是所收獲葡萄中糖水平增加的結(jié)果。當(dāng)今，具有超過(guò)16% (V/V)乙醇含量的葡萄酒不再稀有，并且預(yù)測(cè)糖水平會(huì)隨著全球變暖甚至增加更多。當(dāng)前認(rèn)為因全球變暖而受負(fù)向影響的重要的葡萄酒區(qū)是例如Rioja(西班牙)、 Chianti (意大利)、Hunter Valley (澳大利亞)和南加利福尼亞的重要區(qū)域。當(dāng)前的減少乙醇的方法，像反向滲透、旋轉(zhuǎn)錐或稀釋不能令人滿意。這些方法會(huì)對(duì) 葡萄酒的感官質(zhì)量具有不利影響。此外，對(duì)于葡萄酒反向滲透的價(jià)格高達(dá)1美元/加侖，這 對(duì)于該方法的廣泛使用而言是主要的限制。US467519KNovo Industri，在丹麥公布，1987)描述了減少葡萄酒中酒精含量的 方法，其包括使用葡萄糖氧化酶。對(duì)于所描述的方法，第2欄第25-29行寫到“本發(fā)明方法包括在氧存在下以葡萄糖氧化酶處理未發(fā)酵的葡萄糖，由此將葡萄 汁中的葡萄糖轉(zhuǎn)化成葡糖酸并且之后將如此處理的葡萄汁發(fā)酵?！痹摤F(xiàn)有技術(shù)方法的在此 處的主要相關(guān)技術(shù)原理示意性地圖解于圖1。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明待解決的問(wèn)題是提供減少葡萄酒中酒精含量的方法，其中方法會(huì)使葡萄酒 中的酒精明顯更少。此外，方法明顯降低了不期望的酒精發(fā)酵停滯。解決方案基于這樣一個(gè)事實(shí)，即本發(fā)明人已經(jīng)鑒定出，基于本領(lǐng)域的葡萄糖氧化 酶的方法還可以通過(guò)包括使用葡萄糖異構(gòu)酶得以顯著改善。US4675191的方法與本發(fā)明方法的示意性比較圖解于圖1。在本文的工作實(shí)施例中可以看出，僅使用葡萄糖氧化酶的過(guò)程使得總糖減少12% 左右，而額外加入葡萄糖異構(gòu)酶使該數(shù)值明顯增加至19%左右的糖減少。葡萄汁中糖更少 意味著葡萄酒中酒精含量更少。此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)額外加入葡萄糖異構(gòu)酶幫助維持葡萄汁中葡萄糖/果糖比率在 1 1左右，這顯著降低了不期望的酒精發(fā)酵停滯的危險(xiǎn)。對(duì)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)見(jiàn)本文的工作 實(shí)施例。技術(shù)人員已知，如果葡萄汁中葡萄糖/果糖比率明顯不同于1. 1則會(huì)停滯酒精發(fā) 酵，即酵母沒(méi)有將所有的糖發(fā)酵，并且將因此得到太甜的葡萄酒。
如技術(shù)人員所已知，葡萄糖異構(gòu)酶的重要的商業(yè)化相關(guān)應(yīng)用是將葡萄糖轉(zhuǎn)化成果 糖，例如為了制造高果糖糖漿(果糖比葡萄糖更甜)。因?yàn)榇?，本發(fā)明人真正感到驚訝地是，加入葡萄糖異構(gòu)酶給出了如此積極的結(jié)果 (糖顯著較少= >葡萄酒中酒精較少)。對(duì)于此結(jié)果的一個(gè)原因是葡萄糖異構(gòu)酶乍看起來(lái) 作為可以“去除/轉(zhuǎn)化”太多的葡萄糖的酶，并且葡萄糖氧化酶將因此具有更少可利用的底 物(葡萄糖氧化酶對(duì)果糖無(wú)效)。然而，如在本文的工作實(shí)施例中所示，加入葡萄糖異構(gòu)酶給出十分積極的結(jié)果。不被理論所限制，據(jù)信下面將是關(guān)于為何加入葡萄糖異構(gòu)酶得出十分積極結(jié)果的 理論解釋。葡萄糖氧化酶(EC 1. 1.3. 4)在葡萄汁中催化下列反應(yīng)β -D-葡萄糖 +02< = >D-葡萄糖酸-1，5-內(nèi)脂 +H2O2在葡萄汁內(nèi)產(chǎn)生的“D-葡萄糖酸-1，5-內(nèi)脂”自發(fā)轉(zhuǎn)化成葡糖酸。因此，D-葡萄 糖酸-1，5-內(nèi)脂被去除，并且因此平衡向右進(jìn)行= >葡萄糖從葡萄汁中去除。如果酶制劑還具有過(guò)氧化氫酶活性，則產(chǎn)生的H2O2也被去除= >則平衡更加向右 側(cè)進(jìn)行= >更多葡萄糖被去除。包含過(guò)氧化氫酶活性是本文的優(yōu)選實(shí)施方案-見(jiàn)下面討 論。過(guò)氧化氫酶(EC 1. 11. 1.6)催化反應(yīng)2H202< = >02+2 H2O與本文所述方法有關(guān)的是葡萄糖異構(gòu)酶EC 5. 3. 1. 5 (法定名稱木糖異構(gòu)酶)。對(duì) 于該EC 5.3. 1.5類的法定名稱是木糖異構(gòu)酶。然而，如技術(shù)人員所已知，其還有一個(gè)稱作 葡萄糖異構(gòu)酶的別名。葡萄糖異構(gòu)酶是在例如該酶類別相關(guān)商業(yè)產(chǎn)品，例如在本文工作實(shí) 施例中使用的商業(yè)產(chǎn)品中使用的名稱。在葡萄汁中，本文相關(guān)并且眾所周知的在葡萄汁中由葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)是 下列反應(yīng)D-葡萄糖< =>D_果糖。