專利名稱：蔗糖作為底物用于發(fā)酵產(chǎn)生1,2-丙二醇的用途的制作方法
蔗糖作為底物用于發(fā)酵產(chǎn)生1，2-丙二醇的用途本發(fā)明涉及發(fā)酵工藝，涉及微生物，并涉及可用于發(fā)酵的底物。具體而言，本發(fā)明涉及通過發(fā)酵從含有蔗糖的培養(yǎng)基，特別是從植物生物質(zhì)產(chǎn)生1，2-丙二醇。1,2-丙二醇或丙二醇，一種C3 二醇，是廣泛使用的化學物。其為不飽和聚酯樹脂、 液體洗滌劑、冷卻劑、用于飛行器的抗凍和消冰流體的組分。丙二醇自從1993-1994年以來作為乙烯衍生物的替代品而使用增加，因為乙烯衍生物被認為比丙烯衍生物更具毒性。目前，1，2_丙二醇是通過化學手段使用丙烯氧化物水合工藝產(chǎn)生的，其消耗大量的水。丙烯氧化物可通過兩種方法任一產(chǎn)生，一種使用表氯醇(印ichlorhydrin)，而另一種使用過氧化氫。兩種路線均使用高度有毒的物質(zhì)。此外，過氧化氫路線生成副產(chǎn)物如叔丁醇和1苯基乙醇。為了使丙烯的產(chǎn)生有利可圖，必需為這些副產(chǎn)物找到用途?；瘜W路線通常產(chǎn)生外消旋的1，2-丙二醇，而兩種立體異構(gòu)體(R) 1，2-丙二醇和(S) 1，2-丙二醇均各自適用于某些應用(例如，作為特種化學品和藥物產(chǎn)品的手性起始材料)。
現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)生1，2_丙二醇的化學工藝的不利之處使得生物合成為有吸引力的替代手段。 對于通過微生物從糖天然產(chǎn)生1，2_丙二醇，表征了兩條路線。在第一條路線中，將6-脫氧糖(例如L-鼠李糖或L-巖藻糖)切割為磷酸二羥丙酮和(S)-乳醛，其可進一步還原為(S)-l，2-丙二醇(Badia等，1985)。該路線在大腸桿菌中起作用，但由于脫氧己糖居高不下的成本，這并不能得到經(jīng)濟上可行的工藝。第二條路線是通過糖酵解途徑繼以甲基乙二醛途徑代謝常見的糖(例如葡萄糖或木糖)。將磷酸二羥丙酮轉(zhuǎn)化為甲基乙二醛，其可還原為乳醛或丙酮醇。然后這兩種化合物可進行第二還原反應得到1，2-丙二醛。(R)-l， 2-丙二醛的天然生產(chǎn)者，如楔形梭菌(Clostridium sphenoides)和熱解糖熱厭氧桿菌 (Thermoanaerobacter thermosaccharoIyticum) {1!^ ! ° Elii^iJMii胃禾中LiAf 同的糖即單糖(對于己糖，D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖，而對于戊糖，D-木糖或L-阿拉伯糖)或二糖(乳糖或纖維二糖)或混合物產(chǎn)生1，2-丙二醇CTran Din和Gottschalk，1985， Cameron and Cooney，1986，Sanchez-Rivera 等，1987，Altaras 等，2001)。獲得的最佳性能是9g/l的效價和來自葡萄糖0. 2g/g的得率(Sanchez-Rivera等，1987)。然而，對于用這些生物獲得的性能的改進很可能是受限的，由于缺乏可用的遺傳工具。相同的合成途徑在大腸桿菌或其他腸桿菌中起作用，而Cameron團隊(Cameron等，1998，Altaras和Cameron， 1999，Altaras and Cameron, 2000)禾口 Bennett 團隊(Huang 等，1999，Berrios-Rivera 等， 2003)已經(jīng)進行了幾項關(guān)于用限于D-葡萄糖或D-果糖的碳源在該生物中產(chǎn)生1，2-丙二醇的研究。在厭氧的分批補料發(fā)酵器中獲得的最佳結(jié)果為產(chǎn)生4. 5g/l 1，2-丙二醇，而來自葡萄糖的得率為0. 19g/g(Altaras和Cameron，2000)。用相同方法獲得的，但具有較低效價和得率的結(jié)果還描述于專利W098/37204，盡管其使用不同的碳源，即半乳糖、乳糖、蔗糖和木糖，但其也使用了葡萄糖。用二糖(乳糖和蔗糖)獲得的效價非常低(分別為6mg/l和 7mg/l)。在專利申請WO 2005/073364中描述了用理性設計然后進化的大腸桿菌株的較佳的產(chǎn)生結(jié)果。獲得了 1.8g/l的1，2_丙二醇效價，得率為0.35g/g消耗的葡萄糖。1，2_丙二醇和羥基丙酮的產(chǎn)生還描述于專利W099/28481，其使用重組酵母。用于發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源通常由糖類組成，所述糖類主要來源于植物。