專利名稱：用于檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群或分枝桿菌屬的組合物和使用所述組合物通過多重實(shí)時(shí) ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosis complex)或分枝桿菌屬(Mycobacterium genus)的組合物和一種使用所述組合物通過多 重實(shí)時(shí)PCR來同時(shí)檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和分枝桿菌屬的方法。更具體地說，本發(fā)明涉 及一種用于檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群或分枝桿菌屬的組合物，所述組合物包含(i)靶向 IS6110的引物和/或探針，所述IS6110為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異性基因；(ii)靶向rpoB 的引物和/或探針，所述rpoB為分枝桿菌屬特異性基因；和視需要的(iii)作為內(nèi)對照的 靶向植物源基因的引物和/或探針。
背景技術(shù)：
結(jié)核是自古以來世界上導(dǎo)致死亡的主要傳染病。結(jié)核的成因性細(xì)菌病原體是致結(jié) 核細(xì)菌，所述致結(jié)核細(xì)菌屬于分枝桿菌屬并且具有桿狀(桿菌)形態(tài)，其厚度為0. 2-0.5μπι 并且長度為1-4 μ m。分枝桿菌屬涵蓋導(dǎo)致人類和動(dòng)物的呼吸道疾病(包括結(jié)核)、麻風(fēng)(韓森氏病 (Hansen ‘ s disease))等的各種病原性物種。目前為止，已經(jīng)識別出大于100種分枝 菌物禾中(Shinnick TM et al. , Mycobacterial Taxonomy. Eur JClin Microbiol Infect Dis. 1994 ；13(11) :884-901)。已知結(jié)核分枝桿菌是導(dǎo)致人類結(jié)核的主要菌株。人類結(jié)核的罕見病例是由牛分枝 桿菌(Mycobacterium bovis)所致。已知麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprae)會導(dǎo)致 麻風(fēng)病，艮韓森氏疾病(Shinnick TM andGood RC. ,Mycobacterial Taxonomy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1994 ；13(11) :884-901)。在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)的國家，結(jié)核是疾病和死亡的主要原因之一。在韓國，估計(jì)每年有 120，000人感染結(jié)核病原體。根據(jù)2004年韓國國家統(tǒng)計(jì)局(Korea National Statistical Office, KNS0)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，在2003年的調(diào)查中，新結(jié)核患者的發(fā)病率多達(dá)30，687例(每 100，000人中64例)，而且就結(jié)核死亡率而言，韓國在30個(gè)OE⑶成員國中不體面地排名最高。近年來，歸因于感染AIDS或其他免疫缺陷患者或免疫受損嬰兒受非結(jié)核性分枝 桿菌(NTM)感染，顯示類似于結(jié)核感染臨床癥狀的非典型結(jié)核病例的發(fā)病率正穩(wěn)定增長。非結(jié)核性分枝桿菌(NTM)的實(shí)例可以包括鳥分枝桿菌胞內(nèi)復(fù)合群 (M. avium-intracellulare complex)或鳥分枝桿菌復(fù)合群(M. avium complex)、偶發(fā)分枝 桿菌(M. fortuitum)、龜分枝桿菌(M. chelonae)、戈登分枝桿菌(M. gordonae)、蘇爾加分枝 桿菌(M. szulagai)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)、非洲分枝桿菌(M. africanum)和日內(nèi) 瓦分枝桿菌(M. genavense) (Barnes PFet al. , Tuberculosis in patients with human immunodeficiency virus infection. N Engl J Med. 1991 ；324 (23) :1644-1650)。
