專利名稱：適于表達(dá)用于基因治療的編碼序列的表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于基因治療的表達(dá)載體，更特別地涉及包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(順式調(diào) 控元件或者反式作用元件)新組合的用于基因治療的表達(dá)載體，其包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi) 含子、非翻譯區(qū)(UTR)和基因座控制區(qū)(locus control region, LCR)，所述載體能夠支持 靶基因在肝中以高水平持續(xù)表達(dá)。
背景技術(shù)：
肝的功能包括血液儲(chǔ)存、糖轉(zhuǎn)換和分泌多種細(xì)胞因子，以及表達(dá)影響許多疾病 (如遺傳的、心血管的、代謝的、血液的和癌性疾病)的基因。已將多種肝特異性疾病(如感 染性肝炎)作為基因治療的靶標(biāo)進(jìn)行了研究。肝細(xì)胞在形成后擁有很長的壽命，具有大多數(shù)病毒基因轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的受體而且直接 與血流相連，使其易于接觸藥物，因此肝被認(rèn)為是基因治療的重要候選器官。血友病是一種由位于X染色體上的因子VIII(FVIII、f8)或因子IX (FIX、f9)基因 的缺陷所引起的退行性出血疾病，依據(jù)突變或缺失的基因?qū)⑵浞殖裳巡(FVIII缺陷) 或B (FIX缺陷)。對(duì)用于治療血友病A或B的藥物，只有當(dāng)FVIII或FIX以其正常血液濃度 的1-5% (分別為100-200ng/ml和500ng/ml)或更高水平持續(xù)表達(dá)時(shí)，治療效果才是可預(yù) 期的。在最近的血友病B基因治療研究中，已報(bào)道的是，將帶有人FIX(hFIX)基因的腺相 關(guān)病毒(AAV)引入血友病B小鼠模型中導(dǎo)致hFIX蛋白以高達(dá)1，500-1，800ng/ml的水平表 達(dá)(Snyder，R. 0.，Nat. Med.，5 :64_70 (1999) ；Manno, C. S.，Nat. Med.，12 :342_347 (2006))， 而在血友病B的狗模型中以高達(dá)730ng/ml的水平表達(dá)hFIX蛋白(Arruda，V. R.，Blood, 105 =3458-3464(2005)) 0然而，當(dāng)將這種在動(dòng)物模型中高效表達(dá)的載體臨床應(yīng)用于人患者 時(shí)，F(xiàn)IX的血液濃度僅為185ng/ml或更低，這低于有效臨床治療的閾值(500ng/ml)，另外的 難題是在人受試者中的hFIX表達(dá)水平不是持續(xù)的而是瞬時(shí)的(Kay，M.A. ,Nat. Genet. ,24 257-261 (2000) ；Manno，C. S. ,Nat. Med.，12 342-347 (2006)) 在血友病 A 的治療模型中發(fā) 現(xiàn)了與上述相似的趨勢。針對(duì)遺傳疾病(如血友病)治療的臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，首要條件是開發(fā)能夠保持 在特定組織(如肝組織)中持續(xù)高水平表達(dá)治療基因的高效組織特異性表達(dá)載體。此外， 逃脫針對(duì)載體的體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答以及誘導(dǎo)對(duì)所表達(dá)蛋白的免疫耐受被認(rèn)為是成功的 基因治療的關(guān)鍵因素。例如，為了將正常FVIII或FIX的表達(dá)水平提高到有效用于成功的 臨床治療的閾值，還必須考慮的是，注射高劑量的帶有FVIII或FIX基因的病毒并且抑制體 內(nèi)的免疫應(yīng)答。然而為使這種方法獲得成功，首先要通過改進(jìn)表達(dá)載體來提高基因表達(dá)的 效率。僅在肝中產(chǎn)生的脂蛋白(a)是用于肝組織特異性表達(dá)載體開發(fā)的另一個(gè)重要靶 標(biāo)。脂蛋白(a)是通過載脂蛋白(a)(—種糖蛋白)與apo B_100(低密度脂蛋白(LDL) 的主要蛋白質(zhì)組分)結(jié)合而形成的(Fless，G.M.，J. Biol. Chem.，261 :8712_8717 (1986))。
4載脂蛋白(a)負(fù)責(zé)膽固醇的體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，已報(bào)道血漿中脂蛋白(a)濃度的提高是動(dòng)脈硬化 和心臟病的主要風(fēng)險(xiǎn)因子(Armstrong, V. W.等，Arteriosclerosis, 62 :249_257 (1986)； Assmann, G.，Am. J. Cardiol. ,77 :1179_1184(1996))。載脂蛋白(a)含有與纖維蛋白溶酶 原kringle IV和V相似的兩類kringle結(jié)構(gòu)域，以及無活性的蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域。眾所周 知的是，具有kringle結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)可抑制腫瘤的新血管形成及轉(zhuǎn)移(Folkman J.，N Eng J Med,285 1182-1186(1971) ；Falkman J, Klagsbrun M.，Science,235 442-447(1987)； Scapaticci FA.，J Clin Oncol. ,20 =3906-3927 (2002)) 最近，本發(fā)明人及其他研究者發(fā) 現(xiàn)，載脂蛋白(a)的kringle結(jié)構(gòu)域由于其顯著的抗血管發(fā)生活性而具有抗癌和抗轉(zhuǎn)移活 性(Sculter V等，Arterioscler Thromb Vasc Biol,21 433-438(2001) ；Trieu UN和Uckun FM.，Biochem Biophys Res Commun.，257 :714_718(1999) ；Kim JS 等，J. Biol Chem.，278 29000-29008(2003) ；Yu HK 等，Cancer Res.，64 :7092_7098 (2004) ；Kim JS 等，Biochem Biophys Res Commun.，313 534-540(2004) ；Lee K等，H印atology，43 :1063_1073(2006))。在抗轉(zhuǎn)移和抗癌治療中，公認(rèn)的是，選擇性作用在患病位點(diǎn)上的治療方式會(huì)更有 效。因此，開發(fā)用于抗癌治療(例如用于對(duì)肝癌或者轉(zhuǎn)移肝腫瘤的有效基因治療)的能組 織特異性地持續(xù)進(jìn)行基因表達(dá)的載體非常重要。如上所述，持續(xù)的組織特異性基因表達(dá)是有效基因治療的關(guān)鍵，這需要開發(fā)新的 改良表達(dá)載體。這可通過改進(jìn)這種表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(順式調(diào)控元件或反式作用元 件)來實(shí)現(xiàn)。常用轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的實(shí)例包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、非編碼區(qū)、基因座控制區(qū)寸寸。在這種肝組織特異性表達(dá)的表達(dá)載體中所使用的是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPCK，為糖原異生酶)(Yang, Y. W.，J.等，Gene Med. ,5(5) :417_424 (2003))、α 1-抗胰 蛋白酶、白蛋白、FVII、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽C(OATP-C)、乙型肝炎病毒核心蛋白(Kramer， M.G.，等，Mol. Ther. ,7(3) :375_385 (2003))和甲狀腺素結(jié)合球蛋白(Wang，L.，等，Proc. Natl. Acad. Sci.，96 :3906_3910 (1999))的啟動(dòng)子；以及白蛋白(Kang, Y.，等，Blood, 106 (5) 1552-1558 (2005))、苯丙氨酸羥化酶(PAH)和α 1-微球蛋白/尿抑胰酶素 (bikunin)前體(AMBP) (Wang, L.，等·，Mol. Ther.，1 (2) 154-158 (2000))的增強(qiáng)子。由于與肝中所富含的HNF_4(肝細(xì)胞核因子-4)結(jié)合，F(xiàn)VII啟動(dòng)子(大小約為 500bp)在肝中的轉(zhuǎn)錄活化水平是其他組織中的10倍或更高。已報(bào)道的是，大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子 主要結(jié)合在 FVII 啟動(dòng)子 3，端的 300bp 片段上(Greenberg,D.，等，Proc. Natl. Acad. Sci.， 92:12347-12351 (1995))。當(dāng)截短FVII啟動(dòng)子(大小為501bp)5，端的315bp片段時(shí)，啟 動(dòng)子的肝特異性活性提高約30%，但當(dāng)截短210bp片段時(shí)活性降低大約20-30% (Pollak, W. S.，等，J.Biol. Chem. ,271 (3) :1738_1747 (1996))。由于與肝中所富含的HNF-I α結(jié)合，有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽C(OATP-C)的啟動(dòng)子 (大小約為900bp)在肝中的轉(zhuǎn)錄活化水平是其他組織中的3倍或更高。已報(bào)道的是， 大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在啟動(dòng)子3’端的440bp片段上(Jung，D.，等，J. Biol. Chem.，276 37206-37214(2001))?？赏ㄟ^增強(qiáng)子的作用增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性。苯丙氨酸羥化酶(PAH)增強(qiáng)子(大小約 為230bp，并具有HNF-I結(jié)合位點(diǎn))位于PAH基因5’端上游-3. 5kb。已報(bào)道的是，由于存
5在肝富含的HNF-I的結(jié)合位點(diǎn)，PAH增強(qiáng)子使其所結(jié)合的啟動(dòng)子的活性提高為4倍或更高 (Lei, X. D.，等，Proc. Natl. Acad. Sci. ,95 :1500_1504(1998))。AMBP ( α 1-微球蛋白/尿抑胰酶素前體)增強(qiáng)子大小約為400bp，其從AMBP基因 5，端的-2945bp延伸到-2539bp。它主要包括HNF_1、2、3和4的結(jié)合位點(diǎn)，它的主要活性 區(qū)域?qū)?yīng)于其-2802 到-2659bp 的片段(Route, P.，等，Biochem. J.，334 :577_584 (1998))。 已報(bào)道的是，AMBP增強(qiáng)子一般使啟動(dòng)子活性提高為兩倍或三倍。位于基因5’和3’端的非翻譯區(qū)(UTR)負(fù)責(zé)基因mRNA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定(Holcik，Μ.， Liebhaber S. A. , Proc NatlAcad Sci USA.，94 :2410_2414 (1997) ；Chkheidze，A. N.，等， Mol Cell Biol. ,19 =4572-4581 (1999)) 0已報(bào)道的是，3，UTR中的多腺苷酸化信號(hào)序列也 明顯有助于 mRNA 的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定(Kolev, N. G.，等，Genes Dev.，19 :2583_2592 (2005))。真核基因包括外顯子(被翻譯成蛋白質(zhì))和內(nèi)含子(在外顯子之間的非翻譯序 列)。通過剪接去除這些內(nèi)含子，使由DNA首先轉(zhuǎn)錄得到的mRNA前體轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓膍RNA。 這些內(nèi)含子包括以GT(U)開始的剪接供體和以AG結(jié)尾的剪接受體。此外，出現(xiàn)在內(nèi)含子3’ 端的是多聚嘧啶片段、剪接因子、snRNP結(jié)合分支序列、三鳥嘌呤重復(fù)序列(3重G基序)等， 它們?cè)谛纬杉艚芋w(RNA與內(nèi)含子剪接酶的復(fù)合物)的過程中起關(guān)鍵作用(Pagani，F(xiàn).，等， Nat. Rev. Genet.，5 :389_396 (2004))。當(dāng)與啟動(dòng)子和增強(qiáng)子組合時(shí)，內(nèi)含子可作為用于持續(xù)高效基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元 件。