專利名稱：用于生產(chǎn)異戊二烯的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體涉及從培養(yǎng)細(xì)的胞生產(chǎn)異戊二烯的方法以及包括這些培養(yǎng)細(xì)胞的組 合物。
背景技術(shù)：
異戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)是多種合成聚合物，最典型為合成橡膠的關(guān) 鍵起始材料。異戊二烯是由多種微生物、植物、和動物種類所天然生產(chǎn)的。特別地，已 經(jīng)鑒定出異戊二烯的兩種生物合成途徑甲羥戊酸(MVA)途徑和非甲羥戊酸(DXP)途 徑(

圖19A和19B)。然而，來自天然發(fā)生的生物的異戊二烯產(chǎn)量在商業(yè)上并不具吸引 力。每年從異戊二烯的聚合生產(chǎn)約800,000噸的順式聚異戊二烯；該聚異戊二烯中大多 數(shù)被用于輪胎和橡膠工業(yè)。異戊二烯也被共聚合以在其他產(chǎn)品如鞋類、機(jī)械產(chǎn)品、醫(yī)藥 產(chǎn)品、運(yùn)動商品和膠乳中用作合成高彈體。目前，輪胎和橡膠工業(yè)是基于天然和合成橡膠的使用。天然橡膠獲自橡膠樹或 在非洲雨林中發(fā)現(xiàn)的植物的乳汁。合成橡膠主要是基于丁二烯聚合物。對于這些聚合 物，丁二烯作為乙烯和丙烯生產(chǎn)的副產(chǎn)物而獲得。雖然異戊二烯可以通過石油分餾而獲得，但是這一物質(zhì)的純化是昂貴且耗時(shí) 的。對C5烴類流的石油裂化只產(chǎn)生約15%的異戊二烯。因此，需要生產(chǎn)異戊二烯的更 加經(jīng)濟(jì)的方法。特別地，期望在速度、滴定度和純度方面有足以滿足穩(wěn)健的商業(yè)化工藝 要求的生產(chǎn)異戊二烯的方法。也期望從廉價(jià)的起始材料生產(chǎn)異戊二烯的系統(tǒng)。發(fā)明簡要說明一方面，本發(fā)明表征了生產(chǎn)異戊二烯的培養(yǎng)細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明 提供培養(yǎng)細(xì)胞，該培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生基于異戊二烯的細(xì)胞濕重/小時(shí)(納摩爾/gw。m/hr)計(jì)， 大于約400納摩爾的異戊二烯/克細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，該細(xì)胞具有(i)編碼異戊 二烯合酶多肽和Gi)有效地連接到啟動子的異源核酸。在一些實(shí)施方式中，該細(xì)胞在包 括碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該碳源例如但不限于碳水化合物(例如木糖或葡萄糖)、乙酸鹽 /酯、丙三醇、甘油、二羥丙酮、單碳源、油、動物脂肪、動物油、脂肪酸、脂類、磷 脂、甘油脂、甘油單酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源(例如水解的生物量碳源)、 多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、來自酵母提取物的組分或前述兩種或 更多種的任一組合。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供具有異戊二烯的平均體積生產(chǎn)力大于約O.lmg/ L±if#a/hr的培養(yǎng)細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供具有異戊二烯的峰值體積生產(chǎn)力 大于約0.5mg/L±if#a/hr的培養(yǎng)細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，該細(xì)胞具有(i)編碼異戊二 烯合酶多肽和Gi)有效地連接到啟動子的異源核酸。在一些實(shí)施方式中，該細(xì)胞在包括碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該碳源例如但不限于碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸鹽 /酯、丙三醇、甘油、二羥丙酮、單碳源、油、動物脂肪、動物油、脂肪酸、脂類、磷 脂、甘油脂、甘油單酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源(例如水解的生物量碳源)、 多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、來自酵母提取物的組分或前述兩種或 更多種的任一組合。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供將細(xì)胞培養(yǎng)基中大于約0.002%的碳轉(zhuǎn)化成異戊 二烯的培養(yǎng)細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，該細(xì)胞具有ω編碼異戊二烯合酶多肽和(ω有 效地連接到啟動子的異源核酸。在一些實(shí)施方式中，該細(xì)胞在包括碳源的培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，該碳源例如但不限于碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸鹽/酯、丙三醇、甘 油、二羥丙酮、單碳源、油、動物脂肪、動物油、脂肪酸、脂類、磷脂、甘油脂、甘油 單酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源(例如水解的生物量碳源)、多肽(例如微生物 或植物蛋白或肽)、酵母提取物、來自酵母提取物的組分或前述兩種或更多種的任一組合。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包括編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸的培養(yǎng) 細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，該細(xì)胞具有ω編碼異戊二烯合酶多肽和Gi)有效地連接到 啟動子的異源核酸。在一些實(shí)施方式中，該細(xì)胞在包括碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該碳源例 如但不限于碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸鹽/酯、丙三醇、甘油、二羥丙 酮、單碳源、油、動物脂肪、動物油、脂肪酸、脂類、磷脂、甘油脂、甘油單酯、甘油 二酯、甘油三酯、可再生碳源(例如水解的生物量碳源)、多肽(例如微生物或植物蛋白 或肽)、酵母提取物、來自酵母提取物的組分或前述兩種或更多種的任一組合。在一方面，本發(fā)明表征了生產(chǎn)異戊二烯的方法，例如使用在此所述的任何細(xì)胞 生產(chǎn)異戊二烯的方法。在一些實(shí)施方式中，該方法包括在足以生產(chǎn)大于約400納摩爾/ gw。m/hr的異戊二烯的條件下，培養(yǎng)細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，該方法也包括回收由該細(xì) 胞生產(chǎn)的異戊二烯。在一些實(shí)施方式中，該方法包括純化由該細(xì)胞生產(chǎn)的異戊二烯。在 一些實(shí)施方式中，該方法包括使異戊二烯聚合。在一些實(shí)施方式中，該細(xì)胞具有(i)編碼 異戊二烯合酶多肽和Gi)有效地連接到啟動子的異源核酸。在一些實(shí)施方式中，該細(xì)胞 在包括碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該碳源例如但不限于碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、 乙酸鹽/酯、丙三醇、甘油、二羥丙酮、單碳源、油、動物脂肪、動物油、脂肪酸、脂 類、磷脂、甘油脂、甘油單酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源(例如水解的生物量 碳源)、多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、來自酵母提取物的組分或前 述兩種或更多種的任一組合。在一方面，本發(fā)明表征了生產(chǎn)異戊二烯的方法，例如使用在此所述的任何細(xì)胞 生產(chǎn)異戊二烯的方法。在一些實(shí)施方式中，該方法包括在使得異戊二烯的平均體積生產(chǎn) 力大于約0.1mg/L±if#a/hr的條件下，培養(yǎng)細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，該方法包括在使得 異戊二烯的峰值體積生產(chǎn)力大于約0.5mg/L±if#a/hr的條件下，培養(yǎng)細(xì)胞。在一些實(shí)施 方式中，該方法也包括回收由該細(xì)胞生產(chǎn)的異戊二烯。在一些實(shí)施方式中，該方法包括 純化由該細(xì)胞生產(chǎn)的異戊二烯。在一些實(shí)施方式中，該方法包括使異戊二烯聚合。在一 些實(shí)施方式中，該細(xì)胞具有G)編碼異戊二烯合酶多肽和Gi)有效地連接到啟動子的異源 核酸。在一些實(shí)施方式中，該細(xì)胞在包括碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該碳源例如但不限于碳水化合物(例如木糖或葡萄糖)，乙酸鹽/酯、丙三醇、甘油、二羥丙酮、單碳源、油、 動物脂肪、動物油、脂肪酸、脂類、磷脂、甘油脂、甘油單酯、甘油二酯、甘油三酯、 可再生碳源(例如水解的生物量碳源)、多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取 物、來自酵母提取物的組分或前述兩種或更多種的任一組合。