專利名稱：：一種高靈敏度的利用基因突變酵母細(xì)胞篩選抗朊病毒藥物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種利用酵母細(xì)胞篩選抗朊病毒藥物的方法。特別涉及到的是利用基因定點(diǎn)突變酵母細(xì)胞高靈敏度的篩選抗朊病毒藥物的方法。
背景技術(shù)：
：朊病毒是一類能在動物和人中引起可傳染性腦病(包括瘋牛病、羊搔癢癥、庫魯病、克雅氏病等)的病原體，其高度傳染性和致死性對整個社會造成了極大的危害。目前，全世界的研究者們正致力于尋求建立高通量抗朊病毒藥物篩選平臺的研究，從而盡快研發(fā)出預(yù)防和治療朊病毒引發(fā)疾病的藥物。目前，在美國和歐洲有關(guān)抗朊病毒藥物的研發(fā)領(lǐng)域中，主要利用動物細(xì)胞模型來篩選抗朊病毒的藥物。但是由于這個篩選系統(tǒng)技術(shù)上的復(fù)雜性，只能局限在少數(shù)化合物中進(jìn)行；更重要的是，由于這個篩選系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)成本過于昂貴，又具有哺乳類動物內(nèi)朊病毒交叉?zhèn)魅镜奈ｋU性，需要P3級以上的無菌實(shí)驗(yàn)室和大量的高級技術(shù)人員的工作才能保證藥物篩選的進(jìn)行，使得大規(guī)模的在已知化合物的范疇內(nèi)篩選抗朊病毒藥物缺乏實(shí)用的可能性。最近的研究表明，建立在野生型釀酒酵母細(xì)胞(&^c/2mw^cesce"WWae)上的抗朊病毒藥物篩選模型在很大的程度上可以取代動物細(xì)胞模型，并且具有經(jīng)濟(jì)、簡單、安全的特性。但是野生型酵母細(xì)胞作為抗朊病毒藥物篩選模型仍存在著缺陷和不足由于對藥物的敏感度較低，使得待測藥物用量較大，并容易造成藥物篩選時假陰性過高，可能漏篩某些溫和型的抗朊病毒的藥物。
發(fā)明內(nèi)容為了解決上述問題，本發(fā)明根據(jù)野生型釀酒酵母細(xì)胞(S"cc/^nw^c^ce^T^/ae)中分子伴侶Ssalp對于朊病毒[尸S廣]的調(diào)控機(jī)理，通過基因定點(diǎn)突變酵母細(xì)胞內(nèi)分子伴侶S5^7基因，提供一個高靈敏度的抗朊病毒藥物篩選的酵母細(xì)胞模型，從而降低待測藥物用量，降低藥物篩選時假陰性的比率，使得能在更大的范圍內(nèi)高通量篩選抗朊病毒藥物。本發(fā)明選用的菌種是野生型釀酒酵母細(xì)胞(&cc/wro^yc"c^ev/s/"e)來自于美國標(biāo)準(zhǔn)菌種庫(AmericanTypeCultureCollection,ATCC),保藏編號為208719。這種釀酒酵母帶有[7^廣]朊病毒，固體菌落顏色為白色。本發(fā)明的技術(shù)方案是基于分子水平的朊病毒的致病機(jī)理，以及細(xì)胞內(nèi)分子伴侶在朊病毒的形成過程中的調(diào)控作用原理，使用基因突變技術(shù)改造了野生型酵母細(xì)胞對抗朊病毒藥物敏感度低的缺陷。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種高靈敏度的利用基因突變酵母細(xì)胞篩選抗朊病毒藥物的方法，步驟如下1)S5^7-FS7酵母細(xì)胞的制備將野生型釀酒酵母細(xì)胞(&"/^，;;c^ce^^^)內(nèi)的分子伴侶S5^/基因編碼的第483位亮氨酸突變?yōu)樯彼?