專利名稱：一種包括肝羧酸酯酶1的用于診斷肝癌的血漿生物標(biāo)記物工具及肝癌篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于肝癌(hepatocellular carcinoma ； HCC)的診斷的血漿生物標(biāo)記物(羧酸酯酶1)以及相關(guān)的確定健康志愿者與患有HCC的病人之間的差異生物標(biāo)記物 表達(dá)的篩選方法，該篩選方法采用雙向熒光凝膠電泳O-D DIGE)、免疫沉淀以及納升液 相色譜質(zhì)譜(Nano-LC-MS/MS)系統(tǒng)。分泌到血漿中的生物標(biāo)記物蛋白的量被測定并被 用作HCC的存在的指示。
背景技術(shù)：
肝癌(HCC)在全世界是第五大最常見的癌癥并且具有第四高的致死率。它是亞 洲和非洲人群中特別主要的問題。與患有其他癌癥(例如，肺癌和乳腺癌)的病人不同， 95%以上的HCC病人在診斷患有HCC的五年內(nèi)死亡。
盡管HCC是不斷研究的對象，并且它的癥狀已經(jīng)眾所周知，但是該疾病的早期 診斷仍然困難并且確診后的存活率非常低(3%至5%)。
除了通過計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)和磁共振成像(MRI)用來診斷HCC的活組織切 片檢查以外，諸如血漿之類的體液提供了臨床樣品以允許蛋白的同時(shí)測量來確定可能存 在 HCC。
如今，生物標(biāo)記物甲胎蛋白(AFP)、des- Y -羧基凝血酶原(DCP)、 glypican-3 (GPC3)、α -1-巖藻糖苷酶以及轉(zhuǎn)化生長因子_bl已被單獨(dú)或組合地用于HCC 病人的臨床篩選。盡管這些生物標(biāo)記物對于HCC的檢測是有用的，但是它們存在敏感性 和/或特異性差的問題。例如，已被用作HCC的血清標(biāo)記物多年的甲胎蛋白具有低敏感 性(39%至65% )和中等特異性(76%至94% )。因此，急需一類新的具有提高的敏感性 和特異性并能早期診斷HCC的生物標(biāo)記物。
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了是HCC的特異生物標(biāo)記物的N-連接糖基化蛋白。 通過雙向凝膠電泳O-D DIGE)和納升液相色譜質(zhì)譜(Nano-LC-MS)鑒定出了該蛋白， 即，人肝羧酸酯酶1 (hCEl)，并發(fā)現(xiàn)該蛋白在從健康志愿者和HCC病人獲得的臨床血漿 樣品中差異表達(dá)。
已知主要在肝臟中表達(dá)的候選的HCC生物標(biāo)記物蛋白(hCEl)在HCC組織中相 對于正常肝組織以較低水平表達(dá)。然而，沒有關(guān)于在人體液(即，血漿)中直接檢測到分 泌的hCEl蛋白的報(bào)道。與此一致的是，本發(fā)明的發(fā)明人對公共血漿蛋白數(shù)據(jù)庫Chttp:// www.plasmaproteomedatabase.org)的檢索未能發(fā)現(xiàn)血漿中存在hCEl的證據(jù)。
有關(guān)人血漿中的hCEl的在先研究已經(jīng)使用采用了非特異性基質(zhì)、三油酸甘油酯 或乙酸對硝基苯酯的酶測定法，來測量通過瓊脂糖親和色譜純化的樣品中的hCEl或其異 形物的活性。然而，最近已經(jīng)報(bào)道該水解活性可能歸因于同樣存在于人血漿中的丁酰膽 堿脂酶、對氧磷酶(paraoxonase)和白蛋白的酯酶活性。觀察到特異的hCEl抑制劑-雙 (對硝基苯基)磷酸酯(BNPP)，未證實(shí)人血漿中存在hCEl，該觀察支持了上述解釋。
