專利名稱：：編碼β-半乳糖苷酶的基因及其表達(dá)和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種編碼P-半乳糖苷酶的基因，尤其涉及一種編碼P_半乳糖香酶基因的克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究，屬于酶的基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：牛乳與乳制品含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物以及幾乎全部已知的維生素和多種礦物質(zhì)，尤其是其釣含量高且4丐磷比例適當(dāng)，易被人體消化吸收，還含有免疫球蛋白等抗病因子，是人類(lèi)增強(qiáng)體質(zhì)的理想食品。乳糖是牛奶和乳清中的主要成分，乳糖約占牛奶干物質(zhì)的30%，但溶解度低，在20。C水中溶解度僅為20%，而其甜度僅及蔗糖的16%，久貯的乳制品由于乳糖析出，呈砂樣感覺(jué)，影響風(fēng)味。此外，許多成人，特別是嬰兒(因人種而異，西歐占2-8%,亞洲、非洲占60-90%)由于體內(nèi)缺乏P-半乳糖苦酶，因此他們很難消化牛奶，飲用牛奶后，乳糖到了腸里，被腸道細(xì)菌分解發(fā)酵，產(chǎn)生大量二氧化碳?xì)怏w，使腸道膨脹，并興奮腸道蠕動(dòng)，使收縮加強(qiáng)，造成腸鳴和腹瀉，這種疾病稱作乳糖不耐受癥(BerkaRandyM.,Hucul,JohnA.，Ward,Michael.Increasedproductionofbeta-galactosidaseinA/ergz7/z^USpatent,5736374,1998,47)。利用外源性P-半乳糖苷酶將乳糖降解為易被人體吸收利用的單糖，水解條件溫和、產(chǎn)物簡(jiǎn)單、口感好，且不會(huì)破壞牛乳中其他營(yíng)養(yǎng)成分，是目前在低乳糖乳品加工中所釆用的最好方法。P-半乳糖苷酶(I3-D半乳糖苷半乳糖水解酶，P-D-galactosidegalactohydrolase,EC3.2.1.23)通常被稱為乳糖酶(Lactase)。|3-半乳糖苷酶能將乳糖水解成為半乳糖和葡萄糖，同時(shí)具有半乳糖苷的轉(zhuǎn)移作用(張樹(shù)政主編.酶制劑工業(yè)下冊(cè).北京科學(xué)出版社，1984,818-819),可用來(lái)生產(chǎn)低聚半乳糖。葡萄糖是人體各部分代謝的能量來(lái)源，半乳糖則是人大腦和粘膜組織代謝時(shí)所必需的結(jié)構(gòu)糖，是嬰兒大腦發(fā)育的必要組織，與嬰兒大腦迅速生長(zhǎng)有著密切的聯(lián)系。通過(guò)轉(zhuǎn)糖苷作用生成的低聚糖，是一種低分子量，不粘稠的水溶性膳食纖維，它在人體腸道內(nèi)作為益菌增殖因子僅能被雙歧桿4菌所利用，卻不被腐敗細(xì)菌所利用，如此可大大地減少腸道內(nèi)有害毒素物質(zhì)的產(chǎn)生，對(duì)預(yù)防便秘和腹瀉有很好的作用(秦立虎，韓啟文，張洪穎.P-半乳糖苷酶的作用及其在乳品工業(yè)中的應(yīng)用.中國(guó)奶牛，2007，6:46~48)，可廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域，目前已成為P-半乳糖苷酶應(yīng)用研究的另一熱點(diǎn)。目前，商品化的半乳糖苷酶主要來(lái)源于微生物湘尺孝亮等著，酶應(yīng)用手冊(cè)，上海科學(xué)技術(shù)出版社，1989，407~414)。例如來(lái)源于大腸桿菌(丑scijeric/3iaco』i)、黑曲霉C4spergi〃us/n'ger)、克魯維斯酵母(Uuyrero/nyces2actis)及臭曲霉Usperg川i;sfoet油s)等。在研究蛋白質(zhì)合成及遺傳因子抑制的關(guān)系中，廣泛應(yīng)用的大腸桿菌P-半乳糖苷酶是第一個(gè)被結(jié)晶的P-半乳糖苷酶，分子量為850,OOODa。大腸桿菌的酶最適pH為7.0,但在Na+存在下最適pH變?yōu)?.6。在乳品及其他食品工業(yè)中獲得有效應(yīng)用的P-半乳糖苷酶主要是由克魯維斯氏酵母(inuj^erofflycesia"is)和曲霉中得到的。克魯維斯氏酵母是從牛乳中分離到的，其產(chǎn)生的13-半乳糖苷酶最適pH與新鮮牛乳的天然pH(6.6~6.8)相近，主要適用于分解牛乳及脫脂奶粉中的乳糖。該酶在pH6.2~7.0穩(wěn)定，6.2-7.0以上或以下酶活迅速下降。最適溫度為35~40°C。分子量為135000Da。40。C處理lhr,pH在6.5~8.5之間穩(wěn)定，即使處理3hr也同樣穩(wěn)定，處理24hrpH78穩(wěn)定。40。C以上就急劇失活。Ca2+、Cu2+、Fe2+可以使酶失活，Mn2+、Mg2+可恢復(fù)Ca2+對(duì)酶的抑制，K+單獨(dú)存在就可以大大提高酶的熱穩(wěn)定性(謝毅等，復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1999，Vo1.38,No.5:523-528)。以0NPG(鄰硝基苯酚-P-D半乳糖苦)為底物，40。C反應(yīng)3min，Km為2.78mmol/L，最大反應(yīng)速度為0.lumol/min，酶的水解產(chǎn)物半乳糖對(duì)酶的活性有強(qiáng)烈的抑制作用，值得注意的是，核糖的抑制作用也極為強(qiáng)烈，但其機(jī)理尚不清楚(沈?yàn)槿旱?，生物工程學(xué)報(bào)，1993，9(4):348354;DicksonRCetal.，JournalofBacteriology,1980,142(3):777785)。從黑曲霉所得的P-半乳糖苷酶pH較低，而且在高溫下有活性。分子量為1060G0Da,最適溫度60°C，最適pH在3.5~4.0。精制酶在pH4~8穩(wěn)定，粗酶在pH2.2~8穩(wěn)定，以O(shè)NPG和乳糖為底物，Km分別為7.2X10-4M,1.8X10-2M，最大反應(yīng)速度分別為86.7umol/min/mg和121.9咖ol/min/mg(LEEetal.,ArchivesofBiochemistryandBiophysics,1970,138:264271;AKASAKIM,etal.,J.Biochem,1976,80:11951200)。酶的穩(wěn)定與激活，均不需要金屬離子。Mg2+能抑制活性。螯合劑使酶鈍化，對(duì)微量的重金屬離子也不顯示敏感。硝基酚疏基半乳糖苷(半乳糖酸內(nèi)酯)(TANAKA，etal.，J.Biochem,1975，77:241-247)及半乳糖是強(qiáng)抑制劑。從霉菌來(lái)的P-半乳糖苷酶的最大特點(diǎn)是熱穩(wěn)定性高，最適pH值低，這樣在食品工業(yè)上就不容易受到微生物的污染，更具有應(yīng)用價(jià)值?；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展為用微生物合成、生產(chǎn)和改造外源蛋白展示出廣闊的前景。利用基因工程技術(shù)，我們可以從自然界豐富微生物資源中篩選獲得目的菌抹，克隆獲得P-半乳糖苷酶基因，特別是可以通過(guò)建立基因組文庫(kù)的方法克隆獲得實(shí)驗(yàn)室環(huán)境不能培養(yǎng)的微生物的P-半乳糖苷酶基因，將有優(yōu)良酶學(xué)性質(zhì)的不同來(lái)源的P-半乳糖苷酶異源表達(dá)或?qū)?3-半乳糖苷酶在分子水平進(jìn)行改造，則可進(jìn)一步推動(dòng)P-半乳糖苷酶制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用。1998年，Berka將產(chǎn)P-半乳糖苷酶的AoiyazeCCC28通過(guò)紫外誘變、NTG誘變處理獲得半乳糖苷酶表達(dá)量較高的突變林CCC161(ATCC74285)(親本|3-半乳糖苦酶分泌量為5U/ml,突變抹分泌量為50U/ml)，以其為受體，將其自身的P-半乳糖苷酶基因至于Ga〃啟動(dòng)子之下，導(dǎo)入其中，陽(yáng)性克隆子中的P-半乳糖苷酶蛋白表達(dá)量為lmg/ml發(fā)酵液，p-半乳糖苷酶活性達(dá)500U/ml以上，比原始菌提高了IOO倍(BerkaRandyM.，Hucul，JohnA.,Ward，Michael.Increasedproductionofbeta-galactosidaseinAspergillusoryzae.USpatent,5736374，1998,47)。1997年，M.Becerra利用受體菌的特殊性質(zhì)來(lái)提高胞內(nèi)P-半乳糖苷酶的提取率或簡(jiǎn)化分離純化工藝。他利用熱敏型自溶酵母突變體(蛋白酶缺陷)S.cereWsiae異源表達(dá)(_/actis的|3-半乳糖苷酶，轉(zhuǎn)化子首先在25。C下培養(yǎng)，然后再轉(zhuǎn)入37。