專利名稱：：具有阿魏酸酯酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及具有阿魏酸酯酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及用于產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。相關領域描述植物細胞壁多糖約構成植物細胞壁的90%，并且能分成三組纖維素，半纖維素和果膠。纖維素代表細胞壁多糖的主要成分。半纖維素是植物細胞壁第二豐富的成分。主要的半纖維素聚合物是木聚糖。植物細胞壁中發(fā)現(xiàn)的木聚糖的結構依賴于其來源而顯著不同，但是總是包含日-1，4-連接的0-木糖骨架。0-1，4_連接的D-木糖骨架可以由各種側鏈基團取代，如L-阿拉伯糖，D-半乳糖，乙?；?，阿魏酰基，對-香豆酰基和葡萄糖醛酸殘基。木聚糖骨架的生物降解依賴于兩類酶內(nèi)切木聚糖酶和木糖苷酶。內(nèi)切木聚糖酶(EC3.2.1.8)將木聚糖骨架切割成更小的寡糖，其可以進一步由木糖苷酶(EC3.2.1.37)降解成木糖。其它與木聚糖降解有關的酶包括，例如，乙?；揪厶酋ッ?，阿拉伯糖酶，a“葡糖醛酸糖苷酶，阿魏?；ッ?，和對_香豆酸酯酶。Faulds和Williamson，1991，J.Gen.Microbiol.137:2339_2345描述了來自橄欖色鏈霉菌(Str印tomycesolivochromogenes)的4_羥基-3-甲氧基-肉桂(阿魏酰基)酸酯酶的純化和表征。Faulds和Williamson，1994，Microbiology140:779_787，描述了來自黑曲霉(Aspergillusniger)的阿魏酸酯酶的純化和表征。Kroon等，1996，Biotechnol.Appl.Biochem.23:255_262描述了由糖甜菜粕上黑曲霉生長而誘導的阿魏酸酯酶的純化和表征。deVries等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63:4638_4644公開了來自黑曲霉和塔賓曲霉(Aspergillustubingensis)的阿魏酸酯酶基因。Castanares等，1992，EnzymeMicrobiol.Technol.14:875-884，描述了來自嗜松青霉(Penicillumpinophilu)的阿魏?；?對_香豆?；ッ傅募兓托再|(zhì)。本發(fā)明涉及具有阿魏酸酯酶活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸。發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有阿魏酸酯酶活性的分離的多肽，所述多肽選自下組(a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少75%同一性；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中_高嚴緊條件下與以下雜交4(i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；(c)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少75%同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。本發(fā)明還涉及編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽的分離的多核苷酸，所述多核苷酸選自下組(a)編碼包含氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列與SEQIDN02的成熟多肽具有至少75%同一性；(b)多核苷酸，其在至少中-高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的互補鏈；(c)多核苷酸，其包含與SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列具有至少75%同一性的核苷酸序列；和(d)多核苷酸，其編碼SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、重組表達載體和重組宿主細胞，和產(chǎn)生具有阿魏酸酯酶活性的多肽的方法。本發(fā)明還涉及抑制所述具有阿魏酸酯酶活性的多肽在細胞中表達的方法，其包括對細胞施用雙鏈RNA(dsRNA)分子或在細胞中表達雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中dsRNA包括本發(fā)明的多核苷酸的亞序列。本發(fā)明還涉及這種雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其中任選地dsRNA是siRNA或miRNA分子。本發(fā)明還涉及用具有阿魏酸酯酶活性的多肽降解含木聚糖材料的方法。本發(fā)明還涉及包含分離的多核苷酸的植物，所述多核苷酸編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生具有阿魏酸酯酶活性的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)包含多核苷酸的轉基因植物或植物細胞，所述多核苷酸編碼具有阿魏酸酯酶的多肽；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明進一步涉及包含編碼蛋白質(zhì)的基因的核酸構建體，其中將所述基因可操作地連接于編碼信號肽的核苷酸序列，所述信號肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1至18或由SEQIDNO2的氨基酸1至18組成，其中所述基因?qū)τ谒龊塑账嵝蛄惺峭庠吹?。附圖簡述圖1顯示特異腐質(zhì)霉DSM1800CE1阿魏酸酯酶的基因組DNA序列和推導的氨基酸序列(分別為SEQIDNO1和2)。圖2顯示pMMar8的限制圖譜。圖3顯示pHinsFAEBl的限制圖譜。定義阿魏酸酯酶活性術語“阿魏酸酯酶活性”在本文中定義為4-羥基-3-甲氧基肉桂酉先—糖水角軍Bl(4-hydroxy-3-methoxycinnamoyl-sugarhydrolase)夕舌個生(EC3.1.1.73)，其催化從酯化的糖水解4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰基)基團，所述糖通常是“天然”底物中的阿拉伯糖，以產(chǎn)生阿魏酸(4-羥基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也稱作阿魏?；ッ浮⒘u基肉桂?；ッ浮AE-III、肉桂酰酯水解酶、FaeA、FaeB、cinnAE、FAE-I或FAE-II。已經(jīng)報道了兩種主要的阿魏酸酯酶(Cr印in等，2004，Appl.Microbiol.Biotechnol.63647-652)。A型阿魏酸酯酶從1，5_酯-連接的阿魏?；陌⒗轻尫虐⑽核?，并且在用木聚糖酶預處理或者將木聚糖酶與阿魏酸酯酶共溫育時還能釋放少量的5，5’_和8-0-4’-阿魏酸脫氫二聚體。A型阿魏酸酯酶還表現(xiàn)出對于底物的酚部分的優(yōu)先性，所述底物包含甲氧基取代，特別是在碳3和/或5處，如在阿魏酸和芥子酸(sinapicacid)中所發(fā)生的。就針對合成底物的特異性而言，A型阿魏酸酯酶對于阿魏酸甲酯、芥子酸甲酯和對-香豆酸甲酯有活性，但是對于咖啡酸甲酯沒有活性。B型阿魏酸酯酶釋放與阿魏酰化阿拉伯糖殘基的C-2或阿魏?；肴樘菤埢腃-6連接的阿魏酸酯，但是不能釋放阿魏酸的二聚形式。B型阿魏酸酯酶對于底物的酚部分表現(xiàn)出優(yōu)先性，所述底物包含一個或兩個羥基取代，如分別在對香豆酸和咖啡酸中存在的。當存在甲氧基基團時水解速度顯著降低。就針對合成底物的特異性而言，B型阿魏酸酯酶對于咖啡酸甲酯、阿魏酸甲酯和對-香豆酸甲酯有活性，但是對于芥子酸甲酯沒有活性。就本發(fā)明而言，根據(jù)實施例中描述的方法確定阿魏酸甲酯活性。一個單位的阿魏酸酯酶活性等于能夠在PH5，25°C每分鐘釋放1微摩爾對硝基苯酚陰離子的酶量。本發(fā)明的多肽具有SEQIDNO2的成熟多肽的阿魏酸酯酶活性的至少20%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少100%。CE1或CE1家族術語“CE1家族”或“CE1”在本文中定義為根據(jù)Coutinho和Henrissat,(1999)Carbohydrate-activeenzymes:anintegrateddatabaseapproach.于"RecentAdvancesinCarbohydrateBioengineering",H.J.Gilbert,G.Davies,B.Henrissat禾口B.Svensson編，TheRoyalSocietyofChemistry,Cambridge,pp.3-12屬于糖酯酶家族的多肽。含木聚糖材料術語“含木聚糖材料”在本文中定義為包含木聚糖作為組分的任何物質(zhì)。木聚糖是包含0-1，4_連接木糖殘基骨架的植物細胞壁多糖。4-0-甲基葡萄糖醛酸和阿拉伯糖的側鏈通常以不同的量與乙酰和阿魏?；鶊F一起存在。木聚糖是半纖維素的主要組分。分離的多肽術語“分離的多肽”用于本文中指由來源分離的多肽。在一個優(yōu)選的方面，多肽是如通過SDS-PAGE測定的，至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純的多肽?；旧霞兊亩嚯男g語“基本上純的多肽”在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物含有按重量計至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%,更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結合的(associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式，即，所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結合的其它多肽材料。例如，這能夠通過以下實現(xiàn)通過公知的重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽。成熟多肽術語“成熟多肽”在本文中定義為多肽，所述多肽以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截斷、糖基化等。在一個優(yōu)選的方面，根據(jù)預測SEQIDNO2的氨基酸1至18是信號肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering101-6)，成熟多肽是SEQIDNO2的氨基酸19至291。成熟多肽編碼序列術語“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼具有阿魏酸酯酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一個優(yōu)選的方面，根據(jù)預測SEQIDN0:1的核苷酸1至54編碼信號肽的SignalP程序，成熟多肽編碼序列是的SEQIDNO1的核苷酸55至1054。同一性由參數(shù)“同一性”描述的兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的同一性程度通過Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48443-453)使用EMBOSS軟件(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,TrendsinGenetics16276-277)的Needle程序來確定，優(yōu)選3.0.0版或更高版本。使用的可選參數(shù)為缺口罰分(gappenalty)10，缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62取代矩陣(BL0SUM62的EMBOSS版)。使用Needle標記為“最高同一性(longestidentity)”(使用-nobrief選項獲得)的輸出結果作為百分比同一性，并計算如下(相同的殘基X100)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個核苷酸序列之間的同一性程度通過Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，見上文)使用EMBOSS軟件(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite，Rice等，2000，見上文)的Needle程序來測定，優(yōu)選3.0.0或更高版本。使用的可選參數(shù)為缺口罰分10，缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL取代矩陣(NCBINUC4.4的EMBOSS版)。使用Needle標記為“最高同一性”的輸出結果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，并計算如下(相同的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))同源序列術語“同源序列”在本文中定義為在用SEQIDNO:2的特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶或其成熟多肽進行的tfasty搜索(Pearson,ff.R.，1999，于BioinformaticsMethodsandProtocols，S.Misener和S.A.Krawetz編，pp.185-219)中E值(或期望值)小于0.001的預測蛋白質(zhì)。多肽片段術語“多肽片段”在本文中定義為從SEQIDNO2的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(幾個)氨基酸的多肽；其中所述片段具有阿魏酸酯酶活性。在一個優(yōu)選的方面，片段含有SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的至少230個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少245個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少260個氨基酸殘基。亞序列術語“亞序列(subsequence)”在本文中定義為從SEQIDNO1或其同源序列的5’和/或3’端缺失一個或多個(幾個)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亞序列編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽片段。在一個優(yōu)選的方面，亞序列含有SEQIDN0:1的成熟7多肽編碼序列或其同源序列的至少690個核苷酸，更優(yōu)選至少735個核苷酸，并且最優(yōu)選至少780個核苷酸。等位變體(allelicvariant)術語“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導致種群內(nèi)的多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術語“分離的多核苷酸”用于本文中指從來源分離的多核苷酸。在一個優(yōu)選的方面，多核苷酸是如通過瓊脂糖電泳測定的，至少純，優(yōu)選5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純的多核苷酸。基本上純的多核苷酸術語“基本上純的多核苷酸”用于本文指不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%，并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。本發(fā)明所述多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選在本文公開的多核苷酸是“基本上(essentially)純的形式”，即，所述多核苷酸制備物基本上不含與其天然或重組結合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。編碼序列當用于本文時術語“編碼序列”的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成或重組核苷酸序列。cDNA:術語“cDNA”在本文中定義為能夠通過反轉錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內(nèi)含子序列。因而源自mRNA的cDNA沒有任何內(nèi)含子序列。核酸構建體術語“核酸構建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或?qū)⑺龊怂岱肿右员緛聿淮嬖谟?nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區(qū)段，或所述核酸是合成的。當所述核酸構建體含有表達本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時，術語核酸構建體與術語“表達盒”同義。調(diào)控序列(controlsequence)術語“調(diào)控序列”在本文定義為包括對編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達是必需的或有利的所有成分。各個調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各個調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接術語“可操作地連接”在本文表示這樣的構型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當位置，使得調(diào)控序列指導多肽編碼序列的表達。表達術語“表達”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達載體術語“表達載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞如本文中所使用的術語“宿主細胞”包括任何細胞類型，所述細胞類型對于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構建體或表達載體的轉化、轉染、轉導等是易感的(susceptible)0修飾術語“修飾”在本文的意思是，對由SEQIDNO2的成熟多肽或其同源序列組成的多肽的任何化學修飾，以及對編碼所述多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個(幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個(幾個)氨基酸側鏈的置換。人工變體當用在本文時，術語“人工變體”的意思是具有阿魏酸酯酶活性的多肽，所述多肽由表達SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的修飾的核苷酸序列的生物體產(chǎn)生。所述修飾的核苷酸序列通過人為干預(humanintervention)，通過修飾公開于SEQIDNO:1或它們的同源序列的多核苷酸序列來獲得。