在該上下文中，本發(fā)明的發(fā)明人使用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在肝組織和血漿中檢測 hCEl。使用免疫沉淀以及2-D DIGE和Nano-LC-MS/MS系統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，本發(fā) 明的發(fā)明人已經(jīng)證明hCEl存在于健康志愿者和患有HCC的病人的血漿中，并且提供了 hCEl代表一種新的HCC生物標(biāo)記物的證據(jù)。發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的目的在于提供hCEl是能夠使用病人血漿來有效地檢測HCC的存在的 HCC診斷生物標(biāo)記物的新的證據(jù)，以及常規(guī)的檢測方法。
本發(fā)明提供的HCC篩選方法包括以下的必要步驟確認(rèn)人血液樣品中hCEl的 存在；通過使用免疫沉淀、蛋白質(zhì)印記分析(Westemblotanalysis)和Nano-LC-MS/MS 系統(tǒng)對血漿中的hCEl進(jìn)行定量檢測而在患有HCC的病人和健康志愿者之間做出區(qū)分。
技術(shù)問題
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，使用2-D DIGE和蛋白質(zhì)印記分析，本發(fā)明證實(shí)了與患有 HCC的病人的非腫瘤性肝組織相比，患有HCC的病人的腫瘤性肝組織中的hCEl表達(dá)顯 著降低。
本發(fā)明還使用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)(Nano-LC-MS/MS系統(tǒng))確定了 hCEl實(shí)際上是 一種血漿蛋白，這在此前未使用傳統(tǒng)方法予以證明。此外，本發(fā)明表明與健康志愿者的 血漿中的hCEl蛋白的水平相比，患有HCC的病人的血漿中的hCEl蛋白的水平平均是其 2至5倍。
由于hCEl是結(jié)合血凝素的N-連接糖蛋白，所以在非腫瘤性肝組織和腫瘤性肝 組織的分析中，本發(fā)明采用血凝素親和色譜來分離糖蛋白。接下來進(jìn)行2-DDIGE，以將 hCEl蛋白定位在2-D圖譜上的與大約62kDa分子量和4.5至5.3PI對應(yīng)的位置上。
通過本發(fā)明描述的方法，在磁珠(Dynabeads，Invitrogen)上富集之后使用免疫 沉淀以及基于高靈敏度的Nano-LC-MS/MS的方法來驗(yàn)證hCEl的存在。在確定最佳的 Dynabeads分裝和血漿濃度條件的過程中，還確定了健康志愿者與患有HCC的病人的血 漿中hCEl的水平的比較分析可以使用蛋白質(zhì)印記分析來完成。
根據(jù)本發(fā)明，通過采用下面步驟的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的使用，可以證實(shí)人血漿中 hCEl的存在
a)將血液樣品收集到含有乙二胺四乙酸二鉀(Ii2EDTA)的試管中并在室溫下保 持30分鐘；以2,400Xg離心15分鐘，以獲得血漿(上清物)；
b)將400 μ g抗hCEl的抗體與IOmg磁珠結(jié)合，然后將500 μ g抗體包被的磁珠 轉(zhuǎn)移到含有8mg來自HCC病人或健康志愿者的血漿的Iml試管中并培育2小時(shí)，以對 hCEl進(jìn)行免疫沉淀并將其與剩余的血漿蛋白分開；
c)在裂解緩沖液中使經(jīng)免疫沉淀的來自健康志愿者的hCEl和經(jīng)免疫沉淀的來自 HCC病人的每種樣品變性，然后使用一維凝膠電泳將樣品分離；
d)在大約60kDa處切割凝膠條帶，并使用胰蛋白酶將蛋白消化為肽；
e)使用高靈敏度的Nano-LC-MS/MS系統(tǒng)來分析消化的肽，以鑒定hCEl蛋白 (參見圖6和圖7)。
此外，在本發(fā)明中也對人血漿中的分泌的hCEl的水平進(jìn)行了測定，并且可將分 泌的hCEl用作使用下面一系列步驟而在患有HCC的病人與健康志愿者之間做出區(qū)分的 生物標(biāo)記物
1)使用2-D DIGE和蛋白質(zhì)印記分析證實(shí)與非腫瘤性肝組織中的hCEl表達(dá)水平 相比，來自患有HCC的病人的腫瘤性肝組織中的hCEl的表達(dá)水平顯著降低；
2)按上述a)至b)步驟對血漿樣品進(jìn)行免疫沉淀，以獲得hCEl的溶液；