如技術(shù)人員所已知，該酶類還催化反應(yīng)D-木糖< =>D-木酮糖。該木糖相關(guān)反應(yīng)與本文相關(guān)性小。一個(gè)理論是，由葡萄糖氧化酶去除葡萄糖導(dǎo)致在葡萄汁中產(chǎn)生一種情況，即葡萄 糖/果糖比率變成低于1 1(得到“太多的果糖”-“太少的葡萄糖”)。因此，葡萄糖異構(gòu) 酶平衡“強(qiáng)制”向左側(cè)進(jìn)行=> 果糖被轉(zhuǎn)化成葡萄糖以“恢復(fù)” 1 1的葡萄糖/果糖比率 =>葡萄糖氧化酶得到“新”產(chǎn)生的葡萄糖以繼續(xù)工作并且因此總體上從葡萄汁中去除更 多的糖(葡萄糖和果糖兩者)。如上所述，維持1 1的葡萄糖/果糖比率還具有明顯減少酒精發(fā)酵停滯的危險(xiǎn) 的優(yōu)點(diǎn)。在酵母的酒精發(fā)酵之前，O2存在于未發(fā)酵葡萄汁中。如技術(shù)人員所已知，正常的酵 母發(fā)酵一般由兩部分組成部分1需氧生長(zhǎng)(存在氧)
這是最初的快速生長(zhǎng)過(guò)程，在其中酵母細(xì)胞數(shù)量大約每4小時(shí)翻倍。(通常24-72 小時(shí))部分2厭氧發(fā)酵(不存在氧)較慢的活性和酵母使糖(葡萄糖和果糖兩者)發(fā)酵，將其轉(zhuǎn)化成酒精(糖=> 2乙 醇+2C02)，而不是增加酵母細(xì)胞的數(shù)量。(取決于酵母和方法該過(guò)程可發(fā)生數(shù)天至數(shù)周)。因此，在酵母發(fā)酵過(guò)程中，O2將遲早消失。葡萄糖氧化酶的活性需要02。然而，葡 萄糖異構(gòu)酶在有或者無(wú)O2存在下是有活性的。因此，在實(shí)際的酵母酒精發(fā)酵過(guò)程中，葡萄 糖異構(gòu)酶還可以幫助維持11的葡萄糖/果糖比率。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及生產(chǎn)具有低酒精含量葡萄酒的方法，其包括下列步驟(1)以有效量的下列兩種酶處理未發(fā)酵的葡萄汁(a)葡萄糖氧化酶，在氧存在下處理一段足以將葡萄汁中至少部分葡萄糖轉(zhuǎn)化成 葡糖酸的時(shí)間；和(b)葡萄糖異構(gòu)酶處理一段足以將葡萄汁中至少部分果糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖的時(shí)間；和隨后，(2)將具有減少量葡萄糖和果糖的如此處理的葡萄汁發(fā)酵，以生產(chǎn)具有低酒精含 量的葡萄酒。定義本文相關(guān)術(shù)語(yǔ)的所有定義與本文相關(guān)技術(shù)背景相關(guān)技術(shù)人員的理解一致。與根據(jù)第一個(gè)方面的方法生產(chǎn)的葡萄酒有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“低酒精含量”在本文中指，與 在相同條件下但沒(méi)有用第一個(gè)方面的步驟(1)的兩種酶處理所生產(chǎn)的葡萄酒相比，葡萄酒 中的酒精含量較低。事實(shí)上，該術(shù)語(yǔ)可以看作是與使用有效量的兩種酶直接相關(guān)。如果使用有效量的葡萄糖氧化酶，則至少部分葡萄糖將從葡萄汁中去除，并且因 此葡萄酒中的酒精更少。類似地，對(duì)于有效量的葡萄糖異構(gòu)酶，其將葡萄汁中的至少部分果 糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖=>這樣產(chǎn)生的葡萄糖然后被葡萄糖氧化酶去除=>因此葡萄酒中的酒 精更少。本發(fā)明的實(shí)施方案僅通過(guò)實(shí)施例的方式在下描述。


Sl :US4675191方法與本發(fā)明方法的示意性圖解/比較。
具體實(shí)施例方式降低/減少酒精量實(shí)際上，本文所述的方法可以用于制造具有實(shí)際上任何預(yù)期低酒精含量的葡萄酒。例如，起可以是具有6-7%左右酒精含量的所謂的輕度酒。如上所述，由于全球變暖的緣故，全球的葡萄包含更多的糖，導(dǎo)致葡萄酒具有增加 水平的酒精。由于不同的原因，如差的口感或不同的納稅類別，這將是不期望的。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文所述生產(chǎn)的具有低酒精含量葡萄酒實(shí)際上具 有據(jù)認(rèn)為對(duì)于當(dāng)今的紅/白葡萄酒而言為正常的酒精含量-例如12-14%。
