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食品中李斯特氏菌屬微生物檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法

文檔序號(hào):571668閱讀:564來(lái)源:國(guó)知局

專利名稱::食品中李斯特氏菌屬微生物檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及食品中李斯特氏菌屬微生物檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。尤其是基于mPCR-DHPLC技術(shù)檢測(cè)食品中李斯特氏菌屬微生物的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)
:李斯特氏菌為腐生菌,在自然界中廣泛分布,主要生存于土壤和腐生植物中,多種動(dòng)植物食品、人畜排泄物、污水和青儲(chǔ)飼料中均可檢出。人和多種動(dòng)物都可成為其宿主。人類(lèi)糞便攜帶率達(dá)0.61.6%,人群中短期帶菌者占70%。引起李斯特氏菌病爆發(fā)的食品主要有乳及乳制品、肉類(lèi)制品、水產(chǎn)品以及蔬菜水果,其中乳及乳制品最為常見(jiàn)。食品被污染和中毒發(fā)生的原因李斯特氏菌是近年來(lái)己被重視的病原菌。食品作為傳播李斯特氏菌的媒介亦漸被重視。世界衛(wèi)生組織(WHO)關(guān)于單增李斯特氏菌食品中毒報(bào)告中指出,4%8%的水產(chǎn)品、5%10%的乳及乳制品、30%以上的家禽均被該菌污染。由于該菌在4。C冰箱保存的食品中也能生長(zhǎng)繁殖,使其危害性更進(jìn)一步增大。食品中存在的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌對(duì)人類(lèi)的安全有潛在的危險(xiǎn)。由于此菌在環(huán)境中普通存活,廣泛分布,在海水、淡水、土壤、糞肥、垃圾、飼料甚至甲殼動(dòng)物、蠅中可分離到,能在大多數(shù)非酸性食品中生長(zhǎng)、繁殖。在牛奶、蔬菜、青貯飼料和土壤中存活的時(shí)間比沙門(mén)氏菌長(zhǎng),并且存活率高;巴氏消毒不易殺滅此菌;耐鹽性較強(qiáng),25%NaCl環(huán)境中仍可存活,對(duì)多種物質(zhì)有較強(qiáng)的抵抗力;不易被寒冷日曬等強(qiáng)烈因素所殺滅,對(duì)熱的耐受力比一般無(wú)芽胞桿菌強(qiáng),在4"C的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖,是冷藏食品威脅人類(lèi)健康的主要病原菌之一。單核細(xì)胞增生李斯特菌是嗜冷菌,在0"C50'C條件下均能生長(zhǎng)。盡管30°C37'C是它最佳生長(zhǎng)溫度,但在冰箱溫度條件下仍能生長(zhǎng)。低于3'C時(shí)在磷酸蛋白胨肉湯、4"C牛奶中和0"C在肉中可存活1620天。而最新的分類(lèi)學(xué)研究表明,李斯特氏菌屬分為六個(gè)種單核細(xì)胞增生李斯牛寺氏菌(丄&ten.awo"oc;^oge"es)、綿羊李其Jf牛寺氏菌(ZiWer/"/va"ovz7)、英i若克3李斯特氏菌(Z/Wen'a細(xì)ocMa)、西爾李斯特氏菌(i^fer/awe/^^7')、烕爾斯李斯牛寺氏菌(丄&fen'awe/W/weW)以及格氏李斯年寺氏菌(丄^ten'agray/)、在這6個(gè)種中,單核細(xì)胞增生李斯特氏菌對(duì)人類(lèi)致病性強(qiáng),綿羊李斯特氏菌對(duì)人類(lèi)也有一定的致病性,其余李斯特氏菌無(wú)致病性。然而,最近國(guó)內(nèi)外有文獻(xiàn)報(bào)道,食品中的英諾克李斯特氏菌也對(duì)人類(lèi)具有一定的潛在致病性。有報(bào)道,2003年曾在廣東省采集深圳、番禺、湛江、澄海、韶關(guān)五個(gè)地區(qū)的9類(lèi)食品共430份中,檢出單核細(xì)胞增生李斯特菌17株,英諾克李斯特菌1株,因而應(yīng)加強(qiáng)相關(guān)的食品衛(wèi)生監(jiān)督管理。食品中李斯特氏菌引起食源性疾病的預(yù)防與控制已引起了世界各國(guó)關(guān)注,而食品中李斯特氏菌的檢測(cè)技術(shù)是預(yù)防與控制的關(guān)健的技術(shù)環(huán)節(jié)。細(xì)菌的鑒定是一項(xiàng)既耗時(shí)又復(fù)雜的工作,由于細(xì)菌的生化特征相對(duì)的不穩(wěn)定,給細(xì)菌的鑒定帶來(lái)了很大的困難和不確定性,同時(shí)由于某些生化試劑、血清等質(zhì)量不穩(wěn)定、特異性不好等因素,經(jīng)常給鑒定的結(jié)果帶來(lái)不準(zhǔn)確性。