發(fā)明詳述具有阿魏酸酯酶活性的多肽在第一個方面，本發(fā)明涉及包含氨基酸序列的分離的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO2的成熟多肽具有優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%、97%、98%或99%的同一性程度，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性(下文中的“同源多肽”)。在一個優(yōu)選的方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，其與SEQIDNO:2的成熟多肽相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO2的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有阿魏酸酯酶活性的片段。在一個優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選方面，多肽包含SEQIDNO:2的成熟多肽。在另一個優(yōu)選方面，多肽包含SEQIDNO2的氨基酸19至291，或其等位變體；或它們的具有阿魏酸酯酶活性的片段。在另一個優(yōu)選方面，多肽包含SEQIDN0:2的氨基酸19至291。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO2的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有阿魏酸酯酶活性的片段組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO2的成熟多肽組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO2的氨基酸19至291或其等位變體；或它們的具有阿魏酸酯酶活性的片段組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDN0:29的氨基酸19至291組成。在第二個方面，本發(fā)明涉及具有阿魏酸酯酶活性的分離的多肽，所述分離的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優(yōu)選非常低嚴緊條件下，更優(yōu)選低嚴緊條件下，更優(yōu)選中嚴緊條件下，更優(yōu)選中_高嚴緊條件下，甚至更優(yōu)選高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選非常高嚴緊條件下，與以下雜交(i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全長互補鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽片段。在一個優(yōu)選的方面，所述互補鏈是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。SEQIDNO:1的核苷酸序列或其亞序列，以及SEQIDNO:2的氨基酸序列或其片段，可用于設計核酸探針，以根據(jù)本領域內(nèi)公知的方法從不同屬和種的菌株鑒定和克隆編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽的DNA。具體而言，根據(jù)標準的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定和從其中分離相應的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長度上應為至少14，優(yōu)選至少25，更優(yōu)選至少35，并且最優(yōu)選至少70個核苷酸。然而，優(yōu)選所述核酸探針是至少100個核苷酸長度。例如，所述核酸探針的長度可為至少200個核苷酸，優(yōu)選至少300個核苷酸，更優(yōu)選至少400個核苷酸，或最優(yōu)選至少500個核苷酸。甚至可以使用更長的探針，例如，長度是優(yōu)選至少600個核苷酸，更優(yōu)選至少700個核苷酸，更優(yōu)選至少800個核苷酸，或最優(yōu)選至少900個核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以探測相應的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。將這些探針包含于本發(fā)明中。因而，可從由這些其它生物體制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術分離來自這些其它生物體的基因組或其它DNA。可以將來自文庫的DNA或分離的DNA轉移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料優(yōu)選用在Sounthern印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴緊條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應于SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列；包含于SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，其全長互補鏈；或它們的亞序列?？墒褂美鏧射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸55至1054。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:1。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是包含在大腸桿菌(E.coli)NRRLB-50077中的質(zhì)粒pHinsFAEBl中含有的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50077中的質(zhì)粒pHinsFAEBl中含有的成熟多肽編碼序列區(qū)域。對于長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴緊條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS,200ug/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對于非常低和低嚴緊性為25%的甲酰胺、對于中和中-高嚴緊性為35%的甲酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍谰o性為50%的甲酰胺，根據(jù)標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交最佳12至24小時。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2%SDS優(yōu)選至少在45°C(非常低嚴緊性)，更優(yōu)選至少在50°C(低嚴緊性)，更優(yōu)選至少在55°C(中嚴緊性)，更優(yōu)選至少在60°C(中-高嚴緊性)，甚至更優(yōu)選至少在65°C(高嚴緊性)，并且最優(yōu)選至少在70°C(非常高嚴緊性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴緊條件定義為在比牛艮據(jù)Bolton禾口McCarthy計算法(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA481390)得出的Tm低大約5°C至大約10°C，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA，0.5%NP-40,1XDenhardt溶液，ImM焦磷酸鈉(sodiumpyrophosphate)，ImM石舞酸二fil內(nèi)(sodiummonobasicphosphate)，0.ImMATP禾口0.2mg每ml的酵母RNA中，根據(jù)標準的Southern印跡步驟進行預雜交、雜交和雜交后洗滌最佳12至24小時。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在比計算的Tm低5°C至10°C的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。在第三方面，本發(fā)明涉及具有阿魏酸酯酶活性的分離的多肽，其由包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%同一性的同一性程度，其編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽。參見本文的多核苷酸部分。在第四方面，本發(fā)明涉及SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的人工變體。優(yōu)選地，氨基酸改變對性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為1至大約30個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進純化的小延伸,如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結合域(bindingdomain)。保守取代的實例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979，于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu禾口Asp/Gly。除了20個基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2_氨基異丁酸、異纈氨酸和a-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基。“非天然氨基酸”在蛋白質(zhì)合成后已經(jīng)過修飾，和/或在它們的側鏈具有不同于基本氨基酸的化學結構。非天然氨基酸能夠以化學方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上能夠獲得的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑燒羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸?？晒┻x擇的是，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)以使多肽的物理化學性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改進多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據(jù)本領域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的生物活性(即，阿魏酸酯酶活性)以鑒定對于所述分子的活性關鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699_4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結構的物理分析而測定，如通過以下這些技術如核磁共振、晶體學、電子衍射或光親和標記，連同推定的接觸位點氨基酸的突變來測定。參見例如deVos等，1992，Science255:306-312;Smith等，1992，J.Mol.Biol.224:899_904；fflodaver等，1992，F(xiàn)EBSLett.30959-64必需氨基酸的同一性也能夠從與多肽的同一性分析來推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關的篩選方法，例如由Reidhaar-Olson禾口Sauer，1988，Science24153-57；Bowie禾口Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152_2156；W095/17413；或W095/22625公開的那些方法來進行并測試單個或多個氨基酸取代。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.3010832-10837；美國專利號5，223，409；W092/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46145；Ner等，1988，DNA7127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。能夠從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領域內(nèi)標準方法快速測序。這些方法允許快速測定感興趣的多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并且能夠應用于未知結構的多肽。SEQIDNO2的成熟多肽，如SEQIDNO2的氨基酸19至291的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選1。具有阿魏酸酯酶活性的多肽的來源本發(fā)明的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關的術語“獲得自”，意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌株產(chǎn)生。在一個優(yōu)選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。本發(fā)明具有阿魏酸酯酶活性的多肽可以是細菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽性細菌多肽例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、鏈霉菌12屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性；或革蘭氏陰性細菌多肽，如大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽是嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸瘟亞種(Str印tococcusequisubsp.Zooepidemicus)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是不產(chǎn)色鏈霉菌(Str印tomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。本發(fā)明具有阿魏酸酯酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選酵母多肽如念珠菌屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性；或更優(yōu)選絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬賭菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二孢屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium、鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、耙齒菌屬(Irpex)>M(Lentinula)>Leptospaeria>|ifM(Magnaporthe)>Melanocarpus>多孔菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(PeniciIlium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假黑盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉屬(Rhizomucor)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、長毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳菇屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽是卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多月太，所述多月太具有阿魏酸酯酶活性。在另一個優(yōu)選方面，所述多肽是解纖維枝頂孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、Ml^^9(Aspergillusaculeatus)Λ^^ftβ(Aspergillusawamori)Λffiβ(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構巢曲霉(Aspergillusnidulans)、漂曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、嗜角質(zhì)金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀,廉抱(Fusariumculmorum)、禾本禾斗德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖,廉抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅,廉抱(Fusariumroseum)、接骨木,廉抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱,廉抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圓,廉抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、白奉巴齒菌(Irpexlacteus)、米M毛毒(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、Thielaviaachromatica、THielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼(THielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimeti、小抱梭抱殼(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱殼(Thielaviaovispora)、THielaviaperuviana、瘤抱梭抱殼(THielaviaspededonium)、^包冑(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、zhtMi包胃(Thielaviaterrestris)、@He(Trichodermaharzianum)(Trichodermakoningii)、長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。