上述例示的NTM的多種細(xì)菌菌株對于抗結(jié)核藥顯示多重耐藥性，這使得難以對 結(jié)核取得有效療效(Kam KM et al. , Trends inMultidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis in Relation to Sputum SmearPositivity in Hong Kong,1989-1999. Clin Infect Dis. 2002 ；34 (3) :324-329) 具體地講，與結(jié)核菌相比，已知鳥分枝桿菌胞內(nèi)復(fù)合群或鳥分枝桿菌復(fù)合群(MAC) (其是最常見的NTM物種)對一線抗結(jié)核藥顯示十到一百分之一的較低敏感性。為此，美 國胸科學(xué)會(American Thoracic Society, ATS)提出一種用于診斷和治療NTM疾病的方 ft"(美 15月匈禾斗學(xué)I，Diagnosis andtreatment of disease caused by nontuberculous mycobacteria. Am J Respir CritCare Med. 1997 ；156(2) :S1_S25)。也就是說，NTM疾病的病原性癥狀十分類似于結(jié)核感染，但用于治療這兩種疾病的 治療性藥物彼此間可能完全不同。為了提供對應(yīng)于受結(jié)核或非結(jié)核分枝桿菌感染的個(gè)別 患者的合理治療方案，有必要盡早且準(zhǔn)確地檢測和診斷所關(guān)注患者的結(jié)核和非結(jié)核分枝桿 菌。診斷結(jié)核的傳統(tǒng)方法可以包括患者臨床癥狀的檢查、結(jié)核菌素皮膚測試、X射線照 相術(shù)和細(xì)菌學(xué)測試。雖然結(jié)核菌素皮膚測試是用于辨別受結(jié)核感染的患者的最簡單的手 段，但缺點(diǎn)是由于嚴(yán)重結(jié)核、麻疹(風(fēng)疹)和免疫抑制而在無反應(yīng)性誘導(dǎo)條件下可能經(jīng)常產(chǎn) 生假陰性結(jié)果。此外，X射線診斷的效能由讀取者的能力決定，并且平均25%的由X射線檢 查診斷為陽性的患者經(jīng)其他診斷測試診斷為陰性。因此，由X射線照相術(shù)來診斷結(jié)核取決 于得到異常陰影和讀取者對所述異常陰影的準(zhǔn)確判讀。細(xì)菌學(xué)測試(S卩，結(jié)核菌的檢測)是診斷結(jié)核感染的可靠方法，并且可以包括涂片 測試、培養(yǎng)測試、分子診斷測試等。涂片測試通常使用萋-尼氏染色(Ziehl-Neelsen staining)，萋-尼氏染色是用 于辨別耐酸有機(jī)物(主要為分枝菌)的一種特殊技術(shù)。雖然萋-尼氏染色是簡單且快速的 診斷技術(shù)，但難以辨別結(jié)核和非結(jié)核性分枝桿菌，而且檢測靈敏度也低。培養(yǎng)測試有利地提供用于準(zhǔn)確診斷和辨別結(jié)核菌的高檢測靈敏度。也就是說，即 使在約10個(gè)細(xì)菌/毫升測試樣本的極低濃度下，仍可以檢測病原菌。遺憾地是，由于需要 約4-8周的長期培養(yǎng)和由良好培訓(xùn)的專業(yè)人員檢查以得到測試結(jié)果，因此這種方法在療法 上并不有利于治療結(jié)核患者。BACTEC方法(Becton Dickinson，美國)是一種用于診斷結(jié)核的新穎方法，其通 過放射性同位素來測量由接種到含有C14-棕櫚酸酯的液態(tài)介質(zhì)上的細(xì)菌新陳代謝產(chǎn)生的 wCO2的量并且將所測量的量表示為生長商數(shù)。該方法平均要花16天來取得結(jié)果。然而，問 題在于，需要各種措施和技術(shù)人員來安全處理和管理放射性同位素。基于電泳的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)是一種能夠在 2-3小時(shí)的短時(shí)期內(nèi)通過放大特異性基因區(qū)域迅速且準(zhǔn)確地診斷結(jié)核的方法。PCR測定 是一種有用的技術(shù)，其實(shí)現(xiàn)了在一天內(nèi)以高靈敏度和95%或更高的特異性來檢測臨床樣 本中的結(jié)核菌(Wilson SM et al. , Progress toward a simplified polymerase chain reaction and its application todiagnosis of tuberculosis. J Clin Microbiol. 1993 ； 31 (4) :776-78)。