內(nèi)含子通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而參與提高基因表達(dá)效率和轉(zhuǎn)錄效率(Liu，K.，等，Proc. Natl. Acad. Sci.，92 :7724_7728 (1995) ；LeBlanc, S. E.，等，J. Biol. Chem.，(2005))，還 參與提高轉(zhuǎn)錄后的蛋白質(zhì)翻譯效率(Moore, M.J.，Cell, 108 :431_434 (2002))。已報(bào)道 的是，hFIX的內(nèi)含子1引起hFIX蛋白表達(dá)的增加(Kurachi, S.，等，J. Biol. Chem.，270 5276-5281(1995)).抗凝血蛋白(如抗凝血酶和纖維蛋白溶酶原)和凝血因子(如凝血酶原)都在 肝中表達(dá)。通過分析這些蛋白為缺陷型的血栓形成或血友病患者的基因內(nèi)含子，發(fā)現(xiàn)了 多種錯(cuò)義突變和/或無義突變，這提示這些蛋白質(zhì)的內(nèi)含子對(duì)肝中的基因表達(dá)起關(guān)鍵作用 (Jochmans, K.，等，Blood, 84 :3742_3748 (1994))。已發(fā)現(xiàn)在至少36種哺乳動(dòng)物(包括人、大鼠、兔、山羊等等)中存在基因座控制區(qū) (LCR)。LCR是含有DNase I敏感區(qū)(其對(duì)轉(zhuǎn)錄因子具有組織特異性)的核苷酸序列。人 β -珠蛋白 LCR 的功能是眾所周知的(Harju S.等，Exp. Biol. Med. 227 :683_700 (2002))。肝細(xì)胞控制區(qū)(h印atocyte control region, HCR)因其增強(qiáng)肝特異性基因表達(dá)的 能力而眾所周知，該區(qū)發(fā)現(xiàn)于載脂蛋白E(ApoE)基因的下游。HCR具有與肝特異性轉(zhuǎn)錄因子 結(jié)合的DNase I敏感區(qū)域。HCR作為ApoE基因的肝特異性表達(dá)的LCR。ApoE HCR具有在與 多種因子(如HNF3a、HNF4、GATA-1、C/EBP、TF-LF2和Alu家族)結(jié)合時(shí)被活化的位點(diǎn)。在 這些位點(diǎn)中，表現(xiàn)出DNase I超敏感性的HNF3 α結(jié)合位點(diǎn)具有TGTTTGC基序，DNase I可切 開第一個(gè) G 和第二個(gè) T 之間的連接(Dang Q.，等，J. Biol. Chem. 270 =22577-22585 (1995)) 事實(shí)上，已報(bào)道了向表達(dá)載體中引入ApoE HCR導(dǎo)致動(dòng)物模型中hFIX表達(dá)提高(Miao C. H.， 等.，Mol. Ther. 1 :522_532(2000))。已報(bào)道了具有與人ApoE基因的HCR(包含TGTTTGC基序)、人的載脂蛋白A_I、載 脂蛋白B、轉(zhuǎn)鐵蛋白、甲胎蛋白、α 1-抗胰蛋白酶等、以及小鼠中的甲胎蛋白、白蛋白等相似·，J. Biol. Chem. 270 :22577-22585(1995))。發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供可用作轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的多核苷酸，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控 元件用于以高水平持續(xù)表達(dá)肝組織特異性基因。本發(fā)明的另一目的是提供用于以高水平持續(xù)表達(dá)肝組織特異性基因的表達(dá)載體。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供多核苷酸，其包含具有SEQ ID NO :42之核苷酸序 列的多核苷酸以及與SEQ ID NO :42之多核苷酸有效連接的至少一個(gè)多核苷酸，后者選自具 有SEQ ID NO 44和45之核苷酸序列的多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供多核苷酸，其選自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸 序列的多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供多核苷酸，其選自具有SEQ ID NO :58到61之核苷酸 序列的多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供表達(dá)載體，其包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和與所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控 元件有效連接并受其控制的編碼序列，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包括1)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；2)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸以及與SEQ ID NO 42之多核苷 酸有效連接的至少一個(gè)多核苷酸，后者選自具有SEQ IDNO :44和45之核苷酸序列的多核苷 酸；3)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸以及與SEQ ID NO 42之多核苷 酸有效連接的至少一個(gè)多核苷酸，后者選自具有SEQ IDNO :46到57之核苷酸序列的多核苷 酸；4)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸以及與SEQ ID NO 42之多核苷 酸有效連接的至少一個(gè)多核苷酸，后者選自具有SEQ IDNO :58到61之核苷酸序列的多核苷 酸；5)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO 44和45之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸 序列的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接；6)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO 44和45之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸 序列的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接；7)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO 46到57之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸 序列的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接；或者8)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO 44和45之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸；選自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸序列 的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸序列的多核 苷酸的至少一個(gè)多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供表達(dá)載體，其包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和與所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控
7元件有效連接并受其控制的編碼序列，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包含啟動(dòng)子和與所述啟動(dòng)子有效 連接的多核苷酸，所述多核苷酸選自選自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸序列的多核 苷酸的至少一個(gè)多核苷酸；選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少 一個(gè)多核苷酸；以及與選自具有SEQ ID NO 58到61核苷酸序列之多核苷酸的至少一個(gè)多 核苷酸有效連接的選自具有SEQ ID NO :46到57核苷酸序列之多核苷酸的至少一個(gè)多核苷 酸。附圖簡述通過對(duì)本發(fā)明的下述描述結(jié)合下述附圖，本發(fā)明上述的和其他的目的和特征將變 得顯而易見，所述附圖分別顯示圖IA 包含F(xiàn)VII啟動(dòng)子的pCR-FVII Pro質(zhì)粒、包含有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽 C(OATP-C)啟動(dòng)子的pCR-OATP-C Pro質(zhì)粒和包含α-抗胰蛋白酶(AAT)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的 pCR-AAT Enh/Pro質(zhì)粒的示意圖；圖 IB :mRLuc 螢光素酶表達(dá)載體 pmRL-FVII Pro、pmRL_FVII Δ Pro 和 pmRL-OATP-C Pro的示意圖，其分別含有FVII啟動(dòng)子、截短的FVII (FVIIA)啟動(dòng)子和OATP-C啟動(dòng)子；圖2A:直方圖，其顯示FVII啟動(dòng)子和OATP-C啟動(dòng)子在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系 (HUVEC)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系(Huh-7)、人腎細(xì)胞系(HEK293)、人肺腺癌上皮細(xì)胞系(A549) 和人宮頸癌細(xì)胞系(HeLa)中的表達(dá)效率；圖2B 含有FVII啟動(dòng)子和FVII Δ啟動(dòng)子的螢光素酶表達(dá)盒的示意圖，以及比較 所述啟動(dòng)子表達(dá)效率的直方圖；圖2C 直方圖，其通過與CMV啟動(dòng)子比較的方式顯示FVII Δ啟動(dòng)子、OATP-C啟動(dòng) 子、乙型肝炎病毒核心蛋白(HBcP)啟動(dòng)子、內(nèi)皮糖蛋白(Endoglin)啟動(dòng)子、細(xì)胞粘附分子 (ICAM2)啟動(dòng)子和酪氨酸激酶受體(Tie2)啟動(dòng)子的表達(dá)效率；圖3A :pCR-PAH enh和pCR-AMBP enh質(zhì)粒的示意圖，其分別含有苯丙氨酸羥化酶 (PAH)增強(qiáng)子和α 1-微球蛋白/尿抑胰酶素前體(AMBP)增強(qiáng)子；圖 3Β :pmRL-PF、pmRL-AF、pmRL-PAF、pmRL-P0、pmRL-A0 和 pmRL-PAO 表達(dá)載體的示 意圖，其通過向含有FVII Δ啟動(dòng)子的pmRL-FVII Δ Pro表達(dá)載體或者含有OATP-C啟動(dòng)子的 pmRL-OATP-CPro表達(dá)載體中插入選自PAH增強(qiáng)子和AMBP增強(qiáng)子中的至少一種構(gòu)建而成；圖4A 直方圖，其顯示根據(jù)PAH增強(qiáng)子和AMBP增強(qiáng)子與FVIIA、0ATP-C、Tie_2和 ICAM2啟動(dòng)子組合方式的不同，在A549、HeLa和Huh_7中的體外螢光素酶表達(dá)水平；圖4B 直方圖，其通過與CMV啟動(dòng)子比較的方式顯示當(dāng)AMBP增強(qiáng)子與FVII啟動(dòng) 子組合時(shí)在HEK293、A549、HeLa、Huh-7、人肝癌細(xì)胞系0fep3B)和HUVEC中螢光素酶表達(dá)效 率；圖4C 直方圖，其顯示在將每種表達(dá)載體與聚乙烯亞胺(PEI)或體內(nèi)jetPEI的混 合物注射入小鼠尾靜脈之后，帶有表達(dá)盒的表達(dá)載體在肝組織中的螢光素酶表達(dá)效率，所 述表達(dá)盒含有PAH增強(qiáng)子、AMBP增強(qiáng)子、CMV增強(qiáng)子和SV40增強(qiáng)子以及圖4A中顯示的啟動(dòng) 子；圖5 不含有UTR的hFIX表達(dá)質(zhì)粒(FIX)和含有UTR的hFIX表達(dá)質(zhì)粒(FIXUTR) ((a))以及含有多種內(nèi)含子的FIXUTR質(zhì)粒((b)、(c)和(d))的示意圖(SD，剪接供體；SA， 剪接受體；(G)3,三鳥嘌呤基序；BS，分支序列)；