在另一個優(yōu)選方面，所述多肽是灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)或疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalmuginosa)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。在一個更優(yōu)選的方面，所述多肽是具有阿魏酸酯酶活性的特異腐質(zhì)霉多肽。在一個最優(yōu)選的方面，所述多肽是具有阿魏酸酯酶活性的特異腐質(zhì)霉DSM1800多肽，例如，包含SEQIDNO2的成熟多肽的多肽?？衫斫獾氖菍τ谇笆龅姆N，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)，和其它分類學的等同物(equivalent)，例如無性型(anamorph)，而無論它們已知的種名。本領域熟練技術人員將容易地識別適合的等同物的同一性。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機構專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術是本領域內(nèi)公知的。隨后可通過相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苷酸序列，就能夠使用本領域普通技術人員熟知的技術將所述多核苷酸分離或克隆(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一個多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術是本領域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，并且使融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。融合多肽還可以包括切割位點。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位點，從融合蛋白質(zhì)釋放具有阿魏酸酯酶活性的多肽。切割位點的實例包括，但不限于，編碼二肽Lys-Arg的Kex2位點(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568_76；Svetina等，2000,J.Biotechnol.76245-251；Rasmussen-Wilson等，1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488_3493；Ward等，1995，Biotechnology13:498_503；和Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381)；Ile_(Glu或Asp)-Gly-Arg位點，其在精氨酸殘基后通過因子Xa蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25:505_512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位點，其在賴氨酸后通過腸激酶切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology13:982_987)；His-Tyr-Glu位點或His-Tyr-Asp位點，其通過GenenaseI切割(Carter等，1989,Proteins-Structure,Function,andGenetics6:240_248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位點，其在Arg后通過凝血酶切割(Stevens，2003，DrugDiscoveryWorld435-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位點，其在Gln后通過TEV蛋白酶切割(Stevens，2003，見上文)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位點，其在Gln后通過基因工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，見上文)。多核苷酸本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含編碼本發(fā)明具有阿魏酸酯酶活性的多肽的核苷酸序列，或由編碼本發(fā)明具有阿魏酸酯酶活性的多肽的核苷酸序列組成。在一個優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO1或由SEQIDNO=I組成。在另一個更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌NRRLB-50077中所含質(zhì)粒pHinsFAEBl中含有的序列，或由大腸桿菌NRRLB-50077中所含質(zhì)粒pHinsFAEBl中含有的序列組成。在另一個優(yōu)選方面，核苷酸序列包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列組成。在另一個優(yōu)選方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸55至1054或由SEQIDNO1的核苷酸55至1054組成。在另一個更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌NRRLB-50077中所含質(zhì)粒pHinsFAEBl中含有的成熟多肽編碼序列或由大腸桿菌NRRLB-50077中所含質(zhì)粒pHinsFAEBl中含有的成熟多肽編碼序列組成。本發(fā)明還包含編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQIDNO2的氨基酸序列或其成熟多肽組成；由于遺傳密碼的簡并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO1或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及SEQIDNO1的亞序列，所述亞序列編碼具有阿魏酸酯酶活性的SEQIDNO2的片段。本發(fā)明還涉及突變多核苷酸，所述突變多核苷酸在SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變，或由具有至少一個突變的SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列組成，其中所述突變核苷酸序列編碼SEQIDNO:2的成熟多肽。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術是本領域內(nèi)已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^例如使用熟知的聚合酶鏈式反應(PCR)或表達文庫的抗體篩選來檢測具有共有結構特性的克隆DNA片段，從而實現(xiàn)從這種基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork?？梢允褂闷渌怂釘U增方法，如連接酶鏈式反應(LCR)、連接活化轉錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于核苷酸序列的擴增(NASBA)?？梢詮母|(zhì)霉屬菌株，或其它或相關生物體克隆多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。本發(fā)明還涉及包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成的分離的多核苷酸，所述核苷酸序列與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%同一性的同一性程度，其編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽。修飾編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列對于合成與所述多肽基本上相似的多肽可為必需的。術語與所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適PH等方面不同的人工變體?？梢栽谧鳛镾EQIDNO:1的多肽編碼區(qū)存在的核苷酸序列，例如其亞序列的基礎上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構建變體序列所述取代不產(chǎn)生由核苷酸序列編碼的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲產(chǎn)生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產(chǎn)生不同的氨基酸序列。關于核苷酸取代的概述，參見，例如，F(xiàn)ord等，1991,ProteinExpressionandPurification2一107。對于本領域技術人員顯而易見的是，這些取代能夠在對于分子功能重要的區(qū)域之外進行，并且仍然產(chǎn)生活性多肽。對于由本發(fā)明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關鍵的并且因此優(yōu)選不進行取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領域公知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(參見，例如，Cunningham和Wells，1989，見上文)來鑒定。在后一技術中，將突變引入到分子中的每個荷正電的殘基處，并且測試所得突變分子的阿魏酸酯酶活性，以鑒定對于所述分子的活性關鍵的氨基酸殘基。底物_酶相互作用的位點也能夠通過分析三維結構測定，通過如核磁共振分析、晶體學或光親和標記這樣的技術來測定(參見，例如，deVos等，1992，見上文；Smith等，1992，見上文；Wlodaver等，1992，見上文)。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在非常低嚴緊條件下，優(yōu)選低嚴緊條件，更優(yōu)選中等嚴緊條件，更優(yōu)選中_高嚴緊條件，甚至更優(yōu)選高嚴緊條件，并且最優(yōu)選非常高的嚴緊條件下，與以下序列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，見上文)，如本文所定義的。在一個優(yōu)選的方面，互補鏈是SEQIDNO:1的所述成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸通過以下方法獲得(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高嚴緊條件下，將DNA的群體與以下序列雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽。在一個優(yōu)選的方面，互補鏈是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。核酸構建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的核酸構建體，所述分離的多核苷酸與一個或多個(幾個)調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導編碼序列的表達?？梢杂迷S多方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸以提供多肽的表達。依賴于表達載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術是本領域熟知的。調(diào)控序列可以是適當?shù)膯幼有蛄?，其是由用于表達編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導多肽的表達的轉錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選的宿主細胞中顯示轉錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截斷的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導本發(fā)明的核酸構建體轉錄，特別是在細菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌Iac操縱子、天藍色鏈霉菌(Str印tomycescoelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727_3731)，以及tac啟動子(DeBoer等，1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)。另外的啟動子在〃Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"于ScientificAmerican,1980,242:74_94中；禾口在Sambrook等，1989，見上文中描述。用于指導本發(fā)明的核酸構建體在絲狀真菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構酶、構巢17曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(WC)00/56900)、鑲片鐮孢Quirm(W000/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截斷的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對于酵母宿主細胞其它有用的啟動子由Romanos等，1992，Yeast8:423_488描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉錄終止子序列，是由宿主細胞識別以終止轉錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地連接?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對于酵母宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對于酵母宿主細胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見上文描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導序列，其是對于宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何前導序列用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的前導序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構巢曲霉丙糖磷酸異構酶。對于酵母宿主細胞合適的前導序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α-因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3，末端可操作地連接的序列，并且在轉錄時，宿主細胞將其識別為信號以將聚腺苷殘基添加至轉錄的mRNA?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發(fā)明中使用。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。對于酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，MolecularCellularBiology15:5983_5990描述。調(diào)控序列還可以是信號肽編碼序列，其編碼與多肽的氨基末端相連的氨基酸序列，并且指導編碼的多肽進入細胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5’端可固有地包含信號肽編碼序列，其與編碼分泌多肽的編碼序列片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?？晒┻x擇的是，編碼序列5’端可含有對于所述編碼序列異源的信號肽編碼序列。異源信號肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號肽編碼序列時可為必需的。或者，外源信號肽編碼序列可以簡單地取代天然信號肽編碼序列以增強多肽的分泌。然而，指導表達的多肽進入所選宿主細胞的分泌途徑(即，分泌至培養(yǎng)基中)的任何信號肽編碼序列可在本發(fā)明中使用。對于細菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT，nprS,nprM)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號肽由Simonen和Palva，1993，MicrobiologicalReviews57109-137描述。對于絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼區(qū)米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶。對于酵母宿主細胞有用的信號肽從釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼序列由Romanos等，1992，見上文描述。在一個優(yōu)選的方面，信號肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1至18，或者由SEQIDNO:2的氨基酸1至18組成。在另一個優(yōu)選方面，信號肽編碼序列包含SEQIDNO1的核苷酸1至54，或者由SEQIDNO1的核苷酸1至54組成。調(diào)控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))0前多肽通常是無活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉化為成熟活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α-因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)的基因獲得前肽編碼區(qū)。當信號肽和前肽區(qū)二者均出現(xiàn)在多肽的氨基末端時，將前肽區(qū)置于緊接著(nextto)多肽氨基末端，并且將信號肽區(qū)置于緊接著前肽區(qū)的氨基末端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對于宿主細胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是引起基因表達響應化學或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達載體本發(fā)明還涉及重組表達載體，所述重組表達載體包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子和轉錄和翻譯終止信號。