專利名稱：一種海洋溢油生物毒性快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了 一種海洋溢油生物毒性快速檢測方法。
背景技術(shù)：
隨著工業(yè)化進程的加快，人們對石油的依賴越愛越大，使港口和沿海油輪密度增大，使得原已十分繁忙的通航環(huán)境更加復(fù)雜，導致船舶溢油污染的風險增大。近幾年的溢油事件造成了大面積的海洋污染，給海域的生態(tài)環(huán)境帶來巨大的損失，已經(jīng)引起了人們的重視。目甜對于油品毒性的檢測很大程度上依靠化學手段和動物實驗，但是這種方法價格昂貴、需要很多動物，而且費時。因而近年來更傾向于一種快速、簡便的方法，發(fā)光細菌的毒性檢驗方法就是符合這些要求的生物檢測方法之一。目前我國己經(jīng)制定了發(fā)光細菌的水質(zhì)檢測標準(GB/T15441-1995)，國內(nèi)外的一些學者也通過發(fā)光細菌對一些油品的生物毒性進行了檢測，但是由于實驗采用的發(fā)光細菌是從海洋中提取來的，而在以往的檢測過程中都是利用純水作為配制水融合組分的溶劑，這樣就改變了發(fā)光細菌的鹽度，給結(jié)果來了一定的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述問題，提供了一種海洋溢油生物毒性快速檢測方法，它通過人工海水作為水融合組分制備的溶劑，并采用半數(shù)效應(yīng)載荷率EL5o作為油類在水中生物毒性的判定標準，使難溶的油類的生物毒性判定更加科學和準確，從而實現(xiàn)油品生物毒性的分級。
本發(fā)明的技術(shù)方案是 一種海洋溢油生物毒性快速檢測方法，具體步驟如下-
一、 發(fā)光細菌的培養(yǎng)
菌種采用明亮發(fā)光桿菌T3變種(P/^o^"m'ww/7/m;^we,)，制備發(fā)光菌新鮮菌懸液n)斜面菌種培養(yǎng)在新鮮斜面上接出第一代斜面，25'C土0.5。C培養(yǎng)24h后立即轉(zhuǎn)接第二代斜面，25。C土0.5。C培養(yǎng)24h后再轉(zhuǎn)接第三代斜面，25'C土0.5。C培養(yǎng)24h后備用。
(2) 搖瓶菌液培養(yǎng)取第三代斜面菌種近一環(huán)，接種于裝有30ml細菌培養(yǎng)液的100ml三角燒瓶中，25°C±0. 5°C, 160r/min下培養(yǎng)24h備用。
(3) 將培養(yǎng)后的發(fā)光細菌菌懸液稀釋至每毫升108個~109個細胞，初始發(fā)光度不低于800mV，備用。
斜面和菌液的營養(yǎng)基為
胰蛋白胨0.5gNaCl 3gNa2HP04 0.5g KH2P04 0.5g
酵母0.5g &油0.3g蒸餾水100ml固體培養(yǎng)基加瓊脂1.69g
二、 水融合組分的制備
在毒性試驗中實際評定的是油類在水中溶解的成分和在水相中穩(wěn)定存在的小油珠部分，既水融合組分WAF。我們將配置好的人工海水作為WAF中的水溶液和稀釋水溶液。人工海水
的配方為
NaCl 20gMgS04 3.6gMgCl 7.2 g
無水CaCl2 0.7g蒸餾水 1000ml
油類在水中的載荷率可以直接根據(jù)單位體積溶液添加的材料的重量(w/v)為基礎(chǔ)進行添
加。設(shè)置10g/L、 8 g/L、 6 g/L、 4 g/L、 2 g/L、 1 g/L、 0.5 g/L等7個載荷率梯度。
如果試驗材料比水密度小，應(yīng)采用從容器底部攪拌試驗材料的攪拌器，而對于那些密度比水大的試驗材料，則應(yīng)采用從容器頂部攪拌試驗溶液的攪拌器，攪拌器的攪拌速度應(yīng)該適當、勻速， 一般液面漩渦的深度為WAF溶液制備容器中試驗液高度的1(W-35%。對于同一種油溶液WAF的制備，攪拌速度應(yīng)相同。攪拌時速度不要太快，速度在1200-1500rpm/min為宜，防止乳化現(xiàn)象的產(chǎn)生。
在制備WAF溶液時，為了使油與水充分融合，需要一定的攪拌時間，隨攪拌時間的延長，.水中油的含量增加，但增加量逐漸平緩。 一般需要攪拌24h，攪拌后，為使混合液中非分散的油成分與已分散和溶解組分分離，應(yīng)靜置4h。
在為一種油制備不同載荷率的WAF時，必須用一個載荷率制備一種WAF，不能僅制備--種WAF，經(jīng)過稀釋后制成試驗用WAF系列，因為試驗材料在較低載荷率時，各種成分的溶解度不同。