C培養(yǎng)，因該熱敏型酵母突變體在高溫下細(xì)胞壁發(fā)生變化，在高溫下用lmol/L的山梨醇對(duì)細(xì)胞進(jìn)行滲透處理，該細(xì)胞就會(huì)發(fā)生自溶，使胞內(nèi)95%的p-半乳糖苷酶都釋放出來(lái)，活性可達(dá)75U/ml(水解ljimoL0NPG)(M.Becerra,E.Cerdan，M.I.GonzalezSiso.HeterologousA7wjveramyces/acf/csP-galactosidaseproductionandreleasedby/Sacc/wramjcescereWw'aeosmotic-remedialthermosensitiveautolyticmutants.5—戸.c"cto,1997,1335:235241)。2001年，PETERL.M0LLER/人不同的兩種雙歧桿菌^ndoba"eri咖bi/7du/nDSM20215和5indo^"eriwni;]/"ai!"sDSM20088中通過(guò)建立基因組文庫(kù)分別獲得三個(gè)P-半乳糖苷酶基因BIFl,BIF2，BIF3和一個(gè)P-半乳糖苷酶基因INFl,并且進(jìn)行了異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析。在對(duì)構(gòu)建好的大腸桿菌重組質(zhì)粒的開(kāi);^丈閱讀框進(jìn)行比4交分析發(fā)現(xiàn)，pINFl相對(duì)于同一分支的pBIFl,pBIF2，pBIF3三個(gè)重組質(zhì)粒及大腸桿菌的L4Zgene的親^^關(guān)系4交遠(yuǎn)，且同一FLEMMINGJ0RGENSEN，OLEC.HANSEN,S0RENM.MADSEN.ANDPETERSTOUGAARD.Intra-andExtracellular卩-Galactosidasesfrom5zycfoZjacten'wmZ)(/(iw/wand萬(wàn).Z/^/^w/^:MolecularCloning,HeterologousExpression,andComparativeCharacterizatio.^4pp/zWa"(i￡>m>ow,"ta/M/cra6油gy,May2001,67(5):2276~2283)。JamesA.Coker等從來(lái)源于南極干谷的土壤中篩選獲得產(chǎn)p-半乳糖苷酶的一林嗜低溫的節(jié)桿菌。序列分析表明，其P-半乳糖苷酶基因&aSDNA序列有3159bp，編碼1053個(gè)氨基酸，(G+CV/。含量為67。/。，屬于糖苷水解酶家族2。其最適溫度為18°C，且在0°C時(shí)仍能保持50%的活力(JamesA.Coker，PeterP.Sheridan,JenniferLoveland-Curtze,KevinR.Gutshall,BiochemicalCharacterizationofaP-GalactosidasewithaLowTemperatureOptimumObtainedfromanAntarcticJW/zroftac&rIsolate.JOURNALOFBACTERIOLOGY,2003，185(18):5473—5482);2006年，TomoyukiNakagawa等將來(lái)源于4r^Lrobacterpsyc/2ro2actop/n'2iiSstrainF2的P-半乳糖苦酶純化并進(jìn)4亍分子7jc平的研究。該酶最適溫度為10。C，最適pH為8.0,在7.0和9.0時(shí)還有90。/。的相對(duì)活力，在pH6.0-10.0之間穩(wěn)定，該酶在0。C時(shí)也具有較高酶活力，在45。C處理5min,酶快速失活?？寺～@得酶基因6g",由3084bp組成，編碼1028個(gè)氨基酸，通過(guò)衍生的氨基酸序列分析屬于糖基水解酶家族2的新成員(TomoyukiNakagawa，YujiFujimoto,RyokoIkehata，TatsuroMiyaji,NoboruTomizuka.Purificationandmolecularcharacterizationofcold-activeP-galactosidasefrom^W/zra6ac^戸yc/2r0/actopMwsstrainF2々//跑ec/wo/.2006，72:720725)。2008年,W.Chen等克隆并在5aciHus.s的-"h'sWB600菌抹中表達(dá)來(lái)自于5aciJusstearo^enn叩in'"s的耐熱的|3-半乳糖苷酶基因(bga5)。經(jīng)純化的p-半乳糖苷酶分子量約為70kDa,等電點(diǎn)接近5.1，酶活性最大的溫度是70°C,最優(yōu)pH為7.0。結(jié)果表明這種重組熱穩(wěn)定酶可能適宜應(yīng)用于乳處理過(guò)程中的乳糖水解和低聚半乳糖的生產(chǎn)(W.Chen,H.Chen,Y.Xia，J.Zhao:F.TianandH.Zhang.Production,Purification,andCharacterizationofaPotentialThermostableGalactosidaseforMilkLactoseHydrolysisfrom5ac/〃usWe<arof/zermc>;/H7^s./Daz>ySb/.2008，91:175.11758)。在特殊的環(huán)境下長(zhǎng)期生活的微生物可能具有特殊的生理機(jī)能和遺傳基因，是重要的極端微生物資源，因此，對(duì)其p-半乳糖苷酶基因的克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析，不僅可以豐富生物多樣性的研究?jī)?nèi)容，為生物演化和系統(tǒng)發(fā)育提供有價(jià)值的資料，同時(shí)也為研究P-半乳糖苷酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供更多的信息，為進(jìn)一步獲得高效表達(dá)菌抹奠定了基礎(chǔ)，為開(kāi)發(fā)多功能用途的P-半乳糖苷酶產(chǎn)品提供技術(shù)保障。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是"R供一種來(lái)源于纖維單胞菌屬(Cenu2offlO朋ssp.)的p-半乳糖苷酶新基因；本發(fā)明的目的之二是構(gòu)建一種含有上述P-半乳糖苷酶新基因的表達(dá)載體；本發(fā)明的目的之三是提供一種制備0-半乳糖苷酶的方法。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種編碼p-半乳糖苷酶的基因(gak基因)，該基因選自(a)、(b)、(c)或(d)所示的核苷酸序列(a)SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；或(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與(a)所示的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列，且該核苷酸序列編碼具有e-半乳糖苷酶活性的蛋白；或(c)編碼SEQIDNO:2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(d)編碼具有p-半乳糖苦酶功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，該蛋白衍生物通過(guò)將SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基替換、缺失或插入而獲得。優(yōu)選的，本發(fā)明編碼半乳糖苷酶的基因是SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。所述的"多個(gè)"通常意味著2~60個(gè)，優(yōu)選為2~15個(gè)，這些取決于p-半乳糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置或氨基酸的種類(lèi)；所述的"替換"是指分別用不同的氨基酸殘基取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；所述的"缺失"是指氨基酸序列的改變，其中分別缺少一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；所述的"插入"是指氨基酸序列的改變，相對(duì)天然分子而言，所述改變導(dǎo)致添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；所述的"嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件，，是指在所屬領(lǐng)域中已知的低離子強(qiáng)度和高溫的條件。通常，在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，探針將雜交到核酸的復(fù)合混合物中的其目標(biāo)子序列上，但并不雜交到復(fù)合混合物中的其它序列上。嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴性的并且在不同環(huán)境中將有所不同。嚴(yán)謹(jǐn)條件通常被選擇為低于特異序列在規(guī)定離子強(qiáng)度pH下的熱熔點(diǎn)(Tm)約5-10。C。L為在平衡狀態(tài)下50%與目標(biāo)互補(bǔ)的探針雜交到目標(biāo)序列時(shí)所處的溫度(在指定離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)。