專(zhuān)利名稱(chēng)：一種使孢子快速萌發(fā)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使孢子快速萌發(fā)的方法，具體的說(shuō)是采用改進(jìn)后的培養(yǎng)皿法進(jìn)行
的孢子培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
孢子萌發(fā)是植物病理學(xué)真菌病害試驗(yàn)研究中經(jīng)常用到的手段，比如可以作為鑒定 某些真菌性狀的方法，孢子的萌發(fā)實(shí)驗(yàn)又是殺菌劑藥效測(cè)定的主要方法。同時(shí)對(duì)于某些病 害的接種，也需要大量的孢子。另外在研究病原真菌的生活史，病害的侵染循環(huán)及病害的發(fā) 生和流行條件等，都涉及孢子的萌發(fā)問(wèn)題。因此，如何快速高效的得到高萌發(fā)率的孢子，并 用這些萌發(fā)的孢子來(lái)做進(jìn)一步研究，也是植病研究中重要的手段和方法。本方法是發(fā)明人 本人在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中總結(jié)出來(lái)的一種高通量的高效快速得到病菌萌發(fā)孢子的方法。
傳統(tǒng)的孢子萌發(fā)方法主要有懸滴法、載玻片上萌發(fā)法、培養(yǎng)皿中萌發(fā)法、瓊脂平板 表面萌發(fā)法及其它特殊方法。發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)中主要采用懸滴法和載玻片萌發(fā)法作為比較方 法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種使孢子快速萌發(fā)的方法，是一種改進(jìn)的培養(yǎng)皿法。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)
—種使孢子快速萌發(fā)的方法，包括以下步驟 A、取孢子菌株在PDA培養(yǎng)基上置于28 ±0. 5。C培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行單孢培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng) 滿(mǎn)皿后，置于光照下28±0. 5t:連續(xù)照射至少4天，誘導(dǎo)孢子的產(chǎn)生。 B、用適當(dāng)量的無(wú)菌水沖洗菌落表面，得到孢子液。再用4層紗布過(guò)濾得到孢子懸 浮液，用無(wú)菌水稀釋?zhuān)规咦訚舛冗_(dá)到1()S個(gè)/ml。 C、參照方中達(dá)《植病研究方法》，取配置好的孢子懸浮液進(jìn)行懸滴法和載玻片萌發(fā) 法操作實(shí)驗(yàn)。 D、把從步驟B得到的部分孢子懸浮液離心，保留部分上清約100ul，其余上清丟 棄，保留孢子備用。E、無(wú)菌條件下，把滅過(guò)菌的孔徑為0. 45um的透明微孔濾膜平鋪在事先準(zhǔn)備好的 PDA平板上，使膜與培養(yǎng)基表面緊密接觸，不留空隙。膜大小以剛能全部遮住培養(yǎng)基為準(zhǔn)。
F、取離心得到的100ul孢子懸浮液平鋪到濾膜上，用三角玻棒攤勻，用封口膜封 口后置于28 ±0. 5t:培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 G、培養(yǎng)一定時(shí)間后即可在顯微鏡下直接觀察孢子的萌發(fā)率，或者用無(wú)菌水沖洗萌 發(fā)的孢子，得到萌發(fā)的孢子懸浮液(此過(guò)程禁用三角玻棒刮)。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)兩種觀察方法得到 的結(jié)果一樣，采用觀察孢子懸浮液的方法。 H、所有三種處理都是在培養(yǎng)5h和8h后在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)率。每個(gè)處理觀 察IO個(gè)視野。其中孢子萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)為以芽管長(zhǎng)度超過(guò)孢子直徑長(zhǎng)度(指直徑最小的一邊)的一半，視為已經(jīng)萌發(fā)的孢子。 本發(fā)明的有益效果為與常用的孢子萌發(fā)方法相比，在相同的時(shí)間條件下，可以大 幅度提高孢子萌發(fā)率。
具體實(shí)施例方式