換句話說(shuō)，如果相同的葡萄酒沒(méi)有經(jīng)過(guò)本文所述的處理而制造的話，則其將具有 高的多的酒精百分?jǐn)?shù)(例如15-17% )。葡萄酒可以是任何相關(guān)類型的葡萄酒，例如白葡萄酒、紅葡萄酒、無(wú)氣葡萄酒或含 汽葡萄酒。葡糖酸以葡萄糖氧化酶處理未發(fā)酵的葡萄汁產(chǎn)生葡糖酸，其不可被酵母發(fā)酵并且因此葡 糖酸出現(xiàn)在葡萄酒中。如技術(shù)人員所已知，葡糖酸會(huì)使葡萄酒具有令人不愉快的感官特性。因此，第一個(gè)方面方法的實(shí)施方案包括去除至少部分葡糖酸的任選步驟(3)以得 到具有滿意感官特性的葡萄酒。在一個(gè)實(shí)施方案中，葡糖酸通過(guò)加入形成葡糖酸微溶鹽的物質(zhì)，優(yōu)選碳酸鈣的中 和手段被去除。碳酸鈣是廉價(jià)的，并且已經(jīng)用作葡萄酒的化學(xué)脫酸劑，并且沉淀的葡糖酸 鹽，主要是葡糖酸鈣，可以通過(guò)過(guò)濾容易地去除。由于葡萄酒無(wú)論如何也要過(guò)濾，所以該中 和作用沒(méi)有向葡萄酒制造過(guò)程中引入任何額外的過(guò)濾步驟。如技術(shù)人員所已知，具有高酒精含量的葡萄酒常常缺乏酸度。這意味著，對(duì)于此類 葡萄酒實(shí)際上可以優(yōu)選不去除葡糖酸。如在本文所述方法中待使用的葡萄糖氧化酶和葡萄糖異構(gòu)酶可以從多種不同適 宜來(lái)源，如相關(guān)的商業(yè)可得的酶產(chǎn)品中得到。如技術(shù)人員所已知，在酶市場(chǎng)上存在在正常葡萄酒制造條件下工作(例如相關(guān)pH 值、溫度等)的眾多不同商業(yè)可得的葡萄糖氧化酶/異構(gòu)酶產(chǎn)品。在下面的工作實(shí)施例中，使用了下列商業(yè)可得到的酶產(chǎn)品葡萄糖氧化酶Hyderase (來(lái)自Amano)葡萄糖異構(gòu)酶來(lái)自Sigma的產(chǎn)品(目錄號(hào)G4166_50g)-見(jiàn)本文的工作實(shí)施例。Hyderase 產(chǎn)品的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其還包括過(guò)氧化氫酶活性。過(guò)氧化氫酶活性如上所述，在本文所述方法中使用具有過(guò)氧化氫酶活性的酶制劑還導(dǎo)致去除由葡 萄糖氧化酶所產(chǎn)生的H202。過(guò)氧化氫(H2O2)會(huì)產(chǎn)生令人討厭的葡萄酒顏色，并且因此不是葡萄酒中的合意成份。此外，如上所述，通過(guò)去除H2O2，可以使葡萄糖氧化酶平衡甚至進(jìn)一步地移向左邊 = >更多的葡萄糖被去除。因此，在第一個(gè)方面的步驟(1)的優(yōu)選實(shí)施方案中，葡萄汁還以具有過(guò)氧化氫酶 活性的有效量制劑處理一段足以將葡萄汁中的至少部分H2O2轉(zhuǎn)化成02+H20的時(shí)間。優(yōu)選的生產(chǎn)參數(shù)_第一個(gè)方面的步驟1如技術(shù)人員所已知，葡萄酒制造過(guò)程中的變化改變了葡萄酒產(chǎn)品的感官特性。因 此，在通常的葡萄酒制造過(guò)程與本文所述方法的實(shí)踐之間的緊密配合是優(yōu)選的。在盡可能 的范圍內(nèi)，通過(guò)實(shí)施本發(fā)明而無(wú)須做什么來(lái)改變葡萄酒的口味和香味。酶催化的過(guò)程通常在酶的最適pH內(nèi)開(kāi)展。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施是處理沒(méi)有調(diào)節(jié)其 PH的未發(fā)酵葡萄汁。幸運(yùn)地是，如本文所使用的、商業(yè)可得到的適宜相關(guān)酶產(chǎn)品在未發(fā)酵葡 萄汁的通常PH3-4的范圍內(nèi)表現(xiàn)出足夠的活性和穩(wěn)定性。
應(yīng)當(dāng)理解的是，本文所述的任何酶可以用于本發(fā)明方法中，只要其在葡萄酒生產(chǎn) 方法過(guò)程中普遍使用的PH和溫度下表現(xiàn)出適當(dāng)?shù)南嚓P(guān)活性和穩(wěn)定性即可。因此，縱使可溶 性的酶制劑通常是優(yōu)選的，但是可以使用可溶性和固定化的酶制劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定對(duì)于給定的葡萄汁和預(yù)期糖轉(zhuǎn)化需要多少給定類型 的酶。例如，依賴于治療時(shí)間和溫度的細(xì)節(jié)(i)大致在約1，000和50，000, 000國(guó)際單位每hi葡萄汁之間的葡萄糖氧化酶活 性將是適當(dāng)?shù)模缓?ii)大致在約100和5，000, 000國(guó)際單位每hi葡萄汁之間的葡萄糖異構(gòu)酶活性
將是適當(dāng)?shù)摹Ｈ缂夹g(shù)人員所已知，國(guó)際單位定義為每分鐘催化1 μ M底物轉(zhuǎn)化的酶的量。條件也 必須詳細(xì)說(shuō)明。如技術(shù)人員所已知，人們通常采用30°C的溫度和得到最大底物轉(zhuǎn)化率的ρΗ 值和底物濃度。在此，國(guó)際單位如上面所述并且根據(jù)本領(lǐng)域定義，即在30°C的溫度下和得到最大 底物轉(zhuǎn)化率的PH值和底物濃度下確定。如技術(shù)人員所已知，對(duì)技術(shù)人員而言如本文所述確定酶的國(guó)際單位是常規(guī)工作， 并且可以在本文的相對(duì)小的不確定性之內(nèi)確定。例如，如技術(shù)人員所已知，最適pH值和最適底物濃度會(huì)隨著特定的目的酶(例如 特定的葡萄糖氧化酶)改變。然而，可以容易鑒定這種最適PH和底物濃度，因?yàn)槔缙渫?常在相關(guān)的商業(yè)可得酶產(chǎn)品的產(chǎn)品文件中給出。