專利名稱：：一種有效抑制曼地亞紅豆杉細(xì)胞生物合成c-14位氧化紫杉烷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明創(chuàng)造涉及一種有效降低曼地亞紅豆杉(Taxusxmedia)細(xì)胞合成C-14位氧化紫杉烷的方法。它屬于在植物細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，上世紀(jì)80年代發(fā)展起來的基因工程的
技術(shù)領(lǐng)域：
。植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)作為一種新技術(shù)，可以大規(guī)模生產(chǎn)出有用藥物，前景非常可觀。
背景技術(shù)：
：紫杉醇(taxol)是Wall等首次從短葉紅豆杉(TaxusBrevifolia)樹皮中分離得到的一種重要的次生代謝產(chǎn)物。臨床可用于治療卵巢癌、肺癌、膀胱癌、子宮癌及AIDS相關(guān)的Karposis肉瘤等，是目前應(yīng)用最廣泛的天然抗癌藥物之一。然而，目前紫杉醇主要從紅豆杉植物中提取，生產(chǎn)1kg的紫杉醇就需要2000-3000棵紅豆杉的2000磅重的樹皮。由于過度砍伐，導(dǎo)致紅豆杉野生資源受到嚴(yán)重破壞。為解決這一問題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在人工栽培、紫杉醇化學(xué)半合成與全合成、內(nèi)生真菌、細(xì)胞培養(yǎng)等領(lǐng)域進(jìn)行了探索。人工生產(chǎn)紫杉醇的方法中紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)法被認(rèn)為是最有發(fā)展前途的途徑之一。同時(shí)，隨著紫杉醇生物合成途徑的逐步闡明及越來越多的關(guān)鍵酶和相關(guān)酶的基因的克隆和功能重組表達(dá)，利用基因工程方法對(duì)紅豆杉細(xì)胞從基因水平上進(jìn)行改造或?qū)Ξa(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌菌種進(jìn)行改造已經(jīng)成為一種可能。已有以大腸桿菌為宿主菌組合紫杉烯合成酶等4種酶的基因產(chǎn)生紫杉烯的報(bào)道，且產(chǎn)率達(dá)到1.3mg/L，為天然產(chǎn)物生物合成基因的應(yīng)用提供了借鑒。如果能將細(xì)胞培養(yǎng)與基因工程法結(jié)合，則有可能成為解決紫杉醇資源短缺的有效途徑。紅豆杉紫杉醇生物合成全過程約20步酶促反應(yīng)，其中紫杉二烯合酶、紫杉二烯_5a-羥化酶、紫杉烷1013-羥化酶、紫杉烷_3a-羥化酶、紫杉二烯_5a-乙酰轉(zhuǎn)移酶、紫杉烷_2a_苯甲酰轉(zhuǎn)移酶、10-去乙酰巴卡亭111-1013-乙酰轉(zhuǎn)移酶、3-氨基-3-苯基丙酰轉(zhuǎn)移酶和3-N-去苯甲酰-2-脫氧紫杉醇苯甲酰轉(zhuǎn)移酶等主要的相關(guān)酶基因已成功克隆與表達(dá)。其中，紫杉烷14|3-羥基化酶(簡(jiǎn)稱140H)存在于包括紫杉醇在內(nèi)的各種C-13氧取代的紫杉烷生物合成分支途徑中，對(duì)該基因表達(dá)進(jìn)行抑制，則有可能阻斷中間產(chǎn)物流向C-14氧取代的紫杉烷，而改向生成包括紫杉醇在內(nèi)的C-13氧取代的紫杉烷的途徑，從而大幅度提高后者的產(chǎn)量。經(jīng)文獻(xiàn)檢索Kim等，JournalofMicrobiologyandBiotechnology,2000，10(1):91-94，Ketch咖等，PlantCellR印orts，2007，26(7):1025-1033和國(guó)際專利W02007/081772，分別利用紅豆杉的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系進(jìn)行了轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。Kim的實(shí)驗(yàn)中研究了GFP蛋白在東北紅豆杉(Taxuscuspidate)細(xì)胞中的表達(dá)，他們提供了GFP蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡的證據(jù)，但他們沒有進(jìn)行任何外源目的基因的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。Ketchum等的研究中也進(jìn)行了東北紅豆杉的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，但他們用的是野生型的根癌和發(fā)根農(nóng)桿菌，同樣也沒有開展任何外源目的(功能)基因的轉(zhuǎn)化工作。國(guó)際專利W02007/081772盡管進(jìn)行了曼地亞紅豆杉外源目的(功能)基因的轉(zhuǎn)化工作，但沒有涉及到紫杉烷14!3-羥基化酶基因的遺傳操作。