在一些實(shí)施方式中，該方法包括在足以將細(xì)胞培養(yǎng)基中大于約0.002%的碳轉(zhuǎn)化 成異戊二烯的條件下，培養(yǎng)細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，該方法也包括回收由該細(xì)胞生產(chǎn) 的異戊二烯。在一些實(shí)施方式中，該方法包括純化由該細(xì)胞生產(chǎn)的異戊二烯。在一些實(shí) 施方式中，該方法包括使異戊二烯聚合。在一些實(shí)施方式中，該細(xì)胞具有ω編碼異戊二 烯合酶多肽和(ω有效地連接到啟動子的異源核酸。在一些實(shí)施方式中，該細(xì)胞在包括 碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該碳源例如但不限于碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸鹽 /酯、丙三醇、甘油、二羥丙酮、單碳源、油、動物脂肪、動物油、脂肪酸、脂類、磷 脂、甘油脂、甘油單酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源(例如水解的生物量碳源)、 多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、來自酵母提取物的組分或前述兩種或 更多種的任一組合。在本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)細(xì)胞以大于或約400、500、 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000、10,000、12,500、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000、100,000、125,000、 150,000、188,000，或更多納摩爾/gwem/hr的異戊二烯來生產(chǎn)異戊二烯。在一些實(shí)施方式 中，培養(yǎng)細(xì)胞具有異戊二烯的平均體積生產(chǎn)力為大于或約0.1、1.0、10、25、50、100、 150、 200、 250、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 900、 1,000、 1100、 1200、 1300、 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,100, 2,200, 2,300, 2,400, 2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500，或更 多mg的異戊二烯/L#_/hr(mg/L#_/hr，其中培養(yǎng)液的體積包括細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng) 基的體積)。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)細(xì)胞具有異戊二烯的峰值體積生產(chǎn)力高于或約 0.5、 1.0、 10、 25、 50、 100、 150、 200、 250、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 900、 1,000、1100、1200、1300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、 2,200, 2,300, 2,400, 2,500, 2,600, 2,700, 2,800, 2,900, 3,000, 3,100, 3,200, 3,300, 3,400, 3,500, 3,750, 4,000, 4,250, 4,500, 4,750, 5,000, 5,250, 5,500, 5,750, 6,000, 6,250, 6,500, 6,750, 7,000, 7,250, 7,500, 7,750, 8,000, 8,250, 8,500、8,750、9,000、9,250、9,500、9,750、10,000、12,500、15,000，或更多 mg 的異戊 二烯/L的培養(yǎng)液/hr(mg/L_a/hr，其中培養(yǎng)液的體積包括細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基的體積)。 在本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)細(xì)胞將在細(xì)胞培養(yǎng)基中以大于或約0.002、 0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、0.14、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、 0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0、2.2、2.4、2.6、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、 10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18.0、19.0、20.0、21.0、22.0、23.0、 23.2、23.4、23.6、23.8、24.0、25.0、30.0、31.0、32.0、33.0、35.0、37.5、40.0、45.0、 47.5、50.0、55.0、60.0、65.0、70.0、75.0、80.0、85.0、90.0 摩爾％，或更多的碳轉(zhuǎn)化成 異戊二烯。在本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)細(xì)胞以基于細(xì)胞濕重/hr(ng/gw。m/ h)計(jì)，大于或約 1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、 100,000，或更多ng的異戊二烯/克細(xì)胞來生產(chǎn)異戊二烯。在本發(fā)明任何方面的一些 實(shí)施方式中，培養(yǎng)細(xì)胞以大于或約1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、 500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、 5,000、10,000、50,000、100,000，或更多mg的異戊二烯/L培養(yǎng)液(mg/L培養(yǎng)液，其中培養(yǎng)液 的體積包括細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基的體積)來生產(chǎn)累積滴定度(總量)的異戊二烯。在此公 開了其他示例性的異戊二烯生產(chǎn)速率和異戊二烯生產(chǎn)總量。在本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施方式中，細(xì)胞還包括編碼IDI多肽的異源核酸。在 本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施方式中，細(xì)胞還包括編碼IDI多肽的內(nèi)源核酸拷貝的插入。在 本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施方式中，細(xì)胞還包括編碼DXS多肽的異源核酸。在本發(fā)明任 何方面的一些實(shí)施方式中，細(xì)胞還包括編碼DXS多肽的內(nèi)源核酸拷貝的插入。在本發(fā)明 任何方面的一些實(shí)施方式中，細(xì)胞還包括編碼IDI多肽和DXS多肽的一種或多種核酸。 在本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施方式中，一種核酸編碼異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS 多肽。在本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施方式中，一種載體編碼異戊二烯合酶多肽、IDI多肽 和DXS多肽。在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，載體包括選擇標(biāo)記，如抗生素抗性核酸。在本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施方式中，異源異戊二烯合酶核酸有效連接T7啟 動子，例如在中或高拷貝質(zhì)粒中含有的T7啟動子。在本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施方式 中，異源異戊二烯合酶核酸有效連接Trc啟動子，例如在中或高拷貝質(zhì)粒中含有的Trc啟 動子。在本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施方式中，異源異戊二烯合酶核酸有效連接Lac啟動 子，例如在低拷貝質(zhì)粒中含有的Lac啟動子。在本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施方式中，異 源異戊二烯合酶核酸有效連接內(nèi)源啟動子，例如內(nèi)源性堿性絲氨酸蛋白酶啟動子。在一 些實(shí)施方式中，異源異戊二烯合酶核酸整合到不帶選擇性標(biāo)記的細(xì)胞的染色體中。在本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施方式中，至少一部分細(xì)胞在連續(xù)培養(yǎng)(如未稀釋 的連續(xù)培養(yǎng))中維持異源異戊二烯合酶核酸至少或約5、10、20、40、50、60、65或更多 的細(xì)胞分裂。在本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施方式中，包括異戊二烯合酶、IDI或DXS核 酸的核酸也包括選擇性標(biāo)記，例如抗生素抗性核酸。在本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施方式中，細(xì)胞還包括編碼MVA途徑多肽(例如來 自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisi)、馬氏甲燒八疊球菌(Methanosarcina mazei)、或糞腸 球菌(Enterococcus faecalis)的MVA途徑多肽)的異源核酸。在本發(fā)明任何方面的一些