，得到基因突變型S^X47-KW酵母細(xì)胞，其菌落顏色為粉色；2)篩選抗朊病毒藥物S&47-]^7酵母細(xì)胞的活化取S&4/-ra7酵母細(xì)胞接入l/2YPD培養(yǎng)液中，30°C振蕩過夜培養(yǎng)；/-ZS7酵母細(xì)胞初始OD值的調(diào)試調(diào)制/-ra7酵母細(xì)胞懸液OD600=0.5;篩選待測藥物取無菌凍存管，分別加入待測藥物、1/2YPD培養(yǎng)液以及調(diào)試好的5X47-FW酵母細(xì)胞懸液，在24X:的條件下，振蕩培養(yǎng)，每天定時取前一天凍存管中的S&^-FS/酵母細(xì)胞放入新的裝有1/2YPD培養(yǎng)液和待測藥物的無菌凍存管中，振蕩培養(yǎng)15天；檢測從第一天起，隔天提取100iil前一天的凍存管中的6S47-K7酵母細(xì)胞懸液，稀釋后，在1/2YPD固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上涂布；將涂好^&4/-1^酵母細(xì)胞懸液的培養(yǎng)皿置于24'C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，再轉(zhuǎn)入4'C冰箱中培養(yǎng)7天，觀察S5L^-:KS7酵母細(xì)胞的顏色。通過6"&47-KS7酵母菌落顏色的變化觀察待測藥物對于朊病毒的治療效果菌落(即S&47-KW酵母細(xì)胞)為紅色表示該待測藥物具有抗朊病毒的作用，菌落仍為粉色表示該待測藥物對于朊病毒無作用。計(jì)算該待測藥物對朊病毒[尸S廣]的治愈率愈率=變紅的菌落數(shù)/總的菌落數(shù)x100%。SS^/-!^酵母細(xì)胞的基本生理特征對比原來的野生型酵母細(xì)胞進(jìn)行定量化的評估測定相同培養(yǎng)條件下的<S&4/-;KS7酵母細(xì)胞與野生型酵母細(xì)胞的代時及菌落顏色的指標(biāo)。結(jié)果見表l。表1酵母細(xì)胞與野生型酵母細(xì)胞的代時及菌落顏色<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>*培養(yǎng)條件為1/2YPD，三次測定結(jié)果的平均值。本發(fā)明的有益效果是分子伴侶基因突變型5"&^-ra7酵母細(xì)胞會使該酵母對于抗朊病毒藥物的敏感性產(chǎn)生巨大的提高，而這個基因突變對酵母細(xì)胞的正常生長及生理特征影響極小，因此可以極大地降低藥物篩選過程中的假陰性?？梢栽诨铙w內(nèi)安全的篩選出溫和型的抗朊病毒藥物，為在更大范圍內(nèi)的尋找抗朊病毒的藥物奠定基礎(chǔ)，為尋找抗哺乳動物朊病毒藥物提供了依據(jù)。同時，不僅大大降低了待測藥物的用量，而且提高了篩選精確度、降低篩選成本消耗。具體實(shí)施方式實(shí)施例l1)S&47-757酵母細(xì)胞的制備(l)基因突變?nèi)∫吧歪劸平湍讣?xì)胞(5^cc^ramyc^ce^Ww'fle)來自于美國標(biāo)準(zhǔn)菌種庫(AmericanTypeCultureCollection,ATCC),保藏編號為208719，利用分子生物學(xué)上的基因操作技術(shù)，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，擴(kuò)增酵母細(xì)胞的分子伴侶S&4/基因，并將其分別連接到pRDW10(C/i"3)質(zhì)粒和pJ120(丄五t/2)質(zhì)粒載體上。利用定點(diǎn)突變試劑盒，將pJ120質(zhì)粒上的S&47基因編碼的第483位亮氨酸突變?yōu)樯彼?UUG密碼子—UGG密碼子)，突變后的基因啟動子仍為&X4/基因的啟動子，將突變后的質(zhì)粒命名為pJ121。然后將突變后的SX47基因進(jìn)行DNA測序確認(rèn)，命名為S&^-r57。(2〉基因重組因?yàn)镾&47基因?yàn)樯L必須基因，首先，將帶有S&47基因的pRDW10(WM3)質(zhì)粒導(dǎo)入酵母細(xì)胞中；其次，利用同源重組技術(shù)敲除染色體基因組上的S6^7基因；然后將帶有S5L^-ZS7基因的pJ121質(zhì)粒導(dǎo)入酵母細(xì)胞；最后，利用質(zhì)粒替換技術(shù)在含有5-FOA的培養(yǎng)基上篩選出丟失pRDW10質(zhì)粒的酵母細(xì)胞，利用標(biāo)簽基因丄五t/2篩選出含有pJ121質(zhì)粒的S5L47-r^酵母細(xì)胞，制得S&47-FS/酵母細(xì)胞。