專利名稱：抗結(jié)核桿菌感染的小分子核苷酸dna適配子及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物感染免疫和檢驗領(lǐng)域,具體涉及一種能抑制感染人的結(jié)核桿菌(M少co6ac/en、w rw6ercw/ow;y,v^7AV) [ATCC 93009(4)]的DNA適配子(Aptaraer)，具有 SEQIDNO.l, SEQIDNO.2, SEQIDNO.3, SEQIDNO.4, SEQIDN0.5,SEQIDNO.6, SEQIDNO.7, SEQIDNO.8, SEQIDNO.9, SEQIDNO.IO所示的核苷酸序列。同時還涉及制備一種能與感染人的結(jié)核桿菌特異結(jié)合，抑制結(jié)核桿菌感染的高親和DNA適配子的方法。
背景技術(shù)：
結(jié)核分枝桿菌(J^co6a"erz'ww T^ercw/o^)感染人體導(dǎo)致的結(jié)核病是一種嚴重危害人民身體健康的慢性傳染病。結(jié)核病是歷史上患病率及死亡率最高的疾病之一。上世紀'50年代以來，結(jié)核病的流行在一定程度上得到了控制。80年代中期以來，由于耐藥結(jié)核菌的流行和艾滋病的傳播蔓延等因素，使一些已經(jīng)控制了結(jié)核病疫情的國家出現(xiàn)了疫情進一步加重或擴散流行的局面，結(jié)核病疫情又有進一步抬頭的趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計資料顯示，全球目前有近三分之一的人感染結(jié)核桿菌，活動性肺結(jié)核病人達2000萬，每年有300萬人死于結(jié)核病，新增患者880萬人。1993年，世界衛(wèi)生組織宣布"全球結(jié)核病處于緊急狀態(tài)"，把結(jié)核病列為重點控制的傳染病之一。我國是結(jié)核病高負擔(dān)國家，國務(wù)
3院已確定結(jié)核病為我國三大重點防治傳染病之一。因此，加強對結(jié)核病的研發(fā)力度，急待研制新型抗結(jié)核新藥，以便對該病進行有效的治療和預(yù)防，具有很大的研究價值和社會效益。
SELEX牛支術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,系統(tǒng)進化指數(shù)富集技術(shù))是20世紀90年代初研制的一種新的組合化學(xué)技術(shù)，基本原理是運用大容量的隨機寡核苷酸文庫，并結(jié)合體外PCR擴增技術(shù)，以指數(shù)富集與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸，經(jīng)過多輪篩選，獲得高親和力、特異性強的寡核苷酸適配子(aptamers)，具有庫容量大、耙分子范圍廣、親和力高等優(yōu)點，應(yīng)用范圍十分廣泛。已成功運用于許多靶分子的篩選，包括金屬離子、有機染料、蛋白質(zhì)、藥物、氨基酸以及各種細胞因子等。這種方法具有簡便、快速、經(jīng)濟等特點，與其他組合化學(xué)庫如隨機肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷酸文庫中篩選出的適配子具有更高的親和性和特異性，具有良好的應(yīng)用前景。適配子與傳統(tǒng)意義上抗體相比，具有分子量小，能更快地滲入細胞，更迅速在血液中清除，能夠穩(wěn)定合成，便于修飾等特點。是極有潛力的作為預(yù)防、診斷和治療疾病的新型試劑。本研究中，我們采用SELEX技術(shù)對H37Rv進行篩選，并用BCG進行反篩，以獲得能拮抗結(jié)核分枝桿菌表面毒力成分的生物活性小分子核苷酸Aptamers分子。為結(jié)核桿菌感染機制的研究，結(jié)核病治療性新型藥物和新型診斷試劑的開發(fā)而奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供一種能抑制結(jié)核桿菌感染的DNA適配子，該DNA適配子為預(yù)防和治療結(jié)核病提供了新型的拮抗劑，可以克服臨床常用藥物利福平(rifampin)、鏈霉素(str印tomycin)等治療周期長，副作用大的缺點。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備能抑制結(jié)核桿菌感染的DNA適配子的方法，該方法通過隨機單鏈DNA文庫和引物的構(gòu)建、合成雙鏈DNA文庫、PCR擴增、SELEX篩選、體外抑制細菌侵襲實驗，得到能抑制結(jié)核桿菌感染小鼠的DNA適配子，并通過動物實驗檢測效果好，準確率高。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明釆用以下技術(shù)方案