實(shí)施方式中，細(xì)胞還包括編碼MVA途徑多肽(例如來自釀酒酵母、馬氏甲烷八疊球菌、 或糞腸球菌的MVA途徑多肽)的內(nèi)源核酸拷貝的插入。在本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施方 式中，細(xì)胞包括異戊二烯合酶、DXS和MVA途徑核酸。在本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施 方式中，細(xì)胞包括異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸和MVA途徑核酸(除了 IDI 核酸以外)。在本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施方式中，異戊二烯合酶多肽是天然發(fā)生的多肽， 其來自植物如葛屬(Pueraria)(例如，葛麻姆(Pueraria montana))、或楊(Populus)(如 Populus tremuloides,銀白楊(Ralba)，黑楊(Populus nigra), Populus trichocarpa,或銀白
楊歐洲山楊的雜交品種)。在本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施方式中，細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，如革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞(例如芽孢桿菌細(xì)胞如枯草桿菌(Bacillus subtilis)細(xì)胞或鏈霉菌(Streptomyces)細(xì)胞 如淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)、天 藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor) > 白色鏈霉菌(Streptomyces albus)、或灰色鏈霉菌 (Streptomyces griseus)細(xì)胞)。在本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施方式中，細(xì)胞是革蘭氏陰 性細(xì)菌細(xì)胞(例如埃希氏菌(Escherichia)細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞或泛菌(Pantoea)細(xì)胞如 檸檬泛菌(Pantoea citrea)細(xì)胞)。在一些實(shí)施方式中，大腸桿菌細(xì)胞是大腸桿菌FadR atoC突變細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)(例如組成型表達(dá))ybhE(也稱 作pgl)。在本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施方式中，細(xì)胞是真菌細(xì)胞如絲狀真菌細(xì)胞(例如 木霉屬(Trichoderma)細(xì)胞如里氏木霉(Trichodermareesei)細(xì)胞或曲霉(Aspergillus)細(xì) 胞如米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillusniger)或酵母細(xì)胞(如耶氏酵母屬 (Yarrowia)細(xì)胞如解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)細(xì)胞)。在本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施方式中，微生物多肽碳源包括來自酵母或細(xì)菌的 一或多種多肽。在本發(fā)明任何方面的一些實(shí)施方式中，植物多肽碳源包括來自大豆、玉 米、油菜、麻風(fēng)樹、棕櫚樹、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕櫚仁、橄 欖、紅花、芝麻、或亞麻籽的一或多種多肽。在一方面，本發(fā)明提供包含聚異戊二烯的輪胎。在一些實(shí)施方式中，該聚異戊 二烯是由ω聚合來自在此所述的任一組合物或方法的異戊二烯或(ω聚合由在此所述 的任一組合物或方法回收的異戊二烯所生產(chǎn)的。在一些實(shí)施方式中，聚異戊二烯包含順 式-1，4-聚異戊二烯。在一方面，本發(fā)明表征了由任何的本發(fā)明組合物或方法所生產(chǎn)的產(chǎn)物(例如輪 胎)。應(yīng)理解的是，可組合在此所述的多種實(shí)施方式的一個(gè)、多個(gè)或全部特性以形成 本發(fā)明的其它實(shí)施方式。本發(fā)明的這些以及其他方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見 的。附圖簡要說明圖1是用于在大腸桿菌中表達(dá)而密碼子優(yōu)化的野葛異戊二烯合酶基因的核苷酸 序列(SEQ ID NO: 1)。atg起始密碼子為斜體，終止密碼子為粗體而添加的PstI位點(diǎn)有 下劃線。圖2 是 pTrcKudzu 的圖譜。圖3是pTrcKudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO 2)。RBS有下劃線，野葛異戊
二烯合酶起始密碼子為粗體大寫字母而終止密碼子為粗體、大寫、斜體字母。載體骨架 是 pTrcHis2B。圖 4 是 pETNHisKudzu 的圖譜。圖5 是 pETNHisKudzu 的核苷酸序列(SEQ ID NO 5)。圖6 是 pCL-lac-Kudzu 的圖譜。圖7 是 pCL-lac-Kudzu 的核苷酸序列(SEQ ID NO 7)。圖8A是示出在沒有載體的大腸桿菌BL21細(xì)胞中異戊二烯生產(chǎn)的圖。圖8B是示出在具有pCL-lac-Kudzu的大腸桿菌BL21細(xì)胞中異戊二烯生產(chǎn)的圖。
圖8C是示出在具有pTrcKudzu的大腸桿菌BL21細(xì)胞中異戊二烯生產(chǎn)的圖。圖8D是示出在具有pETN-HisKudzu的大腸桿菌BL21細(xì)胞中異戊二烯生產(chǎn)的圖。圖9A是示出在14升補(bǔ)料分批發(fā)酵中大腸桿菌BL21/pTrcKudZu隨發(fā)酵進(jìn)程的
OD的圖。圖9B是示出在14升補(bǔ)料分批發(fā)酵中大腸桿菌BL21/pTrcKudZu隨發(fā)酵進(jìn)程的異
戊二烯生產(chǎn)的圖。圖IOA是示出在檸檬泛菌中的異戊二烯生產(chǎn)的圖。對照細(xì)胞沒有重組野葛異戊 二烯合酶。灰色菱形表示異戊二烯合成，黑色方塊表示OD_。圖IOB是示出在表達(dá)pCL-lac Kudzu的檸檬泛菌中異戊二烯的生產(chǎn)的圖?；疑?br> 菱形表示異戊二烯合成，黑色方塊表示OD_。圖IOC是示出在表達(dá)pTrcKudzu的檸檬泛菌中的異戊二烯生產(chǎn)的圖?；疑庑?br> 表示異戊二烯合成，黑色方塊表示OD_。圖11是示出在表達(dá)重組異戊二烯合酶的枯草桿菌中的異戊二烯生產(chǎn)的圖。 BG3594comK是沒有質(zhì)粒的枯草桿菌菌株(天然異戊二烯生產(chǎn))。CF443-BG3594comK 是具有pBSKudzu的枯草桿菌菌株(重組異戊二烯生產(chǎn))。y_軸上的IS表示異戊二烯。圖12 是 pBS Kudzu#2 的核苷酸序列(SEQ ID NO 57)。圖13是用于在耶氏酵母中表達(dá)而密碼子優(yōu)化的野葛異戊二烯合酶的核苷酸序列 (SEQ ID NO 8)。圖14是包含用于在耶氏酵母中表達(dá)而密碼子優(yōu)化的野葛異戊二烯合酶基因的 pTrex3g 圖譜。圖15 是載體 pSPZl (MAP29Spb)的核苷酸序列(SEQ IDNO 11)。圖16是用于在耶氏酵母中表達(dá)而密碼子優(yōu)化的合成的野葛(葛麻姆)異戊二烯 基因的核苷酸序列(SEQ ID NO: 12)。圖17是合成的雜交楊(銀白楊χ歐洲山楊)異戊二烯合酶基因的核苷酸序列 (SEQ ID NO 13)。ATG起始密碼子為粗體而終止密碼子有下劃線。圖18A示出描繪載體pYLAl、ρYLl和pYL2的構(gòu)建的示意圖。圖18B示出描繪載體pYLA(POPl)的構(gòu)建的示意圖。圖18C示出描繪載體pYLA(KZl)的構(gòu)建的示意圖。圖18D示出描繪載體pYLl (KZl)的構(gòu)建的示意圖。圖18E示出描繪載體pYLI(MAP29)的構(gòu)建的示意圖。圖18F示出描繪載體pYLA(MAP29)的構(gòu)建的示意圖。圖19A示出異戊二烯的MVA和DXP代謝途徑(根據(jù)F.Bouvier等人，Progress in Lipid Res.44 357-429，2005)。下面的描述包括對于途徑中每種多肽的替代名稱以及公 開有用于測量所示多肽活性的檢測法的參考(這些參考各在此通過整體引用作為參考， 特別是對于在MVA和DXP途徑中的多肽的多肽活性檢測法)。甲羥戊酸途徑AACT ； 乙?；?CoA 乙酰基轉(zhuǎn)移酶，MvaE，EC 2.3.1.9.Assay J.Bacteriol.，184 2116-2122, 2002 ； HMGS ；羥甲基戊二?；?CoA 合成酶，MvaS，EC 2.3.3.lO.Assay I Bacteriol., 184 4065-4070, 2002 ； HMGR ； 3-羥基-3-甲基戊 二酰基-CoA 還原酶，MvaE,EC 1.1.1.34.Assay I Bacteriol.，184 2116-2122，2002 ； MVK ；甲羥戊酸激酶，ERG 12，EC 2.7.1.36.Assay Curr Genet 19 9-14, 1991.PMK ；磷酸甲羥戊酸激酶，ERG8， EC 2.7.4.2，Assay Mol Cell Biol.，11 620-631, 1991 ； DPMDC ； 二磷酸甲羥戊酸 脫羧酶，MVD1，BC4.1.1.33.Assay Biochemistry, 33: 13355-13362，1994 ； IDI ； 異戊烯二磷酸 δ 異構(gòu)酶，IDI1, EC 5.3.3.2.Assay I Biol.Chem.264 19169-19175， 1989。