此外，對(duì)于特定的目的酶，鑒定參數(shù)如最適 PH和底物濃度通常是常規(guī)工作。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用下列(i)大致在約15，000和5，000, 000國(guó)際單位每hi葡萄汁之間的葡萄糖氧化酶活 性；和(ii)大致在約5，000和500，000國(guó)際單位每hi葡萄汁之間的葡萄糖異構(gòu)酶活性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在第一個(gè)方面的步驟(1)過(guò)程中的溫度在1和35°C之間，優(yōu) 選在3和30°C之間。通常，在酶反應(yīng)中，如果溫度從例如25°C左右提高至40°C，總反應(yīng)速率 將隨著溫度的提高而增加。然而，在該情況下，如果溫度從25°C提高至40°C，更多的氧將從 液體中釋放，并且因此在此種情況下總反應(yīng)速率將降低。在40°C下的延長(zhǎng)的更長(zhǎng)處理也有 害于葡萄汁的質(zhì)量?？偟膩?lái)說(shuō)，優(yōu)選地，在葡萄酒制作機(jī)制中所做的唯一變化意味著未發(fā)酵的葡萄汁 的短期儲(chǔ)存，與此同時(shí)(充氣的)葡萄汁以葡萄糖氧化酶、異構(gòu)酶和任選的本文所述其他酶 處理。在這一點(diǎn)上，應(yīng)該注意的是，控制參數(shù)是處理時(shí)間，而不是酶活性。例如，應(yīng)采用足 夠的葡萄糖氧化酶以便在適當(dāng)處理時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化預(yù)期比例的葡萄糖，其中時(shí)間通常不超過(guò)72 小時(shí)，并且多數(shù)時(shí)間不超過(guò)48小時(shí)。即使在未發(fā)酵的葡萄汁中存在一些酵母，發(fā)現(xiàn)在最初 48小時(shí)過(guò)程中發(fā)酵不會(huì)啟動(dòng)達(dá)到任何可感知的程度，并且因此去除相關(guān)量的糖是可能的。至于第一個(gè)方面的步驟1，應(yīng)該注意的是，轉(zhuǎn)化程度非常容易控制，因?yàn)橥ㄟ^(guò)切斷 氧供應(yīng)從葡萄糖至葡糖酸的反應(yīng)幾乎立即停止。該發(fā)明的實(shí)施還考慮了這樣的情況，即自步驟1的糖減少的葡萄汁持續(xù)作為酸供
7應(yīng)(酸儲(chǔ)存)并且與缺乏酸的葡萄汁混合以改善所得到的葡萄酒的感官特性。應(yīng)當(dāng)理解，葡糖酸的去除可以在任何時(shí)間開(kāi)展，例如在發(fā)酵步驟之后。備選地，可以在加入如本文所述的葡萄糖氧化酶之前，通過(guò)加入例如碳酸鈣進(jìn)行 葡糖酸的去除。這樣做的優(yōu)點(diǎn)是葡萄汁中的PH增加，并且這通常改善葡萄糖氧化酶的活 性，由于葡萄糖氧化酶通常在PH中性左右具有最適pH。在優(yōu)選實(shí)施方案中，相關(guān)酶制劑是固體的水溶性制劑，優(yōu)選非粉化制劑。固體制劑 的儲(chǔ)存穩(wěn)定性優(yōu)于液體制劑的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，并且也沒(méi)有必要加入任何保存試劑。推薦使用 者在即將使用之前將固體形式試劑溶解在少量水中。在本文所述的方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，在第一個(gè)方面的步驟1過(guò)程中持續(xù)向葡萄 汁供應(yīng)氧。氧供應(yīng)尤其對(duì)葡萄糖氧化酶的酶促反應(yīng)的反應(yīng)速率具有非常大的影響。因此， 持續(xù)引入氧保證了高的反應(yīng)速率。希望氧通過(guò)空氣泵供應(yīng)，空氣泵是向葡萄汁中引入氧最 有效的手段。在根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，在步驟1中加入的葡萄糖氧化酶/異構(gòu)酶 制劑的量足以在不超過(guò)72小時(shí)左右的時(shí)間段內(nèi)產(chǎn)生所希望的糖濃度降低。如已經(jīng)指出的 那樣，即使葡萄汁中存在一些酵母，在最初的48小時(shí)期間發(fā)酵也不會(huì)進(jìn)展至任何可感知的 程度，并且因此在葡萄糖向葡糖酸的酶促轉(zhuǎn)化期間也沒(méi)有可感知量的葡萄糖/果糖被同時(shí) 發(fā)酵成酒精。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在步驟(1)過(guò)程中對(duì)于葡萄糖氧化酶/異構(gòu)酶兩種酶的有效 量和一段時(shí)間是這樣的，以致于㈧葡萄汁中的糖含量減少至少10%，更優(yōu)選至少14%并且甚至更優(yōu)選至少17%。如上所述，在本文的工作實(shí)施例中，糖含量(葡萄糖和果糖兩者)減少19%。在根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，不控制步驟1中的pH值。該實(shí)施方案在更 長(zhǎng)處理時(shí)間，例如一直到72小時(shí)左右是可行的并且被采用的情況下，是特別優(yōu)選的。