專利名稱：木葡糖酸醋桿菌屬菌株及其選育和生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物，具體涉及一種耐低溫的木葡糖酸醋桿菌 屬菌株及其選育和應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
利用微生物(主要是醋桿菌)發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素， 一般稱之為細(xì) 菌纖維素或微生物纖維素，這種纖維素具有純度高、吸水性強、結(jié)晶 度高、聚合度高等許多不同于植物纖維素的結(jié)構(gòu)特點，其纖維束直徑
在100納米以下，是一種天然的納米生物材料，是近年來生物材料研
究開發(fā)的熱點之一，在食品、造紙、聲音振動膜、人造皮膚的制造及 造紙行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用前景。目前，這種細(xì)菌纖維素在食品方面有 較廣泛的應(yīng)用，其主要方法是以椰子為培養(yǎng)基，經(jīng)產(chǎn)纖維素的醋桿菌 發(fā)酵后生產(chǎn)乳白色或透明的可食用的纖維素凝膠，俗稱"椰果"、"椰 纖果"或"納塔"。
這種細(xì)菌纖維素目前主要在我國海南省、越南、菲律賓等熱帶或 亞熱帶地區(qū)進行了規(guī)?；a(chǎn)， 一方面是因為這些地區(qū)有豐富的發(fā)酵
生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的天然培養(yǎng)基——熱帶果汁(如椰子水、菠蘿汁等)； 另一方面這些地區(qū)常年氣溫較高，適合發(fā)酵生產(chǎn)。但近年來，有許多 文獻報道了利用非熱帶果汁(如柑桔汁、西瓜汁等)作為培養(yǎng)基來 生產(chǎn)細(xì)菌纖維素。因為細(xì)菌纖維素生產(chǎn)的特殊性， 一般工業(yè)發(fā)酵所用的發(fā)酵罐培養(yǎng)并不能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，目前主要的頻!t莫化生產(chǎn)方式是
淺盤培養(yǎng)，這種發(fā)酵方式是在一個相對潔凈的發(fā)酵房內(nèi)擺放相當(dāng)數(shù)量 的淺盤，在淺盤中裝入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基，然后接入能產(chǎn)纖維素的醋桿 菌菌種，經(jīng)靜置發(fā)酵后，塊狀的纖維素膜就在淺盤中產(chǎn)生。顯而易見， 由于不是常規(guī)的發(fā)酵罐生產(chǎn)，發(fā)酵溫度并不容易控帶J，上述淺盤發(fā)酵 一般是在室溫下生產(chǎn)細(xì)菌纖維素，這就解釋了為何細(xì)菌纖維素規(guī)?；?生產(chǎn)主要處在熱帶或亞熱帶地區(qū)，這些地區(qū)由于常年高溫，能夠滿足 微生物發(fā)酵所需的溫度，即使在海南省，在冬季氣溫較低時生產(chǎn)"椰 纖果"也需給發(fā)酵廠房供給熱能，以保持發(fā)酵的溫度。目前發(fā)酵生產(chǎn)
細(xì)菌纖維素或"椰纖果"溫度在3(TC左右， 一般不低于25"C,否則 生產(chǎn)難以進行，這給細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)帶來了極大的限制，在氣溫較 低的季節(jié)或區(qū)域，如果要實現(xiàn)細(xì)菌纖維素的規(guī)?；a(chǎn)，必須額外供 給大量熱能以獲得生產(chǎn)所需的溫度，但這無疑增加了生產(chǎn)的成本。與 此同時，由于淺盤發(fā)酵生產(chǎn)對環(huán)境的潔凈度要求較高，在溫度較高的 環(huán)境中，培養(yǎng)基中極易滋生污染雜菌，從而影響發(fā)酵效果，造成產(chǎn)率 降低。
文獻"細(xì)菌纖維素耐低溫生產(chǎn)菌株的誘變選育"(中國釀造，2008 年第17期)中報道了利用紫外誘變的方法，以獲取在低溫條件下能 高產(chǎn)細(xì)菌纖維素的突變株。然而文獻中所提到的"低溫"是指在25 。C培養(yǎng)，這種溫度在實際生產(chǎn)沒有太大的價值。此外，利用紫外誘變 的方法獲得的菌株往往在遺傳性能發(fā)生變化，其安全性還需進一步進 行評估才能用于生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能于低溫下生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的木葡糖
