專利名稱：表達(dá)輔酶A轉(zhuǎn)移酶及β-酮基硫解酶的工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程菌，具體地說是一種輔酶A轉(zhuǎn)移酶及 P-酮基硫解酶的表達(dá)工程菌，本發(fā)明還涉及該工程菌的構(gòu)建方法， 以及該菌在微生物生產(chǎn)乙酰乙酸鹽中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酮體(ketone bodies)是脂肪酸在肝臟進(jìn)行正常分解代謝所生成的 特殊中間產(chǎn)物，包括三種水溶性成分乙酰乙酸(acetoacetic acid約 占30%)，卩-羥丁酸(卩-hydroxybutyric acid約占70%)和極少量的丙酮 (acetone) (Laffel L， Ketone bodies: a review of physiology, pathophysiology and application of monitoring to diabetes. Diabetes/metabolism research and reviews, 1999， 15(6): 412-426)，結(jié)構(gòu) 式及相互關(guān)系見圖l。理論上講，P-羥丁酸并不屬于酮類，但它經(jīng)常 與其它兩種物質(zhì)伴隨出現(xiàn)，因而統(tǒng)稱為酮體。
正常人血液中酮體含量極少，這是人體利用脂肪氧化供能的正 ?，F(xiàn)象。在某些生理情況(饑餓、禁食)或病理情況下(如糖尿病), 糖的來源或氧化供能障礙，脂動(dòng)員增強(qiáng)，脂肪酸就成了人體的主要 供能物質(zhì)，以酮體的形式作為機(jī)體能量來源有著特殊的意義。但是， 若肝中生成酮體的量超過肝外組織利用酮體的能力，二者之間失去 平衡，血中濃度就會(huì)過高，導(dǎo)致酮血癥(acetonemia)和酮尿癥 (acetonuria)。
乙酰乙酸(acetoacetic acid)是酮體的重要組成成分之一，是最 簡單的J3-酮酸，為無色油狀或漿狀液體，或晶體，能與水、醇任意 混合，是一種有機(jī)弱酸，pKa為3.7。分子量102.09 g/mol,熔點(diǎn)36.5 °C。結(jié)構(gòu)式如式(I)所示<formula>formula see original document page 4</formula>
研究表明，乙酰乙酸及其衍生物有著重要的醫(yī)用前景。目前， 對乙酰乙酸及其衍生物的直接利用還很有限，但是，隨著進(jìn)一步研 究的進(jìn)行，對于乙酰乙酸及其衍生物的醫(yī)學(xué)應(yīng)用將越來越廣泛。
與其他(3-酮酸一樣，乙酰乙酸很不穩(wěn)定。它容易分解為丙酮和 二氧化碳，反應(yīng)式見式II。當(dāng)乙酰乙酸以酸的形式存在時(shí)，在37°C 水中它的半衰期為140min，而在堿性環(huán)境下(以陰離子形式存在)， 半衰期為130h，比它的酸式降解速度慢50倍以上(Hay R W, " Kinetics of decarboxilation of acetoacetic acid. Aust. J. Chem, 1967, 20 (9): 1823-1828)。
CH3COCH2COOH — CH3COCH3 + C02 + H20 ( n )
目前，主要通過乙酰乙酸乙酯在稀堿溶液中加熱水解生成乙酰 乙酸鹽，然后酸化來制備乙酰乙酸(Robert C, a/., Crystalline Acetoacetic Acid. Journal of the American Chemical Society, 1952, 74 (21): 5536-5536)。但是由于乙酰乙酸鹽不穩(wěn)定，生產(chǎn)條件嚴(yán)格，所以 工業(yè)上沒有很好的生產(chǎn)方法。一般來說，乙酰乙酸的制備在'O'C進(jìn)行， 牽'J備后立即使用(George A. a/., Methylglyoxal-co-Phenylhydrazone. Organic Syntheses, 1963, 4: 633)。
相對于純化學(xué)途徑合成有機(jī)物，用生物合成的方法具有一系列 的優(yōu)點(diǎn)，包括經(jīng)濟(jì)消耗低，對環(huán)境的污染少，反應(yīng)條件寬松(37'C 和標(biāo)準(zhǔn)大氣壓)等等。另外，化學(xué)方法生產(chǎn)乙酰乙酸需要強(qiáng)堿性環(huán) 境，合成的強(qiáng)堿性產(chǎn)品不適于醫(yī)療應(yīng)用，微生物方法是在中性偏堿 的條件下合成乙酰乙酸，這顯示出相對于化學(xué)合成巨大的優(yōu)點(diǎn)。而 且隨著人們生活水平的提高，生物合成安全、副作用小的優(yōu)點(diǎn)越來 越受到重視。目前還沒有利用微生物方法生產(chǎn)乙酰乙酸鹽的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于表達(dá)P-酮基硫解酶和3-酮酸-輔酶 A轉(zhuǎn)移酶的專用表達(dá)工程菌。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種表達(dá)載體，其含有P-酮 基硫解酶的基因(/ /2"J)及3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶(Mo"B)基因。 所述表達(dá)載體是將P-酮基硫解酶的基因(戶/2")及3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn) 移酶基因(MO"S)克隆到表達(dá)載體中獲得。