由于葡萄酒的香氣、口味和香味是極端敏感的特性這一事實(shí)，將不能預(yù)測(cè)根據(jù)本 發(fā)明生產(chǎn)的較低酒精的葡萄酒是否會(huì)擁有希望的特性，由于根據(jù)本發(fā)明以可溶性葡萄糖氧 化酶/異構(gòu)酶制劑生產(chǎn)的較低酒精的葡萄酒會(huì)包含痕量無(wú)活性葡萄糖氧化酶/異構(gòu)酶并且 在其他組份的濃度方面也可能不同于常規(guī)葡萄酒。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的較低 酒精的葡萄酒擁有葡萄酒的全部正常特性，包括口味和香味，當(dāng)然與酒精濃度直接相關(guān)的 特性排除在外。優(yōu)選的生產(chǎn)參數(shù)_第一個(gè)方面的步驟2開(kāi)展第一個(gè)方面的步驟2，即所處理葡萄汁的發(fā)酵是本發(fā)明方法的必須步驟。然 而，在此無(wú)需提供對(duì)發(fā)酵步驟的詳細(xì)討論，因?yàn)槊鞔_考慮了開(kāi)展常規(guī)葡萄酒制造實(shí)踐并且 這些實(shí)踐對(duì)葡萄酒釀造學(xué)(釀酒學(xué))領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的。在本文中已經(jīng)強(qiáng)調(diào) 了，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)踐中避免對(duì)葡萄酒制造過(guò)程機(jī)制的強(qiáng)加任何不必要的改變。如上所述，在酵母發(fā)酵過(guò)程中，O2遲早會(huì)消失。葡萄糖氧化酶需要O2才能工作。然 而，葡萄糖異構(gòu)酶可以在存在或不存在O2情況下工作。因此，葡萄糖異構(gòu)酶還可以幫助維 持實(shí)際的酵母酒精發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖/果糖比率為1 1。實(shí)際上，這通常將在如本文所述的方法中發(fā)生。在步驟(1)過(guò)程中加入至未發(fā)酵 葡萄汁中的葡萄糖異構(gòu)酶正常情況下在步驟(2)的酵母酒精發(fā)酵過(guò)程中仍然是有活性的。
然而，任選地，可以在步驟(2)的酵母酒精發(fā)酵過(guò)程中加入額外的葡萄糖異構(gòu)酶。因此，在第一個(gè)方面的本發(fā)明實(shí)施方案中，在酵母酒精發(fā)酵步驟(2)過(guò)程中加入 額外的葡萄糖異構(gòu)酶。實(shí)施例實(shí)施例1 葡萄汁中的酶催化糖減少_第一個(gè)方面的步驟(1)實(shí)例減少葡萄酒中最終酒精含量的一個(gè)可能的方法是在酒精發(fā)酵之前減少葡萄汁中 的糖濃度。因此，開(kāi)展葡萄汁的酶性處理以減少總糖含量。開(kāi)展三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，在每一情況中使用兩個(gè)重復(fù)。在每一樣品中，200ml葡萄汁 (Pinot Blanc 2007，德國(guó)，經(jīng)巴氏滅菌的)加入至玻璃燒瓶中并且使用磁力攪拌器連續(xù)混 合。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均將樣品充氣。IOOmg 葡萄糖氧化酶(Hyderase，Amano, > 15，000u/g)或者 IOOmg 葡萄糖氧化酶 和Ig葡萄糖異構(gòu)酶(Sigma，G4166-50g, > 350u/g)加入至燒瓶中。在室溫下保溫3天。在即將加入酶之前和加入后的3天取出樣品。使用由BoehringerMarmheim/ R-biopharm(目錄號(hào)10 139 106 035)供應(yīng)的商業(yè)化的基于UV的測(cè)定法并按照制造商提供 的實(shí)驗(yàn)方案分析樣品中葡萄糖和果糖的存在。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果總結(jié)于下表I。表I 葡萄汁中的酶促糖(葡萄糖和果糖)減少，GOX =葡萄糖氧化酶天數(shù)處理總糖(g/1)總、
0GOX2300
GOX+異構(gòu)酶2350
3GOX20212
GOX+異構(gòu)酶19019結(jié)論該實(shí)施例1的這些結(jié)果顯示，僅使用葡萄糖氧化酶的過(guò)程得到12%左右的總糖減 少，額外加入葡萄糖異構(gòu)酶使該數(shù)值明顯提高至19%左右的糖減少。葡萄汁中糖更少意味 著葡萄酒中酒精含量更低。實(shí)施例2 所處理葡萄汁的酵母發(fā)酵_第一個(gè)方面的步驟(1)和步驟(2)的實(shí)施例在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模開(kāi)展了對(duì)普通葡萄酒制造過(guò)程的完全模擬。在該實(shí)驗(yàn)中顯示酶處理 的確對(duì)最終酒精水平具有影響，而沒(méi)有負(fù)面影響主要的葡萄酒的生產(chǎn)參數(shù)，如酒精發(fā)酵或 蘋果酸乳酸發(fā)酵。在近似22°C的室溫下開(kāi)展完整的實(shí)驗(yàn)。