(S)重組細(xì)胞(M^-reV酵母細(xì)胞)鑒定采用在基因水平的DNA測序、mRNA逆轉(zhuǎn)錄測序，以及蛋白質(zhì)水平的westemblot鑒定，酵母細(xì)胞的四分體表現(xiàn)型分析等手段進(jìn)行鑒定。④保藏S5^-F^/酵母細(xì)胞使用酵母菌的常規(guī)保藏方法，保藏得到S&47-K7酵母細(xì)胞。2)模擬篩選抗朊病毒藥物鹽酸胍S5^7-FW酵母細(xì)胞的活化在無菌操作條件下，挑取3個以上的上述制備的S&4J-ZS7酵母細(xì)胞放入裝有1/2YPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30。C振蕩過夜培養(yǎng)。酵母細(xì)胞初始OD值的調(diào)試取上述培養(yǎng)的5^/-!^酵母細(xì)胞懸液放入比色杯中，使用紫外分光光度計(jì)，用1/2YPD液體培養(yǎng)基調(diào)零，UV設(shè)置在600nm，測量酵母細(xì)胞懸液的OD值，加入酵母細(xì)胞懸液或1/2YPD液體培養(yǎng)基來調(diào)節(jié)OD值至0.5。篩選待測藥物取3支無菌凍存管，分別加入含有1/2YPD培養(yǎng)液900^、897^1、895nl;上述調(diào)試好的SSv47-FW酵母細(xì)胞懸液各10(^l以及l(fā)mol/L的鹽酸胍(Vl、3^1、5pl，使其終濃度分別為OmM、3mM、5mM。在24'C的條件下，振蕩培養(yǎng)5天。每天定時稀釋酵母細(xì)胞培養(yǎng)液，即取前一天凍存管中的S&47-KS7酵母細(xì)胞10(V1放入新的裝有和上述同樣含量的1/2YPD培養(yǎng)液和鹽酸胍的無菌凍存管中。檢測從第一天起，隔天提取前一天的凍存管中的S&4J-KS7酵母細(xì)胞懸液適量，稀釋后，取10(V1稀釋液在1/2YPD固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上涂布；將涂好&&4/-}^酵母細(xì)胞懸液的培養(yǎng)皿置于24°(:恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，再轉(zhuǎn)入4'C冰箱中培養(yǎng)7天，觀察&X47-1^酵母細(xì)胞的顏色。菌落為紅色表示該待測藥物具有抗朊病毒的作用，菌落仍為粉色表示該待測藥物對于朊病毒無作用。計(jì)算該待測藥物對朊病毒[尸5T]的治愈率愈率=變紅的菌落數(shù)/總的菌落數(shù)x100%。結(jié)果見表2。同時，做對比實(shí)驗(yàn)，直接用野生型酵母細(xì)胞做鹽酸胍對朊病毒的作用效果實(shí)驗(yàn)，步驟同6S47-:T57酵母細(xì)胞。結(jié)果見表2。從表2中可以看出SWKTW酵母細(xì)胞中，不論鹽酸胍的濃度是3mM還是5mM，對于朊病毒[尸S/]的治愈率都極明顯的高于的野生型酵母細(xì)胞。另外，不論鹽酸胍的濃度是3mM還是5mM，5S47-:KW酵母細(xì)胞中鹽酸胍對[/^/]的治愈率在第3天時就基本超過了野生型酵母細(xì)胞中第5天的治愈率。這就說明了S&^-ZW酵母細(xì)胞中朊病毒[尸S/]對藥物鹽酸胍的靈敏性明顯高于野生型酵母細(xì)胞。表2不同濃度鹽酸胍對5S47-;KW酵母細(xì)胞和野生型酵母細(xì)胞對[PS廣]朊病毒的治愈率s<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*數(shù)據(jù)均為三次測定結(jié)果的平均值。