下面以香蕉枯萎菌和西瓜枯萎菌兩種菌為材料的基礎(chǔ)上，采用載玻片發(fā)、懸滴法 和本方法進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)及分析如下 1、三種方法下，F(xiàn)0C-4R的孢子萌發(fā)率比較(表1) 表1 ， F0C-4R的孢子萌發(fā)率
萌發(fā)時(shí)間5h8h處理方法單位面積萌 飾子數(shù)單位面積未 萌發(fā)孢子數(shù)萌發(fā)率 (%)單位面積萌 鵬子數(shù)單位面積未 萌發(fā)孢子數(shù)萌發(fā)率(％)
載波片法 (對(duì)照l(shuí))81455.2101436.5
懸滴法 (對(duì)照2)4021016.08712539.2
本方法4114522.1511577.3 由表1中可以看到，使用三種方法得到的孢子萌發(fā)率以對(duì)照1的萌發(fā)率最低，即使
是在處理8h后，也僅能達(dá)到6. 5%，雖然對(duì)照2的萌發(fā)率在處理相同時(shí)間后達(dá)到了 39. 2%，
但與改良的培養(yǎng)皿法高達(dá)77. 3%的萌發(fā)率相比，還是相差甚遠(yuǎn)。F0C-4R菌株在使用改良的
培養(yǎng)皿發(fā)后，無(wú)論在處理5h或8h后，孢子的萌發(fā)率都顯著高于其它兩種方法。 2、三種方法下，F(xiàn)W的孢子萌發(fā)率比較(表2) 表2，F(xiàn)W的孢子萌發(fā)率
萌發(fā)時(shí)間5h8h處理方法單位面積萌 細(xì)子數(shù)單位面積未 萌發(fā)孢子數(shù)萌發(fā)率 (%)單位面積萌 對(duì)包子數(shù)單位面積未 萌發(fā)孢子數(shù)萌發(fā)率(％)
載波片法 (對(duì)照l(shuí))42221.8212338.3
懸滴法 (對(duì)照2)3418415.610313543.3
本方法8012938.31901592.7 由表2可知，無(wú)論在處理時(shí)間和處理方法下，使用對(duì)照1的孢子萌發(fā)率最低，特別 是在處理5h的情況下，僅能達(dá)到1.8%，而在同樣條件下，使用了改良方法的孢子其萌發(fā)率 都是最高的，特別是在處理了 8h后，萌發(fā)率可以高達(dá)92.7X，幾乎全部萌發(fā)。FW菌株其孢 子萌發(fā)率在使用改良的培養(yǎng)皿發(fā)后，無(wú)論是在處理5h或是8h，其萌發(fā)率都顯著高于其它兩種對(duì)照方法。 改良的培養(yǎng)皿法是在原有的培養(yǎng)皿方法基礎(chǔ)上改進(jìn)而來(lái)的。發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)過(guò)程 中，因?yàn)樾枰劝l(fā)率相當(dāng)高的孢子來(lái)做研究，而由于這兩種孢子需要高濕度環(huán)境才能萌發(fā)。 在實(shí)驗(yàn)了現(xiàn)有的幾種孢子萌發(fā)方法后，都達(dá)不到理想的要求。因此才設(shè)計(jì)和試驗(yàn)了這種方 法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用改良的培養(yǎng)皿法進(jìn)行孢子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，其萌發(fā)率可以很容易控制并能達(dá)到實(shí) 驗(yàn)要求。如果需要全部萌發(fā)，對(duì)于香蕉枯萎菌4號(hào)小種來(lái)說(shuō)，萌發(fā)時(shí)間控制在10個(gè)小時(shí)即 可。而對(duì)于西瓜枯萎菌來(lái)說(shuō)，只要8小時(shí)即可。 本方法結(jié)果是在以香蕉枯萎菌和西瓜枯萎菌兩種菌為材料的基礎(chǔ)上得到的，而這 兩種菌的孢子萌發(fā)都需要高濕環(huán)境，因此對(duì)于需要高濕條件，但不需要在水滴環(huán)境下才能 萌發(fā)的孢子，此方法是可行的。對(duì)于常規(guī)的萌發(fā)方法，如薄片法，由于孢子在水滴中，可能 空氣不夠通暢，而導(dǎo)致萌發(fā)率極低；雖然懸滴法下孢子萌發(fā)率有所提高，但實(shí)際萌發(fā)率也很 低。這種方法下，雖然保證了孢子能與空氣進(jìn)行有效接觸，但因?yàn)槭撬蔚箲?，只有少部?在水膜上的孢子可以接觸到空氣，大部分還在水滴里面，因此也致使孢子萌發(fā)率不高；水瓊 脂培養(yǎng)皿法雖然能保證有較高的孢子萌發(fā)率，但缺點(diǎn)是如果還要用萌發(fā)的孢子進(jìn)行其它研 究工作，如進(jìn)行孢子轉(zhuǎn)化等，這些孢子就不能被再度利用。另外水瓊脂法還必須對(duì)孢子進(jìn)行 染色，才能觀察到孢子的萌發(fā)情況，而改良的培養(yǎng)皿法卻不需要染色步驟。