一種能抑制結(jié)核桿菌感染的DNA適配子，其具有SEQIDNO.l, SEQIDNO.2,SEQIDNO.3, SEQIDNO.4, SEQ訓(xùn)0.5, SEQIDN0.6， SEQIDNO.7, SEQIDNO.8,SEQIDNO.9, SEQIDNO.10所示的核苷酸序列。
一種能抑制結(jié)核桿菌感染的DNA適配子的制備方法，按下列步驟順序進行
1、 構(gòu)建隨機單鏈DNA(ssDNA)文庫和引物。構(gòu)建長度為88個堿基的單鏈DNA(ssDNA)文庫 5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-N30-GGGTCAATGCGTCATA-3'，其中N代表堿基A, G, T， C中的任意一個，該文庫的容量約為1014 1015;構(gòu)建上游引物5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-3'，其中畫線部分為T7啟動子的序列，該引物含有DNA限制性內(nèi)切酶五coRI的酶切位點；構(gòu)建下游引物5'-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3',該引物中含有DNA限制性內(nèi)切酶SamHI的酶切位點。隨機單鏈DNA文庫和引物可由引物合成公司合成。
2、 雙鏈DNA (dsDNA)及單鏈DNA (ssDNA)文庫的PCR擴增，保存每輪篩選前先將ssDNA文庫擴增成dsDNA文庫，保存，并以dsDNA文庫為模板擴增出下一輪篩選的ssDNA文庫。為了穩(wěn)定條件，不改變反應(yīng)程序94。C 4min，94。C 30s,56。C 45s， 72°C lrain30s， 18~25個循環(huán)，72°C 7min。調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)以獲得最佳擴增效果(18~25個循環(huán))。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，試劑盒回收純化。
3、 PCR擴增產(chǎn)物的純化。用含0.5ug/ml溴化乙錠的2呢瓊脂糖凝膠，對步驟2中PCR擴增產(chǎn)物進行電泳，然后將其放在260nm熒光透視板上，把呈橘紅色條帶的PCR擴增產(chǎn)物切下，用德國Qiagen公司提供的DNA純化回收試劑盒純化；
4、 SELEX篩選。每輪篩選所用的ssDNA量均為8 ug,使用前置于85'C水浴15min后，迅速冰浴5min，取等量于篩選緩沖液(1Xbuffer)中與細菌作用，37。C輕振15 rain， 12000 rpm 5 min,棄上清，再加入篩選洗脫液(1Xbuffer)反復(fù)洗滌4~6次。所得細菌用50 ul滅菌ddH20吹勻，煮沸5 min，冰浴，用酚/氯仿(25: 24)抽提，取上清，PCR擴增dsDNA庫，即為下一輪篩選的模板。
上述SELEX篩選緩沖液(2X )為25mmol/L崔氏堿鹽酸緩沖液(Tris-Cl)，5Ommol/L氯化鉀(KC1) , 200mmol/L氯化鈉(NaCl) ， 0. 2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)， 5%甘油(Glycerol)， 0.5mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)。
上述SELEX篩選洗脫液(2X )為25mmol/L崔氏堿鹽酸緩沖液(Tris-Cl),5Ommol/L氯化鉀(KC1), lmol/L氯化鈉(NaCl)，0.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，5。/。甘油(Glycero1)， 0. 5mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)。
5、 為了獲得特異性篩選，選用梯度篩選以增加選擇壓力。前三輪用108CFU(菌落形成單位)H37RV (購自北京藥物制品研究所)篩選；
6、 第四輪開始加入BCG進行反篩，收集第三輪中所得ssDNA適配子8 ug，使用前置于85'C水浴15min后，冰浴5min,取篩選緩沖液/1 X與106 CFU BCG (購自北京生物制品研究所)作用，37"振15 min， 12000 rpm 5 min,棄上清，再加入篩選洗脫液/lX洗滌，12000rpm離心5分鐘，棄沉淀，將上清液與107CFUH37Rv作用，方法同上，離心后所得細菌用50 ul滅菌ddH20吹勻，煮沸5 min，冰浴，用酚/氯仿/25: 24抽提，取上清，PCR擴增dsDNA庫，為下一輪篩選的模板，以此模板擴增出下一輪篩選的ssDNA適配子。