進(jìn)一步將所述表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌，獲得能夠表達(dá)本發(fā)明所提 供的P-酮基硫解酶及3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的專用表達(dá)工程菌。所述 宿主可以是大腸桿菌(&c/^Wc/2/a);所述P-酮基硫解酶基因及3-酮 酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因分別為NCBI GenBank號為NC—008313.所述的 / 編(REGION:1559207..1560388)、 W6—J"37 (腳亂REGION: 1445890..1446591 )基因。
所述用于構(gòu)建含有P-酮基硫解酶及3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因的 表達(dá)載體的出發(fā)載體為任一可在大腸桿菌中表達(dá)外源基因的表達(dá)載 體，如pBBRlMCS-2 ( NCBI GenBank號為U23751 )， pBBRlMCS-5 (NCBIGenBank號為U25061; )， pBBRlMCS-3 ( NCBI GenBank號 為U25059 )。(文獻(xiàn)來源Kovach，M.E., Phillips，R.W., Elzer，P.H., Roop，R.M. and Peterson,K.M. pBBRlMCS: a broad-host-range cloning vector, BioTechniques 16 (5), 800-802 (1994) ; Michael E. Kovach, Philip H. Elzer， *, D. Steven Hill, Gregory T, Robertson, Michael A. Farris, R. Martin Roop, II and Kenneth M. Peterson, Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes, Gene， Volume 166， Issue 1， 1， Pages 175-176可求得)
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，以pBBRlMCS-2為出發(fā)載體，構(gòu)建得 到含有P-酮基硫解酶及3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)載體，其為pHD03。
上述含有P-酮基硫解酶及3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)載體 可按照生物工程領(lǐng)域中的常規(guī)方法構(gòu)建，如參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指 南》中的構(gòu)建方法構(gòu)建。
所述大腸桿菌宿主菌的選擇是多種多樣的，如^c/7"/c/2Z'fl CO//
ToplO、 Esc/zm'c/z/a co// S17-l ( Sambrook J， d "/,， Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 )。
可釆用生物工程領(lǐng)域中常用的方法將含有p-酮基硫解酶及3-酮 酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化假單胞菌宿主菌，如接合轉(zhuǎn)化 法、電擊轉(zhuǎn)化法、氯化鋰轉(zhuǎn)化法或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法等，優(yōu)選為接合 轉(zhuǎn)化法。
本發(fā)明的另 一個(gè)目的是提供上述工程菌在制備乙酰乙酸鹽 (ACAC)中的應(yīng)用。
乙酰乙酸鹽的制備是發(fā)酵上述(3-酮基硫解酶及3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn) 移酶的專用表達(dá)工程菌，獲得(3-酮基硫解酶及3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶， 底物為葡萄糖及琥珀酸鹽的溶液，發(fā)酵得到乙酰乙酸鹽。