本文所述的多種核酸和調(diào)控序列可以結合在一起以產(chǎn)生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個(幾個)方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核苷酸序列。可供選擇的是，可以通過在適當?shù)挠糜诒磉_的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構建體來表達本發(fā)明的核苷酸序列。在制備表達載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與適當?shù)谋磉_調(diào)控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復制獨立于染色體復制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復制的手段(means)?；蛘?，載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復制的載體。此外，可以使用單獨的載體或質(zhì)?；騼蓚€或更多個載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉座子(transposon)。本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個或多個(幾個)選擇性標記，其允許簡單選擇經(jīng)轉化、轉染、轉導等的細胞。選擇性標記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細菌選擇性標記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標記，所述抗生素抗性例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。對于酵母宿主細胞合適的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉移酶)、hph(潮霉素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5，-磷酸脫羧酶(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase))、sC(硫酸腺苷酰轉移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細胞中的是構巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因禾口吸水鏈霄菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細胞基因組或載體在細胞中獨立于基因組的自主復制。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘?，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10，000堿基對，優(yōu)選400至10，000堿基對，并且最優(yōu)選800至10，000堿基對，其與相應的目標序列具有高度同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。為了自主復制，載體可以進一步包含復制起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地復制。復制起點可以是介導自主復制的任何質(zhì)粒復制子(r印licator)，其在細胞中發(fā)揮功能。術語“復制起點”或“質(zhì)粒復制子”在本文定義為能夠使質(zhì)?；蜉d體體內(nèi)復制的核苷酸序列。細菌復制起點的實例是允許在大腸桿菌中復制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復制起點，和允許在芽孢桿菌屬中復制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβ1的復制起點。用于酵母宿主細胞中的復制起點的實例是2微米復制起點，ARSl,ARS4，ARSl和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細胞中有用的復制起點的實例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch159163-9175；WO00/24883)。分離AMAl基因和構建包含該基因的質(zhì)?；蜉d體能夠根據(jù)公開于WO00/24883中的方法完成?？梢詫⒍嘤谝粋€拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細胞以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或?qū)⒖蓴U增的選擇性標記基因包括于多核苷酸，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細胞來選擇含有選擇性標記基因的擴增拷貝的細胞，和由此得到多核苷酸的額外拷貝。用于連接上述元件以構建本發(fā)明的重組表達載體的方法是本領域技術人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。宿主細胞本發(fā)明還涉及重組宿主細胞，其包含本發(fā)明的分離的多核苷酸，可有利地用于多肽的重組生產(chǎn)中。將包含本發(fā)明的多核苷酸的載體導入宿主細胞，使載體作為染色體整合體或如前所述的自復制的染色體外載體維持。術語“宿主細胞”包括由于復制過程中發(fā)生的突變而與親本細胞不同的親本細胞的任何后代。宿主細胞的選擇在很大程度上依賴于編碼多肽的基因及其來源。宿主細胞可以是在本發(fā)明的多肽的重組產(chǎn)生中有用的任何細胞，例如，原核或真核細胞。原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限于，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌和海洋芽孢桿菌。革蘭氏陰性細菌包括但不限于，大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬和脲原體屬。細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌屬細胞。在本發(fā)明的實施中有用的芽孢桿菌屬細胞包括但不限于，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細胞。在一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是克勞氏芽孢桿菌細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是地衣芽孢桿菌細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是枯草芽孢桿菌細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈球菌屬細胞。在本發(fā)明的實施中有用的鏈球菌屬細胞包括但不限于，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種。在一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是似馬鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是釀膿鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是乳房鏈球菌細胞。在21另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈霉菌屬細胞。在本發(fā)明的實施中有用的鏈霉菌屬細胞包括但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌。在一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是不產(chǎn)色鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是除蟲鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是天藍鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是灰色鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是淺青紫鏈霉菌細胞?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬細胞例如原生質(zhì)體轉化(參見，例如，Chang和Cohen，1979，MolecularGeneralGenetics168:111_115)，使用感受態(tài)細胞(參見，例如，Young禾口Spizizen，1961，JournalofBacteriology81:823_829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，JournalofMolecularBiology56:209_221)，電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower,1988，Biotechniques6:742_751)或接合(參見，例如，Koehler和Thorne，1987，JournalofBacteriology169:5771—5278)。可通過如下方法實現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細胞例如原生質(zhì)體轉化(參見，例如，Hanahan,1983，J.Mol.Biol.166557-580)或電穿孔(參見，例如，Dower等，1988，NucleicAcidsRes.166127-6145)。可通過如下方法實現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細胞例如原生質(zhì)體轉化和電穿孔(參見，例如，Gong等，2004，F(xiàn)oliaMicrobiol.(Praha)49:399_405)，接合(參見，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583_3585)，或轉導(參見，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98=6289-6294)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌屬細胞，例如電穿孔(參見，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見，例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71:51_57)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌屬細胞，例如天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.321295-1297)，原生質(zhì)體轉化(參見，例如，Catt和Jollick,1991，Microbios.68189-2070)，電穿孔(參見，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.653800-3804)或接合(參見，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45409-436)。然而，可以使用任何已知的將DNA引入宿主細胞的方法。宿主細胞還可以是真核生物，如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在一個優(yōu)選的方面，宿主細胞是真菌細胞?！罢婢庇迷诒疚陌ㄒ韵麻T子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)禾口接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi,8thedition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995，見上)。在一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞。“酵母”用在本文包括產(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner，F(xiàn).A.，Passmore,S.Μ.，禾口Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9，1980)中所述。在一個甚至更優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是念珠菌屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細胞。在一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是YarrowiaIipolytica細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995，見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Cori0Ius)JIl球菌屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬/嗜熱霉屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細胞。在一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細胞。在另一個最優(yōu)選方面，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)>zFifaIif(Ceriporiopsisaneirina)>zFifa|1>Ceriporiopsiscaregiea>Ceriporiopsisgilvescens>Ceriporiopsispannocinta>Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲擬M菌(Ceriporiopsissubvermispora)、B譽角質(zhì)金包子菌、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、|￡金包子菌、Chrysosporiumqueenslandicum>Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium),輻射射脈菌(Phlebiaradiata)、刺芹側耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、長絨毛栓菌(Trametesvillosa)、變色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細胞。可以將真菌細胞通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉化和細胞壁重建的方法以本身公知的方式轉化。用于轉化曲霉屬和木霉屬宿主細胞的合適方法在EP238023和Yelton等，1984，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA811470-1474中描述。用于轉化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I描述的方法轉化酵母=Becker和Guarente，于Abelson,J.N.禾口Simon,Μ.I.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,pp182—187,AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等，1983,JournalofBacteriology153:163；禾口Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920o產(chǎn)生方法本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞以其野生型形式能夠產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一個優(yōu)選的方面，所述細胞是腐質(zhì)霉屬的細胞。在一個更優(yōu)選的方面，所述細胞是特異腐質(zhì)霉。在一個最優(yōu)選的方面，所述細胞是特異腐質(zhì)霉DSM1800。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)如本文所述的重組宿主細胞；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細胞，其中所述宿主細胞包含突變核苷酸序列，其在SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變，其中所述突變核苷酸序列編碼多肽，該多肽包含SEQIDNO2的成熟多肽或由SEQIDNO2的成熟多肽組成，和(b)回收所述多肽。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)，和實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應商獲得或可以根據(jù)公開的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中，其能夠從細胞裂解物(Iysate)回收?？梢允褂帽绢I域已知的對于所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(enzymeassay)可用于測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(pr印arative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification,J.-C.Janson禾口LarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。植物本發(fā)明還涉及植物，例如，轉基因植物、植物部分或植物細胞，其包含分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有阿魏酸酯酶活性的多肽，從而以可回收的量表達和產(chǎn)生所述多肽。多肽可從植物或植物部分回收。或者，同樣可以將含有該重組多肽的植物或植物部分用于改進食品或飼料的質(zhì)量，例如，改進營養(yǎng)價值、適口性(palatability)和流變性質(zhì)(rheologicalproperties)，或用于破壞抗營養(yǎng)因子。