7、 重復(fù)上述步驟八次。第四至第六輪用107CFU H37RV篩選，用106CFU BCG開始反篩；第七至第九輪用106CFU H37RV篩選，并用107CFU BCG反篩；第十至十二輪用105CFU H37RV篩選，并用108CFU BCG反篩，完成十二輪篩選。
8、 比較各輪篩選后所得適配子庫與結(jié)核桿菌的親合力，方法同步驟5，分別取各輪適配子8ug，與108CFU的H37RV作用，紫外分光光度計260nm檢測作用后剩余的單鏈DNA量。通過檢測，可知第十輪適配子庫與結(jié)核桿菌的親合力最大。將第十輪得到的單鏈DNA進行PCR擴增，得到雙鏈DNA產(chǎn)物，經(jīng)DNA限制性內(nèi)切酶五coRI和5amHI消化，連于質(zhì)粒pUC19 (Yanisch-Perron, C.， et al.,1985)上，轉(zhuǎn)化
到大腸桿菌DH5 a (Hanahan, D.,1983; Tartof, K. D.,et al.,1987),氨芐抗性篩選，
挑取單個生長菌落進行測序，得到上述SEQIDNO.l, SEQIDN0.2, SEQIDN0.3,SEQIDN0.4, S柳DN0.5, SEQIDN0.6, SEQIDN0.7, SEQIDNO.8, SEQIDN0.9,SEQIDNO.10所示的核苷酸序列。
本發(fā)明的優(yōu)點和效果
一能特異性的結(jié)合在結(jié)核桿菌致病過程中發(fā)揮作用的毒力因子，可降低結(jié)
核桿菌侵入巨噬細胞的能力，抑制結(jié)核桿菌感染小鼠。DNA適配子可直接作為結(jié)核桿菌的拮抗劑使用，可預(yù)防和治療結(jié)核病。因為釆用了新的組合化學(xué)技術(shù)-SELEX技術(shù)進行結(jié)核桿菌全菌的DNA適配子的篩選，確保了獲得的DNA適配子可特異性結(jié)合在結(jié)核桿菌菌體毒力因子上，從而封閉了結(jié)核桿菌的致病位點，使其不能進入巨噬細胞，從而不能在機體內(nèi)持留和增殖，有利于免疫系統(tǒng)對其清除。 二為克服臨床上結(jié)核治療出現(xiàn)的日益嚴重的耐藥問題和副作用大的情況， 提供了新的解決途徑。目前治療傷寒感染多采用廣譜抗菌素，如異燕肼
(isoniazid)、利福平(rifampin)、鏈霉素(str印tomycin)、吡嗪酰胺 (pyrazinamide)、乙胺丁醇(etambutol)和氨硫脲(bethiozone),這些藥物不僅 殺傷結(jié)核桿菌也殺傷寄生在人體內(nèi)的多種有益菌群，并且副作用大，周期長；同 時結(jié)核桿菌的對這些藥物產(chǎn)生的耐藥問題也日益嚴重。本發(fā)明制備的DNA適配 子為小分子核酸，其分子結(jié)構(gòu)不同與任何廣譜抗生素，因而無耐藥性之憂；同時 DNA適配子只針對結(jié)核桿菌發(fā)揮作用，對人體內(nèi)的多種有益菌群并無危害。DNA 適配子也別于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)抗體，其分子量小，可快速滲入細胞，無抗原性， 不引起副作用。
三由下表可知，動物實驗中，小鼠攻毒后19天取肺臟和脾臟進行細菌計 數(shù)，可發(fā)現(xiàn)用DNA適配子處理結(jié)核桿菌H37Rv后，結(jié)核桿菌的數(shù)目明顯要少于未 加DNA適配子處理組。說明本發(fā)明的適配子能有效地抑制結(jié)核桿菌侵入巨噬細 胞，促進了結(jié)核桿菌在機體內(nèi)的清除，可以直接作為結(jié)核桿菌的拮抗劑使用。此 外，該DNA適配子及適配子庫己克隆到pucl9質(zhì)粒上，并且該質(zhì)粒已轉(zhuǎn)化到大腸
桿菌DH5a中，可直接用該菌株進行大規(guī)模生產(chǎn)制備。
GroupLung (CFU)Spleen (CFU)
H37Rv1.3X1071.07xl06
H37Rv+NK21.19M077.0xl05
H37Rv+aptamers pool2.9xl061.5xl0

圖1. SELEX技術(shù)篩選特異性抑制結(jié)核感染適配子示意圖。
用合成的隨機單鏈寡核苷酸文庫與結(jié)核桿菌有毒株H37Rv作用，去掉不能 結(jié)合的部分，篩選三輪后加入BCG進行反篩，共篩選十二輪。