酸醋桿菌屬菌株。
本發(fā)明的另一目的是提供一種上述菌株的的選育方法。 本發(fā)明的另一目的是提供一種利用上述菌株在低溫下生產(chǎn)細(xì)菌
纖維素的方法。
發(fā)明人在冬季利用木葡糖酸醋桿菌在淺盤靜置發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖 維素時發(fā)現(xiàn)，在溫度在15。C左右時未向發(fā)酵房中供暖， 一些淺盤中 并未獲得預(yù)期的代謝產(chǎn)物纖維素膜，然而并非所有的淺盤中都如此， 仍有部分淺盤中產(chǎn)生了一定厚度的纖維素膜，纖維素膜的厚度不一， 這說明有些木葡糖酸醋桿菌菌株能夠適應(yīng)較低溫度，在較低溫度下仍 能生長代謝纖維素。發(fā)明人將淺盤中產(chǎn)纖維素膜較厚的菌株篩選出
來，命名為323，通過選育，獲得了能夠在低溫下生產(chǎn)的菌種。這種 菌種能夠在低溫下穩(wěn)定代謝纖維素，而無需供暖以保證發(fā)酵的溫度， 從而節(jié)省了大量的能源。
利用淺盤發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素，由于供氧的原因，發(fā)酵容器內(nèi)不 能和外界隔絕，因此保持發(fā)酵房中的潔凈度是必要的， 一般是在發(fā)酵 房內(nèi)噴灑一定的殺菌劑，如生石灰、酒精等，但這并不能完全保證 發(fā)酵過程中杜絕污染的問題， 一旦發(fā)酵淺盤內(nèi)滋生了污染菌，如能 快速降解纖維素的霉菌或酵母，將會影響目標(biāo)產(chǎn)物的得率。發(fā)明人將
低溫(15"左右)與高溫發(fā)酵(3(TC左右)的方式進行了比較，發(fā)現(xiàn)
在高溫發(fā)酵與低溫發(fā)酵相比，前者在發(fā)酵過程中更容易遭受污染，這菌生長繁殖的最適溫度， 一些生產(chǎn) 中常見污染菌如酵母、霉菌等極易在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中滋生，從而 影響了生產(chǎn)，降低了纖維素的得率。而在低溫發(fā)酵方式下，常見的微 生物污染則不容易發(fā)生，因此低溫發(fā)酵方式一種潛在的可以利用的優(yōu) 勢是可以有效降低淺盤發(fā)酵的污染情況的發(fā)生。即使是在春夏季生 產(chǎn)，如果利用空調(diào)對發(fā)酵房的溫度進行調(diào)節(jié)，雖然消耗了能源，但卻 可以大幅度降低污染，提高產(chǎn)物的得率，對于生產(chǎn)者而言，這種低溫 發(fā)酵方式也是可以接受的。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的
一種木葡糖酸醋桿菌屬菌株，于2004年7月12日保藏于"中國
微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心"，地址北京市海淀區(qū)
中關(guān)村北一條13號，保藏登記號為CGMCC N0.1186,命名為 木葡糖酸醋桿菌323，分類命名為木葡糖酸醋桿菌(G/z^w"ceto^"w x_y//"Mm)。這種菌株能夠在低溫下穩(wěn)定代謝纖維素，而無需供暖以保 證發(fā)酵的溫度，從而節(jié)省了大量的能源。 本發(fā)明的另一 目的是這樣實現(xiàn)的
一種上述木葡糖酸醋桿菌屬菌株的選育方法，其步驟如下篩選
在常溫下產(chǎn)纖維素膜厚、活力強的木葡糖酸醋桿菌，接入滅菌后的培
養(yǎng)基中進行靜置培養(yǎng)，選擇培養(yǎng)箱溫度28'C-3rC作為起始溫度，培 養(yǎng)2-5天后作為第一代菌種，降低培養(yǎng)箱溫度3t:-5"C，篩選第一代 菌種中產(chǎn)纖維素膜較厚的菌液作為種子液，接入滅菌后的培養(yǎng)基中進 行靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)2-5天后作為第二代菌種，以此類推，每轉(zhuǎn)接一代培養(yǎng)溫度降低3°C-5°C，同時每次篩選上一代菌種中產(chǎn)纖維素膜厚的 菌液作為下一代培養(yǎng)的種子液，經(jīng)過3-5代篩選后，可篩選出能在IO °C-20°C生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的耐低溫的木葡糖酸醋桿菌屬菌株。 本發(fā)明的另一 目的是這樣實現(xiàn)的