圖6A =ELISA結(jié)果，其顯示從小鼠中獲得的血漿樣品中的hFIX蛋白表達(dá)水平，所 述小鼠通過尾靜脈注射 了帶有 CMV-hFIXUTR-Synlint、CMV_hFIXUTR-Syn2int、CMV-hFIX 和 CMV-hFIXUTR表達(dá)盒的表達(dá)載體；圖6B =ELISA結(jié)果，其顯示在每周從免疫缺陷型小鼠獲得的血漿樣品中的hFIX蛋 白表達(dá)水平，所述小鼠中注射了帶有CMV-hFIXUTR-Synlint表達(dá)盒的重組腺相關(guān)病毒的 1XIO9個(gè)感染性顆粒(IP)；圖7A 螢光素酶表達(dá)盒的示意圖，所述表達(dá)盒在受TK啟動(dòng)子控制的RLuc螢光素 酶基因中含有內(nèi)含子；圖7B:直方圖，其顯示在用帶有表達(dá)盒(其含有圖7A中多種內(nèi)含子)的表達(dá)載體 轉(zhuǎn)染的H印3B、HEK293和A549細(xì)胞中的螢光素酶表達(dá)水平；圖8A 逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)結(jié)果，其顯示在總RNA (從用圖7B表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的A549 細(xì)胞中提取)中RLuc和β -肌動(dòng)蛋白的mRNA表達(dá)水平；圖8B:直方圖，其顯示用β-肌動(dòng)蛋白對(duì)圖8A中所獲得的RLuc和β-肌動(dòng)蛋白 mRNA條帶強(qiáng)度進(jìn)行歸一化的RLuc mRNA表達(dá)水平；圖9A =ELISA結(jié)果，其顯示從小鼠中獲得的血漿樣品中的hFIX蛋白表達(dá)水平，所述 小鼠通過尾靜脈注射了帶有 CMV-hFIXUTR-SynlAT、CMV-hFIXUTR-Syn2AT、CMV-hFIXUTR-NA、 CMV-hFIXUTR-ANAL、CMV-hFIXUTR-ΔNAS 表達(dá)盒以及作為對(duì)照帶有 CMV-hFIXUTR-0. 3kbFI Xint (CMV-hFIXm2)表達(dá)盒(含0. 3kb FIX內(nèi)含子)的表達(dá)載體；圖9B =Western印跡分析結(jié)果，其顯示在用帶有CMV-hFIX、CMV-hFIXUTR和 CMV-hFIXUTR- Δ NAL表達(dá)盒的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的ΗΕΚ293Τ中的hFIX蛋白表達(dá)水平；

圖10 示意圖，其顯示甲胎蛋白、AAT和白蛋白基因的5’端側(cè)翼區(qū)中，與在Apo E 基因的LCR中所發(fā)現(xiàn)TGTTTGC基序相同或相似的基序的分布；圖IlA :pCR-HCR和pCR-HCRm質(zhì)粒(分別含有HCR(已知為Apo E基因的肝細(xì)胞 控制區(qū))和HCRm (已知為截短TGTTTGC基序的最小HCR結(jié)構(gòu)))以及pCR_AAT78001 cr/ pCR-AAT1081cr、pCR-AFP38001cr和pCR_E61cr質(zhì)粒(分別含有甲胎蛋白、AAT和白蛋白的 TGTTTGC基序)的示意圖；圖 IlB :pBS-HCRm-AATenh/pro (HmA)質(zhì)粒(通過向 pBluescriptll 載體中插 入HCRm、AAT增強(qiáng)子和AAT啟動(dòng)子構(gòu)建而成)和pBS-HCR-AATpro (HA)質(zhì)粒(通過向 pBluescript II載體中插入HCR和AAT啟動(dòng)子構(gòu)建而成)的示意圖；圖12A:表達(dá)盒的示意圖，其通過向含有PAH增強(qiáng)子、FVIIA啟動(dòng)子和內(nèi)含子 SynlPLA 的 hFIX 表達(dá)盒中引入多種 LCR (HCR、HCRm、AFP3800、AAT7800、AAT108 和 E6)而獲 得；圖12B =ELISA結(jié)果，其顯示從小鼠中獲得的血漿樣品中hFIX蛋白表達(dá)水平，所述 小鼠通過尾靜脈注射了帶有圖12A表達(dá)盒的表達(dá)載體和CMV-hFIXUTR-SynlPLA表達(dá)載體；圖13A 示意圖，其顯示含有PAH增強(qiáng)子與FVII Δ啟動(dòng)子(PF)的組合或者PAH增 強(qiáng)子、AMBP增強(qiáng)子與FVII Δ啟動(dòng)子(PAF)的組合、NAL內(nèi)含子以及AAT108LCR的表達(dá)盒； HmA (HCRm-AATenh/pro) -hFIXUTR- Δ NAL 表達(dá)盒；以及 HA (HCR-AATpro) -hFIXUTR-1. 4kbFIX int表達(dá)盒；圖13B =ELISA結(jié)果，其顯示從小鼠中獲得的血漿樣品中hFIX蛋白表達(dá)水平，所述
9小鼠通過尾靜脈注射了帶有圖13A表達(dá)盒的表達(dá)載體以及CMV-hFIXUTR-ANAL表達(dá)載體；圖13C和13D:使用圖13B中獲得的血漿樣品，通過活化部分凝血活酶時(shí)間 (activated partial thromboplastin time, APTT)方法所測得的凝血時(shí)間和活性；圖14A和14B 分別顯示從血友病B小鼠中獲得的血漿樣品中的hFIX蛋白表達(dá)水 平(通過ELISA測量)和凝血活性(通過APTT方法測量)的結(jié)果，所述小鼠通過門靜脈施 用 了帶有 AAT108-PF-hFIXUTR- Δ NAL 和 AAT108-PAF_hFIXUTR- Δ NAL 表達(dá)盒以及作為對(duì)照 帶有普通HA-hFIXUTR-1. 4kbFIXint和CMV-hFIXUTR-l. 4kbFIXint表達(dá)盒的重組腺相關(guān)病 毒的2 X IO9個(gè)傳染性顆粒(IP)；圖15A:表達(dá)載體的示意圖，其通過向PF-LK68-ANAL_UTR表達(dá)盒中引入多種 LCR(HCR、HCRm、AFP3800、AAT7800、AAT108 和 E6)構(gòu)建而成； 圖 15B :AAT108-PF/PAF-LK68 表達(dá)載體、AAT108-PF/PAF-LK68-UTR 表達(dá)載體和 AAT108-PF/PAF-LK68- Δ NAL-UTR 表達(dá)載體的示意圖；圖16Α 顯示從小鼠中獲得的血漿樣品中LK68蛋白表達(dá)水平的ELISA結(jié)果，所述 小鼠通過尾靜脈注射了帶有引入多種LCR(HCR、HCRm, AFP3800、ΑΑΤ7800、AAT108和Ε6)的 PF-LK68-Δ NAL-UTR表達(dá)盒的表達(dá)載體；圖16Β 顯示從小鼠中獲得的血漿樣品中LK68蛋白表達(dá)水平的ELISA結(jié)果，所述 小鼠通過尾靜脈注射了帶有已引入U(xiǎn)TR或UTR和內(nèi)含子ANAL的AAT108-PF/PAF-LK68表 達(dá)盒的表達(dá)載體；圖17Α 在ΗΕΚ293細(xì)胞及其培養(yǎng)基中LK68蛋白表達(dá)水平的Western印跡分析結(jié) 果，所述細(xì)胞用帶有CMV-LK68和CMV-LK68-Δ NAL-UTR表達(dá)盒的復(fù)制缺陷型腺病毒以不同 的感染復(fù)數(shù)比率(MOI)進(jìn)行了轉(zhuǎn)染；以及圖17Β 從圖17Α的Western印跡分析結(jié)果中獲得的條帶強(qiáng)度的直方圖，以顯示 UTR和內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)的影響。發(fā)明詳述除非另行定義，否則本文中所用的科技術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 通常所了解的相同意義。此外，本文中所提到的所有文件均通過參考以其整體并入本文。本文中所用的術(shù)語“表達(dá)載體”旨在理解為集合體(表達(dá)盒或構(gòu)建體)或包含該 集合體的載體，所述集合體包含編碼序列、啟動(dòng)子，并任選地包含與編碼序列有效連接的一 個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。本文中所用的術(shù)語“編碼序列”指編碼氨基酸或者功能性RNA的DNA序列。本文中所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(順式調(diào)節(jié)元件或順式作用元件)”指位于編碼 序列上游、內(nèi)部或下游的核苷酸序列，其控制RNA轉(zhuǎn)錄，以及所轉(zhuǎn)錄RNA的加工、穩(wěn)定性和隨 后的翻譯。轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、5’和3’非翻譯區(qū)(UTR)和基因座控 制區(qū)(LCR)。本文中所用的術(shù)語“啟動(dòng)子”和“增強(qiáng)子”是將編碼序列轉(zhuǎn)錄成RNA所需的DNA序 列代表片段。通常，啟動(dòng)子是指與聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA區(qū)段，增強(qiáng)子是指與聚合酶 活化結(jié)構(gòu)域結(jié)合的DNA區(qū)段。本文中所用的術(shù)語“非翻譯區(qū)(UTR) ”是位于編碼序列3’端和5’端的序列，其包 含作為轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的多腺嘌呤化信號(hào)等。
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本文中所用的術(shù)語“內(nèi)含子”是位于外顯子(轉(zhuǎn)錄后被翻譯為蛋白質(zhì))之間的非 翻譯核苷酸序列。在通過剪接移除內(nèi)含子后，轉(zhuǎn)錄的mRNA前體轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒靘RNA。本文中 所用的術(shù)語“內(nèi)含子”也旨在理解為剪接供體、剪接受體、三鳥嘌呤重復(fù)序列(三重G基序) 和/或分支序列。本文中所用的術(shù)語“基因座控制區(qū)(LCR) ”指具有DNase I敏感性位點(diǎn)的核苷酸序 列。組織特異性的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合于LCR。本文中所用的術(shù)語“有效連接”指一個(gè)或多個(gè)核酸序列與單個(gè)核酸片段偶聯(lián)，以影 響所述單個(gè)片段的功能。例如，啟動(dòng)子與編碼序列有效連接以增強(qiáng)所述編碼序列的表達(dá)。在下文中對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。如前所述，對(duì)有效的基因療法，應(yīng)當(dāng)在特定組織或細(xì)胞中以持續(xù)方式特異性表達(dá) 靶標(biāo)基因，以使靶標(biāo)基因替代致病基因。為實(shí)現(xiàn)組織特異性持續(xù)基因表達(dá)，需要包含改進(jìn)的 轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的表達(dá)載體。因此，本發(fā)明提供截短的FVII(FVIIA)啟動(dòng)子，其具有如SEQ IDN0:42所示的 核苷酸序列，所述核苷酸序列通過從SEQ ID NO :41之核苷酸序列中缺失XhoI (5，端)和 BamHI (3’端)限制性位點(diǎn)而截去504bp FVII啟動(dòng)子的5’端上游207bp片段而產(chǎn)生。下述 實(shí)施例顯示所述FVII Δ啟動(dòng)子具有的活性是未截短FVII啟動(dòng)子的2. 5倍或更高。FVII Δ啟動(dòng)子可與合適的增強(qiáng)子(例如選自具有如前所述SEQ IDNO 44中核苷 酸序列的PAH增強(qiáng)子和具有如前所述SEQ ID NO :45中核苷酸序列的AMBP增強(qiáng)子中的至少 一種)組合。本發(fā)明也提供內(nèi)含子，其選自具有如前所述SEQ ID NO 46到57中核苷酸序列的
多核苷酸。SEQ ID NO :46、47和48的內(nèi)含子分別由截短人抗凝血酶、纖維蛋白溶酶原和凝血 酶原的內(nèi)含子1而產(chǎn)生。SEQ ID NO :49、50和51的內(nèi)含子是合成的內(nèi)含子，其分別包含SEQ ID NO :46、47和48之核苷酸序列，并共有剪接受體序列、來源于人α-珠蛋白內(nèi)含子2的三 鳥嘌呤重復(fù)序列(三重G基序)、人纖維蛋白溶酶原的分支序列以及共有的剪接受體序列。 SEQ ID NO :52、53和54的內(nèi)含子是合成的內(nèi)含子，其分別缺少SEQ ID Ν0:49、50和51之 核苷酸序列的三重G基序和分支序列。SEQ ID NO :55的內(nèi)含子是合成內(nèi)含子，其包含抗凝 血酶的全長內(nèi)含子1、剪接供體序列和共有的剪接受體序列；SEQ ID NO 56和57的內(nèi)含子 是合成的內(nèi)含子，其由截短SEQ ID NO :55之核苷酸序列而產(chǎn)生。在上述內(nèi)含子中，更優(yōu)選 SEQ ID NO 57的內(nèi)含子。本發(fā)明還提供基因座控制區(qū)(LCR)，其選自具有如SEQ ID NO 58到61所示核苷 酸序列的多核苷酸。SEQ ID NO :58、59、60和61的LCR分別位于人α 1-抗胰蛋白酶基因上游_108bp 和-7. 8kb處、人甲胎蛋白上游-3. 8kb處和人白蛋白基因上游-6kb處，其中優(yōu)選SEQ ID NO 58 的 LCR。與本發(fā)明中所提到的序列基本相同且功能相似的多核苷酸也在本發(fā)明的范圍之 內(nèi)。術(shù)語“基本相同且功能相似的多核苷酸”指某一多核苷酸與另一多核苷酸至少有70%、 優(yōu)選80%、更優(yōu)選90%、最優(yōu)選95%的同一性，其中所述同一性由計(jì)算機(jī)算法或軟件所確定。