圖2.單鏈DNA和雙鏈DNA的擴增示意圖。
每輪篩選前先將ssDNA文庫擴增成dsDNA文庫，保存，并以dsDNA文庫為模板擴增出下一輪篩選的ssDNA文庫。此圖選用第3， 5， 7, 9， ll輪的ssDNA和 dsDNA作為示例。
圖3.有毒株結(jié)核桿菌吸附各輪(3~12)篩選后所得到的ssDNA適配子的能力比 較示意圖。
全部篩選完后，分別取8ug每輪篩選后得到的ssDNA與108CFU H37Rv作用， 發(fā)現(xiàn)第十輪適配子庫于結(jié)核桿菌有最強的結(jié)合能力。
圖4A、 4B.等溫滴定量熱法檢測核苷酸SEQIDNO.l與H37Rv和BCG親合力示意圖。
以Microcal公司提供的Origin 5.0軟件對SEQIDNO.l適配子和細菌反應(yīng)的 稀釋熱進行雙位點模型非線性最小方差擬和，可以得到SEQIDNO.l適配子和細 菌作用的本征結(jié)合常數(shù)Ka。其中SEQIDNO.l適配子與BCG的結(jié)合常數(shù)分別為 Kla: 7.20x1 ()4(土3.6xl03)Lmor1， AG尸3.124xl05(±3.674xl04)J; K2a: 1.52xl()5(土9.8xl03)Lmor1， AG2= 7.247><104(±2.94xl03)J(圖4A)。而SEQIDNO.l 適配子與H37Rv的結(jié)合常數(shù)分別為Kla: 1.84xl04(±1.5xl03) Lmol", AG尸 6.248xi。5(±4.517xl04)J; K2a: 7.65xl05(±6.0xl04) Lmol", AG2= -3.739xl05(±8.968xl04)J (圖4B)。從數(shù)據(jù)可知，SEQIDNO.l適配子與結(jié)核桿菌 有兩個結(jié)合位點，與BCG結(jié)合時，都為吸熱反應(yīng)，而與H37RV結(jié)合時，其中一 個位點為放熱反應(yīng)，且親合力較高，說明反篩是有效的，因而篩選所得到的適配 子特異性的。
圖5.抑制結(jié)核桿菌侵襲巨噬細胞的能力示意圖。
由圖可知，結(jié)核桿菌和適配子作用后侵入巨噬細胞的數(shù)量明顯減少， SEQIDNO.1-10混合適配子的作用比單個SEQIDNO.l適配子的作用更為明顯。
圖6.適配子延長小鼠生存時間和提高生存率示意圖。
適配子在與結(jié)合桿菌作用后，可以明顯延長小鼠感染結(jié)核桿菌后的生存時 間，并且生存率也得到提高。其中A為結(jié)核桿菌H37Rv感染小鼠組，B為結(jié)核
8桿菌H37Rv和SEQIDNO.l適配子作用后感染小鼠組，C為結(jié)核桿菌H37Rv和 SEQIDNO.1-10混合適配子作用后感染小鼠組。從圖中可以看出，結(jié)核桿菌與適 配子作用后，半數(shù)死亡率可推遲3天，生存率可提高l倍。
圖7.適配子對結(jié)核桿菌損害小鼠肺臟的病理改變示意圖。
由圖可知，結(jié)合桿菌在與適配子作用后，對小鼠肺臟病理損害明顯減輕。其 中A為正常小鼠肺臟，B為結(jié)核桿菌H37Rv感染小鼠肺臟，C為結(jié)核桿菌H37Rv 和SEQIDNO.l適配子作用后感染小鼠肺臟，D結(jié)核桿菌H37Rv和SEQIDNO.1-10 混合適配子作用后感染小鼠肺臟。
圖8.適配子減少結(jié)核桿菌感染小鼠后肺臟帶菌量示意圖。
抗酸染色證實，結(jié)核桿菌H37Rv與適配子作用后感染小鼠，與未與適配子 作用相比，小鼠肺臟的帶菌量明顯減少。其中A為為結(jié)核桿菌H37Rv感染小鼠 腫臟，B為結(jié)核桿菌H37Rv和SEQIDNO.l適配子作用后感染小鼠肺臟，C結(jié)核 桿菌H37Rv和SEQIDNO.1-10混合適配子作用后感染小鼠肺臟，D為鏈霉素治 療后小鼠肺臟，箭頭所指為結(jié)核桿菌。
具體實施例方式
一種能抑制結(jié)核桿菌感染的DNA適配子，其具有SEQIDNO.(卜IO)所示的
核苷酸序列。
一種能抑制^核桿菌感染的DNA適配子的制備方法按下列步驟順序進行 1、構(gòu)建隨機單鏈DNA(ssDNA)文庫和引物。構(gòu)建長度為88個堿基的單鏈 DNA(ssDNA)文庫 5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-N30-GGGTCAATGCGTCATA-3，，其中N代表堿基A， G， T, C中的任意一個，該文庫的 容量約為1014 1015;構(gòu)建上游引物5，-GCGGMTTCTMTACGACTCACTATAGGG AACAGTCCGAGCC-3'，其中畫線部分為T7啟動子的序列，該引物含有DNA限制性 內(nèi)切酶五coRI的酶切位點；構(gòu)建下游引物5'-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3'， 該引物中含有DNA限制性內(nèi)切酶Sfl附HI的酶切位點。隨機單鏈DNA文庫和引物可由上海生物工程公司合成。