嚴(yán)謹(jǐn)條件可為以下條件其中在pH7.0到8.3下鹽濃度低于約1.0M鈉離子濃度，通常為約0.01到1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)，并且溫度對(duì)于短探針(包括(但不限于)10到50個(gè)核苷酸)而言至少約30°C,而對(duì)于長(zhǎng)探針(包括(但不限于)大于50個(gè)核苷酸)而言至少約60°C。嚴(yán)謹(jǐn)條件也可通過(guò)加入諸如曱酰胺的去穩(wěn)定劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)于選擇性或特異性雜交而言，正信號(hào)可為至少兩倍的背景雜交，視情況為10倍背景雜交。一種例示性嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件可如下50%曱酰胺，5xSSC和1%SDS，在42。C下培養(yǎng)；或5xSSC,1%SDS，在65。C下培養(yǎng)，在0.2xSSC中洗滌和在65。C下于0.1%SDS中洗滌。所述洗滌可進(jìn)行5、15、30、60、120分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。本發(fā)明從采自新疆的土壤中篩選克隆了一個(gè)來(lái)源于纖維單胞菌屬(CenWo顯assp.)的p-半乳糖苦酶新基因(g"c)。該P(yáng)-半乳糖苷酶基因組DNA全長(zhǎng)2076bp,(G+C)°/含量72.9%,推導(dǎo)其編碼692個(gè)氨基酸。將該基因的M酸序列在NCBI的GENBANK中搜索比較發(fā)現(xiàn)，該P(yáng)-半乳糖苷酶與來(lái)源于節(jié)桿菌屬(^^robaWersp.FB24)的p-半乳糖苷酶相似性最高，為59%，且這一p-半乳糖苦酶序列為該菌抹全基因組測(cè)序結(jié)果，未看到其酶蛋白性質(zhì)與表達(dá)的相關(guān)研究。含有本發(fā)明p-半乳糖苷酶基因(gak基因)的重組表達(dá)質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域的常規(guī)方法構(gòu)建而成，例如，可以將SEQIDNO.1所示的核苷酸序列插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使SEQIDNO:1所示的核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案，可以是將SEQIDNO:l所示的核苷酸序列插入到用￡coRI、iVo"雙酶切原核表達(dá)載體pET-30a(+)的酶切位點(diǎn)之間，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-galc。選擇合適的宿主細(xì)胞用于表達(dá)p-半乳糖普酶是所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的常規(guī)技術(shù)。該宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞(例如大腸桿菌細(xì)胞)，也可以是真核細(xì)胞(例如可以為酵母細(xì)胞)；例如，可以為大腸沖干菌(五sci2erici]iaco2i)、畢赤酵母細(xì)月包(Picin'apastoris)、p卑酒酵母細(xì)月包(Saccharo/nycescerevisiae)或乳酉吏酵母纟田月包(/fansenuJapoJ戸orpAa)等。可以將含有本發(fā)明p-半乳糖苦酶基因的重組表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)常規(guī)的方法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，獲得重組菌林；培養(yǎng)該重組菌抹，誘導(dǎo)重組p-半乳糖苷酶的表達(dá)，回收并純化所表達(dá)的蛋白，即得p-半乳糖苷酶；例如可以將本發(fā)明所構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-gale轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)，收集所表達(dá)的蛋白，純化，即得到重組p-半乳糖苷酶。將本發(fā)明原核表達(dá)的P-半乳糖苷酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)，分析結(jié)果如下(1)P-半乳糖苷酶比活的測(cè)定酶活力為98.309U/ml，酶蛋白樣品比活為188.30u/mg;(2)P-半乳糖苷酶的最適pH:pH6.4時(shí)酶活性最高，并且在pH5.8~7.6之間，該|3-半乳糖苦酶均保持約76%以上的活性；(3)(3-半乳糖苦酶的pH穩(wěn)定性P-半乳糖苷酶在較寬的pH范圍內(nèi)較穩(wěn)定，pH5.8~9范圍內(nèi)其相對(duì)酶活達(dá)到60%以上，尤其在pH6.4~9范圍內(nèi)其相對(duì)酶活更在90%以上。在pH8和pH9時(shí)，其相對(duì)酶活在95°/。以上；(4)P-半乳糖苦酶的熱穩(wěn)定性該酶在經(jīng)過(guò)熱處理后，酶活有所下降。47。C處理2min,酶活沒(méi)有多大變化，而在處理4min后，相對(duì)酶活4妄近于70%，在處理20min后，相對(duì)酶活只有2%。而在55。C處理lmin后，相對(duì)酶活^f又存留l.78%。^f旦在37。C處理70min后，相對(duì)酶活仍存留40%以上；(5)金屬離子和相關(guān)化學(xué)試劑對(duì)半乳糖苷酶活性影響K+、Pb2+、Fe2+、Cu2+、EDTA對(duì)p-半乳糖苷酶有明顯的激活作用，其中以Pb2+為最；Mn2+、Mg2+、Zn2+、SDS對(duì)酶有抑制作用,SDS的影響最大,對(duì)酶活抑制作用才妻近20%;其他的離子影響不大；EDTA對(duì)酶的影響不大，說(shuō)明該酶對(duì)金屬離子的依賴性不強(qiáng)；(6)本發(fā)明(3-半乳糖苷酶的Km和Vmax值分別為fm=19.33mmol/L;Kmx=416.67nmol/min。酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定表明，本發(fā)明P-半乳糖苷酶為中性常溫酶。文獻(xiàn)凈艮道的其他節(jié)桿菌屬(Jr"ro&aWersp.)的P-半乳糖苦酶大多屬低溫適冷酶，在酶學(xué)性質(zhì)上與本發(fā)明的半乳糖苷酶存在著顯著差異。圖116Sr腿的PCR產(chǎn)物電泳圖，獲得的16SrDNA條帶大小為1.6kb。圖2pTl-gak重組質(zhì)粒的構(gòu)建圖。圖3與gak基因相關(guān)的p-半乳糖苷酶系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果。圖4pET-ga1c在BL21中誘導(dǎo)后表達(dá)的P-半乳糖苷酶及純化后的|3-半乳糖苷酶SDS-PAGE電泳圖；1:28°C，含重組質(zhì)粒pET-gale未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌裂解液；2:28°C,經(jīng)0.4MmIPTG誘導(dǎo)4h后含重組質(zhì)粒pET-galc的大腸桿菌裂解液；3.:28°C，經(jīng)0.4mMIPTG誘導(dǎo)4h后超聲波破碎后離心含重組質(zhì)粒pET-galc的沉淀；4:28°C,經(jīng)0.4mMIPTG誘導(dǎo)4h,超聲波破碎后離心，含重組質(zhì)粒pET-galc的上清；5.:含重組質(zhì)粒pET-galc的破碎后上清液經(jīng)NTA-6Q(含60mM/L咪唑)洗脫收集液；6.:含重組質(zhì)粒pET-galc的破碎后上清液經(jīng)NTA-80(含80mM/L咪唑)洗脫收集液；7.:含重組質(zhì)粒pET-gale的破碎后上清液經(jīng)NTA-100(含100mM/L咪唑)洗脫收集液；M.:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)DMIOI。圖5p-半乳糖苷酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖6蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖7P-半乳糖苦酶的pH曲線；圖8P-半乳糖苷酶的pH穩(wěn)定性曲線；圖9P-半乳糖香酶的溫度曲線；圖10半乳糖苦酶的熱穩(wěn)定性曲線；圖11金屬離子和相關(guān)化學(xué)試劑對(duì)p-半乳糖苷酶活性的影響；圖12|3-半乳糖苦酶水解ONPG的動(dòng)力學(xué)曲線；具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例l產(chǎn)|3-半乳糖苷酶的纖維單胞菌的篩選、分離和鑒定1.1材料1.1.1樣品從新疆采集的土樣，共計(jì)12種。