在抑制曼地亞紅豆杉(Taxusxmedia)細(xì)胞紫杉烷14P-羥基化酶基因的表達(dá)，降低曼地亞紅豆杉細(xì)胞合成C-14位氧化3紫杉烷方面，國(guó)內(nèi)外未見有報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用反義基因技術(shù)降低曼地亞紅豆杉細(xì)胞C-14位氧化紫杉烷含量的方法，其特征在于，它包括以下步驟a)從紅豆杉中克隆得到1413羥基化酶基因(簡(jiǎn)稱140H)片段；b)構(gòu)建反義基因載體，載體宿主菌為根癌農(nóng)桿菌；c)轉(zhuǎn)化紅豆杉愈傷組織，轉(zhuǎn)化條件為將含有目的反義基因載體的根癌農(nóng)桿菌活化稀釋，轉(zhuǎn)化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期懸浮培養(yǎng)一天后的紅豆杉愈傷組織，共培養(yǎng)2-3天后，清洗，轉(zhuǎn)入含有抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；d)PCR和southern檢測(cè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；e)C_14氧取代的紫杉烷含量分析。本發(fā)明所述方法，其中C-14位氧化紫杉烷為sinenxanA、sinenxanC和Yunnanxane;構(gòu)建反義基因載體所用的140H基因的引物是5'-GCGGAATTCTAGAATGGATGTCTTTTATCCGTTAA-3'(正義鏈)5'-GCTGGATCCATGAAGCAGCCCGGAAAAGTTGTC-3'(反義鏈)。本發(fā)明所述方法，其中根癌農(nóng)桿菌活化步驟如下a)在LB+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平的培養(yǎng)基上篩選攜帶外源基因的農(nóng)桿菌GV3101;b)挑取該單菌落置于2mlLB液體培養(yǎng)基中，28°C，250rpm條件下培養(yǎng)兩天；c)取培養(yǎng)后的菌液250ul放入25mlLB液體培養(yǎng)基中，28°C，250rpm條件下培養(yǎng)過夜。本發(fā)明所述方法，其中載體宿主菌為根癌農(nóng)桿菌GV3101，曼地亞紅豆杉細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化所采用的培養(yǎng)基為6，7-V培養(yǎng)基，C-14氧取代的紫杉烷含量采用HPLC方法分析。本發(fā)明的目的是提供一種有效降低曼地亞紅豆杉(Taxusxmedia)細(xì)胞合成C-14位氧化紫杉烷的方法，是將針對(duì)紅豆杉紫杉烷1413羥基化酶基因(簡(jiǎn)稱140H)片段構(gòu)建的反義基因載體導(dǎo)入到曼地亞紅豆杉(Taxusxmedia)培養(yǎng)細(xì)胞中。通過轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化和一段時(shí)間的培養(yǎng)，快速、有效地抑制了曼地亞紅豆杉細(xì)胞140H基因的表達(dá)，明顯地降低了曼地亞紅豆杉細(xì)胞中sinenxanA(圖1)、sinenxanC(圖2)、Yunnanxane(圖3)這三種C-14位氧化紫杉烷的總含量，顯著地抑制了紅豆杉細(xì)胞向C-14位氧化紫杉烷的流向，為代謝流向包括紫杉醇(taxol)和巴可亭III(baccatinIII)在內(nèi)的C_13位氧化紫杉烷(C_13oxygenatedtaxoids)提供了條件。圖1:sinenxanA[a，5a，IOP，14P_tetraacetoxytaxa_4(20)，ll-diene]圖2:sine證nC[IOP_triacetoxy_14P_(2_methyl)butyryloxy_taxa_4(20)，ll_diene]圖3:Yurmanxane[2a，5a，10P_triacetoxy_14P_(3_hydroxy_2_methyl)butyryloxy_taxa_4(20)，ll一diene]圖4:反義基因載體T-DNA區(qū)圖5:GUS活性檢測(cè)，左轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；右對(duì)照?qǐng)D6:轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的PCR檢領(lǐng)"A:對(duì)照；B，C:轉(zhuǎn)基因細(xì)胞圖7:轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的PCR-Southern檢測(cè)，A:對(duì)照；B，C:轉(zhuǎn)基因細(xì)胞圖8:RT-PCR檢測(cè)結(jié)果第一行是紅豆杉轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中13-actin基因的RT-PCR分析結(jié)果，第二行是紅豆杉轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中140H基因的RT-PCR分析結(jié)果。A，B:轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；C:對(duì)照?qǐng)D9三種C-14氧取代紫杉烷標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜1.Yunnanxane;2.sinenxanA;3.sinenxanC具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通過以上內(nèi)容也能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方案都在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。