開(kāi)展6個(gè)實(shí)驗(yàn)，每一實(shí)驗(yàn)在發(fā)酵瓶中使用 4升葡萄汁(Pinot Blanc 2007，德國(guó)，經(jīng)巴氏滅菌的)。不調(diào)節(jié)葡萄汁的pH并且不加入除 該實(shí)施例中所述酶之外的物質(zhì)。如下所述將葡萄汁與酶預(yù)孵育三天，然后開(kāi)展11天的酒精發(fā)酵和10天的蘋果酸 乳酸發(fā)酵。酶處理6個(gè)燒瓶分成三個(gè)組，每組兩個(gè)燒瓶。在組1中的葡萄汁與0. 5g/l葡萄糖氧化酶(Hyderase，Amano，> 15，000u/g)預(yù)孵 育三天，在組2中葡萄汁與0. 5g/l葡萄糖氧化酶和2g/l葡萄糖異構(gòu)酶(Sigma，G4166_50g，> 350u/g)預(yù)孵育三天，并且在對(duì)照組中葡萄汁不用酶處理。在加入酶之后，將燒瓶在酶存 在下強(qiáng)力充氣三天，之后開(kāi)始酒精發(fā)酵。充氣是重要的，因?yàn)檠跏瞧咸烟茄趸附閷?dǎo)的酶轉(zhuǎn) 化所需要的。酒精發(fā)酵通過(guò)接種再水化的冷凍干燥葡萄酒酵母(釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) Merit. Ferm, Chr. Hansen, 0. lg/1)至9E+05CFU/ml的終濃度開(kāi)始酒精發(fā)酵。再水化是在室 溫在胨水(15g/l 胰蛋白胨、0xoidL42，9g/l NaClU. 14g/l 2%消泡劑 1510、BHD 63215) 中開(kāi)展10分鐘。在此時(shí)停止充氣并且在隨后的幾天內(nèi)由于酵母代謝導(dǎo)致氧消耗光。將酒精發(fā)酵在 室溫運(yùn)行11天，導(dǎo)致將所有糖幾乎完全轉(zhuǎn)化成酒精。蘋果酸乳酸發(fā)酵在酒精發(fā)酵之后，開(kāi)始蘋果酸乳酸發(fā)酵。該部分過(guò)程的目標(biāo)是將蘋果酸轉(zhuǎn)化成產(chǎn) 生更愉悅感官感覺(jué)的乳酸，并且因此是葡萄酒生產(chǎn)過(guò)程的重要部分。蘋果酸乳酸發(fā)酵主要 通過(guò)細(xì)菌酒酒球菌(Oenococcus oeni)實(shí)現(xiàn)。如果酒酒球菌的生長(zhǎng)被葡萄汁的酶處理?yè)p害， 則將是非常不期望的。在開(kāi)始酒精發(fā)酵11天后，通過(guò)向發(fā)酵過(guò)的葡萄汁加入酒酒球菌(Viniflora，Chr. Hansen.批號(hào)2711097)開(kāi)始蘋果酸乳酸發(fā)酵。冷凍干燥的酒酒球菌(0. 7g的8. 2E+11CFU/ g)在 IOOml 胨水(15g/l 胰蛋白胨、Oxoid L 42. 9g/l NaClU. 14g/l 2%消泡劑 1510、 BHD 63215)中再水化10分鐘。向4000ml發(fā)酵過(guò)的葡萄汁中加入3ml，導(dǎo)致最終濃度為 4. 3X 106CFU/ml。在室溫下再放置10天。結(jié)果酶處理對(duì)酒精水平的影響使用由Boehringer Mannheim/R_biopharm(目錄號(hào) 10 139 106 035)供應(yīng)的商業(yè) 化的基于UV的測(cè)定系統(tǒng)并按照制造商提供的實(shí)驗(yàn)方案分析樣品中葡萄糖和果糖水平。表II，在酒精發(fā)酵開(kāi)始和結(jié)束時(shí)的糖水平 在酒精發(fā)酵過(guò)程中的不同天數(shù)時(shí)，使用如文獻(xiàn)(Bestimmung desalkoholgehalts nach Dr. Rebelein.由 C Schliesmann Kellerie-Chemie GmbH& Co. KG, Auwiesenstrasse 5，74523 SchwSbische Hall出版(2001))中所述的Dr. Rebelein滴定方法測(cè)量酒精。在 未處理的葡萄汁中，發(fā)酵幾乎完全，在發(fā)酵過(guò)程結(jié)束時(shí)達(dá)到12. 7%的最終酒精水平。當(dāng)葡萄 汁用葡萄糖氧化酶和葡萄糖異構(gòu)酶預(yù)處理時(shí)，糖發(fā)酵完全，但是酒精的最終水平顯著更低 (11. 8% )。當(dāng)葡萄汁僅用葡萄糖氧化酶預(yù)處理時(shí)發(fā)現(xiàn)酒精為低水平，這是不完全發(fā)酵的結(jié)果。在該實(shí)驗(yàn)中，葡萄糖氧化酶處理的葡萄汁在正常葡萄酒制造中不可使用，因?yàn)樵诎l(fā)酵結(jié) 束時(shí)剩余的糖，特別是果糖水平高(表II)。因此，額外加入葡萄糖異構(gòu)酶幫助維持葡萄汁中的葡萄糖/果糖比率在1 1左 右，這明顯降低了如僅使用GOX時(shí)所示的不期望的酒精發(fā)酵停滯的危險(xiǎn)。此外，使用異構(gòu)酶的實(shí)驗(yàn)去除了所有糖，而在對(duì)照(未處理的葡萄汁)中仍存在一 些果糖(8g/l)。這證明異構(gòu)酶實(shí)質(zhì)防止了發(fā)酵停滯。表III，在發(fā)酵過(guò)程中的酒精水平。在第11天開(kāi)始蘋果酸乳酸發(fā)酵。