DXP 途徑DXS ； 1-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶，dxs，BC 2.2.1.7.Assay PNAS, 94: 12857-62，1997 ； DXR ； 1_ 脫氧 _D_ 木酮糖 _5_ 磷酸還原異構(gòu)酶，dxr，BC 2.2.1.7.Assay Eur.I Biochem.269 4446-4457，2002 ； MCT ； 4- 二磷酸胞苷-2-C-甲 基-D 赤蘚糖醇合酶，IspD, EC 2.7.7.60.Assay PNAS, 97: 6451-6456，2000 ； CMK ； 4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D 赤蘚糖醇激酶，IspE, BC 2.7.1.148.Assay PNAS, 97 1062-1067，2000 ； MCS ； 2C-甲基 _D_ 赤蘚糖醇 2，4-環(huán) 二磷酸合酶，IspF，BC 4.6.1.12.Assay PNAS, 96: 11758-11763，1999 ； HDS ； 1_ 羥基 _2_ 甲基-2-(E) - 丁 烯基-4-二磷酸合酶，ispG，EC1.17.4.3.Assay I Org.Chem.，70 9168-9174, 2005 ； HDR ； 1-羥基-2-甲基-2-(E)- 丁烯基-4- 二磷酸還原酶，IspH, BC 1.17丄2.Assay JACS, 126 12847-12855，2004。圖19B說明了經(jīng)典的和改良的MVA途徑。1，乙酰-CoA乙?；D(zhuǎn)移酶 (AACT) ； 2，HMG-CoA 合酶(HMGS) ； 3，HMG-CoA 還原酶(HMGR) ； 4，甲羥戊 酸激酶(MVK) ； 5，磷酸甲羥戊酸激酶(PMK) ； 6，二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD或 DPMDC) ； 7，異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶(IDI) ； 8，磷酸甲羥戊酸脫羧酶(PMDC) ； 9，異 戊烯基磷酸激酶(IPK)。經(jīng)典MVA途徑從反應(yīng)1開始，通過反應(yīng)5和6至反應(yīng)7來進(jìn) 行，而改良MVA途徑經(jīng)反應(yīng)8和9至反應(yīng)7。結(jié)構(gòu)式中的P和PP分別是磷酸和焦磷酸。 這一圖取自 Koga 和 Morii，Microbiology and Mol.Biology Reviews, 71 97-120, 2007， 其在此通過整體引用作為參考，特別是對于改良MVA途徑的核酸和多肽。改良MVA途 徑例如存在于諸如馬氏甲烷八疊球菌的一些古生物中。圖20示出表示由沒有(左)或具有(右)野葛異戊二烯合酶基因的重組解脂耶 氏酵母菌株生產(chǎn)的異戊二烯的GC-MS分析結(jié)果的圖。箭頭表示真正的異戊二烯標(biāo)準(zhǔn)的 洗脫時(shí)間。圖 21 是 pTrcKudzu yIDI DXS Kan 的圖譜。 圖 22 是 pTrcKudzu yIDI DXS Kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO 20)。圖23A是示出在BL21/pTrcKudzukan中從葡萄糖生產(chǎn)異戊二烯的圖。時(shí)間0是 以IPTG (400 μ mol)誘導(dǎo)的時(shí)間。χ軸是誘導(dǎo)后的時(shí)間；y軸是OD6tltl并且y2軸是異戊二 烯的總生產(chǎn)力(yg/L頂空或比生產(chǎn)力(yg/L頂空/OD)。菱形表示OD_，圓圈表示總 異戊二烯生產(chǎn)力(yg/L)而方塊表示異戊二烯的比生產(chǎn)力(yg/L/OD)。圖23B是示出在BL21/pTrcKudzuyIDIkan中從葡萄糖生產(chǎn)的異戊二烯的圖。時(shí) 間0是以IPTG (400 μ mol)誘導(dǎo)的時(shí)間。χ軸是誘導(dǎo)后的時(shí)間；y軸是OD6tltl并且y2軸是 異戊二烯的總生產(chǎn)力(μ g/L頂空或比生產(chǎn)力(μ g/L頂空/OD)。菱形表示OD_，圓圈 表示總異戊二烯生產(chǎn)力(yg/L)而方塊表示異戊二烯的比生產(chǎn)力(yg/L/OD)。圖23C是示出在BL21/pTrcKudzuDXSkan中從葡萄糖生產(chǎn)的異戊二烯的圖。時(shí) 間O是以IPTG (400 μ mol)誘導(dǎo)的時(shí)間。χ軸是誘導(dǎo)后的時(shí)間；y軸是OD6tltl并且y2軸是異戊二烯的總生產(chǎn)力(yg/L頂空或比生產(chǎn)力(yg/L頂空/0D)。菱形表示OD_，圓圈 表示總異戊二烯生產(chǎn)力(yg/L)而方塊表示異戊二烯的比生產(chǎn)力(yg/L/OD)。圖23D是 示出在BL21/pTrcKudzu yIDI DXS kan中從葡萄糖生產(chǎn)的異戊二烯的 圖。時(shí)間0是以IPTG (400 μ mol)誘導(dǎo)的時(shí)間。χ軸是誘導(dǎo)后的時(shí)間；y軸是OD_并且y2 軸是異戊二烯的總生產(chǎn)力(yg/L頂空或比生產(chǎn)力(yg/L頂空/OD)。菱形表示OD6。。， 圓圈表示總異戊二烯生產(chǎn)力(yg/L)而方塊表示異戊二烯的比生產(chǎn)力(yg/L/OD)。圖23E是示出在BL21/pCL PTrcKudzu中從葡萄糖生產(chǎn)異戊二烯的圖。時(shí)間0 是以IPTG(400ymOl)誘導(dǎo)的時(shí)間。χ軸是誘導(dǎo)后的時(shí)間；y軸是OD6tltl并且y2軸是異戊 二烯的總生產(chǎn)力(yg/L頂空或比生產(chǎn)力(yg/L頂空/OD)。菱形表示OD_，圓圈表示 總異戊二烯生產(chǎn)力(yg/L)而方塊表示異戊二烯的比生產(chǎn)力(yg/L/OD)。圖23F是示出在BL21/pCL PTrcKudzuyIDI中從葡萄糖生產(chǎn)異戊二烯的圖。時(shí) 間0是以IPTG (400 μ mol)誘導(dǎo)的時(shí)間。χ軸是誘導(dǎo)后的時(shí)間；y軸是OD6tltl并且y2軸是 異戊二烯的總生產(chǎn)力(μ g/L頂空或比生產(chǎn)力(μ g/L頂空/OD)。菱形表示OD_，圓圈 表示總異戊二烯生產(chǎn)力(yg/L)而方塊表示異戊二烯的比生產(chǎn)力(yg/L/OD)。圖23G是示出在BL21/pCL PTrcKudzu DXS中從葡萄糖生產(chǎn)異戊二烯的圖。時(shí) 間O是以IPTG (400 μ mol)誘導(dǎo)的時(shí)間。χ軸是誘導(dǎo)后的時(shí)間；y軸是OD6tltl并且y2軸是 異戊二烯的總生產(chǎn)力(μ g/L頂空或比生產(chǎn)力(μ g/L頂空/OD)。菱形表示OD_，圓圈 表示總異戊二烯生產(chǎn)力(yg/L)而方塊表示異戊二烯的比生產(chǎn)力(yg/L/OD)。圖23H是示出在BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan中從葡萄糖生產(chǎn)的異戊二烯的圖。 時(shí)間O是以IPTG (400 μ mol)誘導(dǎo)的時(shí)間。χ軸是誘導(dǎo)后的時(shí)間；y軸是OD6tltl并且y2軸 是異戊二烯的總生產(chǎn)力(μ g/L頂空或比生產(chǎn)力(μ g/L頂空/OD)。黑色菱形表示OD600, 黑色三角表示總異戊二烯生產(chǎn)力(μ g/L)而白色方塊表示異戊二烯的比生產(chǎn)力(μ g/L/ OD)。圖24 是 pTrcKKDylkIS kan 的圖譜。圖 25 是 pTrcKKDylkIS kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO 33)。圖 26 是 pCL PtrcUpperPathway 的圖譜。圖 27 是 pCL PtrcUpperPathway 的核苷酸序列(SEQ ID NO 46)。圖28示出含有下游MVA途徑和用于整合到枯草桿菌染色體nprE座位的酵母idi 的表達(dá)盒的圖譜。nprE上游/下游表示來自nprE位點(diǎn)用于整合的各Ikb序列。aprE啟 動子(堿性絲氨酸蛋白酶啟動子)表示aprE基因的啟動子(-35，-10，+1轉(zhuǎn)錄起始位 點(diǎn)，RBS)。MVKl表示酵母甲羥戊酸激酶基因。RBS-PMK表示具有起始位點(diǎn)的芽孢 桿菌RBS上游的酵母磷酸甲羥戊酸激酶基因。RBS-MPD表示具有起始位點(diǎn)上游的芽孢 桿菌PBS的酵母二磷酸甲羥戊酸脫羧酶基因。RBS-IDI表示具有起始位點(diǎn)上游的芽孢桿 菌RBS的酵母idi基因。終止子表示來自解淀粉芽孢桿菌(B.amyliquefaciens)的終止子 堿性絲氨酸蛋白酶轉(zhuǎn)錄終止子。SpecR表示壯觀霉素抗性標(biāo)記。“用于擴(kuò)增的nprE上游 重復(fù)”表示用于擴(kuò)增的上游區(qū)域的直接重復(fù)。圖29是含有下游MVA途徑和用于整合到枯草桿菌染色體nprE座位的酵母idi的 表達(dá)盒的核苷酸序列(SEQ ID NO 47)。圖3O 是 p9796_poplar 的圖譜。