實(shí)施例1:用本發(fā)明的有效抑制曼地亞紅豆杉(Taxusxmedia)細(xì)胞生物合成C-14位氧化紫杉烷的方法，將針對(duì)紅豆杉紫杉烷1413羥基化酶基因(簡(jiǎn)稱140H)片段構(gòu)建的反義基因表達(dá)載體導(dǎo)入到曼地亞紅豆杉(Taxusxmedia)培養(yǎng)細(xì)胞中。通過優(yōu)化的轉(zhuǎn)化方法，使曼地亞紅豆杉細(xì)胞140H基因的表達(dá)和曼地亞紅豆杉細(xì)胞中sinenxanA、sinenxanC、Yu皿anxane這三種-14氧化紫杉烷的生物合成都得到顯著地抑制。試驗(yàn)材料我們選用本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的生長(zhǎng)狀態(tài)較好的曼地亞紅豆杉細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，采用6，7_V培養(yǎng)基(附加0.2mg/L6-BA，1.5mg/L2，4_D和2mg/LIAA)對(duì)紅豆杉愈傷組織細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。本試驗(yàn)采用根癌農(nóng)桿菌GV3101，該菌株具有利福平(rifampicin)抗性，利用該抗性可對(duì)其進(jìn)行篩選。載體pZhOl由中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所朱立煌教授贈(zèng)送。卡那霉素、乙酰丁香酮、利福平、頭孢霉素、潮霉素，巰基乙醇，PVP購(gòu)自sigma公司，RNA抽提試劑，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)試劑均購(gòu)自鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，引物合成、DNA測(cè)序由鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司完成。乙腈為色譜純，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。PCR儀(GeneAmpPCRsystem4700);冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康FD-1);細(xì)胞超聲破碎儀(寧波新芝JY92-II);高效液相色譜儀(Waters2487);色譜柱(SunFire);HPLC分析軟件(Empower)。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下(1)雙元載體的構(gòu)建首先用引物F:5'-GCGGAATTCTAGAATGGATGTCTTTTATCCGTTAA-3'(P1)，R:5'-GCTGGATCCATGAAGCAGCCCGGAAAAGTTGTC-3'(P2)從中國(guó)紅豆杉中克隆出140H基因片斷，將此目的基因片段反向插入pZh01載體的T-DNA區(qū)域GUS片斷處構(gòu)建出其反義基因表達(dá)載體(圖4)，再將含有外源基因的載體質(zhì)粒用電擊法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101菌株中，獲得有關(guān)工程農(nóng)桿菌菌株。(2)農(nóng)桿菌的活化首先，在LB+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平的培養(yǎng)基上篩選攜帶外源基因的農(nóng)桿菌GV3101。然后，挑取該單菌落置于2mlLB液體培養(yǎng)基中(含50mg/L卡那霉素)，28t:，250rpm條件下培養(yǎng)兩天。取培養(yǎng)后的菌液250ul放入25mlLB液體培養(yǎng)基中(含50mg/L卡那霉素，50uM乙酰丁香酮)，28°C，250rpm條件下培養(yǎng)過夜至OD值為1.0-1.2。5(3)細(xì)胞的培養(yǎng)紅豆杉細(xì)胞生長(zhǎng)大周期呈S型，可將其劃分為延遲期(0-15d左右)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(15-30d)，靜止期(30-35d)。選取處于不同生長(zhǎng)期的的紅豆杉細(xì)胞4g左右，放入12ml6，7-V液體培養(yǎng)基中，24t:，125rpm條件下于懸浮培養(yǎng)液中分別進(jìn)行1天，3天，9天，14天的振蕩培養(yǎng)。(4)轉(zhuǎn)化將2.5ml活化好的農(nóng)桿菌3000g離心15min，去除上清液，在沉淀中加入一定體積的6，7-V液體培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。分別加入2.5ml6，7-V液體培養(yǎng)基、稀釋1倍(加入5ml6，7-V液體培養(yǎng)基)、稀釋2倍(加入10ml6，7-V液體培養(yǎng)基)的菌液，比較它們的轉(zhuǎn)化效果。取稀釋好的菌液500ul放入懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞體系中，超聲30s后，24t:，125rpm條件下共培養(yǎng)。在共培養(yǎng)1-3天后，用含300mg/L頭孢霉素的新鮮6，7-V液體培養(yǎng)基清洗細(xì)胞3-4遍。每次加入培養(yǎng)基后，于24°C，125rpm條件下?lián)u15min，然后用5ml移液槍吸凈液體，再重復(fù)上述操作。之后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含300mg/L頭孢霉素的6，7-V固體培養(yǎng)基上。