三、 發(fā)光細菌相對發(fā)光度的測定
測定時的室溫要控制在2o 25'c，同一批樣品在測定過程中要求溫度波動不超過士rc。取
若干試管，給每支作為對照管的試管加1.98ral的人工海水，給每支作為樣品管的試管加1. 98ml的WAF溶液。向每管中加入步驟一制備的備用的發(fā)光細菌菌液0. 02ml，放入發(fā)光光度計中檢測。
i-s甜ttf弁w、 _樣品管發(fā)光度(w^)相對放光度(%) I照管發(fā)光度(附巧
四、 半數(shù)效應(yīng)載荷率EL5o的確定
(1) 繪制試驗材料載荷率(mg/L)與其相對發(fā)光度(％)的相關(guān)曲線或相關(guān)方程。
(2) 在相關(guān)曲線坐標圖上，相對發(fā)光度50。/。處畫一水平線，與相關(guān)曲線有一交點，該點的載荷率即是半數(shù)效果載荷EL5o值。如建立了相關(guān)方程，也可代入該方程求出樣品的仏50值。(3)根據(jù)表2的化5。值鑒別不同油品的生物毒性。
表2.難溶物質(zhì)急性生物毒性分級標準毒性等級EU。載荷率/ (tng' L—')毒性級別
> 10000無毒
I10000-5000微毒
II5000-1000低毒
III1000-100中毒
IV100-10重度
V10-1咼毒
VI< 1劇毒
本發(fā)明的有益效果是通過人工海水配置水融合組分，可以在檢測過程中更加滿足發(fā)光細菌的生活條件，減少細菌由于反應(yīng)條件的影響而給結(jié)果帶來的誤差，使檢測結(jié)果更加科學可靠。


圖1為實施例相對發(fā)光度與載荷率的關(guān)系曲線及相關(guān)方程。
具體實施例方式
一、 發(fā)光細菌的培養(yǎng)
菌種采用明亮發(fā)光桿菌T3變種(P/zotoZw"erz'wn;^ow/ orewM)，制備發(fā)光菌新鮮菌懸液、1)斜面菌種培養(yǎng)在新鮮斜面h接出第一代斜面，25'C土0.5'C培養(yǎng)24h后立即轉(zhuǎn)接第二代斜面，25°C±0. 5'C培養(yǎng)24h后再轉(zhuǎn)接第三代斜面，25°C±0. 5。C培養(yǎng)24h后備用。
(2) 搖瓶菌液培養(yǎng)取第三代斜面菌種近一環(huán)，接種于裝有30ml細菌培養(yǎng)液的100ml三角燒瓶屮，25°C±0. 5°C， 160r/min下培養(yǎng)24h備用。
(3) 將培養(yǎng)后的發(fā)光細菌菌懸液稀釋至每毫升108個~109個細胞，初始發(fā)光度不低于800mV，備用。
斜面和菌液的營養(yǎng)基為
胰蛋白胨0.5gNaCl 3gNa2HP04 0.5g KH2P04 0.5g
酵母0.5g 甘油0.3g蒸餾水100ml固體培養(yǎng)基加瓊脂1.69g
二、 水融合組分的制備
在毒性試驗中實際評定的是油類在水中溶解的成分和在水相中穩(wěn)定存在的小油珠部分，既水融合組分WAF。將配置好的人工海水作為WAF中的水溶液和稀釋水溶液。人工海水的配方為-.NaCl 20g MgS04 3.6g MgCl 7.2 g
無7jC CaCl2 0.7g 蒸餾水 1000ml
將潤滑油設(shè)置為10g/L、 8 g,/U 6 g/U 4 g/L、 2 g/L、 1 g/L、 0.5 g/L等7個載荷率梯度。
丙為潤滑油密度比水小，所以采用從容器底部攪拌試驗材料的攪拌器，攪拌器的攪拌速 度應(yīng)該適當、勻速，液面漩渦的深度為WAF溶液制備容器中試驗液高度的10y。-35y。。勻速攪拌， 速度不要太快，轉(zhuǎn)速為1200-1500卬m/min，防止乳化現(xiàn)象的產(chǎn)生。攪拌時間為24h，隨攪拌時 間的延長，水中油的含量增加，但增加量逐漸平緩。攪拌后，為使混合液中非分散的油成分 與己分散和溶解組分分離，靜置4h。
三、發(fā)光細菌相對發(fā)光度的測定
測定時的室溫要控制在2(K25'c，同一批樣品在測定過程中要求溫度波動不超過士rc。在
試管架上按下列方式排列測試管左側(cè)放對照管，右側(cè)放樣品管(從低載荷率到高載荷率依 次排列)，每管3個重復(fù)，具體擺放位置見表l。
表l.試管在試管架上的排列
對照管樣品管
空白l空白2空白3樣l樣l樣l樣2樣2樣2…樣n樣n樣n