然而，PCR測定具有諸如遺留污染的高風(fēng)險(xiǎn)和需要PCR技術(shù)人員的缺點(diǎn)(Noordhoek GT et al. , Sensitivity and specificity of PCR for detection ofMycobacterium tuberculosis -.a blind comparison study among sevenlaboratories. J Clin Microbiol. 1994 ；32 (2) :277-284)。關(guān)于結(jié)核診斷，PCR測定顯示高靈敏度和特異性，尤其是在涂片陽性樣本中。因此， 應(yīng)認(rèn)為可能性在于，當(dāng)所關(guān)注樣本是耐酸涂片陽性且PCR陰性時(shí)，其可能含有NTM。在NTM肺病的病發(fā)率很高的美國，推薦進(jìn)行如下診斷。當(dāng)耐酸涂片陽性樣本是PCR 陽性時(shí)，可初步診斷所關(guān)注的受驗(yàn)者患有肺結(jié)核。當(dāng)耐酸涂片陽性樣本是PCR陰性時(shí)，即便 在確認(rèn)樣本中存在/不存在PCR抑制物質(zhì)之后，也可在再次發(fā)現(xiàn)樣本為PCR陰性時(shí)初步診 斷所關(guān)注的受驗(yàn)者感染了 NTM。NTM感染的最后診斷要花4-8周的培養(yǎng)期(疾病控制和預(yù) 防中(Centers for Disease Control and Prevention, CDC)。更新資料:Nucleicacid amplification tests for tuberculosis. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2000 ；49 :5934)。 即使可根據(jù)此方針評估受驗(yàn)者暴露于NTM物種，但如果可以直接辨別NTM，則在臨床上將會 更加有用。在韓國，結(jié)核發(fā)病率較高，而NTM疾病的病發(fā)率較低。因此，當(dāng)受驗(yàn)者的測試樣本 為耐酸涂片陽性時(shí)，通常將大部分疑似病例視為具有結(jié)核，隨后施以抗結(jié)核藥的恰當(dāng)藥物 治療。然而，在韓國，NTM的隔離率和NTM疾病的病發(fā)率最近一直已經(jīng)在增加。免疫受損個(gè) 體可能易受NTM疾病感染，然而診斷NTM感染卻并非易事。此外，因?yàn)镹TM物種具有高耐藥 性，難以有效治療NTM疾病。另外，NTM疾病還顯示出高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)(Scientific Committee in Korean Academy of Tuberculosis and RespiratoryDiseases. National survey of mycobacterial diseases other than tuberculosis inKorea. Tuberc Respir Dis 1995 ； 42 :277-94)。為此，迫切需要開發(fā)能夠檢測和辨別NTM物種的診斷方法。作為當(dāng)前檢測NTM物種的可用方法，可以提及AFB染色法。作為用于辨別分枝菌 物種的分子生物技術(shù)，當(dāng)前通用的是使用限制性內(nèi)切酶的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長 度多態(tài)性(polymerase chainreact ion-restrict ion fragment length polymorphism, PCR-RFLP)和使用特異性探針的PCR雜化。上述方法顯示出低檢測靈敏度，且因此不利地需要在實(shí)際測試之前進(jìn)行預(yù)先細(xì)胞 培養(yǎng)或者應(yīng)涉及復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)步驟。因而，這些傳統(tǒng)方法不利于早期檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合 群和分枝桿菌屬。

發(fā)明內(nèi)容
因此，鑒于上述問題而完成了本發(fā)明，并且本發(fā)明的一個(gè)目的為提供一種對結(jié)核 分枝桿菌復(fù)合群特異性基因IS6110具有優(yōu)異靈敏度的引物和/或探針，其用于準(zhǔn)確診斷結(jié) 核分枝桿菌。本發(fā)明的另一目的為通過對來自所有分枝桿菌屬物種所共有的rpoB基因的高特 異性基因區(qū)進(jìn)行檢測而提供一種具有優(yōu)異靈敏度的引物和/或探針，以使得可以檢測到分 枝桿菌屬的存在。本發(fā)明的又一個(gè)目的為提供一種能夠通過使用上述引物和/或探針的多重實(shí)時(shí) PCR而實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核性分枝桿菌(NTM)的方法。