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本發(fā)明還提供表達(dá)載體，其包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和與所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接并 受其控制的編碼序列，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包括1)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；2)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸以及與SEQ ID NO 42之多核苷 酸有效連接的至少一個(gè)多核苷酸，后者選自具有SEQ IDNO :44和45之核苷酸序列的多核苷 酸；3)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸以及與SEQ ID NO 42之多核苷 酸有效連接的至少一個(gè)多核苷酸，后者選自具有SEQ IDNO :46到57之核苷酸序列的多核苷 酸；4)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸以及與SEQ ID NO 42之多核苷 酸有效連接的至少一個(gè)多核苷酸，后者選自具有SEQ IDNO :58到61之核苷酸序列的多核苷 酸；5)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO 44和45之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸 序列的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接；6)具有SEQ ID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO 44和45之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸 序列的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接；7)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO 46到57之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸 序列的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接；或者8)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO 44和45之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸；選自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸序列 的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸序列的多核 苷酸的至少一個(gè)多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接。本發(fā)明還提供表達(dá)載體，其包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和與所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接并 受其調(diào)控的編碼序列，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包含啟動(dòng)子和與所述啟動(dòng)子有效連接的多核苷 酸，所述多核苷酸選自選自具有SEQ IDNO :46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個(gè) 多核苷酸；選自具有SEQ ID NO :58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸； 以及與選自具有SEQ ID NO :58到61核苷酸序列之多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸有效連接 的選自具有SEQ ID NO :46到57核苷酸序列之多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸。優(yōu)選地，表達(dá)載體還可包含在編碼序列5，和3，端具有SEQ ID NO 62和63之核 苷酸序列的多核苷酸。SEQ ID NO 62和63的核苷酸序列可來自FIX基因的5，和3，UTR0編碼序列可選自編碼肝特異性蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)包括但不限于 白蛋白、甲胎蛋白、α-葡萄糖苷酶、α -抗胰蛋白酶、抗凝血酶、脂蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、 FVII, FVIII、FIX、紅細(xì)胞生成素、纖維蛋白原、葡糖腦苷脂酶、觸珠蛋白、IGF-1、胰島素、纖 維蛋白溶酶原、凝血酶原和轉(zhuǎn)鐵蛋白。編碼序列與啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、UTR和LCR有效且可控地連接。如上所述，本發(fā)明轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的適當(dāng)組合能夠?qū)崿F(xiàn)靶標(biāo)編碼序列的肝組織特異性表達(dá)，并有助于mRNA穩(wěn)定，因此使編碼序列的表達(dá)被提高。包含上述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的各 種組合的表達(dá)盒或載體能夠使靶標(biāo)編碼序列在肝組織中以高水平持續(xù)表達(dá)，因此可廣泛應(yīng) 用于血栓形成、血友病、肝癌等的治療。下述實(shí)施例旨在舉例說明本發(fā)明而不限制其范圍。實(shí)施例1 肝組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的分離和活性分析<步驟1>肝組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子的分離和活性分析使用DNeasy Tissue Kit(Qiagen)從人肝細(xì)胞系(Chang細(xì)胞)的細(xì)胞裂解物中提 取基因組DNA。為了分離FVII啟動(dòng)子，使用作為模板的基因組DNA、SEQ ID NO :1和2的引 物組和DNA聚合酶(Ex-TaqJakara)進(jìn)行PCR，以獲得具有SEQ ID NO 41之核苷酸序列的 DNA片段。具體地，PCR按照如下條件進(jìn)行首先在94°C變性5分鐘；94°C變性30秒、56°C退 火30秒和72°C延伸1分鐘的30個(gè)循環(huán)；72 °C最終延伸3分鐘。將PCR產(chǎn)物通過凝膠提取 進(jìn)行純化，并插入到PCR2. 1-T0P0質(zhì)粒載體中。具有SEQ ID NO 41之核苷酸序列的FVII啟 動(dòng)子通過限制性酶切圖譜和序列分析進(jìn)行鑒定。含有FVII啟動(dòng)子的質(zhì)粒命名為“pCR-FVII pro”。此外，如前文所述進(jìn)行PCR(但使用OATP-C啟動(dòng)子的引物組(SEQ ID NO :3禾P 4)和 AAT啟動(dòng)子的引物組(SEQ ID NO 5和6)之外，將PCR產(chǎn)物插入到pCR2. 1-TOPO質(zhì)粒載體 中。OATP-C啟動(dòng)子(具有SEQ ID NO :43之核苷酸序列)和AAT啟動(dòng)子通過限制性酶切圖 譜和序列分析進(jìn)行鑒定。含有OATP-C啟動(dòng)子和AAT啟動(dòng)子的質(zhì)粒分別命名為“pCR-OATP-C pro” 禾口“pCR-AAT enh/pro，，。pCR-FVII pro,pCR-OATP-C pro 禾口 pCR-AAT enh/pro 的示意 圖顯示于圖IA中。將表達(dá)Renilla螢光素酶的phRL-null載體(Promega)中的SV40晚期poly (A)替 換成人生長激素的poly(A)，并且從其中去除T7啟動(dòng)子和內(nèi)含子，以構(gòu)建pmRL-null載體。 將所述pmRL-null載體用限制性酶BglII進(jìn)行消化并用蝦堿性磷酸酶進(jìn)行處理。用BamHI消化pCR-FVI I pro和pCR-OATP-C pro質(zhì)粒。所得到的DNA片段通過凝 膠提取進(jìn)行純化，并插入到預(yù)先制備好的pmRL-null載體中。通過限制性酶切圖譜在每個(gè) 質(zhì)粒載體中鑒定所需DNA片段。所述質(zhì)粒載體命名為“pmRL-FVII Pro”和“pmRL_0ATP-C Pro”。同時(shí)，用EcoRI限制性酶截掉pmRL-FVII Pro中FVII啟動(dòng)子5，端約200bp的片 段，然后通過連接來構(gòu)建帶有截短FVII (FVIIA)啟動(dòng)子(具有SEQ ID NO :42之核苷酸序 列)的 pmRL-FVII Δ Pro 質(zhì)粒。pmRL-FVII Pro、pmRL-OATP-C Pro 和 pmRL-FVII Δ Pro 的示意圖顯示于圖 IB 中。在人肝細(xì)胞系(Huh-7、H印G2、H印3B)、腎細(xì)胞系(HEK293)、肺癌細(xì)胞系(A549)和 宮頸癌細(xì)胞系(HeLa)中測量 pmRL-FVII Pro、pmRL_FVII Δ Pro 和 pmRL-OATP-C Pro 的螢光 素酶表達(dá)水平。具體地，用聚乙烯亞胺(PEI)試劑(Polyplus, Illkirch, France)在六孔 板的每一個(gè)孔中培養(yǎng)細(xì)胞，以達(dá)到70到80%的匯合。將培養(yǎng)的細(xì)胞用2 μ g的pmRL-FVII Pro、pmRL-FVII Δ Pro 和 pmRL-OATP-C Pro 質(zhì)粒中每一種和 pcDNA-lacZ 質(zhì)粒 1 μ g 進(jìn)行轉(zhuǎn) 染，并于37°C培養(yǎng)24小時(shí)。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行收集，并以3，OOOrpm離心5分鐘以分離細(xì)胞和培養(yǎng) 基。在 100 μ 1 裂解緩沖液(25mM Tris-磷酸、pH 7. 8、2mM DTT (二硫蘇糖醇)、2mM 1，2_ 二 氨基環(huán)己烷N，N，N，N'-四乙酸、10%甘油、Triton X-100)中重懸細(xì)胞，然后凍融(3 次)以完全裂解細(xì)胞。細(xì)胞裂解物以10，OOOrpm離心1分鐘。對(duì)所得上清液進(jìn)行半乳糖苷
13酶測定和Bradford測定，以使轉(zhuǎn)染效率歸一化，啟動(dòng)子活性通過螢光素酶活性分析進(jìn)行測 定。結(jié)果顯示于圖2A中。如圖2A中所示，F(xiàn)VII啟動(dòng)子和OATP-C啟動(dòng)子在肝細(xì)胞系Huh_7中誘導(dǎo)更高水平 的螢光素酶表達(dá)。在他11-7細(xì)胞中斤￥11八啟動(dòng)子表現(xiàn)出的活性為FVII啟動(dòng)子的2.5倍(見圖2B)。在他11-7細(xì)胞中斤￥11八啟動(dòng)子表現(xiàn)出的表達(dá)效率為CMV啟動(dòng)子的1.4%，在來源 于肝組織之外的其他組織的細(xì)胞系中平均為CMV啟動(dòng)子表達(dá)效率的0. 07%。然而，與CMV 啟動(dòng)子不同，F(xiàn)VII Δ啟動(dòng)子對(duì)肝組織的特異性是其他組織的20倍(見圖2C)。這一結(jié)果顯 示，F(xiàn)VIIA啟動(dòng)子提高靶標(biāo)基因的表達(dá)效率而對(duì)肝組織特異性無不利影響，因此其適用于 在肝組織中選擇性作用的表達(dá)載體。在圖2C，(-)代表陰性對(duì)照(缺少啟動(dòng)子)，ICAM2代 表細(xì)胞內(nèi)粘附分子的啟動(dòng)子，Tie2代表酪氨酸激酶受體的啟動(dòng)子，內(nèi)皮糖蛋白代表內(nèi)皮糖 蛋白的啟動(dòng)子，HBcP代表乙型肝炎核心蛋白啟動(dòng)子?！床襟E2>分離增強(qiáng)子為了分離PAH增強(qiáng)子，如〈步驟1>所述進(jìn)行PCR，但使用PAH增強(qiáng)子的弓丨物組(SEQ ID N0:7和8)。將PCR產(chǎn)物通過凝膠提取進(jìn)行純化，并插入到pCR2. 1-T0P0質(zhì)粒載體中。 具有SEQ ID NO :44之核苷酸序列的PAH增強(qiáng)子通過限制性酶切圖譜和序列分析進(jìn)行鑒定。 所述質(zhì)粒命名為“pCR-PAHenh”。此外，重復(fù)上述步驟，但使用AMBP增強(qiáng)子的引物組(SEQ ID NO 9和10)，以構(gòu)建帶有AMBP增強(qiáng)子(具有SEQ ID NO 45之核苷酸序列)的pCR-AMBPenh 質(zhì)粒。pCR-PAHenh和pCR-AMBPenh質(zhì)粒的示意圖顯示于圖3A中。將PAH 和 AMBP 增強(qiáng)子通過用 SpeI 和 XbaI 消化 pCR-PAHenh 和 pCR-AMBPenh 質(zhì) 粒加以分離，通過凝膠提取進(jìn)行純化，并插入到 < 步驟1>中所制備的pmRL-FVII ΔΡΓ0和 pmRL-OATP-C Pro 載體的 SpeI 位點(diǎn)。