給每支作為對照管的試管加1.98ml的人工海水，給每支作為樣品管的試管加1.98ml的 潤滑油WAF溶液。向每管中加入步驟一制備的備用的發(fā)光細菌菌液0.02ml，放入發(fā)光光度計 中檢測。
相對放光度
對照管發(fā)光度(wr) 四、半數(shù)效應(yīng)載荷率EL5o的確定
以相對發(fā)光度與載荷率之間的關(guān)系做出關(guān)系曲線并得到相關(guān)方程，根據(jù)方程求的 EL50=2901.96 mg/L。根據(jù)表2得知潤滑油的毒性屬于低毒。
權(quán)利要求
1、一種海洋溢油生物毒性快速檢測方法，其特征在于，該方法步驟如下一、發(fā)光細菌的培養(yǎng)菌種采用明亮發(fā)光桿菌T3變種(Photobacterium phosphoreum)，制備發(fā)光菌新鮮菌懸液(1)斜面菌種培養(yǎng)在新鮮斜面上接出第一代斜面，25℃±0.5℃培養(yǎng)24h后立即轉(zhuǎn)接第二代斜面，25℃±0.5℃培養(yǎng)24h后再轉(zhuǎn)接第三代斜面，25℃±0.5℃培養(yǎng)24h后備用；(2)搖瓶菌液培養(yǎng)取第三代斜面菌種近一環(huán)，接種于裝有30ml細菌培養(yǎng)液的100ml三角燒瓶中，25℃±0.5℃，160r/min下培養(yǎng)24h備用；(3)將培養(yǎng)后的發(fā)光細菌菌懸液稀釋至每毫升108個～109個細胞，初始發(fā)光度不低于800mV，備用；斜面和菌液的營養(yǎng)基為胰蛋白胨0.5g NaCl 3g Na2HPO40.5g KH2PO40.5g酵母0.5g甘油0.3g 蒸餾水100ml 固體培養(yǎng)基加瓊脂1.69g二、水融合組分的制備配置人工海水作為WAF中的水溶液和稀釋水溶液，人工海水的配方為NaCl 20gMgSO4 3.6gMgCl 7.2g無水CaCl2 0.7g蒸餾水 1000ml將潤滑油設(shè)置10g/L、8g/L、6g/L、4g/L、2g/L、1g/L、0.5g/L 7個載荷率梯度；制備WAF溶液，如果試驗材料比水密度小，應(yīng)采用從容器底部攪拌試驗材料的攪拌器，而對于那些密度比水大的試驗材料，則應(yīng)采用從容器頂部攪拌試驗溶液的攪拌器，攪拌器的攪拌速度應(yīng)該適當、勻速，為1200-1500rpm/min，一般液面漩渦的深度為WAF溶液制備容器中試驗液高度的10％-35％，攪拌時間為24h，攪拌后，靜置4h；三、發(fā)光細菌相對發(fā)光度的測定測定時的室溫要控制在20～25℃，同一批樣品在測定過程中要求溫度波動不超過±1℃。取若干試管，給每支作為對照管的試管加1.98ml的人工海水，給每支作為樣品管的試管加1.98ml的WAF溶液。向每管中加入步驟一制備的備用的發(fā)光細菌菌液0.02ml，放入發(fā)光光度計中檢測；四、半數(shù)效應(yīng)載荷率EL50的確定(1)繪制試驗材料載荷率(mg/L)與其相對發(fā)光度(％)的相關(guān)曲線或相關(guān)方程；(2)在相關(guān)曲線坐標圖上，相對發(fā)光度50％處畫一水平線，與相關(guān)曲線有一交點，該點的載荷率即是半數(shù)效果載荷EL50值，如建立了相關(guān)方程，也可代入該方程求出樣品的EL50值；(3)根據(jù)的EL50值鑒別不同油品的生物毒性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種海洋溢油生物毒性快速檢測方法，該方法通過發(fā)光細菌作為檢驗海洋溢油生物毒性的受試生物，同時利用人工海水配制水融合組分(WAF，water accommodation friction)，解決了以往發(fā)光細菌實驗中由于應(yīng)用純水作為配制水融合組分的溶劑，從而降低了海洋發(fā)光細菌的鹽度，改變了發(fā)光細菌的生活條件而給實驗帶來的誤差。
文檔編號C12N1/20GK101551336SQ20091001042
公開日2009年10月7日 申請日期2009年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月20日
發(fā)明者劉長安, 張世宇 申請人:國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心