可釆用大腸桿菌的常規(guī)培養(yǎng)條件對重組大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)。
在發(fā)酵罐發(fā)酵中，可釆用如下培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵罐底成分10-15 g/L酵母浸出物，8-12g/L胰蛋白胨，8-12g/LNaCl， 28-32 g/L葡萄 糖，2-3g/L琥珀酸鈉和8-12g/L磷酸氫二鉀，其余為水；補(bǔ)料成分 600-800g/L葡萄糖和200-400g/L琥珀酸鈉。
在實(shí)際培養(yǎng)過程中，可向上述培養(yǎng)基中再添加一定濃度的抗生 素以維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，如50)ig/mL硫酸卡那霉素。
發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵溫度為34-38, pH值為7.0-8.5。優(yōu)選發(fā)酵溫度為 37°C, pH值為8.0。
可釆用流加或分批補(bǔ)加的方式，將葡萄糖600g/L及琥珀酸鹽
6100g/L溶液加入發(fā)酵液中。釆用流加方法時(shí)，流加速度按照每L培 養(yǎng)基10-15mL/h;釆用分批補(bǔ)加方式時(shí)，可在糖濃度低于10g/L時(shí) 加入底物葡萄糖及琥珀酸鹽的溶液。
本發(fā)明提供了一種P-酮基硫解酶及3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的專用 表達(dá)工程菌。該工程菌是利用基因工程技術(shù)構(gòu)建出含有p/2"及
的質(zhì)粒，然后將其導(dǎo)入大腸桿菌中，獲得的重組大腸桿菌。 此外，搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的工程菌可高效表達(dá)3-酮酸輔酶A 轉(zhuǎn)移酶，并可將底物葡萄糖及琥珀酸鹽轉(zhuǎn)化成ACAC，轉(zhuǎn)化效率較 高。小型發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)表明將本發(fā)明的工程菌在6L發(fā)酵罐中發(fā)酵后， DHCD的產(chǎn)量最高可達(dá)2.2g/L以上，且生產(chǎn)工藝簡單，成本低廉， 應(yīng)用前景廣闊。


圖1顯示的是三種酮體的結(jié)構(gòu)式及轉(zhuǎn)化關(guān)系； 圖2為質(zhì)粒pHD03的物理圖譜。
圖3顯示的是菌落PCR篩選陽性克隆，其中M: 1 kb DNALadder; 1, 2， 3:連有oxcL4B及/7/za力基因的陽性克?。?:陰性克隆。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明 的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步 驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所 熟知的常規(guī)手段；所用酶試劑均購自MBIFermentas公司，提取質(zhì)粒 所用的試劑盒購自北京新長江生物科技有限公司，回收DNA片斷所 用的試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，相應(yīng)的操作步驟按 照產(chǎn)品說明書進(jìn)行；所有培養(yǎng)基如無特別說明均用去離子水配制。
本發(fā)明中的溶氧是6升發(fā)酵罐(NBSBioflo 3000， New Brunswick Scientific, U.S.A.)探頭獲得的結(jié)果，即指在l大氣壓，25。C時(shí)，按照C*=0.2mmol/L (發(fā)酵液中)來計(jì)算溶氧率。 培養(yǎng)基配方
1) 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基
葡萄糖琥珀酸鈉培養(yǎng)基，命名為LBGS。含5g/L酵母浸出物， 10g/L胰蛋白胨，10g/LNaCl， 20 g/L葡萄糖和2 g/L琥珀酸鈉，其 余為水。調(diào)pH值至7.0-7.2，高壓蒸汽滅菌。
2) 6升發(fā)酵罐(NBS Bioflo 3000， New Brunswick Scientific, U.S.A.)。初始培養(yǎng)基體積為3L。
罐底成分如下15g/L酵母浸出物，10g/L胰蛋白胨，10 g/L NaCl， 30g/L葡萄糖，2g/L琥珀酸鈉和10g/L磷酸氫二鉀，其余為 水。
補(bǔ)料成分如下800g/L葡萄糖和300g/L琥珀酸鈉。 在實(shí)際培養(yǎng)過程中，可向上述培養(yǎng)基中再添加一定濃度的抗生 素以維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，如50pg/mL硫酸卡那霉素。