與 PAH 增強(qiáng)子組合的 pmRL-FVII Δ Pro 和 pmRL-OATP-C Pro分別命名為“pmRL-PF”和“pmRL-P0”。與AMBP增強(qiáng)子組合的pmRL-FVII Δ Pro和 pmRL-OATP-C Pro 分另Ij 命名為 “pmRL—AF，，禾口 “pmRL—AO，，。使用 SpeI 禾口 XbaI 從 pmRL-PF 中提取PAH增強(qiáng)子，并將其插入到pmRL-AF和pmRL_A0的SpeI位點(diǎn)。所得的載體命名為 "pmRL-PAF"禾口 “pmRL-PAO，，。pmRL-PF、pmRL-P0, pmRL—AF、pmRL—AO、pmRL-PAF 禾口 pmRL-PAO 載體的示意圖顯示于圖3B中。根據(jù)上述步驟，向OATP-C和FVII啟動(dòng)子的上游插入能以非組織特異性的方式增 強(qiáng)啟動(dòng)子活性的CMV和SV40增強(qiáng)子。<步驟3>根據(jù)啟動(dòng)子與增強(qiáng)子的組合分析靶標(biāo)基因的表達(dá)效率<3_1>體外測試在人肝細(xì)胞系(Huh-7)和對(duì)照細(xì)胞系(即人肺細(xì)胞系(A549)和人宮頸癌細(xì)胞系 (HeLa))中，以與 < 步驟1>中相同的方式測量 < 步驟2>中所構(gòu)建的載體的基因表達(dá)效率。 結(jié)果顯示于圖4A中。如圖4A中所示，帶有PAH增強(qiáng)子和FVII Δ啟動(dòng)子的載體在肝細(xì)胞系Huh_7中的特 異性平均為其他細(xì)胞系的28. 4倍。這顯示PAH增強(qiáng)子使FVII Δ啟動(dòng)子的組織特異性提高 了 1.42倍。AMBP增強(qiáng)子使FVIIA啟動(dòng)子的組織特異性提高了 213. 7倍或更多，這大約是 由AMBP增強(qiáng)子引起的OATP-C啟動(dòng)子組織特異性提高(65. 6倍)的3倍。上述結(jié)果顯示， 增強(qiáng)子可顯著提高FVII Δ啟動(dòng)子的肝選擇性。
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為了測量AMBP增強(qiáng)子和FVII Δ啟動(dòng)子控制下的表達(dá)載體相對(duì)于CMV啟動(dòng)子控制 下的表達(dá)載體的活性，在人肝細(xì)胞系(Huh-7、Hep3B)和對(duì)照細(xì)胞系(即腎細(xì)胞系(HEK293)、 肺癌細(xì)胞系(A549)、宮頸癌細(xì)胞系(HeLa)和血管內(nèi)皮細(xì)胞系(HUVEC))中測量了螢光素酶 的表達(dá)水平。結(jié)果顯示于圖4B中。如圖4B中所示，在肝細(xì)胞系中，含有AMBP增強(qiáng)子和FVIIA啟動(dòng)子的表達(dá)載體表 現(xiàn)出的螢光素酶表達(dá)效率為含有CMV啟動(dòng)子的表達(dá)載體的8. 7% ；在其他細(xì)胞系中，其平均 為含有CMV啟動(dòng)子的表達(dá)載體的螢光素酶表達(dá)效率的0. 14%。這顯示含有AMBP增強(qiáng)子和 FVII Δ啟動(dòng)子的表達(dá)載體的肝組織特異性約為其他組織的62倍高。<3_2>體內(nèi)測試為了測量在肝中的體內(nèi)基因表達(dá)效率，向小鼠尾靜脈中注射 < 步驟2>的pmRL質(zhì) 粒與聚乙烯亞胺(PEI) (Polyplus, Illkirch,France)或體內(nèi) jetPEI (Polyplus, Illkirch, France)的每種復(fù)合物。兩天后，從所述小鼠中取出肝，并測量螢光素酶表達(dá)水平。具體而言，在5%葡萄糖溶液中將 40 μ g 的 pmRL-P0、pmRL-PF、pmRL-A0 和 pmRL_AF 質(zhì)粒中每一種和pcDNA-LacZ質(zhì)粒10 μ g以與PEI或體內(nèi)jetPEI的復(fù)合物的形式注射入 小鼠(六周齡)尾靜脈中。兩天后，將肝、腎、心臟、脾和肺組織從小鼠中分離，并在PBS溶 液中用勻漿器進(jìn)行勻漿。然后，將500μ 1所得組織溶液與500μ 1 2Χ裂解緩沖液(50mM Tris-磷酸、pH 7. 8、4mM DTT (二硫蘇糖醇)、4mM 1，2-二氨基環(huán)己烷N，N，N，N'-四乙酸、 20%甘油、2%TritOn X-100)混合，其后進(jìn)行凍融(3次)以完全裂解細(xì)胞。細(xì)胞裂解物 以10，OOOrpm離心1分鐘。所得上清進(jìn)行半乳糖苷酶測定和Bradford測定以使轉(zhuǎn)染效率 歸一化，基因表達(dá)效率通過螢光素酶活性測定進(jìn)行測量。結(jié)果顯示于圖4C中。如圖4C中所示，在肝組織中，由含有FVII Δ啟動(dòng)子/PAH增強(qiáng)子的表達(dá)載體與PEI 的復(fù)合物誘導(dǎo)的螢光素酶表達(dá)水平等于由CMV啟動(dòng)子誘導(dǎo)的14%，這是螢光素酶表達(dá)體外 測定的14倍或更高。由FVII △啟動(dòng)子/AMBP增強(qiáng)子誘導(dǎo)的肝特異性螢光素酶表達(dá)水平等 于由CMV啟動(dòng)子誘導(dǎo)的80%，這是螢光素酶表達(dá)體外測定的10倍或更高。用體內(nèi)jetPEI代替PEI提高了肝中的基因表達(dá)效率。具體地，由含有OATP-C啟 動(dòng)子/PAH增強(qiáng)子的表達(dá)載體與體內(nèi)jetPEI的復(fù)合物誘導(dǎo)的肝特異性螢光素酶表達(dá)水平等 于由CMV啟動(dòng)子誘導(dǎo)的約38%，由FVII Δ啟動(dòng)子/PAH增強(qiáng)子誘導(dǎo)的螢光素酶表達(dá)水平等 于由CMV啟動(dòng)子誘導(dǎo)的約80%。由FVII Δ啟動(dòng)子/AMBP增強(qiáng)子和體內(nèi)jetPEI的復(fù)合物誘 導(dǎo)的肝特異性螢光素酶表達(dá)水平與由CMV啟動(dòng)子誘導(dǎo)的相似。這些結(jié)果顯示，本發(fā)明啟動(dòng) 子和增強(qiáng)子的活性在體內(nèi)優(yōu)于體外。實(shí)施例2 分離hFIX UTR和肝特異性基因的內(nèi)含子，并分析UTR和內(nèi)含子的基因 表達(dá)效率<步驟1>鑒定hFIX的UTR并構(gòu)建包含UTR的表達(dá)載體使用RNA提取試劑盒(Pharmacia Biotech)從Ig人肝組織中提取了 1. 2mg的總 RNA,預(yù)先用勻漿器對(duì)所述組織進(jìn)行勻漿。使用作為模板的所提取RNA、M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶 (Takara)和oligo_dT17引物(Takara)合成單鏈DNA，使用DNA聚合酶I (Takara)由單鏈 DNA合成雙鏈cDNAo為了評(píng)估FIX UTR對(duì)基因表達(dá)效率的影響，使用作為模板的cDNA、從FIX核苷酸序 列(Genbank登錄號(hào)ΝΜ000133)設(shè)計(jì)的引物組(SEQ ID NO 11和12)和Ex-Taq進(jìn)行PCR，
15以獲得具有 5，UTR(SEQ ID NO 62)和 3，UTR(SEQ ID NO 63)的 FIX cDNA。PCR 條件如下: 首先94°C變性5分鐘；94°C變性1分鐘、56 °C退火1分鐘、72 °C延伸1分鐘的30個(gè)循環(huán) ’最 后72 °C延伸3分鐘。除了使用SEQ ID NO 13和14的引物組之外，重復(fù)上述步驟，以獲得不含UTR的 FIX cDNA作為對(duì)照。將擴(kuò)增的DNA片段用限制性酶NotI和SalI進(jìn)行消化，通過凝膠提取進(jìn)行純化，并 插入到pBluescript SK(+)載體的NotI和SalI限制性位點(diǎn)。包含所需UTR的FIX和不含 UTR的FIX通過限制性酶切圖譜和序列分析進(jìn)行鑒定。所述載體分別命名為“pBS-hFIXUTR” 和 “pBS-hFIX”(見圖 5(a))。<步驟2>分離肝特異性基因的內(nèi)含子并構(gòu)建包含內(nèi)含子的表達(dá)載體<2_1>構(gòu)建 pCR-int首先，進(jìn)行PCR以獲得包含人抗凝血酶、纖維蛋白溶酶原和凝血酶原內(nèi)含子1中 5'端約300bp的片段。具體而言，使用實(shí)施例1〈步驟1>中所述的基因組DNA(作為模板)以及人抗凝 血酶內(nèi)含子(SEQ ID N0:15和16)、人纖維蛋白溶酶原內(nèi)含子(SEQ ID N0:17和18)和人 凝血酶原酶內(nèi)含子(SEQ ID NO 19和20)的引物組在下述條件下進(jìn)行PCR 首先94°C變 性5分鐘；94°C變性1分鐘、60°C退火1分鐘、72°C延伸2分30秒的30個(gè)循環(huán)；最后72°C 延伸3分鐘。將PCR產(chǎn)物通過凝膠提取進(jìn)行純化，并插入到pCR2. 1-T0P0載體中。SEQ ID NO :46、47和48的內(nèi)含子通過限制性酶切圖譜和序列分析進(jìn)行鑒定。所述質(zhì)粒分別命名為 "pCR-ATint，，、“pCR-PLAint，，禾口 "pCR-PTint，，。進(jìn)一步地，為了分離Kurachi S所報(bào)道的FIX內(nèi)含子1，重復(fù)上述PCR步驟，但使用 FIX內(nèi)含子1的引物組(SEQ ID NO :21和22)，并將所獲得的PCR產(chǎn)物插入到pCR2. 1-TOPO 載體中。所產(chǎn)生的質(zhì)粒載體用限制性酶PvuI或ScaI進(jìn)行消化，并進(jìn)行自連。具有不 同大小的FIX內(nèi)含子通過限制性酶切圖譜和序列分析進(jìn)行鑒定。所述質(zhì)粒分別命名為 "pCR-1. 4kbFIXint” 和 “pCR-0. 3kbFIXint，，。<2-2> 構(gòu)建 pBS-FIX-Synlint在FIX的外顯子1和2之間插入<2-1>中所制備的pCR-ATint、pCR-PLAint和 pCR-PTint內(nèi)含子片段。具體而言，重復(fù)<2-1>的PCR，但使用FIX 5，UTR的有義引物(SEQ ID NO 11)和 共有剪接供體序列GTAA和三重G基序(來源于人α-珠蛋白的內(nèi)含子2)的反義引物(SEQ ID NO :23)，以獲得包含F(xiàn)IX的5’ UTR和外顯子1、剪接供體和人α-珠蛋白三重G基序的 DNA片段。進(jìn)一步地，重復(fù)上述PCR，但使用人纖維蛋白溶酶原的分支序列和共有剪接受體 序列TCGA的有義引物(SEQ ID NO 24)和FIX3，UTR的反義引物(SEQ ID NO 12),以獲得 包含分支序列、剪接受體、外顯子2至8和FIX 3’UTR的DNA片段。將PCR產(chǎn)物通過凝膠提 取進(jìn)行純化，并插入到PCR2. 1-T0P0載體中。所需的DNA片段通過限制性酶切圖譜和序列 分析進(jìn)行鑒定。所述質(zhì)粒分別命名為“pCR-5’ hFIX”和“pCR-3’ hFIX”。將pCR-5，hFIX和pCR-3'hFIX分別用限制性酶NotI和NdeI以及NdeI和SalI進(jìn) 行消化，均插入到pBluescript的NotI和SalI限制性位點(diǎn)。所得質(zhì)粒用NdeI進(jìn)行消化， 并插入用相同的酶(NdeI)預(yù)處理的<2-1>的pCR-ATint、pCR-PLAint和pCR-PTint中。所需的SEQ IDN0:49、50和51內(nèi)含子通過限制性酶切圖譜和序列分析進(jìn)行鑒定。所述質(zhì)粒分 別命名為 “pBS-hFIXUTR-SynlAT” “pBS-hFIXUTR-SynlPLA” 和 “pBS-hFIXUTR-SynlPT，，。所 述質(zhì)粒的示意圖顯示于圖5(b)中。<2-3> 構(gòu)建 pBS-FIX_Syn2int將<2-2>的pBS-FIXUTR-SynlPLA質(zhì)粒用XhoI和AatII進(jìn)行消化(針對(duì)與剪接 供體和受體相鄰的XhoI和AatII限制性位點(diǎn))，并插入用相同的酶(XhoI和AatII)預(yù)處 理的 <2-1> 的 pCR-ATint、pCR-PLAint、pCR-PTint、pCR-1. 4kbFIXint 和 pCR-0. 3kbFIXint 中。Syn2AT、Syn2PLA 和 Syn2PT (SEQ ID NO : 52、53 和 54)的內(nèi)含子以及 1. 4kbFIXint 和0.3kbFIXint的內(nèi)含子通過限制性酶切圖譜進(jìn)行鑒定。所述質(zhì)粒分別命名為 “pBS-hFIXUTR-Syn2AT”、“pBS-hFIXUTR-Syn2PLA”、“pBS-hFIXUTR-Syn2PT”、“pBS-hFIXUTR-1. 4kbFIXint (hFIXml) ”和“pBS-hFIXUTR-O. 3kbFIXint (hFIXm2) ”。所述質(zhì)粒的示意圖顯示 于圖5(c)中。<2-4>分離抗凝血酶全長內(nèi)含子1并構(gòu)建縮短的抗凝血酶內(nèi)含子重復(fù)<2_1>的PCR，但使用SEQ ID NO 15和25的引物組，以擴(kuò)增包含抗凝血 酶全長內(nèi)含子1的片段。將大約2. 3kb的PCR產(chǎn)物插入到pCR2. 1-T0P0載體中，其命名 為“pCR-NAint”。所得的質(zhì)粒用XhoI和AatII進(jìn)行消化，并根據(jù)<2_3>的步驟插入到 pBS-hFIXUTR 中，以獲得包含 SEQ ID NO 55 內(nèi)含子的 pBS-hFIXUTR-NA。