一種利用上述菌株生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法，其利用上述經(jīng)篩選的 耐低溫的木葡糖酸醋桿菌作為菌株，可以直接在低溫下生產(chǎn)的細(xì)菌纖 維素。其步驟如下
① 菌株擴培將篩選出的菌株在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，根據(jù)生產(chǎn)需
要，按每代擴大10-25倍的產(chǎn)量，培養(yǎng)溫度1(TC-15'C，每代培養(yǎng)2-5 天，通過2-3代的轉(zhuǎn)代擴培，獲得所需的種子液。
② 培養(yǎng)基制備將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH值至3.0-6.5,培養(yǎng)基煮沸 5min-30min。
③ 培養(yǎng)基裝盤將培養(yǎng)基趁熱裝入發(fā)酵淺盤中，冷卻至室溫。
④ 接種發(fā)酵裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵淺盤移入低溫發(fā)酵室，低溫發(fā)酵 室溫度控制在10°C-20°C，待培養(yǎng)基溫度降至與低溫發(fā)酵室溫度時， 按培養(yǎng)基1%-10%的重量接入種子液，發(fā)酵3-15天即可生產(chǎn)得到細(xì)菌
纖維素。
上述生產(chǎn)步驟③中，若室溫已經(jīng)處于10°C-20°C，則可直接接入 種子液發(fā)酵3-15天，接種量按培養(yǎng)基1%-10%的重量接入。
本發(fā)明提供了一種耐低溫的木葡糖酸醋桿菌屬菌株及其選育和 生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法，這種方法與現(xiàn)有生產(chǎn)細(xì)菌纖維素方法比較存 在如下優(yōu)勢1、 可以突破由于氣溫較低、在生產(chǎn)時必須供暖的限制，可以降 低生產(chǎn)成本。
2、 本發(fā)明提供的在低溫下生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法，可以有效防 止生產(chǎn)中雜菌的污染，從而提高了得率。
具體實施例方式
下面結(jié)合非限定性具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解， 這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍。 實施例一
篩選在常溫下產(chǎn)纖維素膜厚、活力強的木葡糖酸醋桿菌，接入滅
菌后的培養(yǎng)基中進行靜置培養(yǎng)，選擇培養(yǎng)箱溫度3(TC作為起始溫度， 培養(yǎng)3天后作為第一代菌種，調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱溫度為25°C，篩選第一代 菌種中產(chǎn)纖維素膜較厚的菌液作為種子液，接入滅菌后的培養(yǎng)基中進 行靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后作為第二代菌種，以此類推，每轉(zhuǎn)接一代培 養(yǎng)溫度降低5°C，同時每次篩選上一代菌種中產(chǎn)纖維素膜厚的菌液作 為下一代培養(yǎng)的種子液，經(jīng)過5代篩選后，可篩選出能在l(TC下生 產(chǎn)細(xì)菌纖維素的木葡糖酸醋桿菌屬菌株，將菌株冷凍干燥后保藏。
利用上述經(jīng)篩選的耐低溫木葡糖酸醋桿菌作為菌種，直接在低溫 下生產(chǎn)的細(xì)菌纖維素。其主要生產(chǎn)步驟包括-
① 菌株擴培將篩選出的菌株在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，根據(jù)生產(chǎn)需 要，按每代擴大10倍的產(chǎn)量，通過3代的轉(zhuǎn)代擴培，每代培養(yǎng)3天， 培養(yǎng)溫度1(TC，獲得所需的種子液。
② 培養(yǎng)基制備將生產(chǎn)培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH值3.7，培養(yǎng)基煮沸5min。③ 培養(yǎng)基裝盤將培養(yǎng)基趁熱裝入發(fā)酵淺盤中，冷卻至室溫。