室溫條件下生長(zhǎng)兩周后再將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含300mg/L頭孢霉素和2.5mg/L潮霉素的培養(yǎng)基上。轉(zhuǎn)化結(jié)果分析曼地亞紅豆杉細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化(1)細(xì)胞培養(yǎng)周期中不同時(shí)間轉(zhuǎn)化對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響.選用不同生長(zhǎng)時(shí)期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化效率大不相同。如果在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的穩(wěn)定期(21天左右)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，細(xì)胞轉(zhuǎn)化率可高達(dá)100%;而在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的初期(15天左右)轉(zhuǎn)化，則很有可能轉(zhuǎn)化失?。蝗粼趯?duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期(30天左右)、延遲期或靜止期轉(zhuǎn)化，細(xì)胞轉(zhuǎn)化率僅在30%_40%左右。(2)共轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。紅豆杉細(xì)胞與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時(shí)間在2-3天為宜，如果超過3天，細(xì)胞很容易褐化死亡。(3)細(xì)胞懸浮天數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。我們采用懸浮培養(yǎng)14天，9天，3天，1天的細(xì)胞分別進(jìn)行轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)14天，9天的細(xì)胞極易褐化死亡而直接導(dǎo)致轉(zhuǎn)化失??；懸浮3天的細(xì)胞轉(zhuǎn)化后生長(zhǎng)狀態(tài)明顯差于懸浮培養(yǎng)l天的細(xì)胞。(4)農(nóng)桿菌的濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。農(nóng)桿菌的濃度對(duì)轉(zhuǎn)化也有一定的影響。如果農(nóng)桿菌在共培養(yǎng)的培養(yǎng)液中濃度過低(稀釋倍數(shù)2倍)，則紅豆杉的細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率會(huì)大大下降；若農(nóng)桿菌濃度過高(加入2.5ml液體培養(yǎng)基稀釋)，則會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，在本實(shí)驗(yàn)中農(nóng)桿菌稀釋倍數(shù)為l倍時(shí)實(shí)驗(yàn)效果最佳。在對(duì)報(bào)告基因的檢測(cè)中，經(jīng)過抗性篩選的轉(zhuǎn)化細(xì)胞GUS染色結(jié)果呈現(xiàn)藍(lán)色(圖5)。(5)PCR-Southern檢測(cè)取新鮮的愈傷細(xì)胞50mg，參照松科植物基因組總DNA的提取方法，用CTAB(2%)法(加6%PVP)提取基因組DNA。因?yàn)榧t豆杉富含多糖多酚類物質(zhì)，需采用改進(jìn)的CTAB法進(jìn)行基因組總DNA的提取。DNA的提取步驟如下(1)65t:水浴預(yù)熱2X的CTAB提取液(含2%!3-巰基乙醇，6^PVP);(2)在液氮中研磨樣品，轉(zhuǎn)入離心管，加入預(yù)熱好的CTAB提取液(每克樣品加入35ml的提取液)，65。C保溫lh，每隔1020min輕輕搖動(dòng)混勻;(3)于18°C，12000rpm條件下離心5min，取上清;(4)加入等體積酚:氯仿，充分混勻，于18°C，10000rpm條件下離心10min，取上清；(5)加入等體積氯仿，充分混勻，于18t:，10000rpm條件下離心10min，取上清；(6)加入0.6倍體積的異丙醇混勻，室溫放置，沉淀15min;(7)于18°C，12000rpm條件下離心6min，棄上清；(8)將沉淀用75%的乙醇洗20min，室溫條件下12000rpm離心2min，棄上清后重復(fù)上述操作；(9)將沉淀吹干，溶于150ulRNase水，37。C放置30min，除去RNA。(10)將提取產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，置于冰箱(-2(TC)保存待用。以提取的10ug基因組總DNA為模板，用擴(kuò)增目的基因的序列作為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性3min，94t:50s，56°C50s，72°C1.5min，35個(gè)循環(huán)，72"C延伸10min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，80V電泳24h，電泳緩沖液為1XTAE。瓊脂糖凝膠上的DNA片段經(jīng)堿變性后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上，8(TC烘烤2h使DNA與薄膜交聯(lián)。