蔗糖是來源于糖植物如糖甜菜、甘蔗、甜高粱、糖楓、桄榔(sugar palms)或藍葉龍舌蘭(blue agave)。淀粉是植物中最豐富的儲藏糖類。最重要的淀粉來源是谷類(玉米、小麥、稻)、木薯(manioc)、甘薯和馬鈴薯。大部分微生物并不代謝淀粉，但其可由淀粉工業(yè)加工為可發(fā)酵的原料。菊糖或菊糖樣聚合物(主要由果糖單元組成)是植物中第二豐富的儲藏糖類，并見于菊苣、菊芋或大麗花。由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)也是有望的糖源，但仍處于開發(fā)中(Peters，2006)，由于生物技術(shù)產(chǎn)生的商品化學物的成本主要涉及原材料的成本(即發(fā)酵底物的成本)，對于工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)，使用精制糖如葡萄糖或蔗糖并非經(jīng)濟上可持續(xù)的選擇。需要保留高可發(fā)酵糖含量的較廉價的底物。在此方面，來自糖工業(yè)的含有蔗糖的碳源代表著良好的選項。蔗糖是從含有16至糖的糖甜菜通過糖甜菜加工在幾個步驟中產(chǎn)生的。將經(jīng)清理和洗滌的甜菜切為稱為甜菜絲的長條，將其用熱水通過擴散提取以獲得稱為原汁(raw juice)的蔗糖汁，并含有10至15%蔗糖。第二步是通過使用石灰堿化然后用二氧化碳碳酸化以去除雜質(zhì)并獲得稀汁(thin juice)從而純化原汁。蒸發(fā)工藝通過去除水增加了稀汁中蔗糖濃度以獲得具有50至65%蔗糖含量的濃汁(thick juice) 0然后將該濃縮蔗糖汁結(jié)晶，并通過離心分離晶體，然后洗滌并干燥得到純糖?？蛇M行一個或多個結(jié)晶步驟以獲得多種純度級別的蔗糖。糖甜菜加工的副產(chǎn)物包括漿(pulp)(其為用盡的甜菜絲)和糖蜜 (來自結(jié)晶的剩余母液，其仍具有40至60%的蔗糖含量)。糖工業(yè)還從甘蔗(7至20%蔗糖含量)產(chǎn)生蔗糖。清理收獲的甘蔗，然后進行磨制工藝以提取汁。破壞并磨碎甘蔗的結(jié)構(gòu)，同時用水提取蔗糖以獲得原汁。耗盡糖的粉碎的甘蔗稱為甘蔗渣。該殘余物主要用作燃料源以生成工程用汽。然后通過添加石灰并加熱來澄清原汁，而將澄清的汁與沉淀分離。該工藝的最后步驟，蒸發(fā)獲得濃縮的糖漿和結(jié)晶基本上與糖甜菜加工是相同的。甘蔗加工的副產(chǎn)物包括甘蔗渣，來自原汁澄清的濾餅，和不同類型的糖蜜，仍含有相當量的蔗糖。來自糖工藝的不同的含有蔗糖的中間物、產(chǎn)物或副產(chǎn)物(原汁、稀或澄清的汁、濃汁、蔗糖糖漿、純蔗糖、糖蜜)可充當發(fā)酵原料。舉例而言，巴西的糖工業(yè)將澄清的甘蔗汁用于乙醇產(chǎn)生以使用其作為汽油的替代品。最近文獻中使用含蔗糖的粗產(chǎn)品的實例包括通過運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)從糖甜菜擴散汁(diffusion juice)產(chǎn)生乙醇 (Beckers等，1999)，通過大腸桿菌從糖蜜產(chǎn)生D-乳酸(Shukla等，2004)以及通過德氏乳桿菌(LactcAacillus delbrueckii)從甘蔗糖蜜、甘蔗汁或糖甜菜汁產(chǎn)生D-乳酸(Calabia 等，2007)。已經(jīng)表征了蔗糖陽性細菌(即能夠利用蔗糖的細菌)中兩個不同的用于攝取和利用蔗糖的系統(tǒng)。第一個是基于磷酸烯醇丙酮酸(PEP)依存性蔗糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(蔗糖PTS)，其中攝取蔗糖，并使用磷酸烯醇丙酮酸(PEP)作為供體磷酸化蔗糖以得到胞內(nèi)的蔗糖-6-磷酸。然后將蔗糖-6-磷酸通過轉(zhuǎn)化酶水解為D-葡萄糖-6-磷酸和D-果糖。將D-果糖通過ATP依存性果糖激酶進一步磷酸化為D-果糖-6-磷酸，然后可進入中央代謝途徑。此種系統(tǒng)已描述于幾種細菌物種中，既有革蘭氏陽性的又有革蘭氏陰性。在腸桿菌科中，多于90%的野生型克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，但少于50%的埃希氏菌屬Escherichia)和少于10%的沙門氏菌屬(Salmonella)株為蔗糖陽性的。已從沙門氏菌屬分離了攜帶編碼蔗糖PTS的基因scrKYABR的接合質(zhì)粒 pUR400 (Schmid 等，1982，Schmid 等，1988)。第二個非PTS系統(tǒng)更近期在大腸桿菌EC3132中發(fā)現(xiàn)(Bockmarm等，1992)。