1.1.2工具酶和試劑Pfu高保真DNA聚合酶購(gòu)自奇華盛生物公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa及NEB公司；RNase購(gòu)自北京華美/>司；DNA純化試劑盒購(gòu)自上海申能博彩公司；底物鄰硝基苯酚-P-D半乳糖苷(0NPG)購(gòu)自Pierce公司；5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)購(gòu)自TaKaRa;dNTP購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；酵母提取物、蛋白胨購(gòu)自O(shè)xford公司；二曱基曱酰胺(DMF)購(gòu)自上海生物工程有P艮^^司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。1.1.3培養(yǎng)基及有關(guān)溶液的配置(1)細(xì)菌富集培養(yǎng)基:乳糖1.0%，酵母膏1.0°/o,MgS040.02%,115°C15min;(2)細(xì)菌分離培養(yǎng)基乳糖2.0%,酵母膏0.5%,蛋白胨1.0%，NaCl0.5%，(固體培養(yǎng)基含2.0%瓊脂)115。C滅菌15min;(3)真菌富集培養(yǎng)基乳糖2.0%,蛋白胨O.1%,酵母膏O.1%,115。C滅菌15min;(4)真菌分離培養(yǎng)基乳糖2.0%，蛋白胨O.1%,(NH4)2S040.14%,KH2P040.2%，CaCl20.03%,MgS040.03%，Toween800.2%，F(xiàn)eS045.Omg/ml,MnS041.6mg/ml,ZnS041.4mg/ml,CoCl22.0mg/ml,(固體培養(yǎng)基含2.0%瓊脂)115。C滅菌15min;(5)LB培養(yǎng)基0.5°/。酵母提取物，1.0%蛋白胨，1.0%NaCl,用NaOH調(diào)至pH7.0，(固體培養(yǎng)基含1.5°/。瓊脂)121°C滅菌15min。1.2菌體分離將12種土樣，各取O.5g，放入25ml無(wú)菌生理鹽水，制成懸浮液，在37。C恒溫?fù)u床中培養(yǎng)lh。然后再進(jìn)行富集培養(yǎng)兩個(gè)100ml三角瓶，分別放入20ml細(xì)菌富集和真菌富集培養(yǎng)基，滅菌后接入1%的土壤懸浮液，培養(yǎng)至菌體混濁，用ONPG為底物進(jìn)行酶活測(cè)定。將檢測(cè)有酶活的土樣通過(guò)平板稀釋法進(jìn)行菌林分離培養(yǎng)。在進(jìn)行平板稀釋法稀釋到10一時(shí)平板可見(jiàn)單菌落，用X-gal作為指示物，在平板上檢測(cè)有p-半乳糖苷酶活性的菌體，將變藍(lán)的菌落用牙簽挑到分離培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，用平板劃線法進(jìn)行分離純化，反復(fù)馴化，直至在顯微鏡下觀察菌體為單菌。在富含乳糖的細(xì)菌分離培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果分離到有半乳糖苷酶活性的菌林Dm。1.3菌林的分子鑒定1.3.1菌抹Dm基因組DNA的提取將在乳糖分離培養(yǎng)基中30。C培養(yǎng)了10d左右的菌液離心，超純水洗滌后收集菌體。將濕菌體在液氮中研磨成粉末，加入到冰預(yù)冷的0.4ml提取液中(5Ommol/LTris-HClpH8.0，150mmol/LNaCl,100mmol/LEDTApH8.0),振蕩混勻，加入50|a110%SDS,37。CM呆溫lh,再加入75ja115mol/LNaCl,輕輕混勻，然后加入65jalCTAB/NaCl(10°/。CTAB,0.7mol/LNaCl)混合液，65。C下保溫1020min,依次用等體積的酚氯仿(1:1)、氯仿抽提，上清液用終濃度75%的異丙醇沉淀，沉淀用70%乙醇洗滌2次后，真空干燥，溶于TE中備用。1.3.216srDNA序列分析(1)才艮據(jù)細(xì)菌的16srDNA的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物F5，一GGCCTAACACATGCAAGT—3，R5，一CTACGGTTACCTTGTTACGA—3，(2)PCR擴(kuò)增以菌林Dm的基因組DNA為模板擴(kuò)增16SrDM序列。將獲得的PCR產(chǎn)物(圖1)連接pGEM-TEasy載體(購(gòu)自promega公司)構(gòu)建pGEM-T-16SrDNA,￡coRI酶切鑒定獲得正確的克隆，測(cè)序獲得16SrDNA序列。13序列測(cè)定表明，分離抹Dm的16SrDM序列與GENBANK中的放線菌門(mén)中的微球菌亞目下的纖維單胞菌屬(Ceiiulo/no力assp.)的16Sr腿有9簡(jiǎn)相似性。將分離株歸為纖維單胞菌屬(Ce!iuioMxnassp.),命名為Ce!!u2,薦sp.Dm。實(shí)施例2p-半乳糖苷酶基因的分離、克隆2.1材料2.1.1菌種和質(zhì)粒纖維單胞菌Dm(Ce2k]o/Honassp.)為實(shí)施例1所篩選得到；pEASY-Tl克隆載體購(gòu)自北京全式金生物公司；Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物^^司。2.1.2工具酶和試劑LATAqDNA聚合酶購(gòu)自Takara/>司；Phusion超保真PCR試劑盒購(gòu)自NEB公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。2.1.3培養(yǎng)基和相關(guān)溶液配制乳糖分離培養(yǎng)基乳糖2.0%，酵母膏0.5%,蛋白胨1.0%,NaCI0.5%,115。C滅菌15min;TAE(50x):242gTris石威，57.1ml冰乙酸，100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0),用無(wú)菌水定容至1L。提取大腸桿菌質(zhì)粒的溶液溶液I:50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HC1,10mmol/LEDTA;溶液II:(新鮮配制)0.2mol/LNaOH,1%SDS;溶液III:3mol/LKAc,5mol/LHAc。2.1.4所用引物序列(1)簡(jiǎn)并引物序列Primerl:ggcggggactacaaccccga(g/a)ca(g/a)tggccPrimer2:gacgtgccagagcgc(a/t/c/g)a(g/a)(a/t/c/g)gc(a/t/c/g)gg(a/g)tgPrimer3:cacccggcgctg(g/c/a)(c/t/g)(a/g/c/t)(a/c/t)t(a/g/c/t)tggcacgtPrimer4:gcccgcgtgcgggac(a/g/c/t)"a/g/t)(a/t/c/g)gc(a/t/c/g)(c/g)(a/t)(a/g)tg(2)TAIL-PCR引物序列第一輪TAIL-PCR引物上SP1:GAGGATCTCGGGGTGCTTGC上SP2:CTCGTCGAGCCAGCCCCACTC上SP3:CGTCCTCGAGGCGGACCTCC下SP1:GGCCTCGAGCCACACCAAGGGC下SP2:CGCCGGAGGCCACCCGTGGATC下SP3:GATGTTCTTCCAGTGGCGGACG第二輪TAIL-PCR引物TAIL2-SP1:GCTGTGGCGCCTCGGCGTGACCTAIL2-SP2:CGACGGTCGCCGTGACGTACTTCTAIL2-SP3:GTACCCGGGCGCCTTCCGCGACTAIL-PCR簡(jiǎn)并引物AD3:GSWGTTTSSGTTTTAD4:WSCGCWGCWATTTTAD8:STTGNTASTNCTNTGC(3)反向PCR的引物序列9.21反向下內(nèi)(APAI)CTGCCCACGACGTACCAGATCACC9.21反向下外(APAI)TCCGCACGCAGGAGTTCTTCCC9.21反向上內(nèi)(APAI)GTGGCAGCCGATCTCGTTGTCG9.21反向上外(APAI)TCGTCGCATGGTGACGGGTCTG(4)全長(zhǎng)擴(kuò)增引物序列全長(zhǎng)F:GAATTCATGCGACGACGCACCTCAT(￡coRI)全長(zhǎng)R:TATCAAATGCGGCCGCTCAGACGAC(JVotI)2.2P-半乳糖苷酶基因ga7c的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建因目前還沒(méi)有來(lái)源于纖維單胞菌的P-半乳糖苷酶基因的報(bào)道，所以P_半乳糖苷酶基因gak通過(guò)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物獲得中間序列，TAIL-PCR擴(kuò)增側(cè)翼序列，反向PCR獲得末端序列三步完成。