轉基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadowgrass)(藍草(bluegrass)，早熟禾屬(Poa))；飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)；寒地型牧草(temperategrass)，如Agrostis(剪股穎屬)；和谷類，例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實例是煙草(tobacco)，豆類(legumes)，如羽扇豆(lupins)，馬鈴薯，糖甜菜(sugarbeet),豌豆,豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(familyBrassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rapeseed)和緊密相關的模型生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。植物部分的實例是莖(stem)、愈傷組織(calIus)、葉(leaf)、根(root)、果實(fruit)、種子(seed)和塊莖(tuber)，以及包含這些部分的獨立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyme)、維管組織(vasculartissue)、分生組織(meristem)。具體的植物細胞區(qū)室(compartments)，如葉綠體(chloroplast)、質(zhì)夕卜體(apoplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過氧化物酶體(peroxisome)禾口細胞質(zhì)(cytoplasm)也被認為是植物部分。此外，任何植物細胞，無論什么組織來源，都被認為是植物部分。同樣地，植物部分，如分離以促進本發(fā)明的應用的具體組織和細胞也被認為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)。同樣包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的還有這些植物、植物部分和植物細胞的后代。表達本發(fā)明多肽的轉基因植物或植物細胞可以依照本領域已知方法構建。簡而言之，通過如下方法構建所述植物或植物細胞將編碼本發(fā)明多肽的一個或多個(幾個)表達構建體并入植物宿主基因組或葉綠體基因組，并且將所得的修飾植物或植物細胞繁殖為轉基因植物或植物細胞。表達載體便利地是包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的核酸構建體，所述多核苷酸與在選擇的植物或植物部分中表達該多核苷酸序列所需的適當?shù)恼{(diào)節(jié)序列可操作地連接。此外，表達構建體可以包含對于鑒定宿主細胞有用的選擇性標記，在所述宿主細胞中整合了表達構建體和將該構建體引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依賴于使用的DNA引入方法)。調(diào)節(jié)序列的選擇，例如啟動子和終止子序列和任選地信號或轉運序列的選擇，舉例來說，基于期望何時、何處以及如何表達多肽而確定。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達可以是組成型的或誘導型的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可以靶向特定的組織或植物部分例如種子或葉。調(diào)節(jié)序列由例如Tague等，1988，PlantPhysiology86:506所述。對于組成性表達，可以使用35S_CaMV、玉米泛素1和稻肌動蛋白1啟動子(Franck等，1980,Cell21:285_294，Christensen等，1992,PlantMo.Biol.18:675_689；Zhang等，1991,PlantCell3:1155_1165)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯藏庫組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴薯塊蓮和果實的啟動子(Edwards&Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或來自代謝庫組織(metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動子(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863_878)，種子特異性啟動子諸如來自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39:885_889)，來自豆球蛋白(Iegumin)B4和蠶豆(Viciafaba)的未知的種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，JournalofPlantPhysiology152:708_711)、來自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39:935_941)，來自歐洲油菜(Brassicanapus)的貯藏蛋白napA啟動子，或本
技術領域：
公知的任何其他種子特異性的啟動子，例如，在TO91/14772中所描述的。此外，啟動子可為葉特異性的啟動子，如來自稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiology102:991_1000)，小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤甲基轉移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動子(Mitra和Higgins，1994，PlantMolecularBiology26:85_93)，或來自稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995，Molecularandgeneralgenetics248:668_674)，或傷口誘導的啟動子，如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，PlantMolecularBiology22:573_588)。同樣地，所述啟動子可通過非生物的處理誘導，所述非生物的處理諸如溫度、干旱或鹽度變化，或通過外源施加的激活所述啟動子的物質(zhì)誘導，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脫落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellicacid)，和重金屬。啟動子增強子元件也可以用于實現(xiàn)本發(fā)明多肽在植物中的較高表達。例如，啟動子增強子元件可以是內(nèi)含子，其置于啟動子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間。例如Xu等，1993，見上文，公開了使用稻肌動蛋白1基因的第一內(nèi)含子以增強表達。選擇性標記基因和表達構建體的任何其它部分可以選自本領域內(nèi)可得到的那些。將核酸構建體根據(jù)本領域已知的常規(guī)技術并入植物基因組，所述常規(guī)技術包括土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導的轉化、病毒介導的轉化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉化和電穿孔(Gasser等，1990，Science2441293；Potrykus,1990，Bio/Technology8535；Shimamoto等，1989,Nature338274)。目前，根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導的基因轉移(genetransfer)，是產(chǎn)生轉基因雙子葉植物的優(yōu)選方法(為了參考，見Hooykas和Schilperoort，1992，PlantMolecularBiology19:15_38)，而且它也可以用于轉化單子葉植物，雖然對于這些植物其他的轉化方法是常用的。目前，產(chǎn)生轉基因單子葉植物的優(yōu)選的方法，是用粒子(用轉化DNA涂覆的微觀的金或鎢粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發(fā)育中的胚(developingembryos)(Christou,1992,PlantJournal2275-281;Shimamoto,1994，CurrentOpinionBiotechnology5:158_162；Vasil等，1992，Bio/Technology10667-674)。轉化單子葉植物的可供選擇的方法是基于原生質(zhì)體轉化，如由Omirulleh等，1993，PlantMolecularBiology21:415_428所描述的。轉化之后，根據(jù)本領域熟知的方法選擇具有并入的表達構建體的轉化體并且再生成為完整植物。通常設計轉化方法用于通過如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性消除選擇基因例如，使用帶有兩種獨立的T-DNA構建體的共轉化或通過特異性重組酶位點特異性地切除選擇基因。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)包含多核苷酸的轉基因植物或植物細胞，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有阿魏酸酯酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。去除或減少阿魏酸酯酶活性本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生親本細胞突變體的方法，其包括破壞或缺失編碼本發(fā)明的26多肽的多核苷酸序列或其部分，所述方法導致在相同條件下培養(yǎng)時，與親本細胞相比突變的細胞產(chǎn)生較少的所述多肽?？梢允褂帽绢I域熟知的方法(例如，插入、破壞、替代或缺失)通過減少或消除編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的表達來構建突變細胞。在一個優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列是失活的。待修飾或失活的核苷酸序列可以是，例如，編碼區(qū)或其對活性關鍵的部分，或表達編碼區(qū)所需的調(diào)節(jié)元件。這種調(diào)節(jié)或調(diào)控序列的實例可以是啟動子序列或其功能部分，即，足以影響核苷酸序列表達的部分。用于可能的修飾的其它調(diào)控序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列、轉錄終止子和轉錄激活子?？梢酝ㄟ^向親本細胞施以誘變，并且選擇其中已將所述核苷酸序列的表達減少或消除的突變細胞來進行核苷酸序列的修飾或失活。誘變可能是特異性的或隨機的，可以通過例如使用合適的物理或化學誘變劑進行，通過使用合適的寡核苷酸進行，或通過將所述DNA序列進行PCR產(chǎn)生的誘變。此外，可以通過使用這些誘變劑的任何組合來進行誘變。適合于本發(fā)明目的的物理或化學誘變劑的實例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、0_甲基羥胺、亞硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethylmethanesulphonate)(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。當使用這些試劑時，通常通過如下方法來進行所述誘變在合適條件下存在優(yōu)選的誘變劑時溫育待誘變的親本細胞，并篩選和/或選擇顯示基因表達減少的或無基因表達的突變體細胞。通過導入、取代或去除基因中的一個或多個(幾個)核苷酸或其轉錄或翻譯所需的調(diào)控元件可以實現(xiàn)所述核苷酸序列的修飾或失活。例如，可以插入或去除核苷酸從而導致引入終止密碼子，去除起始密碼子，或改變開放閱讀框。按照本領域已知的方法通過定位誘變或PCR產(chǎn)生的誘變可以實現(xiàn)這種修飾或失活。盡管在理論上所述修飾可以在體內(nèi)進行，即，直接在表達待修飾核苷酸序列的細胞上進行，但優(yōu)選如下面所示例的那樣在體外進行所述修飾。消除或減少核苷酸序列通過細胞表達的便利方式的例子是基于基因取代，基因缺失，或基因破壞的技術。例如，在基因破壞方法中，將相應于內(nèi)源核苷酸序列的核酸序列在體外進行誘變以產(chǎn)生缺陷性的核酸序列，隨后將其轉化入親本細胞中以產(chǎn)生缺陷基因。通過同源重組，所述缺陷性核酸序列替代了內(nèi)源性核苷酸序列。理想的是所述缺陷性核苷酸序列還編碼標記，其可用于選擇其中核苷酸序列被修飾或破壞的轉化子。在一個特別優(yōu)選的方面，用可選擇的標記(如本文所述的那些)來破壞所述核苷酸序列。或者，可以使用與所述核苷酸序列互補的序列通過確定的反義或RNAi技術來進行所述核苷酸序列的修飾或失活。更具體地，通過導入與所述基因的核苷酸序列互補的序列可以減少或消除所述核苷酸序列通過細胞的表達，所述序列可以在細胞中轉錄并且能夠與細胞中產(chǎn)生的mRNA雜交。在允許所述互補反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，由此減少或消除翻譯的蛋白質(zhì)的量。本發(fā)明進一步涉及親本細胞的突變體細胞，其包含編碼多肽的核苷酸序列或其調(diào)控序列的破壞或缺失，這導致與親本細胞相比突變體細胞產(chǎn)生更少的多肽或不產(chǎn)生多肽。這樣生成的多肽缺陷型突變細胞作為表達天然和/或異源多肽的宿主細胞特別有用。所以，本發(fā)明進一步涉及生產(chǎn)天然或異源多肽的方法，其包括(a)在有益于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)突變細胞；和(b)回收所述多肽。術語“異源多肽”在本文中定義為對宿主細胞不是天然的多肽，進行了修飾以改變天然序列的天然蛋白，或作為通過重組DNA技術對宿主細胞操作的結果其表達在量上改變的天然蛋白。在另一方面，本發(fā)明涉及通過發(fā)酵可產(chǎn)生本發(fā)明的多肽以及目標蛋白產(chǎn)物的細胞來生產(chǎn)基本上無阿魏酸酯酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的方法在發(fā)酵之前、過程中或發(fā)酵完成之后向發(fā)酵液(fermentationbroth)中添加有效量的能夠抑制阿魏酸酯酶活性的試劑，從發(fā)酵液中回收目標產(chǎn)物，并且任選地將回收的產(chǎn)物進行進一步純化。在另一方面，本發(fā)明涉及如下生產(chǎn)基本上無阿魏酸酯酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的方法在允許產(chǎn)物表達的條件下培養(yǎng)細胞，將得到的培養(yǎng)液進行組合的PH和溫度處理以基本上減少阿魏酸酯酶活性，和從發(fā)酵液中回收產(chǎn)物?；蛘?，可以將從培養(yǎng)液回收的酶制備物進行組合的PH和溫度處理。所述組合的pH和溫度處理可任選地與阿魏酸酯酶抑制劑處理組合使用。依照本發(fā)明的這個方面，可能去除至少60%，優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少85%，還更優(yōu)選至少95%，并且最優(yōu)選至少99%的阿魏酸酯酶活性?？墒褂么朔椒ǐ@得阿魏酸酯酶活性的完全去除。組合的pH和溫度處理優(yōu)選在2-4或9-11范圍內(nèi)的pH和至少60_70°C范圍內(nèi)的溫度進行一段足夠的時間以達到期望的效果，通常30至60分鐘是足夠的。用于培養(yǎng)和純化感興趣的產(chǎn)物的方法可以通過本領域已知的方法進行。用于產(chǎn)生基本上無阿魏酸酯酶的產(chǎn)物的本發(fā)明的方法在真核多肽，特別是真菌蛋白質(zhì)例如酶的產(chǎn)生中是特別令人有興趣的。所述酶可以選自，例如，淀粉分解酶(anxiolyticenzyme)、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶(cellulolyticenzyme)、氧化還原酶或植物細胞壁降解酶。這些酶的實例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶(chitinase)、角質(zhì)酶(cutinase)、環(huán)糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、商素過氧化酶、半纖維素酶、轉化酶、異構酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉移酶、轉谷氨酰胺酶或木聚糖酶。阿魏酸酯酶缺陷細胞也可以用于表達在制藥上引起興趣的異源蛋白質(zhì)如激素、生長因子、受體等?？衫斫獾氖切g語“真核多肽”不僅包括天然多肽，也包括多肽例如酶，其通過氨基酸取代、缺失或添加或其它這樣的修飾而被修飾以增強活性、熱穩(wěn)定性、PH耐受性等。在另外的方面，本發(fā)明涉及基本上無阿魏酸酯酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生。抑制具有阿魏酸酯酶活性的多肽表達的方法本發(fā)明還涉及抑制多肽在細胞中表達的方法，其包括對細胞施用雙鏈RNA(dsRNA)分子或者在細胞中表達雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中dsRNA包含本發(fā)明多核苷酸的亞序列。在一個優(yōu)選的方面，dsRNA是長約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更長的雙鏈體核苷酸。dsRNA優(yōu)選是小干擾RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一個優(yōu)選的方面，dsRNA是用于抑制轉錄的小干擾RNA(SiRNA)。在另一個優(yōu)選的方面，dsRNA是用于抑制翻譯的微RNA(miRNA)。本發(fā)明還涉及用于抑制細胞中多肽表達的這些雙鏈RNA(dsRNA)分子，其包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的部分。雖然本發(fā)明不受到任何特定作用機制的限制，但dsRNA能進入細胞，并引起相似或相同序列的單鏈RNA(ssRNA)的降解，所述RNA包括內(nèi)源mRNA。當細胞接觸dsRNA時，來自同源基因的mRNA選擇性地受到稱為RNA干擾(RNAi)的過程的降解。本發(fā)明的dsRNA可以用于基因沉默療法。在一個方面，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的dsRNAi選擇性地降解RNA的方法。所述過程可以在體外、在活體外(exvivo)或在體內(nèi)進行。在一個方面，dsRNA分子能夠用于產(chǎn)生細胞、器官或動物中的功能缺失突變(loss-of-functionmutation)。制備或使用選擇性降解RNA的dsRNA分子的方法在本領域中公知，參見，例如，美國專利號6，506，559；美國專利號6，511，824；美國專利號6，515，109；和美國專利號6，489，127。