該系統(tǒng)涉及編碼蔗糖質(zhì)子共運輸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(CscB)、果糖激酶(CscK)、轉(zhuǎn)化酶(CscA)和蔗糖特異性阻抑物(CscR)的cscBKAR基因。大腸桿菌K12及其衍生物(包括MG1655)無法利用蔗糖。然而該能力可通過轉(zhuǎn)移編碼兩個前述系統(tǒng)的基因來賦予。這表現(xiàn)為將質(zhì)粒PUR400轉(zhuǎn)移至大腸桿菌K12 (Schmid 等，198 或?qū)⒉煌臄y帶cscBKAR基因的質(zhì)粒(包括pK幾101-1)轉(zhuǎn)移至大腸桿菌蔗糖陰性株(Jahreis等，200 。對于工業(yè)應用，在大腸桿菌K12中記錄了從蔗糖產(chǎn)生色氨酸(Tsunekawa等，199 ，在攜帶pUR400質(zhì)粒的大腸桿菌中顯示了氫產(chǎn)生(Penfold和 Macaskie, 2004)，以及通過轉(zhuǎn)移PTS和非PTS兩種系統(tǒng)產(chǎn)生不同的氨基酸報道于專利申請 EP1149911。Cameron 和 Cooney (1986)提及在熱解糖梭菌 Clostridium thermosaccharoIyticum)(之后重名為熱角軍||熱厭氧!flif，Τ. thermosaccharoIyticum) 中從蔗糖產(chǎn)生1，2-丙二醇，但記錄僅為痕量，而用其他碳源獲得了高于3g/的量而得率高于0. lg/g底物。從蔗糖產(chǎn)生1，2_丙二醇還提及于專利申請W098/37204。然而，用質(zhì)粒pSEARX轉(zhuǎn)化的大腸桿菌AA200株僅從10g/l蔗糖產(chǎn)生7mg/l的1，2-丙二醇，而相同的微生物從單糖產(chǎn)生了 49至71mg/l的1，2_丙二醇。該非常低的產(chǎn)量的數(shù)字使人懷疑這些生物是否切實具有從蔗糖產(chǎn)生1，2_丙二醇的能力。根據(jù)我們的看法，來源于大腸桿菌K12的AA200株不應具有輸入然后代謝蔗糖的能力。這些之前的報道清楚地表明對于本領域技術(shù)人員，使用蔗糖產(chǎn)生1，2_丙二醇并非良好的選擇。令人意想不到的是，通過將不同的用于蔗糖利用的系統(tǒng)引入不能利用蔗糖的大腸桿菌株，本發(fā)明人能夠獲得從蔗糖產(chǎn)生1，2_丙二醇的改進的得率。此外，本發(fā)明人闡明了任何含蔗糖培養(yǎng)基，如來自植物原料的汁或糖蜜，可用作發(fā)酵產(chǎn)生1，2-丙二醇的底物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及通過發(fā)酵產(chǎn)生1，2_丙二醇的方法，包括·在包含蔗糖來源的適當培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生1，2_丙二醇的微生物，和·回收產(chǎn)生的1，2-丙二醇，其中所述微生物能夠利用蔗糖作為唯一的碳源以供產(chǎn)生1，2-丙二醇。具體而言，本發(fā)明描述了能夠使用蔗糖作為唯一碳源的修飾的微生物的用途，所述蔗糖從生物質(zhì)獲得，特別是從植物生物質(zhì)獲得。
具體實施方式
如本文中使用的下述術(shù)語可用于詮釋權(quán)利要求書和說明書。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“培養(yǎng)(cultivating/culture) ”、“生長”和“發(fā)酵”可互換使用， 指在含有簡單碳源的適當生長培養(yǎng)基中生長細菌。發(fā)酵是可在有氧、微氧(microaerobic) 或厭氧條件下進行的經(jīng)典工藝。根據(jù)本發(fā)明術(shù)語“適當?shù)呐囵B(yǎng)基”指適用于生長微生物的已知分子組成的培養(yǎng)基。 具體而言，所述培養(yǎng)基至少含有磷源和氮源。所述適當?shù)呐囵B(yǎng)基例如為適用于所用細菌的已知確定組分的礦物質(zhì)培養(yǎng)基，含有至少一種碳源。所述適當?shù)呐囵B(yǎng)基還可指任何包含氮源和/或磷源的液體，所述液體添加至和/或混合至蔗糖來源。具體而言，用于腸桿菌科的礦物質(zhì)生長培養(yǎng)基可因此與M9培養(yǎng)基(Anderson，1946)、M63培養(yǎng)基(Miller，1992)或如由Shaefer等(1999)限定的培養(yǎng)基，特別是下述命名為MML11PG1_100的基本培養(yǎng)基具有相同或類似的組成表1 用葡萄糖作為碳源的基本培養(yǎng)基MML11PG1 100的組成