改良的培養(yǎng)皿法 之所以能夠得到高萌發(fā)率的孢子原因就在于，在這種方法下，不僅保證了孢子所需要的高 濕度環(huán)境，而且還可以不與水滴直接接觸，同時(shí)也保證了足夠的空氣。因此改良的培養(yǎng)皿法 不僅能夠得到高萌發(fā)率的孢子，而且可以通過(guò)控制萌發(fā)時(shí)間獲得理想的孢子萌發(fā)率。萌發(fā) 的孢子還可洗下來(lái)，用于其它的科學(xué)研究。 本方法對(duì)于需要高濕環(huán)境，但不需要在有水環(huán)境下的孢子萌發(fā)有利，但對(duì)于高濕 環(huán)境不利于萌發(fā)的其它類(lèi)型孢子，此方法未必有效。另外，由于本文只用了兩種菌，且萌發(fā) 時(shí)間只選擇了兩個(gè)時(shí)間段，因此若需要其它菌種的萌發(fā)率，此方法可作為借鑒。
權(quán)利要求
一種使孢子快速萌發(fā)的方法，包括以下步驟A、取孢子菌株在PDA培養(yǎng)基上置于培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行單孢培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)皿后，置于光照下連續(xù)照射至少4天，誘導(dǎo)孢子的產(chǎn)生；B、用適當(dāng)量的無(wú)菌水沖洗菌落表面，得到孢子液，孢子液經(jīng)過(guò)過(guò)濾得到孢子懸浮液，然后用無(wú)菌水稀釋?zhuān)规咦訚舛冗_(dá)到105個(gè)/ml；C、取配置好的孢子懸浮液進(jìn)行懸滴法和載玻片萌發(fā)法操作；D、把從步驟B得到的部分孢子懸浮液離心，保留部分上清約，備用；E、無(wú)菌條件下，把滅過(guò)菌的孔徑為0.45um的透明微孔濾膜平鋪在事先準(zhǔn)備好的PDA平板上，使膜與培養(yǎng)基表面緊密接觸，不留空隙；F、取步驟D離心得到的孢子懸浮液平鋪到濾膜上，用三角玻棒攤勻，用封口膜封口后置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使孢子快速萌發(fā)的方法，其特征在于，還包括步驟G、在 顯微鏡下直接觀察孢子的萌發(fā)率。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使孢子快速萌發(fā)的方法，其特征在于，還包括步驟G、用 無(wú)菌水沖洗萌發(fā)的孢子，得到萌發(fā)的孢子懸浮液，觀察孢子懸浮液得到萌發(fā)率。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的一種使孢子快速萌發(fā)的方法，其特征在于，保留 部分上清約100ul。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l-3任意一項(xiàng)所述的一種使孢子快速萌發(fā)的方法，其特征在于，培養(yǎng) 箱的溫度28±0. 5°C。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的一種使孢子快速萌發(fā)的方法，其特征在于，光照 的溫度控制在28±0. 5t:范圍內(nèi)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使孢子快速萌發(fā)的方法，其特征在于，步驟C采用的懸滴 法和載玻片萌發(fā)法參照方中達(dá)《植病研究方法》。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使孢子快速萌發(fā)的方法，其特征在于，步驟E中，膜的大 小以剛能全部遮住培養(yǎng)基為準(zhǔn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使孢子快速萌發(fā)的方法，具體的說(shuō)是在培養(yǎng)皿法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)的孢子萌發(fā)方法。與常用的傳統(tǒng)的孢子萌發(fā)方法主要有懸滴法、載玻片上萌發(fā)法、培養(yǎng)皿中萌發(fā)法、瓊脂平板表面萌發(fā)法及其它特殊方法相比，在相同的時(shí)間條件下，本方法可以大幅度提高孢子萌發(fā)率。
文檔編號(hào)C12N3/00GK101760434SQ20091000935
公開(kāi)日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2009年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月20日
發(fā)明者張新春 申請(qǐng)人:張新春