組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽的組合物。優(yōu)選地，所述組合物富含這種多肽。術語“富含”表示所述組合物的阿魏酸酯酶活性，例如，以至少1.1的富集因數(shù)(enrichmentfactor)±曾力口。所述組合物可以包含本發(fā)明的多肽作為主要酶成分，例如，單成分組合物?；蛘?，所述組合物可以包含多種酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶(ρ印tidoglutaminase)、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶或木聚糖酶。可以通過例如屬于以下屬或種的微生物產(chǎn)生其它酶曲霉屬，優(yōu)選棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；鐮孢屬，優(yōu)選桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢；腐質(zhì)霉屬，優(yōu)選特異腐質(zhì)霉或疏棉狀腐質(zhì)霉；或木霉屬，優(yōu)選哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉?？梢砸勒毡绢I域內(nèi)已知的方法制備多肽組合物，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式?？梢砸勒毡绢I域內(nèi)已知方法將包括于所述組合物中的多肽穩(wěn)定化。下面給出的是本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選的用途的實例。本發(fā)明的多肽組合物的劑量和使用該組合物的其它條件可以基于本領域內(nèi)已知的方法確定。用途本發(fā)明還涉及用于使用具有阿魏酸酯酶活性的多肽的方法。本發(fā)明的多肽能用于降解或修飾植物細胞壁或來自植物細胞壁的任何含木聚糖材料。各種用途的實例如下所述(其它用途參見，WO2002/18561)。本發(fā)明的多肽的劑量和使用該制備物的其它條件可以基于本領域內(nèi)已知的方法確定。通過完全或部分去除側分支可以促進木聚糖的酶法降解。在降解木聚糖的過程中，本發(fā)明的多肽優(yōu)選與其它木聚糖降解酶組合使用，如木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶和它們的組合。例如，可以由乙酰木聚糖酯酶去除乙?；鶊F；由α-阿拉伯糖苷酶去除阿拉伯糖基團；由阿魏酸酯酶去除阿魏?；?，并由α-葡糖醛酸糖苷酶去除葡糖醛酸基團。由木聚糖酶，或木聚糖酶和側分支水解酶的組合釋放的寡聚物可進一步由木糖苷酶降解成游離木糖。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是組合物的組分，所述組合物包含一種或多種(幾種)木聚糖降解酶，特別是木聚糖酶。在下述各種用途中，本發(fā)明的多肽優(yōu)選與一種或多種(幾種)木聚糖降解酶組合使用。因此，本發(fā)明還涉及用于降解含木聚糖材料的方法，其包括用這種具有阿魏酸酯酶活性的多肽處理含木聚糖材料。在一個優(yōu)選的方面，進一步用木聚糖降解酶處理含木聚糖材料。木聚糖降解酶選自下組木聚糖酶，乙酰木聚糖酯酶，阿魏酸酯酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，木糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，和它們的組合?？梢越到庵参锛毎源龠M不同類型的處理，促進木聚糖之外的組分的純化或提取，如從谷類純化β_葡聚糖或β_葡聚糖寡聚體，提高飼料價值，降低水結合容量，提高廢水裝置中的降解能力，促進轉化，例如草和玉米轉化成青貯飼料，等。本發(fā)明的多肽可以用于各種植物細胞壁來源材料或廢料的酶法水解，例如，來自造紙的廢料，或者農(nóng)業(yè)殘余物如麥秸，玉米穗軸、玉米纖維、全玉米植物、干果殼、草、植物皮殼、豆莢，酒糟、糖甜菜粕等。多肽還可以用于修飾植物細胞壁來源物質(zhì)的粘度。例如，多肽可以用于降低含木聚糖材料的粘度，促進粘性含木聚糖材料的加工，如在小麥分離中。本發(fā)明的多肽還與有限活性的其它木聚糖分解酶一起使用以降解木聚糖，產(chǎn)生寡糖。寡糖可用作膨脹劑，如從谷類細胞壁物質(zhì)釋放的阿拉伯木聚糖寡糖，或者來自谷類的或多或少經(jīng)過純化的阿拉伯木聚糖。本發(fā)明的多肽還可以與其它木聚糖分解酶組合使用，以將木聚糖降解成木糖和其它單糖(美國專利5，658，765)。釋放的木糖可以轉化成其它化合物。本發(fā)明的多肽還可以用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)降解或轉化成可發(fā)酵糖中，以產(chǎn)生，例如，燃料、飲用乙醇和/或發(fā)酵產(chǎn)品(例如，酸、醇、酮、氣體等)。多肽優(yōu)選與其它木聚糖降解酶和纖維素酶組合物(內(nèi)切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶)組合使用。本發(fā)明的多肽可以與其它酶如葡聚糖酶一起使用，以促進從富含油的植物物質(zhì)提取油，如從玉米胚提取玉米油。本發(fā)明的多肽還可以在烘培中使用，以提高面團的發(fā)面、彈性和/或穩(wěn)定性和/或烘培產(chǎn)品的體積、團粒結構和/或保鮮性質(zhì)。多肽可以用于制備面團或者從任何類型的面粉或粉(例如，基于小麥、黑麥、大麥、燕麥或玉蜀黍)制備的烘培產(chǎn)品。用本發(fā)明的多肽制備的烘培產(chǎn)品包括面包、面包卷、小艇餡餅(baquettes)等。為了烘培，本發(fā)明的多肽可以用作唯一或主要酶活性，或者可以與其它酶如木聚糖酶、脂肪酶、淀粉酶、氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶，過氧化物酶)、漆酶和/或蛋白酶組合使用。本發(fā)明的多肽還可以用于動物飼料的修飾，并且可以在體外(通過修飾飼料的組分)或體內(nèi)發(fā)揮作用?？梢韵虬罅堪⒗揪厶呛推咸侨┧崮揪厶堑膭游镲暳辖M合物中加入多肽，例如，包含谷類如大麥、小麥、黑麥、燕麥或玉蜀黍的飼料。在加入飼料時，多肽將促進植物細胞壁材料的體內(nèi)分解，一部分是由于腸粘度下降(Bedford等，1993，Proceedingsofthe1stSymposiumonEnzymesinAnimalNutrition，pp.73—77)，從30而實現(xiàn)動物對植物營養(yǎng)成分的利用得到改善。因此，動物的生長速率和/或飼料轉化比例(即，消化的飼料的重量相對于增重的比例)提高。本發(fā)明的多肽還可以用于紙和紙漿工業(yè)，尤其是在漂白過程中用于增加漂白紙漿的亮度，從而降低漂白階段使用的氯的量，并增加循環(huán)紙過程中紙漿的游離度(Eriksson，1990,WoodScienceandTechnology24:79_101；Paice等，1988,Biotechnol.andBioeng.32:235-239，和Pommier等，1989，TappiJournal187-191)。此外，多肽可以用于含木質(zhì)纖維素紙漿的處理，從而提高其漂白能力。木質(zhì)纖維素紙漿的處理可以，例如，如美國專利No.5，658，765、WO93/08275、WO91/02839和W92/03608中所述進行。本發(fā)明的多肽還可以用于啤酒釀造中，特別是可增加包含，例如，大麥和/或高粱麥芽的麥芽汁的過濾能力(W02002/24926)。多肽可以以與常規(guī)用于釀造的戊聚糖酶相同的方式使用，例如，如ViStor等，1993，J.Inst.Brew.99:243_248和EP227159所述。此外，多肽可以用于處理釀酒酒糟，即，啤酒麥芽汁生產(chǎn)的殘余物，其中包含大麥或發(fā)芽大麥或其它谷類，從而促進殘余物的利用，例如，用作動物飼料。本發(fā)明的多肽可以用于分離植物細胞壁材料的組分，特別是谷物組分如小麥組分。特別關注的是將小麥分離成谷蛋白/面筋(gluten)和淀粉，即，具有可觀商業(yè)利益的組分。所述分離工藝可通過使用本領域已知方法進行，方便地為作為水力旋流(hydroclone)或傾析工藝進行的所謂打糊(batter)工藝(或濕磨工藝)。在所述打糊工藝中，起始材料為待進行分離的植物材料(如小麥)的稀釋的可泵送的分散液。在小麥分離工藝中，所述分散液通常由小麥粉與水制得。本發(fā)明的多肽還可以用于制備水果或蔬菜汁以增加產(chǎn)量。本發(fā)明的多肽還可以用作用于紡織品的酶法煮煉(scouring)系統(tǒng)的組分。本發(fā)明的多肽還可以與其它酶功能組合用于洗衣洗滌劑應用。信號月太本發(fā)明還涉及核酸構建體，所述核酸構建體包含編碼蛋白質(zhì)的基因，該基因與編碼信號肽的核苷酸序列可操作地連接，所述信號肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1至18或由SEQIDNO2的氨基酸1至18組成，其中所述基因?qū)τ诤塑账嵝蛄惺峭庠吹?。在一個優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO1的核苷酸1至54，或者由SEQIDNO1的核苷酸1至54組成。本發(fā)明還涉及包含這種核酸構建體的重組表達載體和重組宿主細胞。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，包括(a)在適合于產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)這樣的重組宿主細胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)對于宿主細胞可以是天然的或異源的。術語“蛋白質(zhì)”在本文的意思不是指特定長度的編碼產(chǎn)物，并且因此包含肽、寡肽和蛋白質(zhì)。術語“蛋白質(zhì)”還包含組合以形成編碼產(chǎn)物的兩種或兩種以上多肽。所述蛋白質(zhì)還包括雜合多肽，其包含部分或全部多肽序列的組合，所述多肽序列從至少兩種不同的蛋白質(zhì)獲得，其中一個或多個(幾個)對于宿主細胞可以是異源或天然的。蛋白質(zhì)進一步包括上述蛋白質(zhì)和雜合蛋白質(zhì)天然存在的等位基因變異和工程的變異。優(yōu)選蛋白質(zhì)是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分，或報告蛋白(reporter)。在一個更優(yōu)選的方面，所述蛋白質(zhì)是氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、異構酶或連接酶。在一個甚至更優(yōu)選的方面，所述蛋白質(zhì)是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶或木聚糖酶?；蚩梢詮娜魏卧?、真核或其它來源獲得。通過以下實施例進一步對本發(fā)明進行描述，但不應將其理解為對本發(fā)明范圍的限制。實施例材料作為緩沖液和底物使用的化學品是至少試劑等級的商業(yè)產(chǎn)品。菌株將特異腐質(zhì)霉DSM1800用作編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽的家族CEl基因的來源。黑曲霉MBinl20菌株(W02004/090155)用于表達編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽的特異腐質(zhì)霉基因。培養(yǎng)基PDA平板由每升39g馬鈴薯右旋糖瓊脂組成。YP培養(yǎng)基由每升IOg酵母提取物和20g細菌用蛋白胨組成。COVEA脲-乙酰胺+平板由每升20mlCOVEA鹽溶液，220g山梨醇，IOg葡萄糖，IOmlIM乙酰胺和30g細菌用瓊脂；pH5.2組成。COVEA鹽溶液由每升26gKCl、26gMgSO4、76gKH2PO4和50mlCOVEA痕量元素溶液組成。Cove痕量元素溶液由每升0.04gNa2B4O7·10Η20、0·4gCuSO4·5Η20、1·2gFeSO4·7Η20、0·7gMnSO4·H20,0.8gNa2MoO2·2H20和IOgZnSO4·7H20組成。M410培養(yǎng)基由每升50g麥芽糖，50g葡萄糖，2gMgSO4·7H20，2gKH2PO4,4g檸檬酸酐粉末，8g酵母提取物，2g脲，0.5gAMG痕量金屬溶液，和0.5gCaCl2；pH6.0組成。AMG痕量金屬溶液由每升14.3gZnSO4·7Η20，2·5gCuSO4·5Η20，0·5gNiCl2·6Η20，13.8gFeSO4·7Η20，8·5gMnSO4·7Η20，和3g檸檬酸組成。LB培養(yǎng)基由每升IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g氯化鈉組成。實施例1特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶的鑒定N-末端蛋白質(zhì)測序。根據(jù)制造商建議的條件，在CRITERI0N8_16%Tris-HClSDS-PAGE凝膠(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)上分離包含推定的酯酶的20μ1ULTRAFL0L(NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)。使用PRECISIONPLUSPROTEIN標準品(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)作為分子量標記物。在配備有Trans-Blot轉化池的CRITERION凝膠設備(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)上，以100伏特，使用10%甲醇，pH11.0中的10MCAPS(3-[環(huán)己基氨基]-1-丙烷磺酸)，歷時2小時，將蛋白質(zhì)樣品從SDS-PAGE凝膠電印跡在PVDF膜(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)上。用40%甲醇/1%乙酸中的0.1%考馬斯藍R-250將膜染色20秒鐘，并在50%甲醇中脫色以觀察蛋白質(zhì)條帶。切下30kDa的蛋白質(zhì)條帶并測序。根據(jù)制造商建議的規(guī)程，使用具有在線毛細管HPLC和液相三氟乙酸(TFA)傳遞的PROCISE494蛋白質(zhì)測序儀(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)進行肽和蛋白質(zhì)的N-末端測序。通過在線毛細管HPLC，用在450ml的溶劑A3和B2(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)中的9ml包含乙酸、乙酸鈉和己烷磺酸鈉的PREMIX濃縮物(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)完成乙內(nèi)酰苯硫脲-氨基酸的檢測，其中溶劑A3包含在水中的3.5%四氫呋喃，而溶劑B2包含乙腈/2-丙醇。用AppliedBiosystems610數(shù)據(jù)分析軟件2.Ia版(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)，用MACINTOSHG4處理器收集并分析數(shù)據(jù)。通過在光源下顯示層析圖而進行序列測定。N-末端確定為Ala-Ser-Leu-Gln-Gln-Val-Trp-Asn-Trp-Gly-Ala-Asn-Pro(SEQIDNO2的氨基酸19至31)。ULTRAFL0L的蛋白質(zhì)分級。首先使用HIPREP26/10脫鹽柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ,USA)，將ULTRAFL0L的2ml等分試樣緩沖液交換入含150mM氯化鈉的20mM乙酸鈉pH5中。然后使用以具有3，000道爾頓分子量截留膜的VIVASPIN20離心柱(VivascienceAG,Hannover,Germany)的超濾，將得到的緩沖液交換的物質(zhì)(18.5ml)濃縮至3ml。然后在HIL0AD26/60SUPERDEX200制備級大小排阻柱(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)上通過大小排阻層析，用相同的緩沖液等度洗脫來分級經(jīng)過緩沖液交換和濃縮的ULTRAFL0L材料的2ml等分試樣。將在280nm顯示出UV吸光度的級分合并成來自不同洗脫時間的六個單獨的匯集物，每個匯集物的總體積為20-40ml。使用以具有3，000道爾頓分子量截留膜VIVASPIN20離心柱超濾，將匯集的級分濃縮至l_5ml。根據(jù)制造商建議的條件，在CRITERION8-16%Tris-HClSDS-PAGE凝膠上分離每個濃縮的匯集級分的20μ1。使用PRECISIONPLUSPROTEIN標準品作為分子量標記物。從盒中去除凝膠，并用考馬斯藍(G250)蛋白質(zhì)染料(BIO-SAFECoomassieStain,Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules，CA，USA)染色，并且用剃刀刀片切下可見條帶，用于蛋白質(zhì)鑒定分析。用于肽測序的多肽凝膠內(nèi)消化。使用MULTIPROBEIILiquidHandlingRobot液體操作機器人(PerkinElmerLifeandAnalyticalSciences,Boston,MA,USA)進行凝膠內(nèi)消化。在IOOmM碳酸氫銨pH8.0中用50μ1IOmM二硫蘇糖醇(DTT)還原30kDa蛋白質(zhì)凝膠條帶30分鐘。還原后，在IOOmM碳酸氫銨pH8.0中用50μ155mM碘乙酰胺將凝膠塊烷基化20分鐘。使干燥的疑膠塊在室溫在25μ1胰蛋白酶消化溶液中膨脹30分鐘，所述溶液包含6ng測序級胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，USA)每μ50mM碳酸氫銨pH8，然后在40°C消化8小時。上述每個反應步驟之后都用合適的溶液按照制造商的標準規(guī)程，進行多次洗滌和預洗滌。使用50μ1乙腈在反應之間使凝膠塊脫水，并且在各步驟之間將凝膠塊風干。用甲酸/2%乙腈在HPLC級水中兩次提取肽30分鐘。將肽提取溶液轉移至96孔有邊的PCR型板(ABGene,Rochester,NY,USA)，其已經(jīng)冷卻至10_15°C，并用96孔板蓋(PerkinElmerLifeandAnalyticalSciences,Boston,MA,USA)覆蓋以防止蒸發(fā)。進一步在4°C保存板直至可進行質(zhì)譜分析。蛋白質(zhì)鑒定。對于串聯(lián)質(zhì)譜進行的從頭肽測序，使用Q-T0FMICR0(WatersMicromassMSTechnologies,Milford,MA,USA)，一種混合的正交四柱時間飛行質(zhì)譜儀進行LC/MS/MS分析。Q-T0FMICR0可以使用MASSLYNX軟件4.1版完全由微處理器控制(WatersMicromassMSTechnologies，Milford，MA，USA)。Q-T0FMICR0配備有ULTIMATE毛細管和納米流HPLC系統(tǒng)，其與FAM0S微型自動取樣器和SWITCHOSII柱切換設備(LCPackings/Dionex,Sunnyvale,CA,USA)偶聯(lián)，用于濃縮和使樣品脫鹽。將樣品載入到配置在進樣環(huán)中的保護柱(300μmIDX5cm,PEPMAPC18)，并使用SwitchosII泵以0.1%甲酸水溶液以40μ1每分鐘洗滌2分鐘。