2.2.1中間序列的獲得根據(jù)纖維單胞菌所屬的亞目即微球菌亞目中所報(bào)道的P-半乳糖苷酶序列來(lái)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以纖維單胞菌Dm的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物組合(fi:Primerl,n:Primer2);(f2:Primer3,r2:Primer4)反應(yīng)體系10xPCRbuffer(含MgCl》2m1dNTPmix(10mmol/L)0.5ju1TaqPlus(3u/ju1)1ju1Primerf(lOfimol/L)3ju1Primerr(10pmol/L)3jal模板腿0.5ja1ddH2010ju1總體系擴(kuò)增條件194°C3min294°C35S372°C2min472°C5min20|al230循環(huán)將Primerl與Primer2,Primer3與Primer4兩個(gè)組合獲得的PCR產(chǎn)物回收，分別克隆到pEasy-Tl載體，測(cè)序獲得P-半乳糖苷酶基因的部分序列。2.2.2TAIL-PCR擴(kuò)增側(cè)翼序列根據(jù)獲得的部分序列設(shè)計(jì)上下游特異引物分別與根據(jù)細(xì)菌同源序列設(shè)計(jì)的一組簡(jiǎn)并引物組合，進(jìn)行TAIL-PCR?；厥誔CR產(chǎn)物，克隆到pEasy-Tl載體，測(cè)序獲得P-半乳糖苷酶基因部分序列。TAIL-PCR引物第一輪TAIL-PCR引物上SP1，上SP2，上SP3，第二輪TAIL-PCR引物TAIL2—SPl,TAIL2-SP2，簡(jiǎn)并引物AD3,AD4，AD8。反應(yīng)體系2xPCRbuffer(高GC)dNTPmix(10mmol/L)LATaq(5u/jli1)SP(10jimol/L)AD(10,1/L)模板醒ddH20下SPl，下SP2,下SP3<TAIL2—SP3'總體系擴(kuò)增條件TAIL--PCR1194°Clmin225°C2min59s372°C2min30s494°Clmin566°C30s672°C2min30s794°Clmin866°C30s972°Clmin30s1094°Clmin1144°Clmin1272°C2min30s1372°ClOmin12.5ju11|u10.5|a14|u11ju15,6|a125ja1-0.2s14循環(huán)17TAIL--PCR2194°Clmin294°Clmin366°C30s472°Clmin594°Clmin666°C30s772°Clmin894°Clmin942°C30S1072°Clmin1172°ClOminTAIL--PCR3194°Clmin294°C30s366°C30s472°Clmin94°C30s666°C30s772°Clmin894。C30s942°C30S1072°Clmin1172°ClOmin24循環(huán)224循環(huán)2.2.3反向PCR獲得末端序列根據(jù)TAIL-PCR的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)反向PCR引物，以纖維單胞菌Dm的基因組DNA為模板，進(jìn)行反向PCR，獲得末端序列。反向PCR的引物9.21反向下內(nèi)(APA1)，9.21反向下外(APAI),9.21反向上內(nèi)(APAI),9.21反向上外(APA1)。反應(yīng)體系182xPCRbuffer(高GC)dNTPmix(10mmol/L)TaqPlus(3u/ja1)Primerf(10,1/L)Primerr(10一01/1)模板醒ddH2010ja14ja11|a11|i11|U11Hi12|al總體系20|il擴(kuò)增條件(touch-downPCR):1234567894°C94°C72°C72°C94°C62°C72°C72°C3min45S30S90S45S30S90S5min-0.5s220循環(huán)30循環(huán)2.2.4基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增根據(jù)測(cè)序結(jié)果拼接所得序列設(shè)計(jì)基因兩端特異引物(在引物兩端加入5coWI，WotI酶切位點(diǎn))，以Dm基因組DNA為模板，用Phuzion超保真DM聚合酶擴(kuò)增全長(zhǎng)。PCR全長(zhǎng)引物全長(zhǎng)F,全長(zhǎng)R。反應(yīng)體系ddH2029,5n1HFbuffer10|alDMSO1.5(a1dNTPmix(2.5mmol/L)4p1全長(zhǎng)F(10pmol/L)2|il全長(zhǎng)R(10^imol/L)2jil模板DM0.5|a1Phuzion0.5ja1總體積50u1擴(kuò)增條件198°Clmin298°C30s365°C10s-ls472°C2min210循環(huán)598°C30s655°C10s772°C2min525循環(huán)872°C10min反應(yīng)結(jié)束后，加入普通Taq酶，72。C延伸30min?；厥誔CR產(chǎn)物，克隆到pEasy-Tl載體，構(gòu)建pTl-ga!c重組質(zhì)粒(圖2),測(cè)序獲得基因全長(zhǎng)。2.3(3-半乳糖苷酶基因ga2c的序列分析及相似性比較將經(jīng)鑒定無(wú)誤的連有纖維單胞菌Dm的p-半乳糖苷酶基因片段的重組質(zhì)粒pTl-ga]c進(jìn)行測(cè)序，序列結(jié)果分析所示，該p-半乳糖苷酶基因全長(zhǎng)2076bp(SEQIDNO:l)，(G+C)%含量72.9%,推導(dǎo)編碼692個(gè)氨基酸(SEQIDNO:2)。無(wú)信號(hào)肽序列。蛋白理論分子量約76kD，等電點(diǎn)為pH5.3。經(jīng)生物信息學(xué)分析推測(cè)該酶屬于糖基水解酶第42家族，具有該家族的保守結(jié)構(gòu)域。將基因ga2c表達(dá)的|3-半乳糖苷酶命名為GALC，ga]c衍生的氨基酸序列在NCBI的GENBANK中搜索比較相似性。氨基酸序列經(jīng)過(guò)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，其與來(lái)源于節(jié)桿菌屬Ur"roba"ersp.FB24)的P-半乳糖苷酶相似性最高,達(dá)到59°/。。圖3顯示，纖維單胞菌屬與節(jié)桿菌屬均屬于4鼓球菌亞目。實(shí)施例3p-半乳糖苷酶基因的表達(dá)3.1材料3.1.1菌4朱和質(zhì)粒大腸桿菌TOPIO、大腸桿菌BL21(DE3)購(gòu)自北京全式金生物公司;pET-30a(+)載體購(gòu)自Novagen/>司。3.1.2工具酶和試劑IPTG購(gòu)自Promega/>司；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)DMIOI,DR101購(gòu)自北京全式金生物/>司；丙烯酰胺、N,N'-亞曱叉丙烯酰胺、瓊脂糖購(gòu)自Sigma/>司；親和層析樹(shù)脂Ni-NTAAgarose購(gòu)自Qiagen/^司；其他均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?.1.3培養(yǎng)基及有關(guān)溶液的配置蛋白上樣緩沖液(2x):100隱ol/LTris-HCl(pH6.8)、200mmol/L二碌u蘇糖醇(DTT)、4%SDS、0.2%溴酚藍(lán)、10%甘油。30%丙烯酰胺溶液29g丙烯酰胺，lgN,N口-亞甲叉丙烯酰胺，溶于100ml水?？捡R斯亮藍(lán)染液0.24g考馬斯亮藍(lán)R250溶于90ml曱醇水(1:1,v/v)和10ml冰乙酸中。脫色液90ml曱醇水(1:1,v/v)和10ml冰乙酸中。親和層析用NTA-O緩沖液20mmol/LTris-Cl緩沖液(pH8.Q)+10%甘油+0.5mol/L氯化鈉。親和層析用NTA-20緩沖液20mmol/LTris-Cl緩沖液(pH8.0)+10%甘油+0.5mol/L氯化鈉+20mmol/L咪唑。親和層析用NTA-40緩沖液20mmol/LTris-Cl緩沖液(pH8.0)+10%甘油+0.5mol/L氯化鈉+40mmol/L咪哇。親和層析用NTA-6G緩沖液20mmol/LTris-Cl緩沖液(pH8.0)+10%甘油+0.5mol/L氯化鈉+60mmol/L咪唑。親和層析用NTA-80緩沖液20mmol/LTris-Cl緩沖液(pH8.0)+10%甘油+0.511101/1>氯化鈉+80mmol/L咪哇。親和層析用NTA-100緩沖液20mmol/LTris-Cl緩沖液(pH8.0)+10%甘油+0.5mol/L氯化鈉+100mmol/L咪唑。親和層析用NTA-200緩沖液20mmol/LTris-Cl緩沖液(pH8.0)+10%甘油+0.5mol/L!U匕鈉+200mmol/L。米哇。0.lmol/L硫酸鎳稱取2.6285gNiS046H20溶于水,定容到100ml，過(guò)濾，4XM呆存。10xYNB(13.4%的無(wú)氨基酸酵母氮源)134gYNB固體溶于1L去離子水,過(guò)濾滅菌，4。C保存；500xB(0.02%生物素)生物素20mg/100ml水，過(guò)濾滅菌，4。C保存；10xD(20%葡萄糖)200gD-葡萄糖溶于1000ml水，過(guò)濾滅菌，4°C保存；lOxGY(10%的甘油)100ml甘油溶于900ml水，過(guò)濾滅菌，4。C保存；lOOxAA(含每種氨基酸O.5%):稱取L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-賴氨酸各500g溶于100ml水，過(guò)濾滅菌，4。C保存；1mol/L的山梨醇將182.lgD-山梨醇溶于1L的水中，過(guò)濾滅菌，4匸保存。