在葡萄糖氧 化酶(GOX)預(yù)處理樣品中的酒精水平用斜體字表示以表明這些數(shù)值是酒精發(fā)酵嚴(yán)重延緩 的結(jié)果。Nd:不能確定 結(jié)論該實(shí)施例2的結(jié)果顯示，與對(duì)照的12. 7%相比，GOX+異構(gòu)酶明顯降低酒精百分?jǐn)?shù) 至 11. 8%。此外，額外加入葡萄糖異構(gòu)酶幫助維持葡萄汁中的葡萄糖/果糖比率在1 1左 右，這明顯降低了與僅使用GOX相比時(shí)的不期望的酒精發(fā)酵停滯的危險(xiǎn)。當(dāng)葡萄汁僅用葡萄糖氧化酶預(yù)處理時(shí)發(fā)現(xiàn)酒精水平低(9.3% )，這是不完全發(fā) 酵，換句話說(shuō)是不期望的酒精發(fā)酵停滯的結(jié)果。在該實(shí)驗(yàn)中葡萄糖氧化酶處理的葡萄汁不 能用于正常的葡萄酒制造，因?yàn)樵诎l(fā)酵結(jié)束時(shí)剩余糖，特別是果糖水平高(表II)。此外，使用異構(gòu)酶的實(shí)驗(yàn)去除了所有糖，而在對(duì)照(未處理的葡萄汁)中仍存在一 些果糖(8g/l)。這證明異構(gòu)酶本身防止了發(fā)酵停滯。實(shí)施例3 酒精發(fā)酵過(guò)程中的酵母生長(zhǎng)_異構(gòu)酶的加入
明顯降低了酒精發(fā)酵停滯。技術(shù)人員已知，當(dāng)果糖濃度比葡萄糖濃度高相當(dāng)多時(shí)，有代表性的出現(xiàn)發(fā)酵停滯。 在酒精發(fā)酵開(kāi)始時(shí)為1/1的葡萄糖/果糖比率，在酒精發(fā)酵過(guò)程中會(huì)變成負(fù)值，導(dǎo)致發(fā)酵延 遲。在該實(shí)施例3中，通過(guò)僅以葡萄糖氧化酶處理未發(fā)酵的葡萄汁誘導(dǎo)延緩的(停滯 的)發(fā)酵。為了研究葡萄糖異構(gòu)酶對(duì)在酒精發(fā)酵過(guò)程中酵母生長(zhǎng)和存活能力的影響，如本文 實(shí)施例2中所述開(kāi)展模擬葡萄酒生產(chǎn)。如下所述，葡萄汁與酶預(yù)孵育三天，然后進(jìn)行11天 的酒精發(fā)酵和10天的蘋果酸乳酸發(fā)酵。開(kāi)展三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，在每一實(shí)驗(yàn)中使用兩個(gè)重復(fù)。在每一樣品中，200ml葡萄汁 (Pinot Blanc 2007，德國(guó)，經(jīng)巴氏滅菌的)加入至玻璃燒瓶中并且使用磁力攪拌器連續(xù)混 合。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均將樣品充氣。IOOmg 葡萄糖氧化酶(Hyderase，Amano, > 15，000u/g)或者 IOOmg 葡萄糖氧化酶 和Ig葡萄糖異構(gòu)酶(Sigma，G4166-50g, > 350u/g)加入至燒瓶中。在室溫下保溫3天。 在該時(shí)間點(diǎn)之后，通過(guò)接種再水化的冷凍干燥的葡萄酒酵母(釀酒酵母Merit. Ferm, Chr. Hansen, 0. lg/1)至9E+05CFU/ml的終濃度開(kāi)始酒精發(fā)酵。再水化是于室溫下在胨水(15g/ 1 胰蛋白胨、Oxoid L42. 9g/l NaClU. 14g/l 2%消泡劑 1510、BHD 63215)中開(kāi)展 10 分 鐘。在開(kāi)始酒精發(fā)酵11天后，通過(guò)向發(fā)酵過(guò)的葡萄汁加入酒酒球菌(Viniflora，Chr. Hansen.批號(hào)2711097)開(kāi)始蘋果酸乳酸發(fā)酵。冷凍干燥的酒酒球菌(0. 7g的8. 2E+11CFU/ g)在 IOOml 胨水(15g/l 胰蛋白胨、Oxoid L 42. 9g/l NaClU. 14g/l 2%消泡劑 1510、 BHD 63215)中再水化10分鐘。向4000ml發(fā)酵過(guò)的葡萄汁中加入3ml，獲得終濃度為 4. 3X 106CFU/ml。在室溫下再放置10天。釀酒酵母菌落形成單位數(shù)如下確定，即在不同時(shí)間點(diǎn)從發(fā)酵的葡萄汁取出樣品并 將系列稀釋液涂布于YGC固體培養(yǎng)基瓊脂平板上，然后在30°C孵育過(guò)夜。使用由Boehringer Mannheim/R-biopha rm(目錄號(hào) 10 139 106 035)供應(yīng)的商 業(yè)化的基于UV的測(cè)定系統(tǒng)并按照制造商提供的實(shí)驗(yàn)方案確定糖水平。結(jié)果異構(gòu)酶對(duì)酒精發(fā)酵停滯的影響在酒精發(fā)酵過(guò)程中，葡萄汁中的糖被釀酒酵母轉(zhuǎn)化成乙醇。僅以葡萄糖氧化酶處理顯示，由于釀酒酵母生長(zhǎng)的延緩導(dǎo)致酒精發(fā)酵延緩(停滯 發(fā)酵)(如表IV中所示)。在以葡萄糖氧化酶預(yù)處理的未發(fā)酵葡萄汁中，酵母的生長(zhǎng)在酒精 發(fā)酵的前幾天非常差。CFU數(shù)在酒精發(fā)酵第一天時(shí)低于檢測(cè)限，并且在第二天時(shí)低于近似 31og單位。這清楚地表明發(fā)酵停滯。糖分析支持該結(jié)果。在未處理的未發(fā)酵葡萄汁中，在酵母發(fā)酵3天后，近似60 %的 糖被發(fā)酵，而在GOX預(yù)處理的未發(fā)酵葡萄汁中少于10%的糖被發(fā)酵。然而，當(dāng)在預(yù)處理和酒精發(fā)酵過(guò)程中存在葡萄糖異構(gòu)酶時(shí)，發(fā)酵過(guò)程的行為幾乎 與未處理的葡萄汁的發(fā)酵相同。剩余的糖水平和釀酒酵母CFU數(shù)(表IV)可與未處理的葡 萄汁相當(dāng)。換句話說(shuō)，葡萄糖異構(gòu)酶能夠克服由GOX處理所造成的發(fā)酵停滯。表IV，在酒精發(fā)酵過(guò)程中的活釀酒酵母細(xì)胞計(jì)數(shù)。葡萄汁已經(jīng)如上所述預(yù)處理3 結(jié)論