圖1是繪示本領(lǐng)域中傳統(tǒng)上已知的分枝菌物種的rpoB基因的局部堿基序列的 表；圖2是示出使用根據(jù)本發(fā)明的分析組合物的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群-陽性樣本的多 重實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的照片；圖3是示出使用根據(jù)本發(fā)明的分析組合物的分枝桿菌屬-陽性樣本的多重實(shí)時(shí) PCR結(jié)果的照片；和圖4是示出使用根據(jù)本發(fā)明的分析組合物的陰性樣本的多重實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的照 片。
具體實(shí)施例方式1. ■■■碰木干賄舗gF遍描勵(lì)·一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群或非結(jié)核分枝桿菌的組合 物，所述組合物包含選自由以下各者組成的群組的至少一種引物含有如SEQ ID N0:1中 所述的堿基序列的引物；含有如SEQ IDNO :2中所述的堿基序列的引物；含有如SEQ ID NO 3中所述的堿基序列的引物；和含有如SEQ ID NO 4中所述的堿基序列的引物。如本文所用，術(shù)語“含有如SEQ ID NO :x中所述的堿基序列的引物”旨在涵蓋具有 95%或更高的序列同源性的堿基序列。原因如下在引物的長度為20bp時(shí)，如果改變兩個(gè) 或兩個(gè)以上堿基，則引物的解鏈溫度下降5°C或更多，因而導(dǎo)致不希望的結(jié)果。另一方面，如 果改變單個(gè)堿基，則可以通過在PCR過程中略微降低退火溫度來獲得大體上相同的結(jié)果。為了在本發(fā)明的上下文中簡潔且方便地進(jìn)行闡釋，“含有SEQ ID NO :x的堿基序列 的引物”簡稱為“SEQ ID NO :x的引物”。在本發(fā)明的上下文中，SEQ ID NO :1的引物和SEQ ID NO :2的引物是旨在靶向 IS6110基因區(qū)的引物，該IS6110基因區(qū)為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群_特異性基因區(qū)。通常，即使“結(jié)核菌”是指人類型結(jié)核桿菌(即，狹義上的結(jié)核分枝桿菌)，但該 術(shù)語在本發(fā)明的上下文中旨在廣義上涵蓋牛分枝桿菌、田鼠分枝桿菌(Mycobacterium microti)和非洲分枝桿菌以及結(jié)核分枝桿菌，并且若有必要，則可與術(shù)語“結(jié)核分枝桿菌復(fù) 合群”或“TB復(fù)合群”互換使用。IS6110基因是一種插入序列，見于包括人類型結(jié)核分枝桿菌和牛型牛分枝桿菌 的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中。已知結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群含有通常用于結(jié)核的PCR診斷中的 10-12 個(gè) IS6110 拷貝(Thierry, D. et al.，ClinMicrobiol. 1990 ；28 (12) :2668-2673)。 然而，KENT等人報(bào)道了 IS6110視引物的選擇位置而顯示出假陽性風(fēng)險(xiǎn)的差異(J.Clin Microbioll995 ；33(9) :2290-2293)。為此，本發(fā)明的發(fā)明人使用堿基序列分析對低假陽性風(fēng)險(xiǎn)區(qū)進(jìn)行了研究并且發(fā)現(xiàn) (如在以下實(shí)施例中將確認(rèn))SEQ ID NO :1的引物和SEQ IDNO :2的引物是能夠僅擴(kuò)增結(jié)核 分枝桿菌復(fù)合群的IS6110基因的引物堿基序列，并且顯示出大于97%的極高靈敏度和針 對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的IS6110基因區(qū)的大于99%的陽性預(yù)測值，從而確認(rèn)極低風(fēng)險(xiǎn)的 假陽性。據(jù)我們所知，尚無此類具有高靈敏度和陽性預(yù)測值的引物的報(bào)道。因此，當(dāng)SEQ ID NO 1的引物和SEQ ID NO 2的引物中的任一者或兩者用于診斷結(jié)核感染時(shí)，有利的是可以以非常高的可靠性來檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。