圖31 是 p9796-poplar 的核苷酸序列(SEQ ID NO 48)。圖32 是 pTrcPoplar 的圖譜。圖33 是 pTrcPoplar 的核苷酸序列(SEQ ID NO 49)。圖 34 是 pTrcKudzu yIDI Kan 的圖譜。 圖 35 是 pTrcKudzu yIDI Kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO 50)。圖36 是 pTrcKudzuDXS Kan 的圖譜。圖37 是 pTrcKudzuDXS Kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO 51)。圖38 是 pCL PTrcKudzu 的圖譜。圖39 是 pCL PTrcKudzu 的核苷酸序列(SEQ ID NO 52)。圖40 是 pCL PTrcKudzu A3 的圖譜。圖41 是 pCL PTrcKudzu A3 的核苷酸序列(SEQ ID NO 53)。圖42 是 pCL PTrcKudzu yIDI 的圖譜。圖 43 是 pCL PTrcKudzu yIDI 的核苷酸序列(SEQ ID NO 54)。圖44 是 pCL PTrcKudzu DXS 的圖譜。圖 45 是 pCL PTrcKudzu DXS 的核苷酸序列(SEQ ID NO 55)。圖46示出表示從生物質(zhì)原料生產(chǎn)異戊二烯的圖。小圖A示出來自玉米秸稈的異 戊二烯生產(chǎn)，小圖B示出來自甘蔗渣的異戊二烯生產(chǎn)，小圖C示出來自軟木材木漿的異 戊二烯生產(chǎn)，小圖D示出來自葡萄糖的異戊二烯生產(chǎn)，和小圖E示出來自沒有添加原料 的細(xì)胞的異戊二烯生產(chǎn)?；疑綁K表示在接種后的指定時(shí)間處，對培養(yǎng)物的OD6tltl測量 而黑色三角表示在接種后的指定時(shí)間的異戊二烯生產(chǎn)。圖47示出表示在沒有添加葡萄糖的培養(yǎng)物中由BL21 ( λ DE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)生產(chǎn)的異戊二烯的圖。方塊表示OD6tltl,而三角表示所生產(chǎn)的異戊二烯(μ g/ ml)。圖47B 示出表示由 BL21 ( λ DE3)pTrcKudzu yIDI DXS (kan)從 1 %葡萄糖原料轉(zhuǎn)
化糖生產(chǎn)的異戊二烯的圖。方塊表示OD_，而三角表示所生產(chǎn)的異戊二烯(μ g/ml)。圖47C 示出表示由 BL21 ( λ DE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)從 1 % 轉(zhuǎn)化糖原料生 產(chǎn)的異戊二烯的圖。方塊表示OD_，而三角表示所生產(chǎn)的異戊二烯(μ g/ml)。圖 47D 示出表示由 BL21 ( λ DE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)從 1 % AFEX 玉米秸
稈原料生產(chǎn)的異戊二烯的圖。方塊表示OD·，而三角表示所生產(chǎn)的異戊二烯(μ g/ml)。圖48示出表明酵母提取物對異戊二烯生產(chǎn)的影響的圖。小圖A示出在供給不同 量的酵母提取物的發(fā)酵罐中光密度的時(shí)間進(jìn)程。小圖B示出在供給不同量的酵母提取物 的發(fā)酵罐中異戊二烯滴定度的時(shí)間進(jìn)程。滴定度定義為每升發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)生的異戊二烯 的量。小圖C示出酵母提取物對在生長于補(bǔ)料分批培養(yǎng)物中的大腸桿菌中異戊二烯生產(chǎn) 的影響。圖49示出表明在500L生物反應(yīng)器中含有pTrcKudzu和yIDI和DXS質(zhì)粒的大
腸桿菌細(xì)胞生產(chǎn)異戊二烯的圖。小 圖A示出在供應(yīng)葡萄糖和酵母提取物的500-L生物反 應(yīng)器中的光密度的時(shí)間進(jìn)程。小圖B示出在小圖葡萄糖和酵母提取物的500-L生物反應(yīng) 器中異戊二烯滴定度的時(shí)間進(jìn)程。滴定度定義為每升發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)生的異戊二烯的量。 小圖C示出從供應(yīng)葡萄糖和酵母提取物的500-L生物反應(yīng)器生產(chǎn)的總異戊二烯的時(shí)間進(jìn)程。圖 50 是 pJMupperpathway2 的圖譜。圖 51 是 pJMupperpathway2 的核苷酸序列(SEQ ID NO 56)。圖52 是 pBS Kudzu#2 的圖譜。圖53A是示出在14升補(bǔ)料 分批發(fā)酵中表達(dá)重組野葛異戊二烯合酶的芽孢桿菌發(fā) 酵時(shí)間期間的生長。黑色菱形表示沒有重組異戊二烯合酶(天然異戊二烯生產(chǎn))的對照 菌株(BG3594comK)而灰色三角表示具有pBSKudzu(重組異戊二烯生產(chǎn))的芽孢桿菌。圖53B是示出在14升補(bǔ)料分批發(fā)酵中表達(dá)重組野葛異戊二烯合酶的芽孢桿菌發(fā) 酵時(shí)間期間的異戊二烯生產(chǎn)。黑色菱形表示沒有重組異戊二烯合酶(天然異戊二烯生產(chǎn)) 的對照菌株(BG3594comK)而灰色三角表示具有pBSKudzu(重組異戊二烯生產(chǎn))的芽孢 桿菌。圖54 是質(zhì)粒 pET24P.alba HGS 的圖譜。圖55A 和 55B 是質(zhì)粒 pET24P.alba HGS 的核苷酸序列(SEQ IDNO 87)。圖56是示出用于內(nèi)切核酸酶消化以構(gòu)建質(zhì)粒EWL230的限制性位點(diǎn)以及在 BspHI和NcoI位點(diǎn)之間的相容性粘性末端的示意圖。圖57是質(zhì)粒EWL230的圖譜。圖58A和58B是質(zhì)粒EWL230的核苷酸序列(SEQ ID NO 88)。圖59是示出用于內(nèi)切核酸酶消化以構(gòu)建質(zhì)粒EWL244的限制性位點(diǎn)以及在NsiI 和PstI位點(diǎn)之間的相容性粘性末端的示意圖。圖60是EWL244的圖譜。圖61A和61B是質(zhì)粒EWL244的核苷酸序列(SEQ ID NO 89)。圖62是質(zhì)粒MCM484-487的圖譜。圖63A-63C 是質(zhì)粒 MCM484 的核苷酸序列(SEQ ID NO 90)。圖64A-64C 是質(zhì)粒 MCM485 的核苷酸序列(SEQ ID NO 91)。圖65A-65C 是質(zhì)粒 MCM486 的核苷酸序列(SEQ ID NO 92)。圖66A-66C 是質(zhì)粒 MCM487 的核苷酸序列(SEQ ID NO 93)。圖67A-67D是表達(dá)MVA途徑的基因并且在以15_L規(guī)模的沒有酵母提取物供料 的補(bǔ)料分批培養(yǎng)中生長的大腸桿菌菌株(EWL256)的異戊二烯生產(chǎn)圖。圖67A示出在供 料葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器中光密度的時(shí)間進(jìn)程。圖67B示出在供料葡萄糖的15-L生 物反應(yīng)器中異戊二烯滴定度的時(shí)間進(jìn)程。滴定度定義為每升發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)生的異戊二烯 的量。圖67C示出從供料葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器生產(chǎn)的總異戊二烯的時(shí)間進(jìn)程。圖 67D示出在供料葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器中的總二氧化碳進(jìn)化率(TCER)、或代謝活性
■i並 曰O圖68A-68E是表達(dá)MVA途徑的基因并且在以15_L規(guī)模的具有酵母提取物供料 的補(bǔ)料分批培養(yǎng)中生長的大腸桿菌菌株(EWL256)的異戊二烯生產(chǎn)圖。圖68A示出在供 料葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器中光密度的時(shí)間進(jìn)程。圖68B示出在供料葡萄糖的15-L生 物反應(yīng)器中異戊二烯滴定度的時(shí)間進(jìn)程。滴定度定義為每升發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)生的異戊二烯 的量。圖68C示出從供料葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器生產(chǎn)的總異戊二烯的時(shí)間進(jìn)程。圖 68D示出在供料葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器中的體積生產(chǎn)力。在40小時(shí)期間(23-63小時(shí))維持平均值為l.lg/L/hr的酵母提取物加料。圖68E示出在供料葡萄糖的15-L生物 反應(yīng)器中的二氧化碳進(jìn)化率(TCER)、或代謝活性譜。 圖69A-69D示出從不同碳源通過MVA(途徑)的異戊二烯生產(chǎn)。圖69A示出 含有MVA途徑和異戊二烯合酶的大腸桿菌EWL256在葡萄糖、生物量水解物、丙三醇或 乙酸鹽/酯作為唯一碳源上的生長。在培養(yǎng)基中添加不同碳源至濃度為1%。包括沒有 添加碳源的陰性對照。以600nM處的光密度測量生長。圖69B示出含有MVA途徑和異 戊二烯合酶的大腸桿菌EWL256在葡萄糖、生物量水解物、丙三醇或乙酸鹽/酯作為唯一 碳源上生長時(shí)的異戊二烯比生產(chǎn)力。在培養(yǎng)基中添加不同碳源至濃度為1%。包括沒有 添加碳源的陰性對照。接種后190分鐘、255分鐘和317分鐘取樣并使用GC-MS測量細(xì) 菌生產(chǎn)的異戊二烯。圖69C示出大腸桿菌EWL256在葡萄糖或木糖作為唯一碳源上的生 長。在培養(yǎng)基中添加不同碳源至濃度為1%。包括沒有添加碳源的陰性對照。生長測量 為600nM下的光密度。圖69D示出大腸桿菌EWL256在葡萄糖或木糖作為唯一碳源上 生長的比生產(chǎn)力。在培養(yǎng)基中添加碳源至濃度為1%。包括沒有添加碳源的陰性對照。 接種后260分鐘、322分鐘和383分鐘取樣并使用GC_MS測量細(xì)菌生產(chǎn)的異戊二烯。圖70A和70B示出由大腸桿菌菌株分別從葡萄糖和脂肪酸的異戊二烯生產(chǎn)。對 于圖70A，挑取11個(gè)來自用具有下游甲羥戊酸途徑的質(zhì)粒pMCMl 18轉(zhuǎn)化WW4的菌落來 驗(yàn)證下游途徑的存在。在含有0.1 %酵母提取物和2 %葡萄糖的TM3培養(yǎng)基中培養(yǎng)來自這 些菌落的細(xì)胞。在誘導(dǎo)4小時(shí)后檢測等份誘導(dǎo)培養(yǎng)物的異戊二烯生產(chǎn)。所有菌落都示出 了異戊二烯生產(chǎn)。