培養(yǎng)基YPD培養(yǎng)基1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；RDB固體培養(yǎng)基lmol/L山梨醇，1%葡萄糖，1.34%YNB,0.00004%Biotin,0.005°/谷氨酸，0.005°/。曱硫氨酸，0.005%賴氨酸，0.005°/。亮氨酸，0.005%異亮氨酸，1.5%瓊脂；醒固體培養(yǎng)基1.34%YNB，0.00004%Biotin，0.5°/。甲醇，1.5°/。瓊脂；MD固體培養(yǎng)基1.34%YNB,0.00004%Biotin,2%葡萄糖，1.5°/。瓊脂；BMGY培養(yǎng)基1%酵母提取物，2%蛋白胨，100,ol/L磷酸緩沖液(pH6.0)，1.34%YNB,0.00004%Biotin,1%甘油(V/V);B應(yīng)Y培養(yǎng)基除以0.5%曱醇代替甘油，其余成份相與BMGY相同；發(fā)酵培養(yǎng)基10xBasalSalts:磷酸26.7ml/L,石危酸4丐0.93g/L,石危酸鉀18.2g/L,七水合硫酸鎂14.9g/L,氫氧化鉀4.13g/L，葡萄糖50g/L。發(fā)酵中所用的微量鹽溶液PTM:硫酸銅6.0g/L、硪化鈉0,08g/L、硫酸錳3.0g/L、鉬酸鈉0.2g/L、硼酸0.02g/L、氯化鈷0.5g/L、氯化鋅20g/L、硫酸亞鐵65g/L、生物素0.25g/L、硫酸5ml/L。3.2原核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建重組質(zhì)粒pTl-ga2c用￡coRI，iVotl雙酶切，回收約2.Okb的片l爻(gak基因)，以EcoRI、雙酶切原核表達(dá)載體pET-30a(+)并回收。16。C連接，熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞。用《卯I酶切鑒定篩選原核重組表達(dá)質(zhì)粒，命名為pET-galc。3.3ga2c基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)22將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-gale及空載體pET-30a(+)分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,涂于含卡那霉素的LB(簡(jiǎn)稱LB-kan)平板，37。C培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落。挑單菌落培養(yǎng)，提質(zhì)粒酶切鑒定正確后，接種于10mlLB-kan液體培養(yǎng)基，37。C搖床培養(yǎng)過(guò)夜。按1°/。體積轉(zhuǎn)接于100mlLB-kan液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)至d。為0.6~0.8。加入IPTG(終濃度0.4mmol/L)在28。C誘導(dǎo)培養(yǎng)。取IPTG處理前和IPTG誘導(dǎo)4h后的菌液各1ml用于煮沸裂解細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE4全測(cè)，其余誘導(dǎo)后菌液離心收集菌體，按菌液Tris-HC1緩沖液(20Mm,pH8.0)=20:1的比例重懸菌體，用于超聲波破碎細(xì)胞，破碎后離心收集上清用于蛋白純化。3.4原核表達(dá)P-半乳糖苷酶的純化(1)取親和層析樹(shù)脂Ni-NTAAgarose1.5-2ml，加入已放好墊片的塑料管中，待樹(shù)脂全部沉積到一起時(shí)，放入上層墊片，壓緊，這樣就灌好一個(gè)親和層析柱，備用。(2)將柱子垂直擺放在4。C冰箱中，加入水15-20ml。(3)流盡后加入23ml0.lmol/L硫酸鎳(第一次使用時(shí)可以不加)。(4)流盡后加入15~20mlNTA-O緩沖液平衡柱子。(5)流盡后即可加入破壁后菌體上清液，此時(shí)帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白可以與樹(shù)脂上的鎳結(jié)合。(6)上清液全部流盡后，仍用NTA-0緩沖液20ml清洗柱子。(7)分別取5mlNTA-20,NTA-40，NTA-60,NTA-80，NTA-100,NTA-200緩沖液依次沖洗柱子，洗脫液分別回收。此步驟在第一次做蛋白純化時(shí)用來(lái)摸索洗脫緩沖液時(shí)做，根據(jù)不同濃度洗脫液中目標(biāo)蛋白的濃度和純度來(lái)確定最適的緩沖液。(8)如果洗脫緩沖液已經(jīng)確定則直接用最適緩沖液10ml洗脫，洗脫液回收，進(jìn)行SDS-PAGE電泳才企測(cè)。(9)加入0.5mol/LNaOH清洗柱子30min。加入30%乙醇20ml清洗柱子，最后將柱子保存在30%乙醇內(nèi)。取以不同的咪唑濃度的NTA洗脫的收集液各20in1,加入等體積2x上樣緩沖液煮沸5min，各取10ja1上樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)(蛋白膠濃度12%)(如圖4)。結(jié)果表明，p-半乳糖苷酶基因ga2c在大腸桿菌BL21中表達(dá)，經(jīng)過(guò)柱純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，為單一條帶，有p-半乳糖苷酶活性。蛋白分子量約76KD,與理論分子量一致。經(jīng)梯度洗脫后我們發(fā)現(xiàn)，在NTA-80(含80mM咪唑)時(shí)洗脫效果最好。在后續(xù)的酶液收集中，直接以此濃度進(jìn)行洗脫。3.5|3-半乳糖苦酶酶活性的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制稱取28mgONP(鄰竭基芬)，先溶于lml曱醇中，再用0.lmol/LpH6.4的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液定容至100ml,配成2mmol/LONP母液。分別加入不同量的ONP和0.lmol/LpH6.4的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，總體積lml,然后依次加入lml的IO訂CA，2ml的lmol/LNaC03顯色液，測(cè)定朋42。的光吸收值，繪制酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖5)。表l標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制編號(hào)12345672mmol/LONP母液0501001502002503000.1mol/LpH6.42000195019001850180017501700Buffer(p1)10訂CA終止液(ml)1111111lmol/LNaC。3顯色2222222液(ml)體系中ONP含量0100200300400500600(nmo1)00.110.2170.3350.4460.5480.656卯"。00.1140.2190.3490.4560.5570.65800.1150.2230.3350.450.5630.669平均卯00.1130.2200.3400.4500.5560.661才艮據(jù)p-半乳糖苦酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果，如圖5，半乳糖苷酶酶活性計(jì)算公式5XNX(902.94x-1.8383)酶活性(U/ml"x:420nm處光吸收值；N:酶液的稀釋倍凄t;15:反應(yīng)15min;5:將200li1稀釋酶液中的酶活折算為lml的酶活性。酶活測(cè)定24純化后酶液通過(guò)P-半乳糖苷酶活性檢測(cè)，得到酶活力為98.309U/ml。實(shí)施例4原核表達(dá)p-半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)的分析4.1材料在大腸桿菌BL21中表達(dá)的p-半乳糖苷酶，經(jīng)純化后的獲得單一條帶的p-半乳糖苷酶蛋白。4.2(3-半乳糖苦酶比活的測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制表2蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制編號(hào)123456BSA濃度(ng/ml)1002004006008001000BSA體積(p1)100100100100100100BSA含量(ng)1020406080100考馬斯亮藍(lán)G-250溶液55555(ml)0.1570.3250.5430.7150.8891.0860.1670.3340.5660.7270.9021.085收950.170.330.550.7560.8941.065平均鵬950.1650.3300.5530.7330.8951.079根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果(圖6)得出的蛋白含量公式為蛋白濃度(mg/ml)=(卯595x100.65-11.3)xNx10(2)OA":595nm處光吸收值；N:稀釋倍數(shù)；10:將0.lml的蛋白稀釋液中的蛋白折算成lml中的蛋白含量。