如該實(shí)施例3中所示，僅使用GOX將引起明顯的不期望的發(fā)酵停滯。該實(shí)施例3的結(jié)果顯示，異構(gòu)酶的加入可幫助克服GOX的加入對(duì)通常用于葡萄酒 生產(chǎn)的釀酒酵母生長(zhǎng)的負(fù)面影響。參考文獻(xiàn)l.US4675191(Novo Industri，在丹麥公布的，1987)
權(quán)利要求
生產(chǎn)具有低酒精含量的葡萄酒的方法，其包括下列步驟(1)以有效量的下列兩種酶處理未發(fā)酵的葡萄汁(a)在氧存在下以葡萄糖氧化酶處理一段足以將葡萄汁中的至少部分葡萄糖轉(zhuǎn)化成葡糖酸的時(shí)間；和(b)以葡萄糖異構(gòu)酶處理一段足以將葡萄汁中的至少部分果糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖的時(shí)間；和此后，(2)具有減少量的葡萄糖和果糖的如此處理的葡萄汁被發(fā)酵以生產(chǎn)具有低酒精含量的葡萄酒。
2.權(quán)利要求1的方法，其中權(quán)利要求1步驟(2)所生產(chǎn)的具有低酒精含量的葡萄酒具 有被認(rèn)為對(duì)于紅/白葡萄糖而言是正常的(12-14%左右)的酒精含量，并且其中如果葡萄 酒在沒(méi)有權(quán)利要求1的步驟(1)的酶處理情況下制造的話將具有過(guò)高的酒精百分?jǐn)?shù)(例如 15-17% )。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中權(quán)利要求1的方法包括去除至少部分葡糖酸以得到具 有令人滿意的感官特性的葡萄酒的額外步驟(3)；并且其中葡糖酸通過(guò)加入形成葡糖酸微 溶鹽的物質(zhì)，優(yōu)選碳酸鈣進(jìn)行中和的方法去除。
4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(1)過(guò)程中對(duì)于葡萄糖氧化酶/異構(gòu)酶兩 種酶的所述有效量和所述的一段時(shí)間是這樣的，以致于(A)葡萄汁中的糖含量減少至少10%。
5.權(quán)利要求4的方法，其中葡萄汁中的糖含量減少至少17%。
6.權(quán)利要求4或5的方法，其中-所述的一段時(shí)間不超過(guò)72小時(shí)；并且-對(duì)于葡萄糖氧化酶/異構(gòu)酶兩種酶的有效量為(i)在1，000和50，000,000國(guó)際單位每hi葡萄汁之間的葡萄糖氧化酶活性；和(ii)在100和5，000,000國(guó)際單位每hi葡萄汁之間的葡萄糖異構(gòu)酶活性；和-在權(quán)利要求1步驟(1)過(guò)程中的溫度在1和35°C之間，優(yōu)選在3和30°C之間。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在權(quán)利要求1步驟1過(guò)程中向葡萄汁持續(xù)供應(yīng)氧， 優(yōu)選地用空氣泵供應(yīng)氧。
8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在權(quán)利要求1的步驟(1)中葡萄汁還以有效量的 具有過(guò)氧化氫酶活性的制劑處理一段足以將葡萄汁中的至少部分H2O2轉(zhuǎn)化成02+H20的時(shí) 間。
9.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在權(quán)利要求1的步驟(2)的酵母酒精發(fā)酵過(guò)程中 加入額外的葡萄糖異構(gòu)酶。
10.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中葡萄酒是白葡萄酒、紅葡萄酒、無(wú)氣葡萄酒或含 汽葡萄酒。
全文摘要
生產(chǎn)具有低酒精含量葡萄酒的方法，包括以葡萄糖氧化酶和葡萄糖異構(gòu)酶處理未發(fā)酵的未發(fā)酵的葡萄汁。
文檔編號(hào)C12G3/08GK101932691SQ200880125845
公開(kāi)日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2008年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月29日
發(fā)明者克里斯廷·彼耶爾, 約翰尼斯·馬滕·范丹布林克 申請(qǐng)人:科.漢森有限公司