誘導(dǎo)物IPTG具有強(qiáng)的生長抑制作用，這可見于由50至900uM濃度的 誘導(dǎo)物得到3至4.6倍降低的細(xì)胞密度(數(shù)據(jù)未示出)。該圖示出較高誘導(dǎo)，導(dǎo)致較高的 異戊二烯比滴定度。對于圖70B，生產(chǎn)培養(yǎng)物是由以1至10倍稀釋的沖洗后的過夜培養(yǎng) 物接種。培養(yǎng)物生長若干小時(shí)并用50UMIPTG誘導(dǎo)。左欄示出誘導(dǎo)4小時(shí)后緊接著1小 時(shí)異戊二烯累積檢測的異戊二烯檢測結(jié)果。中欄示出對于相同培養(yǎng)物用相同誘導(dǎo)時(shí)間， 但分析12小時(shí)異戊二烯積累檢測的1小時(shí)歸一化數(shù)值。右欄示出誘導(dǎo)1小時(shí)的培養(yǎng)物的 1小時(shí)異戊二烯累積檢測的數(shù)值。圖71是用于從野葛克隆異戊二烯合酶的大腸桿菌_鏈霉菌(Streptomyces)穿梭 載體pUWL201PW(6400bp)的圖譜。Tsr，硫鏈絲菌肽抗性基因。圖片取自Doumith等 人，Mol.Gen.Genet.264 477-485，2000。圖72示出由白色鏈霉菌(Streptomyces albus)野生型菌株(“wt” )和帶有質(zhì)粒 PUWL201PW (陰性對照)或pUWL201_iso(編碼來自野葛的異戊二烯合酶)的菌株的異 戊二烯形成。圖73A是馬氏甲烷八疊球菌古細(xì)菌的Lower Pathway操縱子的圖譜。圖73B和73C是馬氏甲烷八疊球菌古細(xì)菌的Lower Pathway操縱子的核苷酸序列 (SEQ ID NO 113)。圖74A是來自馬氏甲烷八疊球菌古細(xì)菌的Lowerin pET200D的MCM376-MVK圖譜。圖74B和74C是來自馬氏甲烷八疊球菌古細(xì)菌的Lowerin pET200D的 MCM376-MVK 的核苷酸序列(SEQ ID NO 114)。圖75A-75D示出相比于RM11608-2，EWL256的異戊二烯生產(chǎn)的生長和比生產(chǎn)力。白色菱形表示生長(OD550)；實(shí)心條表示異戊二烯的比生產(chǎn)力。χ-軸是以200(圖 75A和75B)或400(圖75C和75D)uMIPTG誘導(dǎo)后的時(shí)間(小時(shí))。Y_1軸是異戊二烯 的生產(chǎn)力(ug/L/OD/hr)而Y-2是波長為550處的光密度的任意單位。對于OD55tl的這 些數(shù)值必須乘以6.66以獲得培養(yǎng)物的實(shí)際OD。圖76 是質(zhì)粒 pBBRCMPGI1.5_pgl 的圖譜。圖77A 和 77B 是質(zhì)粒 pBBRCMPGI1.5_pgl 的核苷酸序列(SEQ ID NO 122)。圖78A-78F是由表達(dá)甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶、銀白楊異戊二烯合酶和 PgKRHMl 11608-2)并且在15L規(guī)模的補(bǔ)料分批培養(yǎng)中生長的大腸桿菌菌株的異戊二烯 生產(chǎn)的圖。圖78A示出在供料葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器中光密度的時(shí)間進(jìn)程。圖78B 示出在供料葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器中異戊二烯滴定度的時(shí)間進(jìn)程。滴定度定義為每升 發(fā)酵培養(yǎng)液生產(chǎn)的異戊二烯的量。計(jì)算異戊二烯的方法59hr中的累積異戊二烯生產(chǎn)， 在59hr時(shí)的g/發(fā)酵罐體積，L[ = ]g/L培養(yǎng)液。圖78C也示出在供料葡萄糖的15-L生 物反應(yīng)器中的異戊 二烯滴定度的時(shí)間進(jìn)程。計(jì)算異戊二烯的方法/ (瞬時(shí)異戊二烯 生產(chǎn)速率，g/L/hr)dt，t = O至59小時(shí)[=]g/L培養(yǎng)液。圖78D示出由供料葡萄糖的 15-L生物反應(yīng)器產(chǎn)生的總異戊二烯的時(shí)間進(jìn)程。圖78E示出在供料葡萄糖的15-L生物 反應(yīng)器內(nèi)的體積生產(chǎn)力。圖78F示出在供料葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器內(nèi)的二氧化碳進(jìn)化 率(CER)，或代謝活性譜。圖79A是質(zhì)粒pJ201 19813的圖譜。圖79B 和 79C 是 pJ201 19813 的核苷酸序列(SEQ ID NO 123)。發(fā)明詳細(xì)說明本發(fā)明表征了生產(chǎn)增加量的異戊二烯的組合物和方法。特別地，這些組合物和 方法增加異戊二烯生產(chǎn)力并且增加生產(chǎn)的異戊二烯的總量。例如，制造了產(chǎn)生4.8xl04 納摩爾/gwan/hr的異戊二烯的細(xì)胞培養(yǎng)體系(表1)。這些體系的效率被細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng) 基所消耗的 23.6摩爾％產(chǎn)率(10.7重量％產(chǎn)率)的碳轉(zhuǎn)化成異戊二烯(％碳產(chǎn)率)所闡 明。如實(shí)施例和表2所示，產(chǎn)生了每升培養(yǎng)液約60.5g異戊二烯。以1.88xl05nmol/OD/ hr(1.88xl05納摩爾/gwem/hr)的峰值比速率生產(chǎn)異戊二烯。如果需要，可以使用其他條 件，如在此所述的那些，獲得更大量的異戊二烯。在一些實(shí)施方式中，將可再生的碳源 用于異戊二烯的生產(chǎn)。本發(fā)明的組合物和方法是想要的，因?yàn)樗鼈冊试S每細(xì)胞的高異戊 二烯產(chǎn)率，允許高碳產(chǎn)率、高異戊二烯純度、高生產(chǎn)力、低能量利用、低生產(chǎn)成本和投 資、以及最小的副反應(yīng)。這一用于異戊二烯生產(chǎn)的有效、大規(guī)模、生物合成工藝為合成 異戊二烯類橡膠提供了異戊二烯來源，并且為使用天然橡膠提供了期望的低成本替代。如下面進(jìn)一步討論，可以通過向細(xì)胞導(dǎo)入編碼異戊二烯合酶多肽(例如植物異 戊二烯合酶多肽)的異源核酸來顯著增加由該細(xì)胞生產(chǎn)的異戊二烯量。異戊二烯合酶多 肽將二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)轉(zhuǎn)化成異戊二烯。如在實(shí)施例中所示，在諸如大腸 桿菌、檸檬泛菌、枯草桿菌、解脂耶氏酵母菌和里氏木霉的多種宿主細(xì)胞中表達(dá)異源葛 麻姆(Pueraria Montana)(野葛)或銀白楊(楊)異戊二烯合酶多肽。如也在實(shí)施例中所 示，在諸如大腸桿菌的宿主細(xì)胞中表達(dá)異源馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶(MVK)來增 加異戊二烯生產(chǎn)。所有這些細(xì)胞比沒有異源異戊二烯合酶多肽的相應(yīng)細(xì)胞生產(chǎn)出更多的 異戊二烯。如表1和2所示，使用在此所述的方法生產(chǎn)了大量的異戊二烯。例如，具有異源異戊二烯合酶核酸的枯草桿菌細(xì)胞在14升發(fā)酵罐中比沒有異源核酸的相應(yīng)對照枯草 桿菌細(xì)胞生產(chǎn)出高約10倍的異戊二烯(表2)。在發(fā)酵罐中由大腸桿菌生產(chǎn)出每升培養(yǎng) 液(mg/L，其中培養(yǎng)液的體積包括細(xì)胞培養(yǎng)基的體積和細(xì)胞的體積)60.5g異戊二烯而由 枯草桿菌生產(chǎn)的是30mg/L，這表明可以產(chǎn)生相當(dāng)量的異戊二烯(表2)。如果需要，可 以在更大規(guī)模生產(chǎn)異戊二烯或者可以使用在此所述的其他條件來進(jìn)一步增加異戊二烯的 量。在下面以及在實(shí)施例部分中進(jìn)一步詳述表1和2所列出的載體以及實(shí)驗(yàn)條件。表1:使用本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)物和方法，從搖瓶生產(chǎn)異戊二烯的示例性產(chǎn)率。 用于測量異戊二烯生產(chǎn)的檢測法描述于實(shí)施例I，第II部分。對于這一檢測法，在一或多 個(gè)時(shí)間點(diǎn)從搖瓶取出樣品并培養(yǎng)30分鐘。然后測量這一樣品中生產(chǎn)的異戊二烯量。表 1中列出了異戊二烯生產(chǎn)的頂空濃度和比速率，并且在此進(jìn)一步描述。
權(quán)利要求
1.培養(yǎng)的細(xì)胞，其產(chǎn)生大于約400納摩爾/gw。m/hr的異戊二烯。
2.培養(yǎng)的細(xì)胞，其具有大于約0.1mg/L±if#a/hr的異戊二烯平均體積生產(chǎn)力。
3.培養(yǎng)的細(xì)胞，其將細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)基中消耗的碳中大于約0.002摩爾百分?jǐn)?shù)的碳轉(zhuǎn) 化成異戊二烯。
4.培養(yǎng)的細(xì)胞，包括編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸，其中所述細(xì)胞ω產(chǎn)生大于 約400納摩爾/gw。m/hr的異戊二烯，(ii)將細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)基中消耗的碳中大于約0.002 摩爾百分?jǐn)?shù)的碳轉(zhuǎn)化成異戊二烯或Gii)具有大于約0.1mg/L#_/hr的異戊二烯平均體積 生產(chǎn)力。
5.培養(yǎng)的細(xì)胞，其包含編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸，其中該異源核酸有效連 接啟動子，并且其中所述細(xì)胞生產(chǎn)的異戊二烯大于約400納摩爾/gw。m/hr。
6.培養(yǎng)的細(xì)胞，其包含編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸，其中該異源核酸有效連 接啟動子，并且其中所述細(xì)胞具有大于約0.1mg/L±if#a/hr的異戊二烯平均體積生產(chǎn)力。