實(shí)施例21)取實(shí)施例1制得的S&47-]^7酵母細(xì)胞。2)模擬篩選抗朊病毒藥物菲啶(phenanthridine，phe):S5^7-ra7酵母細(xì)胞的活化同實(shí)施例1。S&47-ySi酵母細(xì)胞初始OD值的調(diào)試同實(shí)施例1。篩選待測藥物在該體系中，使用0.5mM鹽酸胍作為藥物篩選的增效劑。取7支無菌凍存管，4支分別加入含有0.5mM鹽酸胍的l/2YPD培養(yǎng)液900W、898.75^1、897.5^1、895|il;上述調(diào)試好的5>&4/-^5/酵母細(xì)胞懸液各10(^1;以及40mM菲啶(^1、1.25|_il、2.5pl、5^1，使每只凍存管中的藥物濃度分別為0.5mM鹽酸胍+OmM菲啶、0.5mM鹽酸胍+0.05mM菲啶、0.5mM鹽酸胍+0.1mM菲啶以及0.5mM鹽酸胍+0.2mM菲啶。1支加入1/2YPD培養(yǎng)液895pl、上述調(diào)試好的S5^7-KS7酵母細(xì)胞懸液100fxl、40mM菲啶5pl使得凍存管中藥物濃度為0.2mM菲啶+OmM鹽酸胍。2支分別加入l/2YPD培養(yǎng)液900)al、895pl;上述調(diào)試好的5"&47-:rS7酵母細(xì)胞懸液各100nl;以及l(fā)mM的鹽酸胍Onl、5^1，使其終濃度分別為OmM(用作陰性對照)、5mM(用作陽性對照)。在24"C的條件下，振蕩培養(yǎng)5天。每天定時稀釋酵母細(xì)胞培養(yǎng)液，即取前一天凍存管中的S&^-KS7酵母細(xì)胞100W放入新的裝有和上述同樣含量的鹽酸胍的1/2YPD培養(yǎng)液、菲啶的無菌凍存管中。檢測從第一天起，隔天提取前一天的凍存管中的5^^(7-r57酵母細(xì)胞懸液適量，稀釋104倍后，取100iil稀釋液在l/2YPD固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上涂布；將涂好5&4/-;^7酵母細(xì)胞懸液的培養(yǎng)皿置于24"恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，再轉(zhuǎn)入4'C冰箱中培養(yǎng)7天，通過5"&47-KS7酵母細(xì)胞的顏色變化，觀察加入增效劑鹽酸胍的不同濃度菲啶的對于朊病毒的治療效果。菌落為紅色表示該待測藥物具有抗朊病毒的作用，菌落仍為粉色表示該待測藥物對于朊病毒無作用。計(jì)算該待測藥物對朊病毒[PS/]的治愈率愈率=變紅的菌落數(shù)/總的菌落數(shù)x100%。結(jié)果見表3。同時，做對比實(shí)驗(yàn)，直接用野生型酵母細(xì)胞做加入增效劑鹽酸胍的不同濃度菲啶對朊病毒的作用效果實(shí)驗(yàn)，步驟同51&47-rW酵母細(xì)胞。結(jié)果見表3。從此表中可以看出在不同濃度下，同樣可以看出實(shí)施例l中的結(jié)果即5>5^/-1^7酵母細(xì)胞對于朊病毒[/^/]的治愈率都極明顯的高于的野生型酵母細(xì)胞；在各個有效藥物濃度下，S&47-;T57酵母細(xì)胞中鹽酸胍對[尸S/]的治愈率在第3天時就基本超過了野生型酵母細(xì)胞中第5天的治愈率。更重要的是，在不足以治愈[i^/]的較低濃度的鹽酸胍存在時，可以增強(qiáng)菲啶對于[/^/]的作用效果。