實(shí)施例1、 P-酮基硫解酶及3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶專用表達(dá)工程菌的 構(gòu)建
一、含有p-酮基硫解酶基因(P/wJ)及3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶基 因"oc"B)的表達(dá)載體的構(gòu)建
1 )提取羅氏真養(yǎng)菌(i^&to"/aeM加/ /^H16X ATCC編號17699, 可購自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection))的基因 組(Pohlmann Anne， a/" Genome sequence of the bioplastic-producing "Knallgas" bacterium i a/Wom'a ew/ra—a HI6. Journal Nat Biotechnol. 2006， 24: 1257-1262),以兄e^rap/w H16基因組為模板，用p/w酶進(jìn) 行PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因并在片段前加入SD序列 (Shine-Dalgarno sequence )。 引物為
Sense: 5' AAGCTTy^04GCGAAGCATGAACAAGGTCTAC 3' 歷"dIII SDAntise脆5' GGAGCTCAGCCCGCTTACAGCA 3
PCR反應(yīng)條件
1. 94。C預(yù)變性8min;
2. 94。C變性30sec;
3. 68士2。C退火30sec;
4. 72。C延伸lmin24sec;
5. 重復(fù)步驟2-4， 29次循環(huán)；
6. 72。C后延伸10min。
PCR擴(kuò)增目的片斷(20pL體系)
模版DNA 0.4^L
引物l 0.5pL
引物2 0.5pL
p/w buffer 2.0^iL，酶 0早
dNTP 1.5fiL
d線O 14.9(iL
PCR擴(kuò)增體系配制時(shí)，DNA聚合酶最后加入。 將回收后的^c"5片段連入平端克隆載體pEASY-Blunt,構(gòu)建 的質(zhì)粒記為pHDOl。把pHDOl轉(zhuǎn)化入五.co/ZTop10中保存，并通過
細(xì)菌增殖進(jìn)一步擴(kuò)增。
2 )pBHR68 ( Spiekermann P, Rehm BHA, Kalscheuer R, Baumeister D,Steinbiichel A (1999) A sensitive, viable-colony staining method using Nile red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other storage corn-pounds. Arch Microbiol 171:73—80 )質(zhì)粒中含有R. eutropha H16的phaA基因，以 pBHR68質(zhì)粒為模板，用pfu酶進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。 引物為Sense: 5' GGTACCMGG^CTACACAATGACTGACGTTGTCATCG 3'
一I SD Antisense: 5' GGAGCTCAGCCCGCTTACAGCA 3' 歷"dIII
反應(yīng)程序94。C預(yù)變性8min; 94。C變性30sec， 70。C退火30sec, 72。C延伸lmin24sec， 29個(gè)循環(huán);72。C后延伸10min。 PCR擴(kuò)增目的片斷(20jiL體系)
模版DNA 0.4pL
引物l 0.5nL
引物2 0早
buffer 2.0joL
; /m酶 0.2jiL
dNTP 1,5jiL
ddH20 14攀
PCR擴(kuò)增體系配制時(shí)，DNA聚合酶最后加入。
PCR產(chǎn)物回收后連入克隆載體pEASY-Blunt，構(gòu)建的質(zhì)粒記為 pHD02,把pHD02轉(zhuǎn)化入￡. co//ToplO中保存，并通過細(xì)菌增殖進(jìn) 一步擴(kuò)增。
3) 提取pHD01、 pHD02、 pBBRlMCS2質(zhì)粒；用限制性內(nèi)切酶 歷wdIII和五coRV酶切質(zhì)粒pHDOl，回收so"^B基因酶切片斷；用 限制性內(nèi)切酶五coRV和BamHI酶切質(zhì)粒pHD02,回收/ /z^4基因酶 切片斷；用限制性內(nèi)切酶歷"dIII和石amHI酶切載體質(zhì)粒 pBBRlMCS2，回收酶切片斷；將回收的/ /w」和ko"5基因片斷與 PBBR1MCS2載體片段用DNA連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物用電轉(zhuǎn) 化的方法導(dǎo)入到E co"TOP10 (北京全式金生物技術(shù)有限公司)中， 將轉(zhuǎn)化子涂布于LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在37。C、 200rpm下?lián)u床 培養(yǎng)12h;