使用Kilo-Sequence Deletion Kit(Takara)從 PvuII 位點(diǎn)截短在 pBS-hFIXUTR-NA中所插入的內(nèi)含子。具體地，將pBS_FIXUTR_NA用PvuII進(jìn)行消化，用核 酸外切酶III在25°C降解15秒、30秒、45秒和1分鐘，用綠豆核酸酶和klenow酶進(jìn)行末 端補(bǔ)平，最后進(jìn)行自連。將所得的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。將所得的轉(zhuǎn)化體在氨芐青霉 素平板上進(jìn)行培養(yǎng)并從其中篩選單菌落，來源于所述菌落的質(zhì)粒中內(nèi)含子的大小使用限制 性酶通過電泳進(jìn)行鑒定。對(duì)帶有正確大小內(nèi)含子的質(zhì)粒進(jìn)行純化和測序，以獲得包含SEQ ID NO 56 的 811bp 內(nèi)含子的質(zhì)粒 pBS-hFIXUTR-ΔNAL 以及包含 SEQ ID NO 57 的 640bp 內(nèi)含子的質(zhì)粒 pBS-hFIXUTR- Δ NAS。所述質(zhì)粒 pBS-hFIXUTR-NA、pBS-hFIXUTR- Δ NAL 和 pBS-hFIXUTR-ANAS的示意圖顯示于圖5(d)中。<步驟3>分析UTR和內(nèi)含子對(duì)FIX表達(dá)的影響將〈步驟1>和〈步驟2>中所制備的pBS-hFIX、pBS-hFIXUTR、 pBS-hFIXUTR-Synlint(AT, PLA, PT)和 pBS_hFIXUTR-Syn2int(AT、PLA, ΡΤ、1· 4kbFIXint、 0. 3kbFIXint)質(zhì)粒用NotI和SalI進(jìn)行消化，并插入到含有CMV啟動(dòng)子和牛poly (A) 的pTRUF6腺相關(guān)病毒載體中，以獲得hFIX表達(dá)載體CMV_hFIX、CMV_hFIXUTR、 CMV-hFIXUTR-Synlint(AT, PLA, PT)和 CMV_hFIXUTR-Syn2int(AT、PLA, ΡΤ、1· 4kbFIXint、 0.3kbFIXint)。將25 μ g上述表達(dá)載體的質(zhì)粒DNA注射到C57BL/6小鼠尾靜脈中。第二天，收集 血液樣品用于下述ELISA。將所得血液樣品在HBS-BSA-EDTA-T20 緩沖液(0. 1MHEPES-0. IM NaCl-I % BSA-IOmM EDTA-0. 1 % Tween-20)中稀釋100倍。將稀釋的血液樣品加入到包被了人 FIX (hFIX)抗體(Affinity Biologicals)的 96 孔板中，于室溫培養(yǎng) 90 分鐘，用 PBS-0. 1% Tween-20洗滌，并與過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育。將平板再次用PBS-0. 1% Tween-20進(jìn)
17行洗滌，并向其中加入溶有0-苯二胺和H2O2的底物緩沖液。將平板孵育5分鐘，并用2. 5M H2SO4 終止反應(yīng)。用分光光度計(jì)(Spectra Shell Microplate Reader, STL Spectra,Milan, Italy)在490nm測量吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)吸光度對(duì)標(biāo)準(zhǔn)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的hFIX濃 度。結(jié)果顯示于圖6A中。如圖6A中所示，注射后第二天，由CMV-hFIXUTR所誘導(dǎo)的hFIX蛋白的血液濃度約 為910ng/ml，是由不含UTR的CMV-hFIX所誘導(dǎo)蛋白(540ng/ml)的約1. 7倍。這表明UTR 有助于hFIX的表達(dá)。CMV-hFIXUTR-SynlPLA 的 hFIX 表達(dá)水平(1，480ng/ml)高至 CMV_hFIXUTR(910ng/ ml)的 1. 6 倍，CMV-hFIXUTR-Syn2AT 的 hFIX 表達(dá)水平(2，170ng/ml)高至 CMV-hFIXUTR(910ng/ml)的2. 4倍。這表明該內(nèi)含子參與hFIX基因表達(dá)及最初的hFIX蛋 白誘導(dǎo)。同時(shí)，使用表達(dá)載體 CMV-hFIX、CMV-hFIXUTR 和 CMV-hFIXUTR-Synlint (AT、 PLA, PT)產(chǎn)生重組腺相關(guān)病毒 rAAV-CMV-hFIX、rAAV-CMV-hFIXUTR 和 rAAV-CMV-hFIXUTR-Synlint (AT、PLA, PT)。具體地，在 500mlSpinner 瓶中制備 200ml 的 HEK293T細(xì)胞，用低鈣DMEM培養(yǎng)基(0. ImM Ca++、0. 1 % PL-68U % FBS)將所述細(xì)胞調(diào)整成 1 X IO6個(gè)細(xì)胞/ml的濃度。向細(xì)胞中載入包含33 μ g的表達(dá)載體中每一種、167 μ g的腺病 毒輔助質(zhì)粒PDG和650 μ 1的10 μ M PEI的DNA-PEI混合物，并將所述細(xì)胞在5% CO2培養(yǎng) 箱中以30rpm懸浮培養(yǎng)6小時(shí)。然后，將培養(yǎng)基更換成100 μ g硫酸葡聚糖低鈣DMEM。培養(yǎng) 48小時(shí)后，收集細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行凍融(3次)并以2000rpm離心5分鐘。所得上清液通過碘 克沙醇梯度超速離心法進(jìn)行純化(Zolotukhin，S.等，Gene Ther.，6 :973_985 (1999))。將 IX IO9個(gè)感染性顆粒(IP)注射到免疫缺陷型裸鼠(Japan SLC Inc)的尾靜脈中。兩周后， 每周收集一次血液樣品，并將其用于上文所描述的ELISA。結(jié)果顯示于圖6B中。如圖6B中所示，病毒注射后14周時(shí)，包含本發(fā)明內(nèi)含子的病毒的hFIX表達(dá)水平 是不含內(nèi)含子的病毒的10到20倍。具體地，帶有CMV-hFIXUTR-SynlAT的病毒的hFIX蛋 白濃度為19，996pg/ml，而帶有CMV-hFIXUTR的病毒的hFIX蛋白濃度為2，024pg/ml。這表 明本發(fā)明內(nèi)含子在增強(qiáng)基因表達(dá)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。<步驟4>分析內(nèi)含子對(duì)螢光素酶表達(dá)效率及mRNA穩(wěn)定性的影響<4-1>向由TK啟動(dòng)子控制的螢光素酶表達(dá)載體中引入內(nèi)含子將pRL-TK表達(dá)載體(promega)用Hindlll/Nhel消化以去除SV40內(nèi)含子，其后進(jìn) 行末端補(bǔ)平及自連。內(nèi)含子截短的PRL-TK載體命名為“pRL-Aint”，含有SV40內(nèi)含子的 pRL-TK 載體命名為 “pRL-SV40”。將<2-2> 和 <2-3> 中得到的 pBS-hFIXUTR-SynlAT、pBS-hFIXUTR-SynlPLA 和pBS-hFIXUTR-0. 3kbFIXint用Xhol/Aatll進(jìn)行消化及末端補(bǔ)平。將所得片段插入 到上述表達(dá)載體pRL- Δ int0所得載體分別命名為“pRL-SynlAT”、“pRL-SynlPLA”和 “pRL-hFIXm2”(見圖 7A)。<4_2>分析螢光素酶表達(dá)效率如實(shí)施例1〈步驟1>中所述，將2yg<4-l>的螢光素酶表達(dá)載體、Iyg β-半 乳糖苷酶表達(dá)載體和6yg PEI(polyplus)的復(fù)合物注射到肝細(xì)胞系0fep3B)、腎細(xì)胞系 (HEK293)和肺細(xì)胞系(A549)中。48小時(shí)后，收集細(xì)胞并根據(jù)與實(shí)施例1<步驟1>中相同
18的方法測量螢光素酶表達(dá)效率。結(jié)果顯示于圖7B中。如圖7B中所示，由含有內(nèi)含子的表達(dá)載體所誘導(dǎo)的螢光素酶表達(dá)高達(dá)由不含內(nèi) 含子的表達(dá)載體所誘導(dǎo)的200倍(SynlAT在H印3B肝細(xì)胞系中表達(dá)的情況)。特別地， SynlAT表達(dá)載體明顯有助于螢光素酶活性的誘導(dǎo)以及如 < 步驟3>中所述的FIX表達(dá)的誘導(dǎo)。<4-3>分析mRNA表達(dá)穩(wěn)定性根據(jù)與<4_2>中相同的方法，將<4_1>的螢光素酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到A549肺細(xì)胞系 中，48小時(shí)后收集細(xì)胞。使用FastPure RNA試劑盒(Takara)從所述細(xì)胞中提取總RNA。使 用500ng每種總RNA (作為模板)和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Takara)制備單鏈DNA。然后，使用上述 單鏈DNA(作為模板)以及檢測螢光素酶和肌動(dòng)蛋白的引物組進(jìn)行PCR。結(jié)果顯示于圖 8Α禾口 8Β中。如圖8Α和8Β中所示，由pRL_SynlAT載體所誘導(dǎo)的RLuc mRNA相對(duì)量是由 pRL-Δ int所誘導(dǎo)的RLuc mRNA的1. 7倍。這表明，本發(fā)明內(nèi)含子導(dǎo)致了 mRNA的更高穩(wěn)定 性，這種更高的穩(wěn)定性導(dǎo)致增強(qiáng)的基因表達(dá)。<步驟5>分析抗凝血酶內(nèi)含子對(duì)FIX表達(dá)的影響為了確定抗凝血酶內(nèi)含子對(duì)hFIX蛋白表達(dá)的影響，根據(jù)與〈步驟3>中相同的方 法，將 <2-4> 中所制備的 pBS-hFIXUTR-NA、pBS-hFIXUTR- Δ NAL 和 pBS-hFIXUTR-NAS 質(zhì)粒 插入到pTRUF6腺相關(guān)病毒中，以獲得表達(dá)載體CMV-hFIXUTR-NA、CMV-hFIXUTR-ΔNAL和 CMV-hFIXUTR- Δ NAS0根據(jù)與 < 步驟3>中相同的方法，將表達(dá)載體CMV_hFIX、CMV_hFIXUTR、 CMV-hFIXUTR-0. 3kbFIXint (CMV_hFIXm2)、CMV-hFIXUTR-SynlAT、CMV_hFIXUTR_Syn2AT、 CMV-hFIXUTR- Δ ΝΑ、CMV-hFIXUTR- Δ NAL 和 CMV-hFIXUTR- Δ NAS 的質(zhì)粒 DNA 注射到小鼠尾 靜脈中，并通過ELISA測量受試者血液hFIX濃度。結(jié)果顯示于圖9A中。如圖9A中所示，含有合成或天然抗凝血酶內(nèi)含子的表達(dá)載體的hFIX蛋白濃 度是 CMV-hFIXUTR 的 1. 7 到 3. 5 倍(1，730 到 3，540ng/ml 對(duì) 1，000ng/ml)。特別地， CMV-hFIXUTR- Δ NAL表達(dá)載體表現(xiàn)出的表達(dá)效率是以前所構(gòu)建的CMV_hFIXm2表達(dá)載體的 約1. 7倍(2，010ng/ml對(duì)1，000ng/ml)。這表明ANAL內(nèi)含子非常適于hFIX的過表達(dá)。同時(shí)，為了在體外評(píng)估內(nèi)含子八嫩1^對(duì)1^1乂表達(dá)的影響，將表達(dá)載體01^-1^1父、 CMV-hFIXUTR和CMV-hFIXUTR- Δ NAL轉(zhuǎn)染到ΗΕΚ293Τ腎細(xì)胞系中。轉(zhuǎn)染后兩天，收集細(xì)胞及 培養(yǎng)基并進(jìn)行裂解。裂解物中hFIX蛋白水平通過使用hFIX抗體的電泳法進(jìn)行測量，結(jié)果 顯示于圖9B中。如圖9B中所示，CMV-hFIXUTR-Δ NAL表達(dá)載體誘導(dǎo)的hFIX表達(dá)水平是CMV-hFIX 和CMV-hFIXUTR表達(dá)載體的1. 55倍。這一結(jié)果表明Δ NAL內(nèi)含子對(duì)于hFIX過表達(dá)是很有 效的。實(shí)施例3 分離肝特異性LCR并分析LCR的基因表達(dá)效率<步驟1>分離肝特異性LCR并構(gòu)建包含LCR的質(zhì)粒載體在僅表達(dá)于肝組織中的α 1-抗胰蛋白酶、甲胎蛋白和白蛋白基因的下游分析 TGTTTGC基序的位置。結(jié)果顯示于圖10中。如圖10中所示，七個(gè)TGTTTGC基序分布在α 1_抗胰蛋白酶基因的_7. 8kb，六個(gè)基 序?yàn)檎虻?，一個(gè)基序?yàn)榉聪虻?；還有一個(gè)正向的基序位于α 1-抗胰蛋白酶基因的-108bp位點(diǎn)。在甲胎蛋白-3. 8kb位點(diǎn)，兩個(gè)TGTTTGC基序以正向分布，一個(gè)基序?yàn)榉聪?；在白蛋?基因的-6kb位點(diǎn)，一個(gè)基序?yàn)榉聪?。此外，TGTTTGC基序在α 1_抗胰蛋白酶基因_800bp位 點(diǎn)、甲胎蛋白基因-1. 5kb和-500bp位點(diǎn)以及白蛋白基因-IOkb, -3. 5kb和-2. 6kb位點(diǎn)聚 簇。在這些位點(diǎn)中，對(duì)α 1-抗胰蛋白酶基因-7. 8kb和_108bp位點(diǎn)、甲胎蛋白基因的-3. 8kb 位點(diǎn)和白蛋白基因_6kb位點(diǎn)進(jìn)行分離。