2、 雙鏈DNA (dsDNA)及單鏈DNA (ssDNA)文庫的PCR擴增每輪篩選前先 將ssDNA文庫擴增成dsDNA文庫，保存，并以dsDNA文庫為模板擴增出下一輪篩 選的ssDNA文庫。為了穩(wěn)定條件，不改變反應(yīng)程序94°C 4min， 94°C 30s， 56 °C 45s， 72°C lmin30s， 18~25個循環(huán)，72°C 7niin。調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)以獲得最佳 擴增效果(18~25個循環(huán))。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，試劑盒回 收純化。
3、 PCR擴增產(chǎn)物的純化。用含0.5ug/ml溴化乙錠的2y。瓊脂糖凝膠，對步驟 2中PCR擴增產(chǎn)物進行電泳，然后將其放在260nm熒光透視板上，把呈橘紅色條 帶的PCR擴增產(chǎn)物切下，用德國Qiagen公司提供的DNA純化回收試劑盒純化；
4、 SELEX篩選。為了獲得特異性篩選，采用梯度篩選以增加選擇壓力。前三 輪用10tFUH37RV篩選；第四輪至第六輪用10tFUH37RV篩選，并用106CFUBCG 開始反篩；第七至第九輪用10tFU H37RV篩選，并用107CFU BCG反篩；第十至 十二輪用105CFU H37RV篩選，并用10SCFU BCG反篩。每輪篩選所用的ssDNA量
均為8 ug，使用前置于85。C水浴15min后，迅速冰浴(0°C) 5min,取適量于篩
選緩沖液(1Xbuffer)中與細菌感作，37。C輕振15 min， 12000 rpm 5 min， 棄上清，再加入篩選洗脫液(1Xbuffer)反復(fù)洗滌4~6次。所得細菌用50 ul 滅菌ddH20吹勻，煮沸(100°C) 5min,冰浴((TC)，用酚/氯仿(25: 24)抽提，
取上清，PCR擴增dsDNA庫，即為下一輪篩選的模板。
上述SELEX篩選緩沖液(2X )為25mmol/L崔氏堿鹽酸緩沖液(Tris-Cl)， 50mmol/L氯化lf (KC1) , 200mmol/L氯化鈉(NaCl) ， 0. 2mmol/L乙二胺四乙 酸(EDTA)， 5%甘油(Glycerol), 0.5mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)。
上述SELEX篩選洗脫液(2X)為25mmol/L崔氏堿鹽酸緩沖液(Tris-Cl), 5Ommol/L氯化鉀(KC1), lmol/L氯化鈉(NaCl)，0.2ranol/L乙二胺四乙酸(EDTA)， 5%甘油(Glycerol), 0. 5mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)。
5、 完成十二輪篩選后，比較各輪篩選后所得適配子庫與結(jié)核桿菌的結(jié)合能力， 方法同步驟5，分別取各輪適配子8ug，與l(rCFU的H37RV作用，紫外分光光度 計260nm檢測作用后剩余的單鏈DNA量。通過檢測，可知第十輪適配子庫與結(jié)核桿菌的結(jié)合能力最大。
6、將第十輪得到的單鏈DNA進行PCR擴增，得到雙鏈DNA產(chǎn)物，經(jīng)DNA限制
性內(nèi)切酶&oRI和5amHI消化，連于質(zhì)粒pUC19上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 oc ，
氨芐抗性篩選，挑取單個生長菌落進行測序；
7、將出現(xiàn)頻率最多克條的單個生長菌落所對應(yīng)的DNA適配子和第10輪適
配子庫各8ug分別加入含有10"CFU的結(jié)核桿菌[ATCC93009(4)]菌液中感作，作
用方法同步驟5，感作后的細菌做小鼠(C57BL/6)攻毒實驗，同時以沒有處理的結(jié)核桿菌做攻毒對照。將小鼠分為四組，每組8只。第一組為攻毒組，注射
107CFU H37RV/只；第二組將107CFU H37RV與第10輪ssDNA庫8ug， 37 。C感作30min