在75μπιIDX15cm，C18,3μm,IOOA,PEPMAP納米流融合毛細管柱(LCPackings,SanFrancisco,CA,USA)上，使用NAN-75校準器(Dionex,Sunnyvale,CA,USA)以來自175μ1/分鐘的分流的175nl/分鐘的流速分離肽。在45分鐘的間隔中應用0.甲酸中的5%至80%乙腈的分步洗脫梯度。在215nm監(jiān)測柱洗脫液，并通過配有納米噴霧界面的電子噴霧離子源將洗脫液導入Q-TOFMICRO中。以探測掃描模式獲取數(shù)據(jù)，m/z的質(zhì)量范圍為400-1990，將針對MS的標準切換至MS/MS以包括高于10.0次計數(shù)每秒的離子強度，并且電荷狀態(tài)為+2、+3和+4。可以1.9秒的掃描時間和0.1秒的掃描間隔時間獲得多達4種共洗脫物質(zhì)的分析光譜。通常使用45伏特的錐孔電壓，并且對碰撞能量編程以根據(jù)洗脫肽的質(zhì)量和電荷狀態(tài)而變化，并且在10-60伏特的范圍內(nèi)。合并獲取的光譜，平滑處理，并以自動的方式放在中央，并產(chǎn)生峰列表。使用PR0TEINLYNX全局服務器2.2.05軟件(WatersMicromassMSTechnologies,Milford,MA,USA)和PEAKSStudio4.5版(SPl)(BioinformaticSolutionsInc.，Waterloo,Ontario,Canada)針對所選數(shù)據(jù)庫搜索峰列表。評價來自PR0TEINLYNX和PEAKSStudio搜索的結果，并進一步通過評價每個目的離子的MS/MS光譜而分析未鑒定蛋白質(zhì)，并且通過鑒定y和b離子系列和將質(zhì)量差異與合適的氨基酸相匹配來確定從頭序列。從凝膠內(nèi)消化的30kDa多肽凝膠條帶的幾個多電荷離子獲得肽序列。將514.772m/z序列的二電荷胰蛋白酶肽確定為Asn-Ser-Tyr-Pro-Gly-Tyr-[Asp/Asn]-Gly-Arg(SEQIDNO:2的氨基酸195至203)。將516.33lm/z序列的三電荷胰蛋白酶肽離子確定為[Ile/Leu]-Gly-His-Ala-Pro-Ala-Val-Asp-Glu-[Gln/Lys]-[Gln/Lys]-Leu-Leu-Arg(SEQIDNO2的氨基酸269至282)。將516.33lm/z序列的另一個三電荷胰蛋白酶肽離子確定為Met-[Gln/Lys]-[Ile/Leu]-Val-His-Gly-[Ile/Leu]-[Gln/Lys]-Asp-Phe-[Ile/Leu]-Val-Arg(SEQIDNO2的氨基酸207至219)。將540.305m/z序列的二電荷胰蛋白酶肽離子確定為Pro-[Gln/Lys]-Cys(a)-Gly-Tyr-Glu-Ala-Leu-Lys(SEQIDNO2的氨基酸220至228)。Cys(a)是半胱氨酸丙烯酰胺，來自SDS-PAGE的人工產(chǎn)物。[Ile/Leu]和[Gln/Lys]不能區(qū)分，因為它們的質(zhì)量相當。實施例2特異腐質(zhì)霉DSM1800基因組DNA提取特異腐質(zhì)霉DSM1800在45°C在PDA平板上生長至匯合(confluence)。從PDA平板切下4mm2方塊，接種到包含25mlYP培養(yǎng)基的帶擋板125ml搖瓶中，所述培養(yǎng)基包含2%葡萄糖，并在41°C在200rpm振蕩溫育2天。使用MIRACLOTH(Calbiochem,LaJolla,CA,USA)通過過濾富集菌絲，在去離子水中洗滌兩次，并在液氮下冷凍。用研缽和杵，將冷凍菌絲磨成細粉，并使用DNEASYPlantMaxiKit(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)分離總DNA。實施例3從特異腐質(zhì)霉DSM1800分離阿魏酸酯酶基因的部分片段使用共有-簡并雜合寡核苷酸引物程序(C0DEH0P；Rose等，1998，NucleicAcidsResearch26:1628_1635)，根據(jù)實施例1中所述的已鑒定肽片段，設計如下所示的簡并引34物，其具有與相關的阿魏酸酯酶序列同源的區(qū)域。弓丨物FAEsenseF5'-CARCARGTNTGGAAYTGGGGNGC-3‘(SEQIDNO3)簡并引物FAEsensF的蛋白質(zhì)翻譯QQVffNWG引物HiFAE-degR5'-GGCGGCGGCCGTCRTANCCNGGRTA-3‘(SEQIDNO4)簡并引物HiFAE-degR的蛋白質(zhì)翻譯YPGYDGRR為了獲得特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶基因的初始DNA片段，在40°C-60°C中的六個不同退火溫度進行梯度PCR。擴增反應物(25μ1)包括作為模板的80ng特異腐質(zhì)霉DSM1800基因組DNA,dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.4mM,引物FAEsenseF和引物HiFAE-degR#50pmol,IXADVANTAGEGC-MeltLA(ClontechLaboratories,Inc.,MountainView,CA,USA)，和1.25單位ADVANTAGEGC基因組聚合酶混合物。使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333(EppendorfScientific,Inc.，Westbury，NY,USA)進行擴增，程序為在95°C預變性1分鐘；30個循環(huán)，每個循環(huán)為95°C變性30秒，50°C+/_10°C退火30秒(6個梯度選擇)并在72°C延長1分鐘；并在72°C最終延長6分鐘。在TBE(10.8gTris堿，5.5g硼酸和4ml0.5MEDTApH8.0每升)緩沖液中，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離反應產(chǎn)物。從凝膠切除來自56°C退火溫度的約700bp的PCR產(chǎn)物條帶，根據(jù)制造商的說明，使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)純化，并使用染料-終止子化學(Giesecke等，1992，JournalofVirologyMethods3847-60)和引物步移，用Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XL自動化DNA測序儀(Perkin-Elmer/AppliedBiosystems,Inc.，F(xiàn)osterCity,CA,USA)測序。獲得部分序列，其編碼實施例1中鑒定的肽片段，并用于設計簡并引物。實施例4全長特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶基因的鑒定根據(jù)制造商的說明，使用GEN0MEWALKER通用試劑盒(ClontechLaboratories,Inc.，MountainView,CA,USA)鑒定來自特異腐質(zhì)霉DSM1800的全長阿魏酸酯酶基因。簡而言之，分別用四種可留下平末端的不同的限制性酶(DraI，EcoRV,PvuII和StuI)消化來自特異腐質(zhì)霉DSM1800的總基因組DNA。然后分別將每批消化的基因組DNA與GEN0MEWALKER銜接頭(ClontechLaboratories,Inc.，MountainView,CA,USA)連接以產(chǎn)生四個文庫。然后將這四個文庫作為PCR反應中的模板，使用如下所示的基因特異性引物，其中兩個用于編碼阿魏酸酯酶的N-末端的5’末端片段上游的一級和二級PCR擴增，另兩個用于編碼阿魏酸酯酶的C-末端的3’末端片段下游的一級和二級PCR擴增。根據(jù)從如實施例3中所述獲得的特異腐質(zhì)霉的部分阿魏酸酯酶基因序列，設計下述引物。N-末端引物Hins_FAE_GSPl_Rl(—級)5'-CATGGCATGGCGAGCAGGGCATTGCTT-3‘(SEQIDNO5)引物Hins_FAE_GSP2_Rl(二級)5'-GCGGTCCGGCACATAGATGTGGAACTG-3‘(SEQIDNO6)35C-末端引物Hins_FAE_GSPl_Fl(—級)5'-GGAGCCATTCTTCGGCGGGATATTGGG-3‘(SEQIDNO7)引物Hins_FAE_GSP2_Fl(二級)5'-TATCAAATCATGCGGCGCGACTAACCG-3‘(SEQIDNO8)一級擴增物在25μ1終體積中包括作為模板的1μ1(約6ng)各個文庫，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.4mM,IOpmol銜接頭引物(ClontechLaboratories,Inc.,MountainView,CA,USA),50pmol弓丨物Hins_FAE_GSPl_Rl或Hins_FAE_GSPl_Fl，IXADVANTAGEGC-MeltLA緩沖液(ClontechLaboratories,Inc.，MountainView,CA,USA)，和1.25單位ADVANTAGE,GC基因組聚合酶混合物。使用EPPEND0RFMASTERCYCLER5333進行N-末端擴增，程序為在95°C預變性1分鐘；7個循環(huán)，每個循環(huán)為95°C變性25秒；在72°C退火并延伸5分鐘；和32個循環(huán)，每個循環(huán)為95°C變性25秒；在67°C退火并延伸5分鐘；和在67°C最終延伸7分鐘。使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333進行C-末端擴增，程序為在95°C預變性1分鐘；5個循環(huán)，每個循環(huán)為在95°C變性25秒；在72°C退火并延伸5分鐘；和7個循環(huán)，每個循環(huán)為在95°C變性25秒；在72°C退火并延伸5分鐘；和32個循環(huán)，每個循環(huán)為在95°C變性25秒；在67°C退火并延伸5分鐘；和在67°C最終延伸7分鐘。二級擴增物在25μ1終體積中包括作為模板的1μ1各個一級PCR產(chǎn)物，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.4mM,IOpmol銜接頭引物2(ClontechLaboratories,Inc.,MountainView,CA,USA),50pmol引物Hins_FAE_GSP2_Rl或Hins_FAE_GSP2_Fl，IXADVANTAGEGC-MeltLA緩沖液(ClontechLaboratories,Inc.，MountainView,CA,USA)，和1.25單位ADVANTAGEGC基因組聚合酶混合物。使用EPPENDORFMASTERCYCLER.5333進行擴增，程序為在95°C預變性1分鐘；5個循環(huán)，每個循環(huán)為在95°C變性25秒；在72°C退火并延伸5分鐘；和20個循環(huán)，每個循環(huán)為在95°C變性25秒；在67°C退火并延伸5分鐘；和在67°C最終延伸7分鐘。在TBE緩沖液中通過1.O%瓊脂糖凝膠電泳分離反應產(chǎn)物。由5’末端PCR擴增，分析3個產(chǎn)物條帶來自DraI文庫的600bp產(chǎn)物條帶，來自EcoRV文庫的Ikb產(chǎn)物條帶，和來自PvuII文庫的2.5kb產(chǎn)物條帶。從凝膠切除這3個產(chǎn)物條帶，根據(jù)制造商的說明，使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒純化，并測序。由3’末端PCR擴增，分析3個產(chǎn)物條帶來自EcoRV文庫的650bp產(chǎn)物條帶，來自PvuII文庫的400bp產(chǎn)物條帶，和來自StuI文庫的1.3kb產(chǎn)物條帶。從凝膠切除這3個產(chǎn)物條帶，根據(jù)制造商的說明，使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒純化，并測序。使用染料-終止子化學(Giesecke等，1992，見上文)和引物步移策略，用Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XL自動化DNA測序儀進行PCR片段的DNA測序。使用銜接頭引物2、引物Hins_FAE_GSP2_Rl，引物Hins_FAE_GSP2_Fl，和引物SeqFAENtermanti(如下所示)測序。弓丨物SeqFAENtermanti5'-GCTTTACTGCCATCGCAGGGCATTCCA-3‘(SEQIDNO9)審核核苷酸序列數(shù)據(jù)的質(zhì)量，并在PHRED/PHRAP軟件(UniversityofWashington,Seattle,WA,USA)的協(xié)助下將所有序列互相比較。將PCR片段序列結果與如實施例3中所述獲得的特異腐質(zhì)霉的部分阿魏酸酯酶基因序列比較并比對。根據(jù)本實施例和實施例3中獲得的基因片段構建基因模型，允許用其它同源阿魏酸酯酶確定基因的5’和3’末端。實施例5克隆特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶基因并構建黑曲霉表達載體設計如下所示的兩個合成寡核苷酸引物以從實施例2中制備的基因組DNAPCR擴增特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶基因。使用InFusion克隆試劑盒(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)將片段直接克隆入表達載體pBM120a(W02006/078256)。HinsFAEBDsenseNCO5'-ACACAACTGGCCATGCGTTTCTCGACCATCCTCTCG-3'(SEQIDNO10)HinsFAEBInfantiPAC5'-CAGTCACCTCTAGTTATTAGATAAGCCTGAAGAACC-3'(SEQIDNO11)黑體字代表編碼序列。其余序列與pBM120a的插入位點同源。在PCR反應物中各使用五十皮摩爾上述引物，所述PCR反應物在25μ1終體積中包括80ng特異腐質(zhì)霉基因組DNA，IXADVANTAGEGC-MeltLA緩沖液，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.4mM,和1.25單位ADVANTAGEGC基因組聚合酶混合物。使用EPPENDORFMASTERCYCLER.5333進行擴增，程序為在94°C1分鐘的1個循環(huán)；30個循環(huán)，每個循環(huán)為在94°C30秒，58°C30秒，和70°C90秒；和在70°C最終延伸5分鐘。然后加熱塊進入4°C浸泡循環(huán)。在TBE緩沖液中通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離反應產(chǎn)物，其中從凝膠切除約1.0-1.Ikb的產(chǎn)物條帶，并且根據(jù)制造商的說明，使用QIAQUICK.凝膠提取試劑盒純化。用NcoI和PacI消化質(zhì)粒pBM120a，在TBE緩沖液中通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，并根據(jù)制造商的說明，使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒純化。使用InFusion克隆試劑盒將基因片段和消化載體連接在一起，得到pMMarS(圖2)，其中阿魏酸酯酶基因在黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸異構酶(NA2_tpi啟動子)的啟動子雜合體的控制下轉錄。連接反應物(20μ1)包括1XInFusion緩沖液(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)，IXBSA(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)，1μ1InFusion酶(110稀釋)(BDBiosciences,PaloAlto，CA，USA)，106ng用NcoI和PacI消化的pBM120a，和96ng純化的特異腐質(zhì)霉PCR產(chǎn)物。在室溫溫育反應物30分鐘。根據(jù)制造商的說明，使用兩微升反應物轉化大腸桿菌XLlOS0L0PACK.Gold超感受態(tài)細胞(stratagene,LaJolla,CA,USA)。通過限制性消化檢測包含pMMar8的大腸桿菌轉化體，并使用BI0R0B0T9600(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)制備質(zhì)粒DNA。使用染料-終止子化學(Giesecke等，1992，見上文)和引物步移策略，通過用Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XL自動化DNA測序儀測序而確認pMMar8中的特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶基因插入。使用如下所示的引物996271Na2tpi正向啟動子和引物996270AMG反向測序996271Na2tpi正向啟動子5'-ACTCAATTTACCTCTATCCACACTT-3‘(SEQ.IDNO12)996270AMG反向5'-CTATAGCGAAATGGATTGATTGTCT-3‘(SEQ.IDNO13)將包含pMMar8的克隆挑進補加100μg氨芐青霉素每ml的2X50mlLB培養(yǎng)基中，并在37°C在200rpm振蕩在250ml玻璃燒杯中過夜生長。按照制造商的說明，使用QIAGEN小型試劑盒分離質(zhì)粒pMMar8。用PmeI消化質(zhì)粒pMMar8，在TBE緩沖液中用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，并根據(jù)制造商的說明，在制備中使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒純化包含阿魏酸酯酶基因的片段，用于轉化黑曲霉Mbinl20原生質(zhì)體。使用Τ0Ρ0TA克隆試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)將相同的1.0-1.IkbPCR片段克隆進pCR2.l-TOPO(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)以產(chǎn)生pHinsFAEBl(圖3)。通過DNA測序確認pHinsFAEBl中的特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶插入。于2007年11月20日將大腸桿菌pHinsFAEBl保藏于農(nóng)業(yè)研究機構專利培養(yǎng)物保藏中心，北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter,Peoria,IL,USA)。實施例6編碼CEl家族阿魏酸酯酶的特異腐質(zhì)霉基因組序列的表征審核核苷酸序列數(shù)據(jù)(實施例5)的質(zhì)量，并在PHRED/PHRAP軟件(UniversityofWashington,Seattle,WA，USA)的協(xié)助下將所有序列互相比較。核苷酸序列(SEQIDNO1)和推定的氨基酸序列(SEQIDNO2)如圖1所示?；蚪M片段編碼291個氨基酸的多肽，中間插入2個預測的內(nèi)含子，分別為73和108個堿基對。全長編碼序列和成熟編碼序列的％G+C含量分別為62.9%和62.5%。使用SignalP軟件程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10:1-6)預測信號肽為18個殘基。