比活的計(jì)算通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定酶液中的蛋白含量為522.101jig/ml,再通過(guò)p-半乳糖苷酶活性測(cè)定，得到酶活力為98.309U/ml,故酶蛋白樣品比活為188.30u/mg。4.3p-半乳糖苦酶的最適pH在37。C條件下，測(cè)定不同pH條件的p-半乳糖苷酶活性，作酶的最適pH曲線(圖7)?？芍猵H6.4時(shí)酶活性最高，并且在pH5.8~7.6之間，該P(yáng)-半乳糖苷酶均保持約76%以上的活性。4.4P-半乳糖苦酶的pH穩(wěn)定性如圖8所示，酶在較寬的pH范圍內(nèi)較穩(wěn)定，Ph5.8~9范圍內(nèi)其相對(duì)酶活達(dá)到60°/。以上，尤其在pH6.4~9范圍內(nèi)其相對(duì)酶活更在90%以上。在pH8和pH9時(shí)，其相對(duì)酶活在95%以上。4.5P-半乳糖苷酶的最適溫度從圖9可知，47。C時(shí)酶的水解活力最高，在40°C50。C之間相對(duì)酶活性均在65°/。以上，但5(TC以上酶活性急劇下降。4.6e-半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性由圖10可知，該酶在經(jīng)過(guò)熱處理后，酶活有所下降。47。C處理兩分鐘，酶活沒(méi)有多大變化，而在處理4min后，相對(duì)酶活接近于70%,在處理20min后，相對(duì)酶活只有2%。而在55。C處理lmin后，相對(duì)酶活僅存留1.78%。^f旦在37。C處理70min后，相對(duì)酶活仍存留40%以上。4.7金屬離子和相關(guān)化學(xué)試劑對(duì)P-半乳糖苷酶活性的影響在酶反應(yīng)體系中加入金屬離子和相關(guān)化學(xué)試劑(終濃度lmmol/L),發(fā)現(xiàn)金屬離子和相關(guān)化學(xué)試劑對(duì)P-半乳糖苷酶活性的影響有較大差異，其活性對(duì)比見(jiàn)圖13。由圖ll可知，K+、Pb2+、Fe2+、Cu2+、EDTA對(duì)p-半乳糖苷酶有明顯的激活作用，其中以Pb"為最；Mn2+、Mg2+、Zn2+、SDS對(duì)酶有抑制作用，SDS的影響最大，對(duì)酶活抑制作用接近20%;其他的離子影響不大；EDTA對(duì)酶的影響不大，說(shuō)明該酶對(duì)金屬離子的依賴性不強(qiáng)。4.8p-半乳糖苷酶的Km和Vmax值用0.lmol/LpH6.4磷酸氬二鈉-檸檬酸緩沖液配制不同濃度的0NPG溶液，按酶活測(cè)定程序測(cè)定稀釋酶液在47。C下的0仏2。值，并計(jì)算[S]及其對(duì)應(yīng)的v，求出二者的倒數(shù)，作1〃對(duì)1/[S]的直線，結(jié)果見(jiàn)圖12。由圖12所得函數(shù)式，計(jì)算出iL=19.33mmol/L;Cx=46.67nmol/min。KLPI090013—3.txt序列表<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所<120>編碼f-半乳糖苷酶的基因及其表達(dá)和應(yīng)用〈130>klpi080887<160〉2<170>Patentlnversion3.1<210>1〈211>2079<212〉腿<213>Cellulomonassp.<400〉1atgcgacgacgcacctcatccgagtccttcgacccttccgccgtccggccctggaacgcc60ggcatccgcggcctcggcttcggcggcgactac貼ccccgagcagtggccccaggaggtc120cgcctcgaggacgtcgagctcatgcgagaggccggcgtcaacctgctcagcgtcgcgatc180ttctcctgggccacgatcgagccgcgcgagggcgagctcgagtggggctggctcgacgag240acgatggaccgcctgcacgacgccggcatccaggtcgcgctcgccacggccacggcgtca300cccccgccgtggctcacgcgcaagc3ccccgagatcctcccccgcaccgccgacggcacc360gtcctgcaccagggcgggcgccagtcgtacgcggtcacgcacccggtgcaccgcgagtac420gcgctgcgcatggccgagcgcatggccgagcgctaccgcgaccatccggcgctcgcgctg480tggcacgtcgacaacgagatcggctgccacgtgccgcgcgactactcggeicgccgccgcc540gcggcgttccgtgagtggctccgcgcccgctacgccacgatcgagg￡tcctcaaccaggcg600tggggC3CCgcgttctggtcgcagcgctacgggitcgttcgacgacgtcctgccgccgctc660gtcgcacccacgttcgccaacccgacgcagcagctcgacttcgaccgcttctcctccgac720gcgctgctcgactactaccgcgacctgcgcgacacgctgcgccagatcacgccccacgtg780cccacgacgaccaacctcatggcctcgagccacaccaagggcatggactacttctcctgg840gcgcccgagctcgacgtcgtcgcgaacgaccactacaccgtcgccgcgtcgcccgagcgg900cacgtcgagctcgccttctccgccgacctctcgcggggcatcgccggaggccacccgtgg960atcctcatggagcactcgacgtcggcggtcaactggcaggagcgcaaccgctccaagctt1020ccggg卿gctgctgcgc犯ctcgctgcagcacgtggcgcgcggcgcggactcggtgatg1080ttcttccagtggcgggcgtcgcgcgcgggcgccgagaagtaccactccgcgatggtcccg1140cacgccggcacggacaccgacctgtggcgcgacgtcgtcggcctgggcgatgcgctgcgc1200gcgctcggcgctcgcgcgtgcgctcgcgggccgcgatggtCgtCg3Ctgg1260ccgtcctggtggggctccgagctcgactcgcaccccacccaggcgctccgctacatggac1320caggtccaggccgagcgcgggacaccgacgtacttctccgttxcgcgaccgtccgggtcgacgcacgtggaggccagcgacgcctcgaccggtccggacgacgacgtcgtgaggcgcccggtccccgccgKLPI090013—3.txtcctggtacgccgcgctgtggcgcctcggcgtgaccgtcgacatgg"tgccg1380acctcgccggttacgacctcgtcgtcctgcccacgacgtacctgatcacc1440ccgccaacgtggccgtcgcggcgtcacgcggcgcgacggtcgccgtgacg1500gcatcgtcgacgagaacgaccacgtgcggctcggcgggtacccgggcgcc1560tgctcggcgtccgcacgcaggagttcttcccgctccaggagggcgagacc1620agggcgaggcgctggacggcggggccacggccgacctgtggaccgagaag1680tcgacgggaccgacgtcgtcgcgacgtacgccgacggcgcgctgcgcggc1740tcacccggcgcccggccggcacgcgtggcgccgcgtggtacgtcgcgacg1800ccgcgggactcgacgcgctcgccacgcgcctggtccgggagtccggcgtc1860"tggccgccccggccggggtcgaggtcgtgcggcgctggtccgacgacggc1920ggctgttcgcgatcaaccacaccgagaccgaggcgacgctgggcaccgca1980tgcgcggcgtcgagctgctcacaggUccgacgtcggcgggcggctcgcc2040gggcggtacgtgtggtgcgggtcgtctga2079<210〉2〈211〉692<212>PRT<213>Cellulomonassp.