④ 接種發(fā)酵裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵淺盤移入低溫發(fā)酵室，其溫度控 制在l(TC，待培養(yǎng)基溫度降至與低溫發(fā)酵室同樣溫度時，按培養(yǎng)基 5%的重量接入種子液，發(fā)酵10天。
實施例二
篩選在常溫下產(chǎn)纖維素膜厚、活力強的木葡糖酸醋桿菌，接入滅
菌后的培養(yǎng)基中進行靜置培養(yǎng)，選擇培養(yǎng)箱溫度28。C作為起始溫度， 培養(yǎng)2天后作為第一代菌種，調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱溫度為25°C，篩選第一代 菌種中產(chǎn)纖維素膜較厚的菌液作為種子液，接入滅菌后的培養(yǎng)基中進 行靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后作為第二代菌種，以此類推，每轉(zhuǎn)接一代培 養(yǎng)溫度降低3°C，同時每次篩選上一代菌種中產(chǎn)纖維素膜厚的菌液作 為下一代培養(yǎng)的種子液，經(jīng)過5代篩選后，可篩選出能在16"C下生 產(chǎn)細(xì)菌纖維素的木葡糖酸醋桿菌屬菌株。
利用上述經(jīng)篩選的耐低溫木葡糖酸醋桿菌作為菌株，可以直接在 低溫下生產(chǎn)的細(xì)菌纖維素。其主要生產(chǎn)步驟包括
① 菌株擴培將篩選出的菌種在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，根據(jù)生產(chǎn)需
要，按每代擴大10倍的產(chǎn)量，通過3代的轉(zhuǎn)代擴培，培養(yǎng)溫度16°C， 每代培養(yǎng)3天，獲得所需的種子液。
② 培養(yǎng)基制備:將生產(chǎn)培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH值4.1，培養(yǎng)基煮沸15min。
③ 培養(yǎng)基裝盤將培養(yǎng)基趁熱裝入發(fā)酵淺盤中，冷卻至16。C。
④ 接種發(fā)酵按培養(yǎng)基1%-10°/。的重量接入種子液，發(fā)酵7天。
實施例三篩選在常溫下產(chǎn)纖維素膜厚、活力強的木葡糖酸醋桿菌，接入滅
菌后的培養(yǎng)基中進行靜置培養(yǎng)，選擇培養(yǎng)箱溫度3(TC作為起始溫度， 培養(yǎng)3天后作為第一代菌種，調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱溫度為25°C，篩選第一代 菌種中產(chǎn)纖維素膜較厚的菌液作為種子液，接入滅菌后的培養(yǎng)基中進 行靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后作為第二代菌種，以此類推，每轉(zhuǎn)接一代培 養(yǎng)溫度降低5°C，同時每次篩選上一代菌種中產(chǎn)纖維素膜厚的菌液作 為下一代培養(yǎng)的種子液，經(jīng)過3代篩選后，可篩選出能在2(TC下生 產(chǎn)細(xì)菌纖維素的木葡糖酸醋桿菌屬菌株。
利用上述經(jīng)篩選的耐低溫木葡糖酸醋桿菌作為菌株，可以直接在 低溫下生產(chǎn)的細(xì)菌纖維素。其主要生產(chǎn)步驟包括-
① 菌株擴培將篩選出的菌株在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，根據(jù)生產(chǎn)需 要，按每代擴大10倍的產(chǎn)量，通過2代的轉(zhuǎn)代擴培，培養(yǎng)溫度2(TC， 每代培養(yǎng)3天，獲得所需的種子液。
② 培養(yǎng)基制備將生產(chǎn)培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH值3.7，培養(yǎng)基煮沸10min。
③ 培養(yǎng)基裝盤將培養(yǎng)基趁熱裝入發(fā)酵淺盤中，冷卻至室溫。
④ 接種發(fā)酵裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵淺盤移入低溫發(fā)酵室，其溫度控
制在20°C，待培養(yǎng)基溫度降至與低溫發(fā)酵室同樣溫度時，按培養(yǎng)基 5%的重量接入種子液，發(fā)酵5天。