權(quán)利要求
1.通過發(fā)酵產(chǎn)生1，2-丙二醇的方法，包括 在包含蔗糖來源的適當培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生1，2_丙二醇的微生物，和 回收產(chǎn)生的1，2-丙二醇，其中所述微生物能夠利用蔗糖作為唯一的碳源以供產(chǎn)生1，2-丙二醇。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物經(jīng)遺傳修飾能夠利用蔗糖作為唯一碳源。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述微生物具有編碼PTS蔗糖利用系統(tǒng)的功能基因。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述微生物以基因scrKYABR的引入進行了修飾。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述微生物具有編碼非PTS蔗糖利用系統(tǒng)的功能基因。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述微生物以基因cscBKAR的引入進行了修飾。
7.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述微生物選自下組細菌、酵母和真菌。
8.權(quán)利要求7的微生物，其中所述微生物選自下組腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、 芽抱桿菌禾斗(Bacillaceae)、梭菌禾斗(Clostridiaceae)、鏈霉菌禾斗(Streptomycetaceae)禾口 ^lf (Corynebacteriaceae)。
9.權(quán)利要求8的微生物，其中所述微生物選自下組大腸桿菌(Escherichiacoli)、 月市炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、熱角軍糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)、楔形梭菌(Clostridium sphenoides)或酉良酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)0
10.權(quán)利要求1-9任一項的方法，其中所述蔗糖來源是從生物質(zhì)特別是植物生物質(zhì)獲得的。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述蔗糖來源是從選自下組的植物獲得的甘蔗、糖甜菜、甜高粱、糖楓、桄榔和藍葉龍舌蘭。
12.權(quán)利要求10或11的方法，其中所述蔗糖來源是汁、濃縮汁或糖漿、經(jīng)澄清的汁、糖蜜或結(jié)晶蔗糖的形式。
13.權(quán)利要求10-12任一項的方法，其中所述蔗糖來源是甘蔗或糖甜菜工業(yè)的終產(chǎn)物、 中間產(chǎn)物或副產(chǎn)物。
14.權(quán)利要求1-13任一項的方法，其中所述適當?shù)呐囵B(yǎng)基由蔗糖來源組成。
15.權(quán)利要求1-13任一項的方法，其中所述適當?shù)呐囵B(yǎng)基除了蔗糖來源之外還含有至少一種磷源和/或氮源。
16.權(quán)利要求1-15任一項的方法，其中所述蔗糖來源包含至少7%蔗糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過發(fā)酵產(chǎn)生1，2-丙二醇的方法，包括在包含蔗糖來源的適當培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生1，2-丙二醇的微生物，和回收產(chǎn)生的1，2-丙二醇，其中所述微生物能夠利用蔗糖作為唯一的碳源以供產(chǎn)生1，2-丙二醇。在本發(fā)明一個優(yōu)選的方面，所述蔗糖來源從植物生物質(zhì)獲得，且具體而言為甘蔗汁。
文檔編號C12P7/18GK102272316SQ200880132605
公開日2011年12月7日 申請日期2008年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月7日
發(fā)明者弗朗索瓦.沃爾克, 菲利普.索凱爾, 雷納.菲格 申請人:代謝探索者公司