3)通過使用抗hCEl的抗體的蛋白質(zhì)印記分析確認(rèn)hCEl信號的存在；以及
4)證實(shí)患有HCC的病人的血漿中的hCEl信號比健康志愿者的血漿中的hCEl信 號強(qiáng)(參見圖8和圖9)。


圖1是示出來自患有HCC的病人的非腫瘤性肝組織的分級的糖蛋白的2-D DIGE 圖像的照片；hCEl的位置被示出。
圖2是示出來自患有HCC的病人的腫瘤性肝組織的分級的糖蛋白的2-DDIGE圖 像的照片；hCEl的位置被示出。
圖3是示出來自另外十名患有HCC的病人的非腫瘤性肝組織和腫瘤性肝組織的 成對樣品的hCEl表達(dá)水平差異的照片。
N非腫瘤性肝組織
T 腫瘤性肝組織
圖4是示出hCEl表達(dá)水平的免疫組化染色、石蠟包埋的組織陣列的照片，該組 織陣列通過來自47名患有HCC的病人的成對的非腫瘤性肝臟部分和腫瘤性肝臟部分而構(gòu)建。
圖5是描繪出染色得分的頻率分布的圖表，該頻率分布圖表通過患有HCC的病 人的成對的非腫瘤性肝臟部分和腫瘤性肝臟部分的免疫組化染色來確定。這些結(jié)果表明 與非腫瘤性肝臟部分相比，hCEl的表達(dá)水平在腫瘤性肝臟部分中明確地降低。
圖6是示出通過Nano-LC-MS/MS系統(tǒng)鑒定的健康志愿者和患有HCC的病人血 漿中的hCEl的胰蛋白酶肽的表格，使用該表格證實(shí)人血漿中的hCEl的存在。
圖7是圖6中示出的共同肽的代表性Nano-LC-MS/MS色譜圖。
圖8是示出在免疫沉淀之后使用蛋白質(zhì)印記分析確定的有代表性的三名健康志 愿者與三名患有HCC的病人之間的hCEl水平的差異的照片。
Np 健康志愿者的血漿
Tp:患有HCC的病人的血漿
圖9是比較八名健康志愿者與八名患有HCC的病人的血漿中的hCEl水平的圖表。
具體實(shí)施方式
在下面的實(shí)施例中詳細(xì)描述本發(fā)明。所包括的實(shí)施例僅為描述本發(fā)明，然而， 本發(fā)明的范圍不局限于實(shí)施例。
實(shí)施例1 臨床組織和血漿的收集
患有HCC的病人的非腫瘤性肝組織和腫瘤性肝組織以及個(gè)體病理信息從延世大 學(xué)醫(yī)學(xué)院(韓國首爾)的病理學(xué)系獲得。使用下面的化驗(yàn)物來評估來自健康志愿者的血 漿作為陰性對照的適當(dāng)性源自HIV的HIV-I抗體和HIV-2抗體，是表征肝癌的標(biāo)準(zhǔn)測 試成分；HIV-I抗原；乙型肝炎表面抗原；乙型肝炎核心抗原；丙型肝炎病毒；T細(xì)胞 白血病病毒(HTLV-I/II)抗原；以及蒼白螺旋體。根據(jù)人類蛋白質(zhì)組組織(HUPO)正式 采用的標(biāo)準(zhǔn)化的樣品分離方法來獲得血漿。
將來自男性或女性的每種血液樣品^ml)在含有乙二胺四乙酸二鉀CK2EDTA)的 試管中在室溫下保持30分鐘，接下來以2,400Xg離心15分鐘。保留上清物(血漿)。 將非腫瘤性肝組織、腫瘤性肝組織和血漿樣品以-70°C保存直到準(zhǔn)備使用。肝組織和血 漿在取得病人知情同意的情況下根據(jù)延世大學(xué)醫(yī)學(xué)院的倫理委員會(huì)(IRB)的批準(zhǔn)程序獲得。
實(shí)施例2 非腫瘤性肝組織和腫瘤性肝組織中的糖蛋白的分離
在RIPA 緩沖液(50mM Tris，150mM NaCl，乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P-40)，0.25%脫氧膽酸鈉，pH 7.4)中以4°C將每種組織的IOOmg樣品進(jìn)行均質(zhì)化。使 用五種不同的瓊脂糖結(jié)合血凝素的混合物通過血凝素親和色譜將糖蛋白分離，五種不同 的瓊脂糖結(jié)合血凝素是伴刀豆球蛋白A、麥胚凝集素、榴蓮凝素(Jacalin)、接骨木提 取物Mambucus nigra)和橙黃網(wǎng)孢盤菌提取物(Aleuria aurantia)。將對于具有不同的糖組 成的糖蛋白有著結(jié)合特異性的血凝素混合物裝入2mlPD-10柱(Pierce)中。將含有糖蛋 白的樣品施加到結(jié)合緩沖液(20mMTris，ImMMnCl2, ImMCaCl2, 0.15M NaCl, pH7.4) 中的柱，并使所述樣品與柱相互作用30分鐘。