<400〉2MetArgArgArgThrSerSerGluSer15PheAspProSerAlaValArg1015ProTrpAsnAlaGlylieArgGlyLeuGlyPheGlyGlyAspTyrAsn202530ProGluGinTrpProGinGluValArgLeuGluAspValGluUuMet354045ArgGluAlaGlyValAsnLeuLeuSerValAlaliePheSerTrpAla505560ThrlieGluProArgGluGlyGluLeuGluTrpGlyTrpLeuAspGlu65707580ThrMetAspArgLeuHisAspAlaGlylieGinValAlaLeuAlaThr859095AlaThrAlaSerProProProTrpLeuThrArgLysHisProGlulie100105110LeuProArgThrAlaAspGlyThrValLeuHisGinGlyGlyArgGin115120125SerTyrAlaValThrHisProValHisArgGluTyrAlaLeuArgMet130135140KLPI090013—3.txtAlaGluArgMetAlaGluArgTyrArgAspHisProAlaLeuAlaLeu145150155160TrpHisValAspAsnGlulieGlyCysHisValProArgAspTyrSer165170175AspAlaAlaAlaAlaAlaPheArgGluTrpLeuArgAlaArgTyrAla180185190ThrlieGluAspLeuAsnGinAlaTrpGlyThrAlaPheTrpSerGin195200205ArgTyrGlySerPheAspAspValLeuProProLeuValAlaProThr210215220PheAlaAsnProThrGinGinLeuAspPheAspArgPheSerSerAsp225230235240AlaLeuLeuAspTyrTyrArgAspLeuArgAspThrLeuArgGinlie245250255ThrProHisValProThrThrThrAsnLeuMetAlaSerSerHisThr260265270LysGlyMetAspTyrPheSerTrpAlaProGluLeuAspValValAla275280285AsnAspHisTyrThrValAlaAlaSerProGluArgHisValGluLeu290295300AlaPheSerAlaAspLeuSerArgGlylieAlaGlyGlyHisProTrp305310315320lieLeuMetGluHisSerThrSerAlaValAsnTrpGinGluArgAsn325330335ArgSerLysLeuProGlyGluLeuLeuArgAsnSerLeuGinHisVal340345350AlaArgGlyAlaAspSerValMetPhePheGinTrpArgAlaSerArg355360365AlaGlyAlaGluLysTyrHisSerAlaMetValProHisAlaGlyThr370375380AspThrAspLeuTrpArgAspValValGlyLeuGlyAspAlaLeuArg385390395400AlaLeuGlyGluValArgGlySerArgValArgSerArgAlaAlaMet405410415ValValAspTrpProSerTrpTrpGlySerGluLeuAspSerHisPro420425430ThrGinAlaLeuArgTyrMetAspGinValGinAlaTrpTyrAlaAla43544044530KLPI090013—3.txtLeuTrpArgLeuGlyValThrValAspMetValProProSerAlaAsp450455460LeuAlaGlyTyrAspLeuValValLeuProThrThrTyrLeulieThr465470475480AspThrAspAlaAlaAsnValAlaValAlaAlaSerArgGlyAlaThr485490495ValAlaValThrTyrPheSerGlylieValAspGluAsnAspHisVal500505510ArgLeuGlyGlyTyrProGlyAlaPheArgAspLeuLeuGlyValArg515520525ThrGinGluPhePheProLeuGinGluGlyGluThrValArgValGlu530535540GlyGluAlaLeuAspGlyGlyAlaThrAlaAspLeuTrpThrGluLys545550555560ThrHisValValAspGlyThrAspValValAlaThrTyrAlaAspGly565570575AlaLeuArgGlyArgProAlalieThrArgArgProAlaGlyThrArg580585590GlyAlaAlaTrpTyrValAlaThrArgLeuAspProAlaGlyLeuAsp595600605AlaLeuAlaThrArgLeuValArgGluSerGlyValGlyProAspVal610615620AlaAlaProAlaGlyValGluValValArgArgTrpSerAspAspGly625630635640ThrThrSerTrpLeuPheAlalieAsnHisThrGluThrGluAlaThr645650655LeuGlyThrAlaGluAlaProValArgGlyValGluLeuLeuThrGly660665670SerAspValGlyGlyArgUuAlaValProAlaGlyAlaValArgVal675ValArgValVal69068068權(quán)利要求1、一種編碼β-半乳糖苷酶的基因，該基因選自(a)、(b)、(c)或(d)所示的核苷酸序列(a)SEQIDNO1所示的核苷酸序列；或(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與(a)所示的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列，且該核苷酸序列編碼具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白；或(c)編碼SEQIDNO2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(d)編碼具有β-半乳糖苷酶功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，該蛋白衍生物通過(guò)將SEQIDNO2所示的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基替換、缺失或插入而獲得。2、按照權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于該基因的核苷酸序列為SEQIDNO:1所示。3、一種(3-半乳糖苷酶，其特征在于選自以下(a)或(b)所示的氨基酸序列(a)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或(b)將SEQIDNO:2所示的氨基酸序列通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有P-半乳糖苷酶活性的蛋白書(shū)亍生物。4.根據(jù)權(quán)利要求3的半乳糖香酶，其特征在于其是SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。5.含有權(quán)利要求1或2所述基因的重組表達(dá)質(zhì)粒。6.按照權(quán)利要求5的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征是所述的重組表達(dá)質(zhì)粒是pET-galc。7.含有權(quán)利要求5或6所述重組表達(dá)質(zhì)粒的重組菌林。8、一種制備權(quán)利要求3所述p-半乳糖苦酶的方法，包括以下步驟構(gòu)建含有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的重組表達(dá)質(zhì)粒；用該重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌抹；培養(yǎng)該重組菌林，誘導(dǎo)重組P-半乳糖香酶的表達(dá)，回收并純化所表達(dá)的P-半乳糖苷酶。9.按照權(quán)利要求8的方法，其特征是所述的重組表達(dá)質(zhì)粒是pET-galc;所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌(￡sci3eric/n'acoii)BL21。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了編碼β-半乳糖苷酶的基因及其表達(dá)和應(yīng)用。本發(fā)明從采自新疆的土壤中篩選克隆了一個(gè)來(lái)源于纖維單胞菌屬(Cellulomonassp.)的β-半乳糖苷酶新基因(SEQIDNO1)。該β-半乳糖苷酶基因組DNA全長(zhǎng)2076bp，(G+C)％含量72.9％，推導(dǎo)其編碼692個(gè)氨基酸。該基因所編碼的β-半乳糖苷酶與來(lái)源于節(jié)桿菌屬的β-半乳糖苷酶相似性最高，為59％。酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定表明，本發(fā)明β-半乳糖苷酶為中性常溫酶。文獻(xiàn)報(bào)道的其他節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)的β-半乳糖苷酶大多屬低溫適冷酶，在酶學(xué)性質(zhì)上與本發(fā)明的β-半乳糖苷酶存在著顯著差異。文檔編號(hào)C12N1/19GK101597614SQ200910001928公開(kāi)日2009年12月9日申請(qǐng)日期2009年1月14日優(yōu)先權(quán)日2008年11月24日發(fā)明者伍寧豐,斌姚,偉張,張宇宏,范云六,軍郭申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所