權(quán)利要求
1、一種木葡糖酸醋桿菌屬菌株，其特征是它于2004年7月12日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏登記號為CGMCC NO.1186，命名為木葡糖酸醋桿菌323，分類命名為木葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter xylinum)。
2、 一種權(quán)利要求1所述的木葡糖酸醋桿菌屬菌株的選育方法， 其特征是其步驟如下篩選在常溫下產(chǎn)纖維素膜厚、活力強的木葡 糖酸醋桿菌，接入滅菌后的培養(yǎng)基中進行靜置培養(yǎng)，選擇培養(yǎng)箱溫度 28t:-31。C作為起始溫度，培養(yǎng)2-5天后作為第一代菌種，降低培養(yǎng) 箱溫度3°C-5°C，篩選第一代菌種中產(chǎn)纖維素膜較厚的菌液作為種子 液，接入滅菌后的培養(yǎng)基中進行靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)2-5天后作為第二代 菌種，以此類推，每轉(zhuǎn)接一代培養(yǎng)溫度降低3"C-5'C，同時每次篩選 上一代菌種中產(chǎn)纖維素膜厚的菌液作為下一代培養(yǎng)的種子液，經(jīng)過 3-5代篩選后，可篩選出能在10'C-2(TC生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的耐低溫的 木葡糖酸醋桿菌屬菌株。
3、 一種利用權(quán)利要求1所述的木葡糖酸醋桿菌屬菌株生產(chǎn)細(xì)菌 纖維素的方法，其特征是其步驟如下① 菌株擴培將篩選出的菌株在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，根據(jù)生產(chǎn)需 要，按每代擴大10-25倍的產(chǎn)量，培養(yǎng)溫度10。C-15T:，每代培養(yǎng)2-5 天，通過2-3代的轉(zhuǎn)代擴培，獲得所需的種子液。② 培養(yǎng)基制備將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH值至3.0-6.5，培養(yǎng)基煮沸 5min-30min。③ 培養(yǎng)基裝盤將培養(yǎng)基趁熱裝入發(fā)酵淺盤中，冷卻至室溫。④ 接種發(fā)酵裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵淺盤移入低溫發(fā)酵室，低溫發(fā)酵 室溫度控制在10°C-20°C，待培養(yǎng)基溫度降至與低溫發(fā)酵室溫度時，按培養(yǎng)基1%-10%的重量接入種子液，發(fā)酵3-15天即可生產(chǎn)得到細(xì)菌纖維素。
全文摘要
本發(fā)明提供的是一種木葡糖酸醋桿菌屬菌株及其選育和生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法，該菌株于2004年7月12日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏登記號為CGMCCNO.1186，命名為木葡糖酸醋桿菌323，分類命名為木葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter xylinum)。其選育方法是篩選在常溫下產(chǎn)纖維素膜厚、活力強的木葡糖酸醋桿菌，然后進行降溫培養(yǎng)后經(jīng)篩選，再進行降溫培養(yǎng)，可篩選出能在10℃-20℃生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的木葡糖酸醋桿菌屬菌株。其生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法包括菌株擴培、培養(yǎng)基制備、培養(yǎng)基裝盤、接種發(fā)酵。本發(fā)明所提供的菌株能突破溫度的限制，降低生產(chǎn)成本，有效防止生產(chǎn)中雜菌的污染，從而提高了得率。
文檔編號C12P19/00GK101608167SQ20091000395
公開日2009年12月23日 申請日期2009年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月20日
發(fā)明者鐘春燕 申請人:海南椰國食品有限公司