將結(jié)合的糖蛋白用緩沖液(0.2M甲基-D-吡喃甘露糖苷，0.2M甲基_D_吡喃 葡萄糖苷，0.2MN-乙酰葡糖胺，0.2M半乳糖，0.1M乳糖，0.IM海藻糖，2OmM Tris， 0.5MNaCl, pH 7.0)洗脫，該緩沖液基于糖組成轉(zhuǎn)移糖蛋白。使用5_kDa的膜濾器將洗 脫的糖蛋白濃縮，并用50%三氯乙酸和100%冰冷的丙酮沉淀。將沉淀物溶解在2D裂解 緩沖液(7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS，30mMTris, pH8.5)中，并且將得到的蛋白溶 液調(diào)整至pH8.5。使用2D Quant (GE Healthcare)試劑盒測定蛋白的濃度。
實(shí)施例3 雙向熒光差異凝膠電泳O-D DIGE)
使用來自五名病人的十個(gè)成對的樣品(五個(gè)來自非腫瘤性肝組織，五個(gè)來自腫 瘤性肝組織)來準(zhǔn)備用于2-D DIGE的分析樣品(每份50 μ g)。對分析樣品和相應(yīng)的合 并標(biāo)準(zhǔn)樣品的每個(gè)用熒光染料Cy3、Cy5和Cy2 (400pmol ； GE Healthcare)在黑暗條件下 標(biāo)記30分鐘。
通過加入IyllOmM賴氨酸使反應(yīng)終止，并將三種標(biāo)記的樣品混合，通過加入樣 品緩沖液(6M 尿素，2M 硫脲，4%CHAPS，60mM 二硫蘇糖醇(DTT)，3OmM Tris，pH 8.5)將樣品的終體積調(diào)節(jié)到450 μ 1并通過用2% IPG3-10NL緩沖溶液在室溫下培育16小 時(shí)而再水化。
使用Immobiline DryStrip pH 3-10 NL 在 MultiPhor II 型電泳系統(tǒng)(GEHealthcare) 上以最佳條件(達(dá)95,000V)執(zhí)行等電聚焦(IEF)，然后進(jìn)行一步法還原和烷基化，其中， DryStrip在三丁基膦(TBP)緩沖溶液(6M尿素，2%十二烷基硫酸鈉6DS)，30mM Tris， 20%甘油，2.5%丙烯酰胺溶液，5mMTBP)中培育25分鐘。
在還原和烷基化之后，使用Ettan Dalt-twelve電泳系統(tǒng)(GE Healthcare)通過在9%至16%梯度的聚丙烯酰胺凝膠上的電泳對等電聚焦的蛋白進(jìn)行第二向分離。然后，使 用Typhoon 9400掃描儀(GE Healthcare)以與Cy2、Cy3和Cy5對應(yīng)的波長對每塊凝膠進(jìn) 行掃描，并且使用Decyder 2-D分析軟件(GEHealthcare)分析每塊凝膠的圖像。
實(shí)施例4 2-D DIGE分離的蛋白的鑒定
在進(jìn)行圖像分析之后，將與顯著差異表達(dá)的蛋白對應(yīng)的點(diǎn)從考馬斯亮藍(lán)染色的 凝膠上切下、脫色并用胰蛋白酶消化。使用Poros R2和Oligo R3樹脂混合物對消化的肽 進(jìn)行脫鹽。使用4800 MALDI-TOF-MS (AppliedBiosystem)來分析蛋白并使用MASCOT數(shù)據(jù)庫對圖譜進(jìn)行鑒定。
實(shí)施例5 通過蛋白質(zhì)印記分析對組織中的HCC生物標(biāo)記物表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證
通過蛋白質(zhì)印記分析驗(yàn)證了來自十名病人的非腫瘤性肝組織和腫瘤性肝組織之 間的HCC生物標(biāo)記物蛋白濃度的差異。將來自每種樣品的等量(5yg)的蛋白在10%的 凝膠上通過SDS-PAGE分離。