同時(shí)，Doucet-Populaire和同事報(bào)道了約7 %的非結(jié)核性分枝桿菌(NTM)含有 IS6110的片段或類似物，從而潛在地存在假陽性的風(fēng)險(xiǎn)(TuberLung Dis 1996 ；77 (4) 358-62)。因此，辨別分枝桿菌屬對于確認(rèn)非結(jié)核性分枝桿菌的存在/不存在十分重要。就 此而論，rpoB基因?yàn)榉种U菌屬所共有，且因此已知rpoB的存在可以用于辨別分枝菌物種 (Lee, Hye-Young等人，韓國專利申請公開案第10-2001-0038701號)。然而，上述韓國專利使用PCR-RFLP，所述PCR-RFLP由于低靈敏度而不利地需要先 前細(xì)胞培養(yǎng)或者涉及復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)步驟。因此，該方法不適合在初期迅速檢測結(jié)核分枝桿菌 復(fù)合群和分枝桿菌屬。為此，本發(fā)明的發(fā)明人打算使用能夠迅速且容易地執(zhí)行對于分枝桿菌屬而言靈敏 度高的實(shí)時(shí)PCR的分析方法。然而，迄今已知用于檢測rpoB基因的可用引物形成非常大的擴(kuò)增產(chǎn)物 (340-360bp)，因此其不適合實(shí)時(shí)PCR。為了解決該問題，本發(fā)明人開發(fā)出了形成具有適于實(shí)時(shí)PCR的大小的擴(kuò)增產(chǎn)物的 引物。也就是說，SEQ ID NO 3的引物和SEQ ID NO 4的引物是用于靶向分枝桿菌屬-特 異性基因rpoB的引物，并且形成具有IOObp或更短的長度的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。有利的是，使 用這些引物產(chǎn)生分枝桿菌屬的高度可靠、快速且準(zhǔn)確的檢測。視需要地，根據(jù)本發(fā)明用于檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群或分枝桿菌屬的組合物可進(jìn) 一步包含內(nèi)對照引物。摻入內(nèi)對照旨在確認(rèn)假陰性的問題，即，是否恰當(dāng)實(shí)施了 PCR。為此， 可視需要選擇適當(dāng)?shù)幕?，所述基因不論在所關(guān)注樣本中存在/不存在結(jié)核分枝桿菌或其 他分枝菌物種的情況下均正常表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，上述內(nèi)對照引物可為添加到所有測試樣本中的植物 源基因-特異性引物。植物源基因優(yōu)選可為凝集素基因。凝集素基因-特異性引物可為含有如SEQ ID NO 28中所述的堿基序列的引物或含有如SEQ ID NO 29中所述的堿基序列的引物。下表1 示出 SEQ ID NO 1 到 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :28 和 SEQ IDNO : 的引物 的堿基序列。表1引物的堿基序列
權(quán)利要求
1.一種用于檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium tuberculosiscomplex)或分 枝桿菌屬(Mycobacterium genus)的組合物，其包含選自由以下各者所組成的群組的至 少一種引物含有如SEQ ID NO 1中所述的堿基序列的引物；含有如SEQ ID NO 2中所述 的堿基序列的引物；含有如SEQ ID NO 3中所述的堿基序列的引物；和含有如SEQ ID NO 4中所述的堿基序列的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其進(jìn)一步包含內(nèi)對照引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述內(nèi)對照引物是植物源基因-特異性引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述植物源基因是凝集素基因并且所述植物源 基因-特異性引物為含有如SEQ ID NO :28中所述的堿基序列的引物或含有如SEQ ID NO 29中所述的堿基序列的引物。
5.一種用于檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的組合物，其包含含有如SEQ IDNO :1中所述的 堿基序列的正義引物和/或含有如SEQ ID NO :2中所述的堿基序列的反義引物作為對結(jié)核 分枝桿菌復(fù)合群的IS6110基因具有特異性的引物。