然后于42t:預(yù)雜交4h，接著加入地高辛標(biāo)記的外源目的基因片段作為探針進(jìn)行雜交，預(yù)雜交液成分為5XSSPE，5Xdenhardt試劑。(6)140H基因mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)利用RT-PCR技術(shù)半定量的檢測(cè)基因表達(dá)水平的變化。按Trizol說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)按照試劑盒說明書操作。參照140H基因的DNA序列設(shè)計(jì)引物F:5'GTGCTGTTGCTGGCATTGTT3'R:5'TCCTCATCGCTGCATGGATT3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增出800bp左右的目的基因片段；同時(shí)針對(duì)看家基因P-actin設(shè)計(jì)引物F:5，GTCCTCAGTGCTGTTGCTGG3，禾PR:R5，GCTGCATGGATTTCCTCTGT3，，預(yù)計(jì)擴(kuò)增出800bp左右的|3-actin基因片段。PCR參數(shù)94。C預(yù)變性2min，94。C變性30s，57t:退火30s，72t:延伸30s，35個(gè)循環(huán)，最后72t:延伸10min。PCR產(chǎn)物于3%瓊脂糖電泳，電壓80V，50min。(7)C-14氧取代的紫杉烷含量分析(1)紫杉烷類成分的提取。細(xì)胞于冷凍干燥機(jī)中(-5(TC)干燥至恒重，稱取O.2g，研磨，2ml甲醇浸提過夜后輔助超聲提取30min，細(xì)胞超聲破碎儀破碎細(xì)胞(50W，10s，10次，間隔15s)，腦g離心10min，取上清液。重復(fù)上述過程，合并兩次上清液，25。C干燥。再溶于2ml二氯甲烷，加等量水混勻，1700g離心10min，取二氯甲烷層，重復(fù)上述過程，合并兩次二氯甲烷層25t:干燥，0.5ml甲醇溶解待測(cè)。(2)紫杉烷類測(cè)定。將待測(cè)樣品用0.45u的濾膜過濾后進(jìn)行HPLC(Waters2487)分析。色譜柱為SunFire(150X4.6mm，5umparticlesize,C18)，柱恒溫40。C，流動(dòng)相為A:水B:100%乙睛，梯度洗脫，流速lml/min。進(jìn)樣量10ul，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。以保留時(shí)間定性，峰面積法定量樣品濃度為C樣品二S樣品XC標(biāo)品/S標(biāo)品梯度洗脫程序如下時(shí)間/min溶劑AA溶劑BA095550010055010075955\(8)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的鑒定PCR檢測(cè)結(jié)果(圖6)顯示實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系)在900bp附近擴(kuò)增出很亮的特異條帶，在進(jìn)一步的PCR-southern檢測(cè)中實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)了強(qiáng)雜交信號(hào)，而對(duì)照組則缺乏亮的雜交條帶，這證實(shí)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)取得成功(圖7)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果取PCR鑒定為陽性的細(xì)胞系進(jìn)行RT-PCR分析。結(jié)果顯示內(nèi)參基因P-actin在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中表達(dá)水平基本一致，而140H基因在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中的表達(dá)水平相對(duì)非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系發(fā)生顯著下降(圖8)。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中紫杉烷類含量HPLC分析結(jié)果以三種C-14位氧化紫杉烷類化合物sinenxanA、sinenxanC、Yunnanxane作為標(biāo)準(zhǔn)品(圖9)，每個(gè)樣品測(cè)定三次，應(yīng)用Empower軟件對(duì)得到的HPLC結(jié)果分析顯示，轉(zhuǎn)基因的紅豆杉細(xì)胞與對(duì)照相比三種紫杉烷的含量發(fā)生了較大的改變，其中紅豆杉細(xì)胞中主要的C-14氧取代紫杉烷SinenxanA下降60%左右，yunnanxane下降65%左右，sinenxanC下降21X左右(表1)。表1轉(zhuǎn)基因的紅豆杉細(xì)胞系與非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中三種C-14位氧化紫杉烷類化合物的含量的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本發(fā)明創(chuàng)造有如下優(yōu)點(diǎn)1.可以迅速、有效地抑制曼地亞紅豆杉細(xì)胞140H基因的表達(dá)。2.