表3加入鹽酸胍的不同濃度菲啶對5S47-FW和野生型酵母細(xì)胞[i^/^朊病毒的治愈率t生長條件治愈率ld3d5d突變型野生型突變型野生型突變型野生型OmMphe+OmMGuHCl0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0.2mMphe+0mMGuHCl0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0mMphe+0.5mMGuHCl0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0.05mMphe+0.5mMGuHCl0.56%0.00%59.07%17.78%68.87%59.49%0.lmMphe+0.5mMGuHCl1.26%0.80%99.95%32.54%94.65%96.13%0.2mMphe+0.5mMGuHCl1.50%0.67%98.19%35.61%99.32%97.20%5mMGuHCl14.80%3.90%98.10%65.070/099.60%96,71%*數(shù)據(jù)均為三次測定結(jié)果的平均值。實(shí)施例31)取實(shí)施例1制得的51Sv47-ra7酵母細(xì)胞。2)篩選待測藥物酵母細(xì)胞的活化同實(shí)施例1。S&47-KS7酵母細(xì)胞初始OD值的調(diào)試同實(shí)施例1。篩選待測藥物取若干支無菌凍存管，按照實(shí)施例l的模式，在總體積為lml的混合體系中分別加入一定濃度的待測藥物、1/2YPD培養(yǎng)液以及占總體積10。/。的上述調(diào)試好的5"&47-:F57酵母細(xì)胞懸液；另取2支無菌凍存管按照實(shí)施例2分別加入1/2YPD培養(yǎng)液、上述調(diào)試好的S&^-I^酵母細(xì)胞懸液以及鹽酸胍OmM(用作陰性對照)、5mM(用作陽性對照)。在24。C的條件下，振蕩培養(yǎng)5天。每天定時稀釋酵母細(xì)胞培養(yǎng)液，即取前一天凍存管中的^&4/-1^7酵母細(xì)胞10(^1放入新的裝有和上述同樣含量的1/2YPD培養(yǎng)液、待測藥品的無菌凍存管中。檢測從第一天起，隔天提取前一天的凍存管中的S&^-KW酵母細(xì)胞懸液適量，稀釋后，取100nl稀釋液在l/2YPD固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上涂布；將涂好SSJ7-;K^酵母細(xì)胞懸液的培養(yǎng)皿置于24"C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，再轉(zhuǎn)入4'C冰箱中培養(yǎng)7天，通過5X47-:rW酵母細(xì)胞的顏色變化，觀察不同濃度的待測藥物對于朊病毒的治療效果。菌落為紅色表示在該待測藥物具有抗朊病毒的作用，菌落仍為粉色表示該待測藥物對于朊病毒無作用。計(jì)算該待測藥物對朊病毒[戶S廣]的治愈率愈率=變紅的菌落數(shù)/總的菌落數(shù)x100%。實(shí)施例41)取實(shí)施例1制得的S&47-FW酵母細(xì)胞。2)篩選待測藥物S&47-FS/酵母細(xì)胞的活化同實(shí)施例l。S&4J-KS/酵母細(xì)胞初始OD值的調(diào)試同實(shí)施例1。篩選待測藥物使用0.5mM鹽酸胍作為藥物篩選的增效劑，檢測不同濃度梯度的待測藥物對朊病毒[/^/]的作用效果。取若干支無菌凍存管，按照實(shí)施例2的模式，在總體積為lml的混合體系中加入一定濃度的待測藥物、含有0.5mM鹽酸胍的l/2YPD培養(yǎng)液以及占總體積10。/。的上述調(diào)試好的S&47-FW酵母細(xì)胞懸液；另取2支無菌凍存管按照實(shí)施例2分別加入1/2YPD培養(yǎng)液、上述調(diào)試好的S^7-:rW酵母細(xì)胞懸液以及鹽酸胍0mM(用作陰性對照)、5mM(用作陽性對照)。在24X:的條件下，振蕩培養(yǎng)5天。每天定時稀釋酵母細(xì)胞培養(yǎng)液，即取前一天凍存管中的5^4/-}^7酵母細(xì)胞10(^1放入新的裝有和上述同樣含量的含鹽酸胍的1/2YPD培養(yǎng)液、待測藥物的無菌凍存管中。