7.培養(yǎng)的細(xì)胞，其包含編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸，其中該異源核酸有效連 接啟動子，并且其中所述細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)基中消耗的碳中大于約0.002摩爾百分?jǐn)?shù)的碳被 轉(zhuǎn)化成異戊二烯。
8.權(quán)利要求1、4和5任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生大于約4.0X IO3納摩爾/gw。m/ hr的異戊二烯。
9.權(quán)利要求8的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生大于約4.0X IO4納摩爾/gw。m/hr的異戊二火布。
10.權(quán)利要求9的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生大于約1.5X IO5納摩爾/gw。m/hr的異戊二火布。
11.權(quán)利要求1、4和5任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞生產(chǎn)約400納摩爾/gw。m/hr至約 2.0 X IO5納摩爾/gw。m/hr的異戊二烯。
12.權(quán)利要求2、4和6任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞具有大于約100mg/L±iffW/hr的 異戊二烯平均體積生產(chǎn)力。
13.權(quán)利要求12的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞具有大于約l,000mg/L±iffW/hr的異戊二烯平 均體積生產(chǎn)力。
14.權(quán)利要求13的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞具有大于約l,500mg/L±iffW/hr的異戊二烯平 均體積生產(chǎn)力。
15.權(quán)利要求2、4和6任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞具有約0.1至約l,500mg/L±if#a /hr的異戊二烯平均體積生產(chǎn)力。
16.權(quán)利要求3、4和7任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞將大于約0.05摩爾百分?jǐn)?shù)的碳轉(zhuǎn) 化成異戊二烯。
17.權(quán)利要求16的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞將大于約1摩爾百分?jǐn)?shù)的碳轉(zhuǎn)化成異戊二烯。
18.權(quán)利要求17的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞將大于約10摩爾百分?jǐn)?shù)的碳轉(zhuǎn)化成異戊二火布。
19.權(quán)利要求18的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞將大于約20摩爾百分?jǐn)?shù)的碳轉(zhuǎn)化成異戊二火布。
20.權(quán)利要求3、4和7任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞將約0.002至約25摩爾百分?jǐn)?shù)的碳轉(zhuǎn)化成異戊二烯。
21.權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述異戊二烯合酶多肽是植物異戊二烯合酶多肽。
22.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的細(xì)胞，還包含編碼IDI多肽的異源核酸。
23.權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的細(xì)胞，還包含編碼IDI多肽的內(nèi)源核酸拷貝的插入。
24.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的細(xì)胞，還包含編碼DXS多肽的異源核酸。
25.權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的細(xì)胞，還包含編碼DXS多肽的內(nèi)源核酸拷貝的插入。
26.權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)的細(xì)胞，還包含編碼IDI多肽和DXS多肽的一種或多種 核酸。
27.權(quán)利要求26的細(xì)胞，其中一種核酸編碼異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。
28.權(quán)利要求27的細(xì)胞，其中一種質(zhì)粒編碼異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。
29.權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)的細(xì)胞，還包含編碼MVA途徑多肽的異源核酸。
30.權(quán)利要求29的細(xì)胞，其中所述MVA途徑多肽是甲羥戊酸激酶(MVK)。
31.權(quán)利要求30的細(xì)胞，其中所述MVK是來自甲烷八疊球菌屬的多肽。
32.權(quán)利要求31的細(xì)胞，其中所述MVK是來自馬氏甲烷八疊球菌的多肽。
33.權(quán)利要求4-32中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述異戊二烯合酶多肽是來自葛屬的天然發(fā) 生的多肽。
34.權(quán)利要求33的細(xì)胞，其中所述異戊二烯合酶多肽是來自葛麻姆的天然發(fā)生的多肽。
35.權(quán)利要求4-32中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述異戊二烯合酶多肽是來自楊屬的天然發(fā) 生的多肽。
36.權(quán)利要求35的細(xì)胞，其中所述異戊二烯合酶多肽是來自銀白楊的天然發(fā)生的多肽。
37.權(quán)利要求35和36中任一項(xiàng)的細(xì)胞，還包含編碼MVA途徑多肽的異源核酸。
38.權(quán)利要求37的細(xì)胞，其中所述MVK是來自甲烷八疊球菌屬的多肽。
39.權(quán)利要求38的細(xì)胞，其中所述MVK是來自馬氏甲烷八疊球菌的多肽。
40.權(quán)利要求1-39中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
41.權(quán)利要求40的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞。
42.權(quán)利要求41的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是芽孢桿菌屬細(xì)胞。
43.權(quán)利要求42的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是枯草桿菌細(xì)胞。
44.權(quán)利要求40的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。
45.權(quán)利要求44的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是埃希氏菌屬或泛菌屬細(xì)胞。
46.權(quán)利要求45的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是大腸桿菌或檸檬泛菌細(xì)胞。
47.權(quán)利要求1-39中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真菌細(xì)胞。
48.權(quán)利要求47的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是木霉屬細(xì)胞。
49.權(quán)利要求48的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是里氏木霉細(xì)胞。
50.權(quán)利要求47的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
51.權(quán)利要求50的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是耶氏酵母屬細(xì)胞。
52.權(quán)利要求51的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是解脂耶氏酵母細(xì)胞。
53.一種生產(chǎn)異戊二烯的方法，該方法包括在足以生產(chǎn)大于約400納摩爾/gw。m/hr的 異戊二烯的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。
54.一種生產(chǎn)異戊二烯的方法，該方法包括在使得異戊二烯平均體積生產(chǎn)力大于約 0.1mg/L培_/hr的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。
55.一種生產(chǎn)異戊二烯的方法，該方法包括在足以將細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)基中消耗的碳中 大于約0.002摩爾百分?jǐn)?shù)的碳轉(zhuǎn)化成異戊二烯的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。