6.一種用于檢測分枝桿菌屬的組合物，其包含含有如SEQ ID NO :3中所述的堿基序列 的正義引物和/或含有如SEQ ID NO :4中所述的堿基序列的反義引物作為對分枝桿菌屬的 rpoB基因具有特異性的引物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中對所述分枝桿菌屬的所述rpoB基因具有特異性 的所述引物形成長度小于IOObp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
8.一種用于檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群或分枝桿菌屬的組合物，其包含選自由以下各者組成的群組的至少一種探針含有如SEQ ID NO :5中所述的堿基序列 的探針；含有如SEQ ID NO :6中所述的堿基序列的探針；和含有如SEQ ID NO :7中所述的 堿基序列的探針。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述探針在其5'端和3'端標(biāo)記有熒光染料， 并且5'-標(biāo)記的熒光染料(報(bào)道劑)和3'-標(biāo)記的熒光染料(淬滅劑)彼此間顯示出 相互干擾。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述5'-標(biāo)記的熒光染料選自由以下各者 組成的群組6-羧基熒光素(FAM)、六氯-6-羧基熒光素(HEX)、四氯-6-羧基熒光素和花 青-5(Cy5)，并且所述3'-標(biāo)記的熒光染料是6-羧基四甲基-羅丹明(TAMRA)或黑洞淬 滅劑-1，2，3(BHQ-1，2，3)。
11.一種用于通過實(shí)時(shí)PCR分析結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群或分枝桿菌屬的組合物，其包含選自由以下各者組成的群組的至少一種引物含有如SEQ IDNO 1中所述的堿基序列的引物；含有如SEQ ID NO :2中所述的堿基序列的引物；含有如SEQ ID NO :3中所述的堿 基序列的引物；和含有如SEQ ID NO 4中所述的堿基序列的引物；和選自由以下各者組成的群組的至少一種探針含有如SEQ IDNO 5中所述的堿基序列 的探針；含有如SEQ ID NO 6中所述的堿基序列的探針；和含有如SEQ ID NO 7中所述的 堿基序列的探針。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其進(jìn)一步包含內(nèi)對照引物和內(nèi)對照探針。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述內(nèi)對照引物是含有如SEQIDNO 中所 述的堿基序列的正義引物或含有如SEQ ID NO 中所述的堿基序列的反義引物，并且所述內(nèi)對照探針是含有如SEQ IDNO 30中所述的堿基序列的探針。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述組合物包含(i)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群IS6110-特異性引物和探針混合物，其包含含有SEQID NO 1的堿基序列的正義引物和含有SEQ ID NO :2的堿基序列的反義引物；以及含有SEQ ID NO 5的堿基序列的探針；(ii)分枝桿菌屬rpoB-特異性引物和探針混合物，其包含含有SEQID NO 3的堿基 序列的正義引物和含有SEQ ID NO 4的堿基序列的反義引物；以及含有SEQ ID NO 6的堿 基序列的探針和/或含有SEQ ID NO 7的堿基序列的探針；(iii)內(nèi)對照-特異性引物和探針混合物，其包含含有SEQIDNO 的堿基序列的正 義引物和含有SEQ ID NO 29的堿基序列的反義引物；以及含有SEQ ID NO 30的堿基序列 的探針；和(iv)PCR反應(yīng)混合物，其含有緩沖劑、DNA聚合酶、dNTP和無菌蒸餾水。
15.—種用于分析結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群或分枝桿菌屬的試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求 14所述的組合物。