然后，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜，通過在含有5%脫脂乳的TBS-T緩沖 液(20mMTris，137mMNaCl，0.1%吐溫-20，pH 7.6)中以室溫培育1小時(shí)而對蛋白進(jìn)行 封閉。然后，將所述膜與抗hCEl的一抗(CE1，Abcam ；以1 10000存在于TBS-T/5% 脫脂乳中)在室溫下一起培育1小時(shí)。使用小鼠抗β -actin(Santa Cruz)作為陽性對照。
在使用TBS-T/5%脫脂乳洗滌之后，將所述膜與辣根過氧化物酶(HRP)耦聯(lián)的 抗兔IgG的二抗Manta Cruz ；以1 20000稀釋)以室溫一起培育1小時(shí)。使用ECL Plus蛋白質(zhì)印記試劑(GE Healthcare)檢測免疫反應(yīng)的蛋白，使用Typhoon 9400掃描儀對 點(diǎn)進(jìn)行掃描及分析。
實(shí)施例6 使用免疫組化染色方法驗(yàn)證組織中HCC生物標(biāo)記物表達(dá)水平
將通過來自患有HCC的47名病人的非腫瘤性肝部分和腫瘤性肝部分的成對的 組織構(gòu)建的石蠟包埋的組織陣列用于免疫組化。使用二甲苯和乙醇對載片進(jìn)行脫蠟，水 化，然后用0.6%過氧化氫進(jìn)行處理。將抗hCEl的抗體(1 100)施加到載片并培育30 分鐘。使用ChemMate Envision試劑盒(DAKO)使hCEl結(jié)合抗體顏色顯示出來并使用蘇 木精(用作對照染色劑)染色30秒。染色的強(qiáng)度得分為1) “_”，未染色；2) “ + ”， 弱染色；以及3) “++”，強(qiáng)染色。
實(shí)施例7:通過免疫沉淀和蛋白質(zhì)印記分析驗(yàn)證人血漿中HCC生物標(biāo)記物蛋白 分泌水平
按照制造商的描述，用抗hCEl的抗體包被Dynabead MyOne Tosylactivated(Invitrogen)磁珠。簡單來說，將磁珠(IOmg)禾Π抗 hCEl 的抗體 000 μ g)混合并在結(jié)合緩沖液(0.1M硼酸鈉，IM硫酸胺，pH9.5)中以37°C培育16小時(shí)，然后 用TBS-T/5%脫脂乳封閉額外的16小時(shí)。通過將抗體包被的珠子(500 μ g)轉(zhuǎn)移到含有 Smg血漿的Iml試管中并培育2小時(shí)而將hCEl從健康志愿者和患有HCC的病人的血漿 中免疫沉淀出來。
通過將TBS-T緩沖液的pH調(diào)整至pH2來洗脫抗體結(jié)合的蛋白。通過使用如在 實(shí)施例5中描述的抗hCEl的一抗(Abeam; 1 1000)和辣根過氧化物酶(HRP)耦聯(lián)的 抗兔IgG的二抗MantaCruz ； 1 5000)的蛋白質(zhì)印記分析來確定健康志愿者和患有HCC的病人的血漿之間的hCEl水平差異。
實(shí)施例8 通過Nano-LC-MS/MS系統(tǒng)驗(yàn)證人血漿中的hCEl蛋白
將基于蛋白質(zhì)印記分析(實(shí)施例7)與hCEl對應(yīng)的條帶從凝膠切下來，并通過 二硫蘇糖醇(DTT)/碘乙酸(IAA)處理來還原并烷基化。在用胰蛋白酶消化來獲得肽之 后，使用Nano-LC-MS/MS系統(tǒng)和四極桿線性離子阱(LTQ)檢測器來對將凝膠-分離的 蛋白鑒定為hCEl的結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性
如上所述，發(fā)現(xiàn)hCEl是一種用于HCC診斷的新的生物標(biāo)記物。根據(jù)本發(fā)明， 血漿中的hCEl蛋白分泌水平可以用作進(jìn)行HCC早期診斷的指標(biāo)，從而有助于通過實(shí)施 及時(shí)的治療干涉來增大患有HCC的病人的存活率。
權(quán)利要求
1.一種用于肝癌診斷的血漿生物標(biāo)記物的組合物，所述組合物包括作為活性組分的 人肝羧酸酯酶1蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，患有肝癌的病人的血漿中的人肝羧酸酯酶1蛋 白的水平增加為高于健康志愿者的血漿中的人肝羧酸酯酶1蛋白的水平。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中，患有肝癌的病人的血漿中的人肝羧酸酯酶1 蛋白的水平與健康志愿者的血漿中的人肝羧酸酯酶1蛋白的水平相比平均增加了 2倍至5 倍。