4) 挑取在LB-Km固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種到 LB-Km液體培養(yǎng)基中，在37。C、 200 rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶/7/mini、 B"mHI和五coRV對質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒 定，陽性質(zhì)粒經(jīng)酶切后可產(chǎn)生大小約為1.4kb、 1.2kb及5.1kb的DNA 片斷，將構(gòu)建正確的含有/^"j和mo"5基因片段的大腸桿菌表達(dá) 載體命名為pHD03，其物理圖譜見圖2。
二、P-酮基硫解酶及3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶專用表達(dá)工程菌五.co// TOP10 ( pHD03 )及五.co// S17-l (pHD03 )的獲得
將步驟一構(gòu)建的含有和"o"5基因片段的表達(dá)載體 pHD03用化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到co/ZTOP10,用電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到co// S17-l ( ATCC編號:47055,可購自美國菌種保藏中心(AmericanType Culture Collection))。
用化學(xué)轉(zhuǎn)化法把質(zhì)粒pHD03轉(zhuǎn)化入￡. co"Top10中，菌落PCR 方法篩選陽性克隆，電泳結(jié)果如圖3所示。
用五coRV、 5awHI及歷mini酶切驗(yàn)證，片段大小也符合預(yù)期。 通過DNA測序結(jié)果比對，證明質(zhì)粒pHD03構(gòu)建成功。重組菌為￡. co/z' Top 10 (pHD03 )。
構(gòu)建的質(zhì)粒pHD03被用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入五.co/ZS17-l中。從 重組菌中提取質(zhì)粒，用五coRV、萬"附111及///"(1111酶切驗(yàn)證，酶切得 到大小符合預(yù)期的三段DNA片段，說明pHD03已經(jīng)被成功轉(zhuǎn)入上 述菌中。
實(shí)施例2、 P-酮基硫解酶及3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶專用表達(dá)工程菌表 達(dá)的3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的酶活測定
用下述方法檢測實(shí)施例1構(gòu)建的3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶專用表達(dá) 工程菌及對對照菌株表達(dá)3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的酶活，具體方法如 下
1)制備細(xì)菌總蛋白裂解液
a)將100mL所需菌液于4。C離心，收集細(xì)胞，棄上清。b) 將細(xì)胞用50mMTris-HCl緩沖液(pH 8.0 )洗滌2次， 離心收集細(xì)胞后，充分重懸于10mL的50 mM Tris-HCl 緩沖液(pH8.0)中。
c) 將懸液容器置于冰上，低溫條件下進(jìn)行超聲破碎。
d) 4°C、 10000 rpm，離心10min。上清液即為細(xì)菌總蛋白 裂解液，將其移至新的離心管中低溫保存?zhèn)溆谩３恋砦餅?細(xì)胞碎片，棄去。
2) 用考馬斯亮藍(lán)染色法(Bradford法)測定蛋白質(zhì)濃度(Bradford M M， A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal. Biochem， 1976， 72:248-254),測定總蛋白含量為0.817mg/ml。
3) 測定琥珀酸3-酮酸-輔酶A轉(zhuǎn)移酶(OxctAB)酶活 OxctAB酶活單位的定義是在25。C下，每分鐘生成0.0025 pmol
乙酰乙酰輔酶A為一個(gè)單位U。本例以菌體總蛋白裂解液為對象， 測定OxctAB的比活力(用OxctAB酶活除以測定溶液中總蛋白含量， 就得到OxctAB的比活力。嚴(yán)格的說應(yīng)該測定OxctAB酶的量，但實(shí) 際操作中一般測定總蛋白來作為參照)。酶活測定需要的試劑是0.1 MTris-HCl ( pH 8.0 )緩沖液、0.25 M MgCl2溶液、670mM乙酰乙 酸鋰溶液、6mM琥珀酰輔酶A溶液和去離子水(Corthesy-Theulaz IE, a/.， Cloning and characterization of //e//co6ac er "/o"' succinyl CoA: acetoacetate CoA-transferase, a novel prokaryotic member of the CoA-transferase family. The Journal of Biological Chemistry, 1997， 272(41): 25659-25667)。通過測定乙酰乙酰輔酶A在303nm的特定吸 收峰來測定OxctAB的酶活。