預測的成熟蛋白質(zhì)包含273個氨基酸，分子量為31.9kDa。預測的多聚羥基丁酸解聚酶結合域出現(xiàn)在氨基酸36至248?；谕贫ǖ陌被嵝蛄?，根據(jù)Coutinho和Henrissat，1999，見上文，阿魏酸酯酶落入糖酯酶家族CE1。使用如在EMBOSS的Needle程序中所實施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，見上文)及缺口開放罰分10、缺口延伸罰分0.5和EBL0SUM62矩陣來確定氨基酸序列的比較配對全局比對。比對顯示，特異腐質(zhì)霉家族CEl阿魏酸酯酶基因的成熟多肽的推定氨基酸序列與粗糙脈孢菌阿魏酸酯酶B(UniProt登錄號Q9HGR3)的推定氨基酸序列具有68.3%的同一性(缺口除外)。實施例7黑曲霉MBinl20中特異腐質(zhì)霉家族CEl阿魏酸酯酶的轉化和表達在黑曲霉MBinl20中表達特異腐質(zhì)霉CEl家族阿魏酸酯酶基因。根據(jù)Christensen等，1988，Bio/Technology6:1419_1422的方法制備黑曲霉MBinl20原生質(zhì)體。使用三微克PmeI消化的pMMar8轉化黑曲霉MBinl20。用由PmeI消化的pMMar8轉化黑曲霉MBinl20得到13個轉化體。將這些轉化體分離到各個COVEA脲-乙酰胺+平板。從13個轉化體的匯合COVEA脲-乙酰胺+平板剪切兩個3mm2瓊脂塊，并單獨接種到125ml塑料搖瓶中的25mlM410培養(yǎng)基中，并在34°C在250rpm振蕩溫育。溫育5天后，根據(jù)制造商的說明，在CRITERION8-16%Tris-HClSDS-PAGE凝膠上用CRITERION細胞(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)分析各個培養(yǎng)物的6μ1上清。用ΒΙΟ-SAFE考馬斯染料將得到的凝膠染色。培養(yǎng)物的SDS-PAGE譜顯示，3個轉化體具有約30kDa的條帶。進行第二次轉化得到另外15個轉化體。通過相同的過程分析這些轉化體，并且，一個轉化體，即黑曲霉MMar206，顯示約30kDa的家族CEl阿魏酸酯酶基因的表達。黑曲霉MMar206在COVEA脲-乙酰胺+平板上在34°C生長至匯合。將五個3mm2瓊脂塊放在2.8升搖瓶中的包含2%葡萄糖的4X500mlYP中，在34°C以250rpm振蕩生長，并在4天后收獲。在3000Xg離心全部培養(yǎng)液以去除生物質(zhì)。將上清無菌過濾并在5至10°C保存。實施例8特異腐質(zhì)霉家族CEl阿魏酸酯酶(FAEB)的純化首先將在黑曲霉MBinl20宿主中表達重組特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶的搖瓶培養(yǎng)液上清(實施例7)緩沖液交換入20mMTris-HClpH8中，并使用PallFiltron切線流過濾系統(tǒng)濃縮，所述系統(tǒng)包括UltrapumpII，ULTRARESERVOIR5L，和截留分子量為5000Da的ULTRASETTE5KOmega切線流濾膜(PallCorporation,EastHills，NY，USA)。然后使用以20mMTris-HClpH8平衡的20mlMEPHYPERCEL樹脂(PallCorporation,EastHills,NY,USA)通過用IOOmM乙酸鈉pH4.5洗脫來純化所得的緩沖液交換材料(129ml)。收集用IOOmM乙酸鈉pH4.5洗脫的級分，并匯集在280nm有UV吸光度的級分(45ml)。然后根據(jù)制造商建議的條件，使用CRITERION8-16%Tris-HClSDS-PAGE凝膠分離7.5μ1匯集的部分。使用PRECISIONPLUSI3ROTEINtm標準品作為分子量標記物。用INSTANTBLUE考馬斯藍蛋白質(zhì)染料(ExpedeonProteinSolutions,Cambridge,UK)將凝膠染色。在28kDa和30kDa可見兩條條帶，對應于純化的特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶蛋白質(zhì)。根據(jù)制造商建議的條件，用PNGaseF(NewEnglandBiolabs,Ipswich,ΜΑ,USA)將特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶的3μ1等分試樣去糖基化。根據(jù)制造商建議的條件，使用CRITERION8-16%Tris-HClSDS-PAGE凝膠分離得到的材料和對照，對照中用水代替PNGaseF。使用PRECISIONPLUSPROTEIN標準品作為分子量標記物。用考馬斯藍G250蛋白質(zhì)染料將凝膠染色。對照顯示28kDa和30kDa的條帶，而用PNGaseF去糖基化的樣品表現(xiàn)出27kDa的單條帶。還使用對硝基苯基阿魏酸(InstituteofChemistry,SlovakAcademyofSciences,Bratislava,Slovakia)作為底物，測試了包含純化的特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶蛋白的合并級分的酶活性。在96孔COSTAR微量滴定板(ComingInc.，Corning,NY,USA)中進行活性實驗。首先在DMSO中制備IOOmM對硝基苯基阿魏酸溶液，然后在包含0.01%TWEEN20的50mM乙酸鈉pH5.0中稀釋至ImM懸浮液。然后通過向ImM對硝基苯基阿魏酸懸浮液加入純化的特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶材料的等分試樣，使最終的底物濃度為0.5mM對硝基酚阿魏酸酯酶，啟動酶反應。允許反應在25°C繼續(xù)進行30分鐘，此時加入IMTris-HClpH8.0，并且使用SPECTRAMAX340PC讀板儀(MolecularDevices,Sunnyvale,CA,USA),通過405nm吸光度的增加確定釋放的對硝基酚鹽陰離子的量，所述讀板儀修正了不溶底物材料在540nm的背景吸光度。使用微板BCA蛋白質(zhì)實驗試劑盒確定純化的特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶的蛋白濃度。一個單位的阿魏酸酯酶活性定義為在PH5，25°C能每分鐘釋放1微摩爾對硝基酚鹽陰離子的酶量。測定特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶的活性為5.8單位每mg純化蛋白。實施例9特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶的底物特異性如實施例8中所述的特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶分別與四種甲酯底物中的每一種一起溫育，所述底物包括4_羥基肉桂酸甲酯(對-香豆酸甲酯)，3，4_二羥基肉桂酸甲酯(咖啡酸甲酯)，4-羥基-3-甲氧基肉桂酸甲酯(阿魏酸甲酯)，和3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸甲酯(芥子酸甲酯)(ApinChemicalsLTD，Abingdon，Oxon，UK)。反應物(270μ1)包括250或265μ120mMMESpH6;20或5μ1純化的特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶；和Img甲酯39底物。在環(huán)境條件(25°C)下在暗處溫育反應物22.5小時。溫育后，通過薄層層析評價反應物的酯水解。使用2.5x7.5cm硅膠60F254平板，250μm厚(EMDChemicals,Darmstadt,Germany)通過在平板上印跡1μ1，用11乙酸乙酯庚烷加冰醋酸(1滴/4ml)，并用MINERALIGHT燈(UVPInc.，SanGabriel,CA,USA)在254nm的紫外光下使其可見，由此進行薄層層析。根據(jù)在254nm的紫外光下酸水解產(chǎn)物與四種底物的真正標準品和相應的酸產(chǎn)物(全部獲得自Apin，如所述，4-羥基-3-甲氧基肉桂酸除外，其獲得自Sigma-Aldrich，SaintLouis,MO,USA)相比的相對可觀察點強度，通過出現(xiàn)相應的酸水解產(chǎn)物定量評價酯水解。當實驗中特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶的蛋白濃度為0.14mg蛋白質(zhì)每ml時，對于4_羥基肉桂酸甲酯、3，4_二羥基肉桂酸甲酯和4-羥基-3-甲氧基肉桂酸甲酯，清楚觀察到酯水解。對于3，5_二甲氧基-4-羥基肉桂酸甲酯，觀察到少量水解。當實驗中特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶的蛋白濃度為0.035mg蛋白質(zhì)每ml時，對于4-羥基肉桂酸甲酯、3，4_二羥基肉桂酸甲酯和4-羥基-3-甲氧基肉桂酸甲酯，清楚觀察到酯水解。對于3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸甲酯，在更低的酶加載量未觀察到酯水解。結果表明阿魏酸酯酶具有水解所選擇的肉桂酸衍生物的甲酯的能力，所述甲酯包括阿魏酸甲酯和相關化合物。實施例10特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶對于預處理的玉米纖維水解的作用評價了特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶對于預處理的玉米纖維水解的效果。玉米纖維是玉米粒濕磨產(chǎn)生的部分。玉米纖維是在去除淀粉和進一步處理之后留下的種皮和殘余胚。通過在140°C高壓滅菌150分鐘而預處理玉米纖維。使用下述方法，將底物中阿拉伯糖、葡萄糖和木糖的量確定為175、317和261g每kg干物質(zhì)。使用稀鹽酸通過糖水解確定阿拉伯糖和木糖。將預處理的玉米纖維轉移至125ml錐形燒瓶并稀釋以包含約10%干物質(zhì)。在油浴中在100°C預處理玉米纖維樣品。通過在100°C加入5ml2M鹽酸2小時而開始水解。溫育后，將搖瓶在冰上冷卻，并用4M氫氧化鈉中和。用MINISART10.2微米注射器式濾器(SartoriusAG,Goettingen,Germany)過濾樣品，并在DIONEXBIOLC系統(tǒng)(DionexCorporation，Sunnyvale，CA，USA)上分析阿拉伯糖和木糖。通過將玉米纖維的預處理樣品進行兩部硫酸水解而確定葡萄糖。向壓力管(AceGlass,Inc.，Vineland，NJ,USA)中約300mg干燥的玉米纖維加入3ml72%硫酸。混合樣品并在30°C水浴60分鐘。每隔5至10分鐘攪拌樣品。60分鐘后，去除樣品并加入84ml去離子水。將樣品放在高壓滅菌器中并在121°C加熱1小時。冷卻后，過濾樣品以去除殘余固體，并通過加入碳酸鈣而中和。根據(jù)下述方法，用DIONEXBIOLC系統(tǒng)確定葡萄糖濃度。將樣品(10μ1)載入如配備有與CARB0PACPAl保護柱(4x50mm)(DionexCorporation,Sunnyvale,CA,USA)組合的DIONEXCARB0PACPAl分析柱(4x250mm)的DIONEXBIOLC系統(tǒng)上。用IOmM氫氧化鉀以Iml每分鐘的流速等度分離單糖，并由脈沖電化學檢測器以脈沖安培檢測模式檢測。電極電勢程序為+0.1伏(t=0-0.4秒)至-2.0伏(t=0.41-0.42秒)至0.6伏(t=0.43秒)和最后-0.1伏(t=0.44-0.50秒)，同時從t=0.2-0.4秒將得到的信號積分。使用阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖的混合物(各成分濃度0.0050-0.075g每升)為標準品。用里氏木霉纖維素分解蛋白組合物(里氏木霉培養(yǎng)液，包含具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱霉GH61多肽和米曲霉β-葡糖苷酶融合體；PCT/US2008/065417)和里氏木霉β-木糖苷酶進行預處理玉米纖維的水解。里氏木霉β-木糖苷酶如Rasmussen等，2006，BiotechnologyandBioengineering94:869_876所述使用米曲霉的標準培養(yǎng)技術通過在米曲霉中表達而重組獲得。特異腐質(zhì)霉阿魏酸酯酶如實施例8中所述獲得。在溫度50"C和pH5.0在2mlEPPENDORF管(EppendorfAG,Germany)中的50mM乙酸鈉中進行預處理玉米纖維的水解。在可對每個樣品進行恒定加熱和混合的EPPENDORFTHERM0MIXERComfort(EppendorfAG,Germany)中溫育樣品。使用的底物量是2.5w/w%，總樣品體積為2ml。在里氏木霉纖維素分解蛋白組合物和里氏木霉β-木糖苷酶的頂部以Img酶每g干物質(zhì)的酶加載量加入來自特異腐質(zhì)霉的阿魏酸酯酶。以5mg酶每g干物質(zhì)的加載量加入里氏木霉纖維素分解蛋白組合物，并且以Img酶每g干物質(zhì)的加載量加入里氏木霉β-木糖苷酶。24小時后通過在加熱塊(TechneInc.，BurlingtonNJ,USA)中在100°C將樣品加熱10分鐘而終止水解。使用配備N0VA-PAKC18，4μm，3.9x150mm柱(WatersCorporation,Milford,ΜΑ,USA)的ICS-3000離子層析系統(tǒng)分析阿魏酸(Dionex，Sunnyvale,CA,USA)。在300nm波長檢測阿魏酸。使用兩種洗脫液洗脫液1是0.IM磷酸pH2.5+lmM三氟乙酸(TFA)，而洗脫液2是乙腈。用包含85%洗脫液1和15%洗脫液2的溶液以0.5ml每分鐘的流量等度分析阿魏酸。使用下述公式，通過確定由底物釋放的糖的量占開始加入量的百分比來計算轉化率。用樣品數(shù)據(jù)的雙尾分布和等方差(equalvariance)進行T-檢驗。轉化率(％)=(水解物中的糖量/加入的底物中的糖量)χ100以Img酶每克干物質(zhì)的酶加載量加入來自特異腐質(zhì)霉的阿魏酸酯酶，連同Img酶每g干物質(zhì)的里氏木霉β“木糖苷酶和5mg酶每g干物質(zhì)的里氏木霉纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，比較此時預處理玉米纖維的轉化率和僅加入Img酶每g干物質(zhì)的來自里氏木霉的β-木糖苷酶和5mg酶每g干物質(zhì)的里氏木霉纖維素分解蛋白質(zhì)組合物時的預處理玉米纖維的轉化率，證明相對轉化率從100.0顯著(P<0.0047)增加至115.0(表1)。還實現(xiàn)了相對半纖維素轉化率從100.0顯著(P<0.0247)增加至115.8(表2)。表權利要求一種具有阿魏酸酯酶活性的分離的多肽，其選自下組(a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少75％同一性；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；(c)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少75％同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。2.權利要求1的多肽，其包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其具有阿魏酸酯酶活性的片段，或由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其具有阿魏酸酯酶活性的片段組成。3.權利要求1的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQIDNO:1的核苷酸序列或其編碼具有阿魏酸酯酶活性的片段的亞序列，或由SEQIDNO:1的核苷酸序列或其編碼具有阿魏酸酯酶活性的片段的亞序列組成。4.權利要求1的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含在大腸桿菌NRRLB-50077所含的質(zhì)粒pHinsFAEBl中。5.分離的多核苷酸，其包含編碼權利要求1-4中任一項的多肽的核苷酸序列。6.核酸構建體，其包含權利要求5的多核苷酸，所述多核苷酸與一個或多個(幾個)調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列指導所述多肽在表達宿主中產(chǎn)生。7.重組宿主細胞，其包含權利要求6的核酸構建體。8.用于產(chǎn)生權利要求1-4中任一項的多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。9.用于產(chǎn)生權利要求1-4中任一項的多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含核酸構建體的宿主細胞，所述核酸構建體包含編碼所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。10.用于產(chǎn)生親本細胞的突變體的方法，所述方法包括破壞或缺失編碼權利要求1-4中任一項的多肽的核苷酸序列，其導致突變體與親本細胞相比產(chǎn)生較少的所述多肽。11.通過權利要求10的方法產(chǎn)生的突變細胞。12.用于產(chǎn)生權利要求1-4中任一項的多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉基因植物或植物細胞，所述轉基因植物或植物細胞包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。13.轉基因植物、植物部分或植物細胞，其已經(jīng)用編碼權利要求1-4中任一項的多肽的多核苷酸轉化。14.雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其包括權利要求5的多核苷酸的亞序列，其中可選地所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。15.抑制細胞中具有阿魏酸酯酶活性的多肽的表達的方法，其包括對細胞施用或在細胞中表達雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中dsRNA包括權利要求5的多核苷酸的亞序列。16.核酸構建體，其包含編碼蛋白質(zhì)的基因，所述基因與編碼信號肽的核苷酸序列可操作地連接，所述信號肽包含SEQIDNO2的氨基酸1至18或者由SEQIDNO2的氨基酸1至18組成，其中所述基因?qū)τ谒龊塑账嵝蛄惺峭庠吹摹?7.重組宿主細胞，其包含權利要求16的核酸構建體。18.用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括(a)在有益于所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權利要求17的重組宿主細胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。19.用于降解含木聚糖材料的方法，其包括用權利要求1-4中任一項的具有阿魏酸酯酶活性的多肽處理所述含木聚糖材料。20.權利要求19的方法，其進一步包括用木聚糖降解酶處理所述含木聚糖材料。全文摘要本發(fā)明涉及具有阿魏酸酯酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及用于制備和使用所述多肽的方法。文檔編號C12N15/82GK101939420SQ200880126491公開日2011年1月5日申請日期2008年12月3日優(yōu)先權日2007年12月7日發(fā)明者米歇爾·馬蘭塔,金伯利·布朗申請人:諾維信公司