4.一種篩選肝癌的方法，所述方法包括以下步驟通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來確認(rèn)人血液樣品中人肝羧酸酯酶1的存在，以將人肝羧酸酯 酶1用作肝癌診斷的血漿生物標(biāo)記物；使用免疫沉淀、蛋白質(zhì)印記分析和納升液相色譜質(zhì)譜系統(tǒng)基于人肝羧酸酯酶1的存 在及其相對水平而在患有肝癌的病人和健康志愿者之間做出區(qū)分。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述確認(rèn)步驟由以下步驟組成a)將血液樣品收集到含有乙二胺四乙酸二鉀的試管中并在室溫下保持30分鐘，然后 以2,400 Xg離心15分鐘，并獲得作為上清物的血漿；b)將400μ g抗人肝羧酸酯酶1的抗體與IOmg磁珠結(jié)合，然后通過將500 μ g抗體結(jié) 合的磁珠轉(zhuǎn)移到含有8mg來自患有肝癌的病人或健康志愿者的血漿蛋白的Iml試管中并 培育2小時(shí)，而將人肝羧酸酯酶1從血漿中免疫沉淀出來；C)在裂解緩沖液中使在步驟b中分離的來自健康志愿者和來自患有肝癌的病人的每 種樣品降解，并且使用一維凝膠電泳將樣品分離；d)在大約60kDa處切割凝膠條帶，并通過胰蛋白酶處理將蛋白消化為肽；e)使用高靈敏度的納升液相色譜質(zhì)譜系統(tǒng)來確認(rèn)人肝羧酸酯酶1蛋白的鑒定。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述區(qū)分的步驟由以下步驟組成1)基于雙向熒光凝膠電泳、蛋白質(zhì)印記分析和免疫組化染色的結(jié)果，證實(shí)與非腫瘤 性肝組織中的人肝羧酸酯酶1的表達(dá)水平相比，患有肝癌的病人的腫瘤性肝組織中的人 肝羧酸酯酶1的表達(dá)水平顯著降低；2)對血漿樣品進(jìn)行免疫沉淀，并獲得人肝羧酸酯酶1的溶液；3)通過使用抗人肝羧酸酯酶1的抗體的蛋白質(zhì)印記分析確認(rèn)抗人肝羧酸酯酶1信號；4)證實(shí)患有肝癌的病人的血漿中的人肝羧酸酯酶1信號比健康志愿者的血漿中的人 肝羧酸酯酶1的信號強(qiáng)。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，患有肝癌的病人的血漿中的人肝羧酸酯酶1蛋白 的水平增大為比健康志愿者的血漿中的人肝羧酸酯酶1蛋白的水平的更大的范圍。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，患有肝癌的病人的血漿中的人肝羧酸酯酶1蛋白 的水平平均增加為健康志愿者的血漿中的人肝羧酸酯酶1蛋白的水平的2倍至5倍。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于診斷肝癌(HCC)的血漿生物標(biāo)記物，具體來講，本發(fā)明使用雙向熒光差異凝膠電泳(2-D DIGE)、免疫沉淀以及納升液相色譜質(zhì)譜(Nano-LC-MS/MS)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)了血漿中的一種基于傳統(tǒng)技術(shù)處于未知的蛋白。通過證明人血漿中肝羧酸酯酶1(hCE1)的存在并證實(shí)人肝羧酸酯酶1在患有HCC的病人中的分泌水平高于健康志愿者的分泌水平，可將本發(fā)明用作HCC早期診斷的篩選方法。
文檔編號C12Q1/44GK102027127SQ200880129216
公開日2011年4月20日 申請日期2008年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月14日
發(fā)明者白融基, 羅根 申請人:生物融合技術(shù)株式會(huì)社