酶活測定結(jié)果如表1所示，表明3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶專用表達(dá) 工程菌可正確穩(wěn)定表達(dá)3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶。
表1 co//Topl0重組菌及對照菌中OxctAB酶活測定
菌種(所含質(zhì)粒；表達(dá)的外源基因)酶的比活力(U/mg)
對照菌(pBBRlMCS2;無)1.37
12重組菌(pHD01;oxrfAB&) 53.21 重組菌(pHD03;;^^4,o;cc"5fe) 47.77
實(shí)施例3、用五"臉WcA/tf ToplO (pHD03)生產(chǎn)ACAC的搖瓶實(shí) 驗(yàn)
為了確定重組菌中ACAC合成量，以及各種處理?xiàng)l件下的濃度 差異，運(yùn)用HS-GC儀，PID檢測方法對實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行檢測。
各菌種(co/z' Top10(無)、五.co// Top10 ( pBBRlMCS2 )、 co/z' Top10 (pHD03))分別用LB培養(yǎng)基，37°C, 200rpm過夜培養(yǎng)；然 后按5%接種量(v/v),分別接種至100mLLBGS培養(yǎng)基(即葡萄糖 琥珀酸鈉培養(yǎng)基，含5g/L酵母浸出物，10g/L胰蛋白胨，10 g/L NaCl, 20g/L葡萄糖和2g/L琥珀酸鈉，其佘為水，pH 7.0-7.2 )， 37 。C ， 200rpm,搖瓶培養(yǎng)36小時(shí)，接種8 h后力口 IPTG至終濃度lmmol/L 誘導(dǎo)，每個(gè)菌種設(shè)置三組平行。運(yùn)用HS-GC儀，PID檢測方法 (Lopez-Soriano F J， Argiles J M. Simultaneous determination of ketone bodies in biological samples by gas chromatographic headspace analysis[J]. Journal of Chromatographic Science, 1985, 23: 120-122.)對 實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行檢測。
表2搖瓶培養(yǎng)的HS-GC檢測結(jié)果
樣品ACAC定量結(jié)果( 上清mg/L ) 菌液細(xì)胞破碎
￡ co// ToplO (無)8.63±0.797.95±0.91
co" ToplO (pBBRlMCS2 )10.85±0.8111.28±0.76
co/z'ToplO a (pHD03)32L16±27.70326.53±30.12
co//ToplO b (pHD03)303.71±23.20310.28±28.77
由表2的測定結(jié)果可以看出，帶有pHD03質(zhì)粒的細(xì)菌ACAC產(chǎn) 量要顯著高于帶pBBRlMCS2質(zhì)粒的同種細(xì)菌，說明ojcc"B及 基因的導(dǎo)入改變了 co//ToplO菌株合成ACAC的能力，同時(shí)也證 明了表達(dá)質(zhì)粒pHD03構(gòu)建成功。
此外，破碎處理的菌液與上清中ACAC濃度基本相同，說明產(chǎn)生的乙酰乙酸傾向于被細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外。
實(shí)施例4、重組菌五sc/^r/c似"ToplO (pHD03)生產(chǎn)ACAC的小 型發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)
菌種在20mL抗性LB培養(yǎng)基(含50)ig/mL硫酸卡那霉素)中 37°C， 200rpm培養(yǎng)12 h以上，獲得一級種子；接種量為5 %(V/V) 將一級種子接種至lOOmL抗性LB培養(yǎng)基中37°C， 200rpm培養(yǎng)12 h，獲得二級種子；再以接種量為10。/。(V/V)進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)。