顯著地降低了曼地亞紅豆杉細(xì)胞中sinenxanA、sinenxanC、Yunnanxane這三種C-14位氧化紫杉烷的總含量，最高可降低到原來的這三種C-14位氧化紫杉烷總含量的47%。3.明顯地抑制了曼地亞紅豆杉細(xì)胞合成C-14位氧化紫杉烷的能力，有望使代謝流向紫杉醇(taxol)和及其前體巴可亭III(baccatinIII)等C_13位氧化紫杉烷(C_13oxygenatedtaxoids)，從而為提高紅豆杉細(xì)胞紫杉醇的生物合成產(chǎn)量提供一條新途徑。權(quán)利要求一種利用反義基因技術(shù)降低曼地亞紅豆杉細(xì)胞C-14位氧化紫杉烷含量的方法，其特征在于，它包括以下步驟a)從紅豆杉中克隆得到14β羥基化酶基因(簡(jiǎn)稱14OH)片段；b)構(gòu)建反義基因載體，載體宿主菌為根癌農(nóng)桿菌；c)轉(zhuǎn)化紅豆杉愈傷組織，轉(zhuǎn)化條件為將含有目的反義基因載體的根癌農(nóng)桿菌活化稀釋，轉(zhuǎn)化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期懸浮培養(yǎng)一天后的紅豆杉愈傷組織，共培養(yǎng)2-3天后，清洗，轉(zhuǎn)入含有抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；d)PCR和southern檢測(cè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；e)C-14氧取代的紫杉烷含量分析。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述方法，其特征在于C-14位氧化紫杉烷為sinenxanA、sinenxanC禾口Yu皿anxane。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于構(gòu)建反義基因載體所用的140H基因的引物是5'-GCGGAATTCTAGAATGGATGTCTTTTATCCGTTAA-3'(正義鏈)5'-GCTGGATCCATGAAGCAGCCCGGAAAAGTTGTC-3，(反義鏈)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降低曼地亞紅豆杉細(xì)胞C-14位氧化紫杉烷含量的方法，其特征在于根癌農(nóng)桿菌活化步驟如下a)在LB+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平的培養(yǎng)基上篩選攜帶外源基因的農(nóng)桿菌GV3101;b)挑取該單菌落置于2mlLB液體培養(yǎng)基中，28t:，250rpm條件下培養(yǎng)兩天；c)取培養(yǎng)后的菌液250ul放入25mlLB液體培養(yǎng)基中，28°C，250rpm條件下培養(yǎng)過夜。5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的降低曼地亞紅豆杉細(xì)胞C-14位氧化紫杉烷含量的方法，其特征在于載體宿主菌為根癌農(nóng)桿菌GV3101。6.根據(jù)權(quán)利要求l-5任一所述的方法，其特征在于曼地亞紅豆杉細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化所采用的培養(yǎng)基為6，7-V培養(yǎng)基。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中C-14氧取代的紫杉烷含量采用HPLC方法分析。全文摘要本發(fā)明涉及一種有效降低曼地亞紅豆杉(Taxusxmedia)細(xì)胞合成C-14位氧化紫杉烷(C-14oxygenatedtaxoids)的方法，屬于基因工程的
技術(shù)領(lǐng)域：
，是通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙元載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將針對(duì)紅豆杉紫杉烷14β羥基化酶基因(簡(jiǎn)稱14OH)片段構(gòu)建的反義基因表達(dá)載體導(dǎo)入到曼地亞紅豆杉(Taxusxmedia)培養(yǎng)細(xì)胞中。利用優(yōu)化的轉(zhuǎn)化方法成功地獲得了轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。PCR-Southern雜交、RT-PCR基因表達(dá)分析和化學(xué)成分檢測(cè)結(jié)果顯示曼地亞紅豆杉細(xì)胞轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)取得成功，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中14OH基因mRNA表達(dá)水平發(fā)生顯著地下降。本發(fā)明顯著抑制了曼地亞紅豆杉細(xì)胞向C-14位氧化紫杉烷的流向，有望使代謝流向包括抗癌藥物紫杉醇(taxol)和及其前體巴可亭III(baccatinIII)在內(nèi)的C-13位氧化紫杉烷(C-13oxygenatedtaxoids)，從而為提高紫杉醇的生物合成產(chǎn)量提供一條新方法。文檔編號(hào)C12Q1/02GK101781648SQ20091000083公開日2010年7月21日申請(qǐng)日期2009年1月19日優(yōu)先權(quán)日2009年1月19日發(fā)明者李鳳嵐,胡新玲,邱德有申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所