56.一種生產(chǎn)異戊二烯的方法，該方法包括培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼異戊二烯合 酶多肽的異源核酸，其中該異源核酸有效連接啟動子，并且其中所述細(xì)胞生產(chǎn)的異戊二 烯大于約400納摩爾/gw。m/hr。
57.—種生產(chǎn)異戊二烯的方法，該方法包括培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼異戊二烯 合酶多肽的異源核酸，其中該異源核酸有效連接啟動子，并且其中所述細(xì)胞具有大于約 0.1mg/L±if#a/hr的異戊二烯平均體積生產(chǎn)力。
58.一種生產(chǎn)異戊二烯的方法，該方法包括培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼異戊二烯合 酶多肽的異源核酸，其中該異源核酸有效連接啟動子，并且其中所述細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)基 中消耗的碳中大于約0.002摩爾百分?jǐn)?shù)的碳被轉(zhuǎn)化成異戊二烯。
59.一種生產(chǎn)異戊二烯的方法，該方法包括(a)在適于生產(chǎn)異戊二烯的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼異戊二烯合酶多 肽的異源核酸，其中所述細(xì)胞G)產(chǎn)生大于約400納摩爾/gw。m/hr的異戊二烯；(ii)將細(xì) 胞從細(xì)胞培養(yǎng)基中消耗的碳中大于約0.002摩爾百分?jǐn)?shù)的碳轉(zhuǎn)化成異戊二烯，或(iii)具有 大于約0.1mg/L±if#a/hr異戊二烯的平均體積生產(chǎn)力，和(b)生產(chǎn)異戊二烯。
60.權(quán)利要求53、56和59中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生大于約4.0X IO3納摩 爾/gw。m/hr的異戊二烯。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生大于約4.0X IO4納摩爾/gw。m/hr的異戊二火布。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生大于約1.5X IO5納摩爾/gwem/hr的異戊二火布。
63.權(quán)利要求53、56和59任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生約400納摩爾/gwem/hr 至約2.0 X IO5納摩爾/gwem/hr的異戊二烯。
64.權(quán)利要求54、57和59任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞具有大于約100mg/L培#a/hr 的異戊二烯平均體積生產(chǎn)力。
65.權(quán)利要求64的方法，其中所述細(xì)胞具有大于約l,000mg/L#_/hr的異戊二烯平 均體積生產(chǎn)力。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述細(xì)胞具有大于約l,500mg/L±iffW/hr的異戊二烯平 均體積生產(chǎn)力。
67.權(quán)利要求54、57和59任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞具有約0.1至約l,500mg/L培 tw/hr的異戊二烯平均體積生產(chǎn)力。
68.權(quán)利要求55、58和59任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞將大于約0.05摩爾百分?jǐn)?shù)的 碳轉(zhuǎn)化成異戊二烯。
69.權(quán)利要求68的方法，其中所述細(xì)胞將大于約1摩爾百分?jǐn)?shù)的碳轉(zhuǎn)化成異戊二烯。
70.權(quán)利要求69的方法，其中所述細(xì)胞將大于約10摩爾百分?jǐn)?shù)的碳轉(zhuǎn)化成異戊二火布。
71.權(quán)利要求70的方法，其中所述細(xì)胞將大于約20摩爾百分?jǐn)?shù)的碳轉(zhuǎn)化成異戊二火布。
72.權(quán)利要求55、58和59任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞將約0.002至約25摩爾百分 數(shù)的碳轉(zhuǎn)化成異戊二烯。
73.權(quán)利要求53-72中任一項(xiàng)的方法，還包括回收所述細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯。
74.權(quán)利要求56-73中任一項(xiàng)的方法，其中所述異戊二烯合酶多肽是植物異戊二烯合 酶多肽。
75.權(quán)利要求53-74中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞還包含編碼IDI多肽的異源核酸。
76.權(quán)利要求53-75中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞還包含編碼IDI多肽的內(nèi)源核酸 拷貝的插入。
77.權(quán)利要求53-76中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞還包含編碼DXS多肽的異源核酸。
78.權(quán)利要求53-77中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞還包含編碼DXS多肽的內(nèi)源核酸 拷貝的插入。
79.權(quán)利要求53-78中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞還包含編碼IDI多肽和DXS多肽 的一種或多種核酸。
80.權(quán)利要求79的方法，其中一種核酸編碼異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。
81.權(quán)利要求80的方法，其中一種質(zhì)粒編碼異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。
82.權(quán)利要求53-81中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞還包含編碼MVA途徑多肽的異源核酸。
83.權(quán)利要求82的細(xì)胞，其中所述MVA途徑多肽是甲羥戊酸激酶(MVK)。
84.權(quán)利要求83的細(xì)胞，其中所述MVK是來自甲烷八疊球菌屬的多肽。
85.權(quán)利要求84的細(xì)胞，其中所述MVK是來自馬氏甲烷八疊球菌的多肽。
86.權(quán)利要求56-85中任一項(xiàng)的方法，其中所述異戊二烯合酶多肽是來自葛屬的天然 發(fā)生的多肽。
87.權(quán)利要求86的方法，其中所述異戊二烯合酶多肽是來自葛麻姆的天然發(fā)生的多肽。
88.權(quán)利要求56-85中任一項(xiàng)的方法，其中所述異戊二烯合酶多肽是來自楊屬的天然 發(fā)生的多肽。
89.權(quán)利要求88的方法，其中所述異戊二烯合酶多肽是來自銀白楊的天然發(fā)生的多肽。
90.權(quán)利要求88和89中任一項(xiàng)的方法，還包括編碼MVA途徑多肽的異源核酸。
91.權(quán)利要求90的細(xì)胞，其中所述MVK是來自甲烷八疊球菌屬的多肽。
92.權(quán)利要求91的細(xì)胞，其中所述MVK是來自馬氏甲烷八疊球菌的多肽。
93.權(quán)利要求53-92中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
94.權(quán)利要求93的方法，其中所述細(xì)胞是革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞。
95.權(quán)利要求94的方法，其中所述細(xì)胞是芽孢桿菌屬細(xì)胞。
96.權(quán)利要求95的方法，其中所述細(xì)胞是枯草桿菌細(xì)胞。
97.權(quán)利要求93的方法，其中所述細(xì)胞是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。
98.權(quán)利要求97的方法，其中所述細(xì)胞是埃希氏菌屬或泛菌屬細(xì)胞。
99.權(quán)利要求98的方法，其中所述細(xì)胞是大腸桿菌或檸檬泛菌細(xì)胞。
100.權(quán)利要求53-92中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是真菌細(xì)胞。
101.權(quán)利要求100的方法，其中所述細(xì)胞是木霉屬細(xì)胞。
102.權(quán)利要求100的方法，其中所述細(xì)胞是里氏木霉細(xì)胞。
103.權(quán)利要求100的方法，其中所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
104.權(quán)利要求103的方法，其中所述細(xì)胞是耶氏酵母屬細(xì)胞。
105.權(quán)利要求104的方法，其中所述細(xì)胞是解脂耶氏酵母細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明描述了從培養(yǎng)的細(xì)胞生產(chǎn)異戊二烯的方法。本發(fā)明也提供了包含這些培養(yǎng)的細(xì)胞的組合物。
文檔編號C12P5/02GK102027124SQ200880126504
公開日2011年4月20日 申請日期2008年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月13日
發(fā)明者A·S·普哈拉, A·尼爾森, A·米亞斯尼科夫, C·佩雷斯, F·J·費(fèi)赫爾, F·瓦耳, G·K·肖塔尼, G·M·懷特德, J·C·麥考利夫, K·J·桑福德, M·塞爾溫, M·米勒, R·J·拉杜卡, Z·貝克 申請人:丹尼斯科美國公司, 固特異輪胎和橡膠公司