具體而言，為了分離位于α 1-抗胰蛋白酶基因-108bp位點(diǎn)的LCR，使用實(shí)施例1< 步驟1>的基因組DNA (作為模板)、SEQ ID NO 26和27的引物組和DNA聚合酶(EX_Taq、 Takara)根據(jù)與實(shí)施例1<步驟1>中相同的方法進(jìn)行PCR。將PCR產(chǎn)物通過凝膠提取進(jìn)行 純化，并插入到PCR2. 1-T0P0載體中。所需具有SEQ ID NO :58之核苷酸序列的α 1-抗胰 蛋白酶LCR通過限制性酶切圖譜和序列分析進(jìn)行鑒定。所述質(zhì)粒命名為“pCR-AAT1081cr”。相似地，重復(fù)上述PCR步驟，但使用引物組SEQ ID N0:28和29、SEQ ID NO 30禾口 31以及SEQ ID NO :32和33，以分別擴(kuò)增位于人α 1-抗胰蛋白酶的-7. 8kb位點(diǎn)、人甲胎蛋 白的-3. 8kb位點(diǎn)和人白蛋白基因的_6kb位點(diǎn)的LCR。將PCR產(chǎn)物插入到pCR2. 1-T0P0載 體中。所需具有SEQ ID NO :59、60和61之核苷酸序列的LCR通過限制性酶切圖譜和序列分 析進(jìn)行鑒定。所述質(zhì)粒分別命名為“pCR-AAT78001cr”、“pCR-AFP38001cr”和“pCR-E61cr”。同時(shí)，為了分離Dang Q.所報(bào)道的人載脂蛋白E (ApoE)基因的肝細(xì)胞控制區(qū)(HCR) 和最小結(jié)構(gòu)HCR(HCRm)，使用引物組SEQ IDN0:34和35以及SEQ ID NO :34和36進(jìn)行PCR， 并將所得的PCR產(chǎn)物插入pCR2. 1-T0P0載體中。人ApoE基因的HCR和HCRm通過限制性酶 切圖譜和序列分析進(jìn)行鑒定。所述質(zhì)粒分別命名為“pCR-ApoEHCR”和“pCR-ApoEHCRm”。這 些質(zhì)粒的示意圖顯示于圖IlA中。進(jìn)一步地，將AAT基因的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子與HCRm的組合插入到pBluescript II 載體中以構(gòu)建pBS-HCRm-AATenh/pro (HmA)，將AAT基因的啟動(dòng)子與HCR的組合插入到 pBluescript II載體中以構(gòu)建pBS-HCR-AATpro (HA)。這些質(zhì)粒的示意圖顯示于圖IlB中?！床襟E2>分析LCR的基因表達(dá)效率對(duì) < 步驟1>中所分離的LCR與啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及內(nèi)含子的組合，對(duì)FIX表達(dá)效率 的影響進(jìn)行評(píng)估。具體而言，將〈步驟1> 中所制備的 pCR-AAT1081cr、pCR_AAT7800cr、 pCR-AFP38001cr、pCR_E61cr、pCR-HCR 和 pCR-HCRm 質(zhì)粒用 HindIII/EcoRV 進(jìn)行消化， 并插入到實(shí)施例1<步驟2>中所制備的pBS-PF的HindIII/EcoRI (稍后補(bǔ)平)限制 性位點(diǎn)，以分別獲得 pBS-AAT108-PF、pBS-AAT7800_PF、pBS-AFP3800_PF、pBS_E6_PF、 pBS-HCR-PF和pBS-HCRm-PF。將這些質(zhì)粒用KpnI和NotI再次進(jìn)行消化，并插入到 實(shí)施例2<步驟5>中所制備的pBS-CMV-hFIXUTR-SynlPLA的KpnI/NotI限制性位 點(diǎn)，以獲得 pBS-AAT108-PF-hFIXUTR-SynlPLA、pBS-AAT7800-PF-hFIXUTR-SynlPLA、 pBS-AFP3800-PF-hFIXUTR-SynlPLA、pBS-E6-PF-hFIXUTR-SynlPLA、 pBS-HCR-PF-hFIXUTR-SynlPLA 和 pBS-HCRm-PF-hFIXUTR-SynlPLA。這些質(zhì)粒的示意圖顯示 于圖12A中。將所述質(zhì)粒用KpnI和SalI進(jìn)行消化，并插入到pTRUF6腺相關(guān)病 毒的KpnI/Sall限制性位點(diǎn)，以獲得表達(dá)載體AAT108-PF_hFIXUTR-SynlPLA、 AAT7800-PF-hFIXUTR-SynlPLA, AFP3800-PF_hFIXUTR-SynlPLA、E6-PF_hFIXUTR-SynlPLA、
20HCR-PF-hFIXUTR-SynlPLA 和 HCRm-PF-hFIXUTR-SynlPLA。將所述表達(dá)載體的質(zhì)粒 DNA 根據(jù) 與實(shí)施例2〈步驟3>中的相同方法注射到小鼠尾靜脈中，通過ELISA測定hFIX蛋白的表達(dá) 水平。結(jié)果顯示于圖12B中。如圖12B中所示，注射兩天后，包含LCR的表達(dá)載體表現(xiàn)出的hFIX表 達(dá)水平高達(dá) CMV-hFIXUTR-SynlPLA 的 7 倍(AAT7800-PF-hFIXUTR-SynlPLA 7, 640ng/ml 對(duì) CMV-hFIXUTR-SynIPLA 1，090ng/ml)。特別地，直到注射后 4 周， AAT108-PF-hFIXUTR-SynlPLA仍持續(xù)表達(dá)390ng/ml或更高的hFIX，這一表達(dá)水平高達(dá) HCR-PF-FIX-SynlPLA (250ng/ml)的1.6倍。該結(jié)果表明AAT108內(nèi)含子非常適于hFIX的持 續(xù)表達(dá)。實(shí)施例4 評(píng)估本發(fā)明表達(dá)載體對(duì)血友病B的治療效果根據(jù)與實(shí)施例3<步驟2>中相同的方法，用實(shí)施例1<步驟2>中所制備的 pBS-PAF構(gòu)建表達(dá)載體AAT108-PAF-hFIXUTR-SynlPLA。然后，將實(shí)施例2<2_4>中所構(gòu)建的 pBS-CMV-hFIXUTR- Δ NAL用NotI和SalI進(jìn)行消化，并插入到實(shí)施例3<步驟2>中所構(gòu)建的 AAT 108-PF-hFIXUTR-SynIPLA 和 AAT108-PAF_hFIXUTR-SynlPLA 的 Notl/Sall 限制性位點(diǎn)， 以獲得 AAT108-PF-hFIXUTR- Δ NAL 和 AAT108-PAF_hFIXUTR- Δ NAL。同時(shí)，將實(shí)施例1<步驟1>的pCR-AAT enh/pro用SpeI (稍后補(bǔ)平末端)/NotI 進(jìn)行消化，并插入到實(shí)施例3<步驟2>的pCR-HCRm的EcoRV/NotI限制性位點(diǎn)，以獲得 pCR-HCRm-AATenh/pro 表達(dá)載體(HmA)。將 pCR-HCRm-AATenh/pro (HmA)表達(dá)載體用 KpnI 和NotI進(jìn)行消化，并插入到實(shí)施例2<步驟5>中所構(gòu)建的CMV-hFIXUTR-Δ NAL的KpnI和 NotI限制性位點(diǎn)，以獲得HmA-hFIXUTR-NAL表達(dá)載體。將實(shí)施例1<步驟1>中所描述的pCR-AAT enh/pro用BglII (稍后補(bǔ)平)/NotI進(jìn) 行消化，并插入到實(shí)施例3<步驟2>中所描述的pCR-HCR的EcoRV/NotI限制性位點(diǎn)，以獲 得 pBS-HCR-AATpro (HA)表達(dá)載體。將 pBS-HCR-AATpro (HA)表達(dá)載體用 KpnI/NotI 進(jìn)行消 化，并插入到實(shí)施例2<步驟3>中所描述的CMV-hFIXUTR-1. 4kbFIXint的KpnI/NotI限制 性位點(diǎn)，以獲得HA-hFIXUTR-1. 4kbFIXint表達(dá)載體。所述表達(dá)載體的示意圖顯示于圖13A中。將25 μ g 的 AAT108-PF-hFIXUTR-ANAL、AAT108-PAF-hFIXUTR-ANAL、 HmA-hFIXUTR- Δ NAL和CMV-hFIXUTR-Δ NAL(實(shí)施例2<步驟5>中所制備)表達(dá)載體的每 一種質(zhì)粒DNA注射到血友病B小鼠的尾靜脈中，并通過ELISA測定hFIX蛋白濃度和凝血活性。如圖13B中所示，相對(duì)于由HmA-hFIXUTR-ΔNAL表達(dá)載體所誘導(dǎo)的hFIX表達(dá)水 平，由AAT108-PAF-hFIXUTR-ANAL表達(dá)載體所誘導(dǎo)的hFIX表達(dá)水平在注射后第1天為 9.8%，第2天為30.6%、第7天為82%，第2周為108%，第9周為208%。此外，相對(duì)于由 HmA-hFIXUTR- Δ NAL表達(dá)載體所誘導(dǎo)的hFIX表達(dá)水平，由AAT108-PF_hFIXUTR- Δ NAL表達(dá) 載體所誘導(dǎo)的hFIX表達(dá)水平在注射后第1天為9 %，第2天為19. 2 %，第7天為41. 9 %，第 2周為56. 9%，第9周為73. 0%。用hFIX表達(dá)載體注射的血友病B小鼠和正常小鼠的凝血活性通過如下的活化部 分凝血活酶時(shí)間(APTT)方法進(jìn)行測定。將FIX缺陷型血漿、10倍稀釋的小鼠血漿、活化的 肌動(dòng)蛋白(各50 μ 1)相混合，并在37°C孵育3分鐘。向其中加入CaCl2，用血液凝集檢測
21器KClOA(Amelung)測定樣品凝結(jié)所消耗的時(shí)間。正常小鼠的凝血時(shí)間約為44秒，血友病B 小鼠約為65秒。如圖13C中所示，直到注射后3天，施用了 hFIX表達(dá)載體的血友病B小鼠 才顯示出正常凝血時(shí)間的約80%。7天后，施用了 CMV-hFIXUTR-ΔNAL的小鼠的凝血時(shí)間 回復(fù)到注射前的水平，而施用 了 AAT108-PF-hFIXUTR- Δ NAL 和 AAT108_PAF_hFIXUTR- Δ NAL 的小鼠表現(xiàn)出凝血時(shí)間改善為50到60秒。進(jìn)一步地，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)活性對(duì)標(biāo)準(zhǔn)凝血時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所述樣品的凝血活性。 如圖 13D 中所示，用 AAT108-PF-hFIXUTR- Δ NAL 和 AAT108_PAF_hFIXUTR- Δ NAL 表達(dá)載體處 理的血友病B小鼠的凝血活性在注射后8周分別為正常小鼠的34. 和29.3%。特別地， 用AAT108-PAF-hFIXUTR-ANAL表達(dá)載體處理的小鼠的凝血活性在注射后8周為正常小鼠 的 31. 9%。同時(shí)，根據(jù)與實(shí)施例2<步驟3>中相同的方法，將使用HA-hFIXUTR-1. 4kbFIXint、 AAT108-PF-hFIXUTR- Δ NAL, AAT108_PAF_hFIXUTR-Δ NAL 和 CMV-hFIXUTR-l. 4kbFIXint 的 2 X IO9IP的重組腺相關(guān)病毒注射到血友病B小鼠的門靜脈中，并通過如前所述的ELISA和 APTT方法測定hFIX蛋白濃度和凝血活性。結(jié)果顯示于圖14A和14B中。如圖14A中所示，帶有AAT108-PF-hFIXUTR- Δ NAL的病毒誘導(dǎo)高達(dá)2，379ng/ ml 的 hFIX 蛋白，帶有 AAT108-PAF-hFIXUTR-ANAL 的病毒誘導(dǎo)高達(dá) 1，431ng/ml 的 hFIX蛋白。另一方面，對(duì)照病毒(即，帶有CMV-hFIXUTR-1. 4kbFIXint的病毒和帶有 HA-hFIXUTR-1. 4kbFIXint的病毒)所誘導(dǎo)的hFIX表達(dá)水平分別為1，542ng/ml和380ng/ ml。特別地，含AAT108-PF-hFIXUTR-ANAL的病毒到注射后68周還誘導(dǎo)500ng/ml或更高 的hFIX表達(dá)。這一結(jié)果表明，本發(fā)明含有LCR的表達(dá)載體適用于需要長期基因表達(dá)的基因 治療。如圖14B中所示，施用了帶有AAT108-PF-hFIXUTR-ANAL的rAAV的小鼠到注射后 7周表現(xiàn)出正常小鼠凝血活性的59. 或更高。上述結(jié)果表明，本發(fā)明的基因表達(dá)系統(tǒng)對(duì)于血友病治療所需的穩(wěn)定而持續(xù)的表達(dá) 是有效的。實(shí)施例5 構(gòu)建包含抗血管發(fā)生蛋白Apo(a)kringle結(jié)構(gòu)域KIV9-KTV10_KV(LK68) 基因的肝特異性表達(dá)載體并評(píng)估LK68蛋白表達(dá)效率為了向LK68表達(dá)載體中引入ANAL內(nèi)含子和FIX UTR，首先使用作為模板的 pAAV-LK68(專利號(hào) KR10-0681762)、引物組 SEQ IDNO 37 和 38、SEQ ID NO 39 和 40 以及 EX-Taq進(jìn)行PCR，以獲得FIX 5，UTR信號(hào)序列片段和LK68-FIX 3，UTR片段。PCR條件如下 首先94 V變性5分鐘；94 V變性1分鐘、60 V退火1分鐘、72 °C延伸1分鐘的30個(gè)循環(huán)；72 °C 最后延伸3分鐘。將所述5’ UTR信號(hào)序列片段和LK68-3’UTR片段分別插入到實(shí)施例2<2_4> 中所制備的pBS-hFIXUTR-ANAL載體的Notl/Xhol和Aatll/Sall限制性位點(diǎn)。所需DNA片 段通過限制性酶切圖譜和序列分析進(jìn)行鑒定，所述質(zhì)粒命名為“PBS-LK68- Δ NAL-FUTR”。將 通過用限制性酶NotI和SalI處理pBS-LK68- Δ NAL-FUTR質(zhì)粒所得到的LK68- Δ NAL-FUTR 片段插入到實(shí)施例4中所制備的AAT108-PF-hFIXUTR-NAL的Notl/SalI限制性位點(diǎn)， 以獲得表達(dá)載體AATl08-PF-LK68-Δ NAL-FUTR。在存在不同LCR或者缺少LCR時(shí)重復(fù) 上述步驟，以獲得表達(dá)載體 E6-PF-LK68- Δ NAL-FUTR, AAT7800-PF-LK68- Δ NAL-FUTR, AFP3800-PF-LK68- Δ NAL-FUTR, HCRm-PF_LK68- Δ NAL-FUTR、HCR-PF-LK68- Δ NAL-FUTR 和PF-LK68-ΔNAL-FUTR。所述表達(dá)載體的酶切圖譜顯示于圖15Α中。根據(jù)與實(shí)施例2<步驟3>中相同的方法，將所述表達(dá)載體注射到小鼠尾靜脈中。從 小鼠中收集血液樣品，并通過ELISA測量LK68蛋白的表達(dá)水平。如圖16Α中所示，在不同LCR中，ΑΑΤ108顯示出最高的基因表達(dá)效率。特別地，相 對(duì)于 PF-LK68- Δ NAL-FUTR 表達(dá)載體的 LK68 表達(dá)效率，AAT108-PF-LK68- Δ NAL-FUTR 表達(dá) 載體的LK68表達(dá)效率在注射后第1天為158. 4%，第2天為104. 8%，第7天為155. 8%，第 2周為160. 2%，第3周為162. 7%，第4周為144. 1%0