發(fā)酵罐初始設(shè)定空氣流速3L/min,即通氣量為1;設(shè)定溫度 為37°C,用5M氫氧化鈉和硫酸調(diào)pH，設(shè)定發(fā)酵罐的p1^8.0，均采 用P-I-D監(jiān)測；溶氧控制為30%，與攪拌速度耦聯(lián)，攪拌速度控制范 圍為200-800 rpm之間。值得注意的是，發(fā)酵時(shí)pH設(shè)定為8.0，是為 了利用偏堿性的發(fā)酵條件減弱ACAC的脫羧。
將葡萄糖及琥珀酸鹽的溶液加入發(fā)酵液中的方式為分批補(bǔ)加； 培養(yǎng)過程中，用糖試紙測糖濃度低于10g/L時(shí)，補(bǔ)加葡萄糖一瓶 (600g/L， 100mL ),琥珀酸鈉 一瓶(100g/L， 50mL )。
用酮體試紙大致監(jiān)測乙酰乙酸鹽濃度，當(dāng)乙酰乙酸鹽濃度變化 進(jìn)入平臺期，終止發(fā)酵。
發(fā)酵過程中，細(xì)菌生長正常。細(xì)菌在發(fā)酵17h時(shí)達(dá)到CDW(菌 體干重)最大值，接近llg/L。細(xì)菌對數(shù)生長期時(shí)，發(fā)酵液中迅速積 累ACAC，產(chǎn)物濃度峰值達(dá)到2.2g/L。發(fā)酵20h后，ACAC的積累 進(jìn)入平臺期。35h后，ACAC積累量減少。<formula>formula see original document page 15</formula><formula>formula see original document page 16</formula>
權(quán)利要求
1、一種表達(dá)載體，其含有β-酮基硫解酶基因和3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因。
2、 如權(quán)利要求l所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述P-酮基硫解酶基因具有SEQIDNo.l所示的核苷酸序列。
3、 如權(quán)利要求l所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因具有SEQIDNo,2所示的核苷酸序列。
4、 如權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體的出發(fā)載體為pBBRlMCS-2 、 pBBRlMCS-5或pBBRlMCS隱3。
5、 如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其為pHD03。
6、 含有權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)表達(dá)載體的工程菌。
7、 如權(quán)利要求6所述的工程菌，其為大場桿菌。
8、 如權(quán)利要求6所述的工程菌，其特征在于，所述大腸桿菌為^&c/zm'c/n'a co// Top 10或E^c/^z'c/n'a co// S17-1 。
9、 權(quán)利要求6 8任一項(xiàng)所述工程菌在制備乙酰乙酸鹽中的應(yīng)用。
10、 一種制備乙酰乙酸鹽的方法，其是在含有底物葡萄糖及琥祐酸鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵權(quán)利要求6 8任一所述的工程菌，從所得培養(yǎng)物中分離獲得乙酰乙酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明公開了表達(dá)β-酮基硫解酶及3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的工程菌及其應(yīng)用，特別是涉及一種β-酮基硫解酶及3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的專用表達(dá)工程菌與該工程菌在生產(chǎn)乙酰乙酸鹽的應(yīng)用。該工程菌是將含有β-酮基硫解酶及3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中得到的。本發(fā)明還提供一種乙酰乙酸鹽的制備方法，其是發(fā)酵所述表達(dá)β-酮基硫解酶及3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的工程菌，獲得β-酮基硫解酶及3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶，再加入底物葡萄糖及琥珀酸鹽的溶液，發(fā)酵得到乙酰乙酸鹽。本發(fā)明β-酮基硫解酶及3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的專用表達(dá)工程菌將在ACAC的工業(yè)化生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12N15/63GK101475956SQ20091000159
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月30日
發(fā)明者瓊 吳, 石振宇, 碟 胡, 陳國強(qiáng), 陳金春 申請人:清華大學(xué)