后再注射；第三組為第10輪出現(xiàn)頻率最大適配子Nk2與107CFU H37RV作用后注射，方法同第二組；第四組為鏈霉素治療組，注射107CFUH37RV后24h，再用鏈霉素治療(lmg/O. 5ml.只/天)，共六天。同時取4只小鼠只注射篩選緩沖液(l.x)和0.05%Tween-80的生理鹽水作為空白對照，所有小鼠均為尾靜脈注射400ul。實驗前H37RV都經(jīng)小鼠體內(nèi)傳代，以增強毒力，以便于結(jié)果穩(wěn)定。
實驗證明，適配子庫和單適配子均能延長小鼠的生存時間，并能明顯減少活體肺組織的帶菌量。因此，第十輪適配子庫即為能抑制結(jié)核桿菌感染小鼠的DNA適配子庫，其中出現(xiàn)頻率最大的單適配子即為能抑制結(jié)核桿菌感染小鼠的DNA
適配子。
上述SELEX篩選緩沖液(2X )為25mmol/L崔氏堿鹽酸緩沖液(Tris-Cl),50mmol/L KC1, 200mmol/LNaCl， 0. 2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)， 5%甘油(Glycerol), O.5mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)。SEQUENCE LISTING
<110>武漢大學(xué)
<120〉抗結(jié)核桿菌感染的小分子核苷酸DNA適配子及其制備方法<130>抗結(jié)核桿菌感染的小分子核苷酸DNA適配子及其制備方、法
〈160> 10
<170〉 Patentln version 3. 1
〈21?！?1
<211〉 30
〈212> DNA〈213〉人工序列
<400> 1
tttaatcaca caacaccgtg cttcaagctt 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA<213〉人工序列
〈400〉 2
tttaatcaca caacaccgtg tttcaagctt 30
<210> 3
<211〉 30
〈212〉 DNA<213〉人工序列
<400> 3
tttaatcaca caacaccgtg cttctagctt 30
<210> 4
〈211> 30<212> DNA<213〉人工序列<400> 4
tttaatcaca caacaccgtg ctactagctt 30
<210〉 5<211> 30<212> DNA<213>人工序列<400〉 5
tttaatcaca caacaccgtg ctactagctt 30
<210〉 6〈211〉 30
<212> 腿 '<213> 人工序列<400〉 6
cgacaggggt ctgaatcacg tacattcgta 30
<210〉 7
<211> 30
〈212〉腿
〈213>人工序列
<400> 7 .
cgacaggggt ctgaaccacg tacattcgta 30
<210〉 8
<211> 30〈212〉腿<213>人工序列
13<400〉 8
ataactggat ccgtccacac cttcaaactg 30
<210> 9<211〉 30<212> 腿〈213>人工序列<400> 9
acccacttcg aatccagatt catgaaccaa 30
<210〉 10<211〉 30<212〉 腿〈213〉人工序列<400> 10
ccca/tactac attcatcccg gaacacgtgg 30
權(quán)利要求
1、一種能抑制結(jié)核桿菌感染的DNA適配子，其序列為SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
2、 權(quán)利要求1所述的一種能抑制結(jié)核桿菌感染的DNA適配子在結(jié)核感染藥 物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能抑制結(jié)核桿菌感染的DNA適配子及制備方法，DNA適配子具有SEQ ID No.1-10所示的核苷酸序列，其制備方法包括以下步驟首先是構(gòu)建隨機單鏈DNA文庫的；其次是合成雙鏈DNA文庫；第三是SELEX篩選；第四是PCR擴增；第五是克隆和測序；第六是通過體內(nèi)和體外實驗證實DNA適配子的效果。該DNA適配子可直接作為結(jié)核桿菌拮抗劑使用，可用于預(yù)防和治療結(jié)核病，克服臨床常用藥物利福平(rifampin)、鏈霉素(streptomycin)等治療周期長，副作用大的缺點。
文檔編號C12N15/11GK101481686SQ200910002498
公開日2009年7月15日 申請日期2006年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月20日
發(fā)明者章曉聯(lián), 凡 陳 申請人:武漢大學(xué)