進(jìn)一步地，重復(fù)上述步驟以獲得包含表達(dá)盒MT108-PF-LK68、MT108-PF-LK68-FUTR、 AAT108-PF-LK68-ΔNAL-FUTR、 AAT108-PAF-LK68、 AAT108-PAF-LK68-FUTR 禾P AAT108-PAF-LK68-ΔNAL-FUTR的表達(dá)載體。所述表達(dá)載體的示意圖顯示于圖15Β中。根據(jù)與實(shí)施例2<步驟3>中相同的方法，將所述表達(dá)載體注射到小鼠尾靜脈中。從 小鼠中收集血液樣品，并通過ELISA測量LK68蛋白的表達(dá)水平。如圖16Β中所示，相對(duì)于AAT108-PF-LK68表達(dá)載體的LK68表達(dá)效率， AAT108-PF-LK68-FUTR 和 AAT108-PF-LK68- Δ NAL-FUTR 表達(dá)載體的 LK68 表達(dá)效率分別在 注射后第1天為197. 7%和425. 4%，第2天為478. 6%和891. 2%，第7天為233. 2%和 319. 3%，第 2 周為 203. 0%和 253. 7%，第 3 周為 113. 8%和 243. 3%，第 4 周為 170. 4%和 277. 6%。相對(duì)于 AAT108-PAF-LK68 表達(dá)載體的 LK68 表達(dá)效率，AAT108-PAF-LK68-FUTR 和 AAT108-PAF-LK68-Δ NAL-FUTR表達(dá)載體的LK68表達(dá)效率分別在注射后第1天為147. 0% 和 344. 6%，第 2 天為 351. 0%和 824. 5%，第 7 天為 220. 2%和 260. 3%，第 2 周為 140. 8% 和 203. 0%,Μ 3 周為 146. 5%禾口 288. 4%，第 4 周為 177. 8%禾口 323. 8% 0這些結(jié)果表明，與不存在內(nèi)含子和UTR的情況相比，基因表達(dá)在內(nèi)含子和/或UTR 存在下是持續(xù)高水平的。實(shí)施例6 評(píng)估細(xì)胞內(nèi)由UTR和內(nèi)含子引起的抗血管發(fā)生蛋白Ap0(a)kringle結(jié) 構(gòu)域KIV9-KIV10-KV(LK68)的表達(dá)效率將通過用NotI 和 SilI 消化實(shí)施例 5 所述 MT108-PF-LK68 和 MT108-PF-LK68- Δ NAL-FUTR 載體所得到的LK68和LK68-Δ NAL-FUTR片段插入到腺病毒穿梭載體 pENTR2B(Invitrogen, Carlsbad, CA)中，以獲得 pENTR_LK68 和 pENTR_LK68_ΔNAL-FUTR 載體。將這些穿梭載體和靶標(biāo)載體pAd/CMV/V5-DEST (Invitrogen, Carlsbad, CA)用 Clonase (Invitrogen, Carlsbad, CA)進(jìn)行體外同源重組，以獲得 pAd-CMV_LK68 和 pAd-CMV-LK68- Δ NAL-FUTR 載體。將所述 pAd-CMV_LK68 和 pAd-CMV_LK68- Δ NAL-FUTR 載體 用PacI限制性酶進(jìn)行線性化，并轉(zhuǎn)染到HEK 293腎細(xì)胞系中，以分別獲得帶有CMV-LK68和 CMV-LK68- Δ NAL-FUTR 的復(fù)制缺陷型腺病毒 rAd_LK68 和 rAd_LK68_UN。將所述 rAd_LK68 和rAd-LK68_UN注射到HEK 293腎細(xì)胞系中，并測量LK68蛋白的表達(dá)水平。以0. 1,0. 5、2和10的多種感染復(fù)數(shù)(MOI)感染HEK 293腎細(xì)胞系。在腺病毒感 染后2天收集細(xì)胞和培養(yǎng)基。使用抗LK68抗體，通過電泳測定LK68蛋白的表達(dá)水平。結(jié) 果顯示于圖17A和17B中。如圖17A和17B中所示，當(dāng)MOI為0. 1,0. 5和2時(shí)，LK68蛋白的表達(dá)水平很低且 相等，然而當(dāng)MOI為10時(shí)，與由rAd-LK68所誘導(dǎo)的相比，由rAd_LK68_UN所誘導(dǎo)的LK68蛋 白表達(dá)水平在細(xì)胞內(nèi)提高了 420%，在培養(yǎng)基中提高了 242%。
23
這些結(jié)果表明，UTR和內(nèi)含子存在下細(xì)胞和培養(yǎng)基中的基因表達(dá)效率都高于缺少 UTR和內(nèi)含子的情況。盡管通過上述具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但應(yīng)當(dāng)理解，可以進(jìn)行多種修 改和改變，而仍屬于由下述權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明范圍。
權(quán)利要求
具有SEQ ID NO42之核苷酸序列的多核苷酸。
2.多核苷酸，其包含具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸；以及與所述SEQ ID NO :42之多核苷酸有效連接的至少一個(gè)多核苷酸，后者選自具有SEQ ID NO :44和45之核 苷酸序列的多核苷酸。
3.多核苷酸，其選自具有SEQID NO :46至57之核苷酸序列的多核苷酸。
4.多核苷酸，其選自具有SEQID NO :58至61之核苷酸序列的多核苷酸。
5.表達(dá)載體，其包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和與所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接并受其控制的編碼 序列，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包含1)具有SEQID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；2)具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，以及與所述SEQID NO :42之多核苷 酸有效連接的至少一個(gè)多核苷酸，后者選自具有SEQ ID NO :44和45之核苷酸序列的多核 苷酸；3)具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，以及與所述SEQID NO :42之多核苷 酸有效連接的至少一個(gè)多核苷酸，后者選自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸序列的多核 苷酸；4)具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，以及與所述SEQID NO :42之多核苷 酸有效連接的至少一個(gè)多核苷酸，后者選自具有SEQ ID NO :58到61之核苷酸序列的多核 苷酸；5)具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，選自具有SEQID NO :44和45之核苷 酸序列的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸，以及選自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸序列 的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸，所述多核苷酸彼此有效連接；6)具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，選自具有SEQID N0:44和45之核苷 酸序列的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸，以及選自具有SEQ ID NO :58到61之核苷酸序列 的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸，所述多核苷酸彼此有效連接；7)具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，選自具有SEQID N0:46到57之核苷 酸序列的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸，以及選自具有SEQ ID NO :58到61之核苷酸序列 的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸，所述多核苷酸彼此有效連接；或者8)具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，選自具有SEQID NO: 44和45之核苷 酸序列的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸，選自具有SEQ ID NO 46到57之核苷酸序列的多 核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸序列的多核苷酸 的至少一個(gè)多核苷酸，所述多核苷酸彼此有效連接。
6.表達(dá)載體，其包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件以及與所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接并受其控制的編 碼序列，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包含啟動(dòng)子和與所述啟動(dòng)子有效連接的多核苷酸，所述多核苷 酸選自選自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸；選 自具有SEQ IDNO 58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸；以及與選自具有 SEQ ID NO :58到61核苷酸序列之多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸有效連接的選自具有SEQ ID NO 46到57核苷酸序列之多核苷酸的至少一個(gè)多核苷酸。
7.權(quán)利要求5或6的表達(dá)載體，其中所述編碼序列是編碼肝特異性蛋白質(zhì)的序列，所述 蛋白質(zhì)選自白蛋白、甲胎蛋白、α-葡萄糖苷酶、α 1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶、脂蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、紅細(xì)胞生成素、纖維蛋白原、葡糖腦 苷脂酶、觸珠蛋白、IGF-1、胰島素、纖維蛋白溶酶原、凝血酶原和轉(zhuǎn)鐵蛋白。
8.權(quán)利要求5或6的表達(dá)載體，其還包含分別位于所述編碼序列5'和3'端的具有 SEQ ID NO :62和63之核苷酸序列的多核苷酸。
全文摘要
提供了用于基因治療的表達(dá)載體，其含有轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的新組合，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、非翻譯區(qū)(UTR)和基因座控制區(qū)(LCR)。所述表達(dá)載體能夠持續(xù)表達(dá)肝組織特異性基因，因而能有效地用于治療血栓形成、血友病、肝癌等等。
文檔編號(hào)C12N15/67GK101952440SQ200880126705
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2008年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月14日
發(fā)明者尹成泰, 李圭鉉, 李賢 , 趙義哲, 高垡經(jīng) 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人牧巖生命工學(xué)研究所