檢測從第一天起，隔天提取前一天的凍存管中的s&47-;rw酵母細(xì)胞懸液，稀釋后，取100nl稀釋液在l/2YPD固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上涂布；將涂好5>>^/-:^7酵母細(xì)胞懸液的培養(yǎng)皿置于24。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，再轉(zhuǎn)入4'C冰箱中培養(yǎng)7天，通過S&^-yS/酵母細(xì)胞的顏色變化，觀察在增效劑鹽酸胍存在時，不同濃度的待測藥物對于朊病毒的治療效果。菌落為紅色表示在該待測藥物具有抗朊病毒的作用，菌落仍為粉色表示該待測藥物對于朊病毒無作用。計(jì)算該待測藥物對朊病毒[i^/1的治愈率愈率=變紅的菌落數(shù)/總的菌落數(shù)x100%。1權(quán)利要求1、一種高靈敏度的利用基因突變酵母細(xì)胞篩選抗朊病毒藥物的方法，其特征在于步驟如下1)SSA1-YS1酵母細(xì)胞的制備將野生型釀酒酵母細(xì)胞(Saccharomycescerevisiae)內(nèi)的分子伴侶SSA1基因編碼的第483位亮氨酸突變?yōu)樯彼?，得到基因突變型SSA1-YS1酵母細(xì)胞，其菌落顏色為粉色；2)篩選抗朊病毒藥物SSA1-YS1酵母細(xì)胞的活化取SSA1-YS1酵母細(xì)胞接入1/2YPD培養(yǎng)液中，30℃振蕩過夜培養(yǎng)；SSA1-YS1酵母細(xì)胞初始OD值的調(diào)試調(diào)制SSA1-YS1酵母細(xì)胞懸液OD600＝0.5；篩選待測藥物取無菌凍存管，分別加入待測藥物、1/2YPD培養(yǎng)液以及調(diào)試好的SSA1-YS1酵母細(xì)胞懸液，在24℃的條件下，振蕩培養(yǎng)，每天定時取前一天凍存管中的SSA1-YS1酵母細(xì)胞放入新的裝有1/2YPD培養(yǎng)液和待測藥物的無菌凍存管中，振蕩培養(yǎng)1～5天；檢測從第一天起，隔天提取100μl前一天的凍存管中的SSA1-YS1酵母細(xì)胞懸液，稀釋后，在1/2YPD固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上涂布；將涂好SSA1-YS1酵母細(xì)胞懸液的培養(yǎng)皿置于24℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，再轉(zhuǎn)入4℃冰箱中培養(yǎng)7天，觀察SSA1-YS1酵母細(xì)胞的顏色。全文摘要本發(fā)明公開了一種高靈敏度的利用基因突變酵母細(xì)胞篩選抗朊病毒藥物的方法。采用的技術(shù)方案是將野生型釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的分子伴侶SSA1基因編碼的第483位亮氨酸突變?yōu)樯彼?，得到基因突變型SSA1-YS1酵母細(xì)胞；然后經(jīng)SSA1-YS1酵母細(xì)胞的活化；初始OD值的調(diào)試；制備篩選待測藥物檢測溶液；從第一天起，隔天提取適量SSA1-YS1酵母細(xì)胞懸液稀釋后平板涂布；置于24℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，再轉(zhuǎn)入4℃冰箱中培養(yǎng)7天，觀察SSA1-YS1酵母細(xì)胞的顏色。本發(fā)明極大地降低藥物篩選過程中的假陰性，不僅待測藥物的用量少，而且提高了篩選精確度、降低了篩選成本消耗。文檔編號C12Q1/18GK101481729SQ200910010219公開日2009年7月15日申請日期2009年1月21日優(yōu)先權(quán)日2009年1月21日發(fā)明者堯宋,宋有濤,輝李申請人:遼寧大學(xué)