16.一種用于使用根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物來分析結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群或分枝 桿菌屬的方法，其包含(1)混合根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物與提取自所關(guān)注樣本的細(xì)菌DNA以制備基因分 析樣本；(2)對步驟(1)的所述基因分析樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR以獲得PCR產(chǎn)物；(3)定量步驟(2)的所述PCR產(chǎn)物以獲得定量曲線；和(4)使用所述定量曲線，定量所述樣本的細(xì)菌DNA中的IS6110-特異性基因、rpoB-特 異性基因和內(nèi)對照-特異性基因。
17.一種分枝桿菌屬的rpoB-特異性核酸，其中所述核酸是選自由以下SEQ ID N0:8到 SEQ ID NO 27的堿基序列組成的群組中的至少一者含有如SEQ ID NO :8中所述的堿基序列的阿卡普分枝桿菌(Macapulsensis)-異性核酸；含有如SEQ ID N0:9中所述的堿基序列的微黃分枝桿菌(M. flavescens)-特異性核酸；含有如SEQ ID NO: 10中所述的堿基序列的蓋斯丁分枝桿菌(Mgastin)-特異性核酸； 含有如SEQ ID NO 11中所述的堿基序列的胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare)-特異 性核酸；含有如SEQ ID NO 12中所述的堿基序列的堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)-特異性核酸；含有如SEQ ID NO :13中所述的堿基序列的粉塵分枝桿菌(M. pulveris)-特異性核酸; 含有如SEQ ID NO 14中所述的堿基序列的猿分枝桿菌(M. simiae)-特異性核酸； 含有如SEQ ID N0:15中所述的堿基序列的舒華巴契(Sctiwabacher)蟾蜍分枝桿菌 (M. xenopi Schwabacher)-特異性核酸；含有如SEQ ID NO :16中所述的堿基序列的南非分枝桿菌(M. austroafricanum)-特異 性核酸；含有如SEQ ID NO 17中所述的堿基序列的隱藏分枝桿菌(M. celatum)-特異性核酸； 含有如SEQ ID NO 18中所述的堿基序列的胃分枝桿菌(M. gastri)-特異性核酸； 含有如SEQ ID NO :19中所述的堿基序列的戈登分枝桿菌(M. gordonae)-特異性核酸； 含有如SEQ ID NO 20中所述的堿基序列的田野分枝桿菌(M. agri)-特異性核酸； 含有如SEQ ID N0:21中所述的堿基序列的亞洲分枝桿菌(M. asiaticum)-特異性核酸；含有如SEQ ID NO 22中所述的堿基序列的西卡分枝桿菌(M. cekatum)-特異性核酸； 含有如SEQ ID NO 23中所述的堿基序列的迪氏分枝桿菌(M. diernhoferi)-特異性核酸；含有如SEQ ID NO 24中所述的堿基序列的偶發(fā)分枝桿菌(M. fortuitum)-特異性核酸；含有如SEQ ID NO 25中所述的堿基序列的不產(chǎn)色分枝桿菌 (M. nonchromogenicum)-特異性核酸；含有如SEQ ID NO 26中所述的堿基序列的草分枝桿菌(M. phlei)-特異性核酸；和 含有如SEQ ID NO 27中所述的堿基序列的日內(nèi)瓦分枝桿菌(M. genavense)-特異性核酸。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群或分枝桿菌屬的組合物，其包含(i)靶向IS6110的引物和/或探針，所述IS6110為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群-特異性基因；(ii)靶向rpoB的引物和/或探針，所述rpoB為分枝桿菌屬-特異性基因；和視需要的(iii)作為內(nèi)對照的靶向植物源基因的引物和/或探針。當(dāng)使用本發(fā)明的組合物進(jìn)行多重實(shí)時(shí)PCR時(shí)，可以通過單輪PCR測定檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和分枝桿菌屬。因此，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了具有高可靠性的快速且容易的臨床診斷。
文檔編號C12N15/31GK102149822SQ200880131091
公開日2011年8月10日 申請日期2008年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月12日
發(fā)明者姜鎮(zhèn)錫, 樸榮石, 李在成 申請人:株式會社Lg生命科學(xué)