目前國(guó)內(nèi)外常用的細(xì)菌鑒定卡如API,盡管質(zhì)量穩(wěn)定,但鑒定時(shí)人為影響因素較多,往往不同的操作者結(jié)果不一;細(xì)菌的自動(dòng)鑒定儀器重現(xiàn)性較好,但由于只是局限在幾個(gè)生化反應(yīng),相似的菌株間鑒別特別困難;熒光免疫檢測(cè)法(VIDAS)檢測(cè)成本極高,且存在著假性結(jié)果的問(wèn)題;PCR-凝膠電泳檢測(cè)技術(shù)雖然檢測(cè)成本低,但存在著反應(yīng)產(chǎn)物后處理極易造成污染的缺點(diǎn);實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng),靈敏度高等優(yōu)勢(shì),但卻存在著檢測(cè)成本較高,熒光探針保存時(shí)間較短等不足。而目前食品中李斯特氏菌的檢測(cè)仍以傳統(tǒng)的病原菌培養(yǎng)、血清抗體檢測(cè)、和生化特征比較水平為主,雖然已建立了許多基于分子生物學(xué)的檢測(cè)方法,例如PCR、基因芯片、測(cè)序等,但還是不能滿足日益發(fā)展的檢驗(yàn)檢疫工作的需要。常規(guī)分離培養(yǎng)是各種微生物檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn),但耗時(shí)長(zhǎng),工作量大,靈敏度低,尤其是其他非致病性的李斯特氏菌經(jīng)常伴隨著并抑制了單核細(xì)胞增生李斯特菌在培養(yǎng)基中的生和培養(yǎng),使李斯特氏菌致病菌株的培養(yǎng)和檢測(cè)帶來(lái)困難;血清學(xué)方法簡(jiǎn)單快速,但因血清質(zhì)量問(wèn)題特異性差,假陽(yáng)性高;PCR技術(shù)簡(jiǎn)單快速,靈敏度高,但工作量大,操作繁瑣,通量低;基因芯片通量高,但也易造成假陽(yáng)性,費(fèi)用昂貴。因此非常必要建立高效、特異、準(zhǔn)確、快捷、成本低廉的快速檢測(cè)技術(shù)方法,從而在屬、種、血清型、流行株的水平上,達(dá)到對(duì)食品中李斯特氏菌屬、致病菌種、血清分型、流行株及李斯特氏菌屬分類(lèi)種的分種鑒別的高通量檢測(cè)目的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明首先提供用于快速檢測(cè)食品中李斯特氏菌的基于PCR-DHPLC檢測(cè)的試劑盒。本發(fā)明所述的試劑盒中包括一種檢測(cè)溶液,該檢測(cè)溶液中含10mMTris《1、50mMKC1、25mMMgCl2、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/)iL及李斯特氏菌引物對(duì)10)iM;其中,李斯特氏菌的特異性引物對(duì)序列如下菌株上、下游引物序列(5'-3')擴(kuò)增產(chǎn)物(bp)李斯特氏菌5'畫(huà)GTTAGTGGCGGACGGGTGAG-3'5'畫(huà)TCAGGTCGGCTATGCATCGT-3'210本發(fā)明還提供了利用上述試劑盒檢測(cè)詞料中李斯特氏菌屬微生物的mPCR-DHPLC方法,包括如下步驟①PCR反應(yīng)取lul待測(cè)樣品DNA溶液,加入10ul檢測(cè)溶液和14ul滅菌超純水,總體積25ul;將以上各組分加入0.2mLPCR反應(yīng)管中,混勻,5000r/min離心10s,然后按下列參數(shù)進(jìn)行PCR循環(huán)預(yù)變性94°C,3min;進(jìn)入循環(huán)94。C變性60s,60。C退火60s,72。C延伸60s,35次循環(huán);終止延伸72°C,7min;②將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DHPLC分析色譜柱PS-DVB&C18DNASep色譜柱,4.6mmx50mm,粒度3柱溫5965°C;流動(dòng)相(體積比)O.Omin,53.7%緩沖溶液A,46.3%緩沖溶液B;0.5min,48.7%緩沖溶液A,51.3%緩沖溶液B;5.0min,39.7%緩沖溶液A,60.3%緩沖溶液B;其中,緩沖溶液A是濃度O.lmM的TEAA水溶液;緩沖溶液B是濃度為0.1MTEAA水溶液與乙腈按體積比3:1的混合溶液;流速0.9mL/min;檢測(cè)器熒光檢測(cè)器,光源150WXenon燈;激發(fā)譜帶寬15nm;發(fā)射譜帶寬15.3nm;檢測(cè)靈敏度在波長(zhǎng)350nm積分2s;上樣量PCR產(chǎn)物5pL。其中,部分變性條件下的DHPLC檢測(cè),柱溫優(yōu)選6rC。本發(fā)明采用mPCR結(jié)合部分變性條件下的DHPLC技術(shù),針對(duì)食品中李斯特氏菌屬微生物進(jìn)行靈敏便捷的檢測(cè),并建立應(yīng)用于該方法的快速檢測(cè)試劑盒。使用本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法,可以高靈敏度地檢測(cè)食品中李斯特氏菌屬微生物,并且檢側(cè)耗時(shí)短,操作簡(jiǎn)捷,可以節(jié)省大量的勞力和財(cái)力,適合快速檢測(cè)的要求。本發(fā)明附圖17幅,其中圖1是李斯特氏菌屬6個(gè)分類(lèi)種的mPCR-DHPLC圖譜,分別是單增李氏菌(A)、綿羊李氏菌(B)、英諾克李氏菌(C)、西爾李氏菌(D)、威爾李氏菌(E)、格式李氏菌(F);圖2是單增李氏菌(A)和綿羊李氏菌(B)組合檢測(cè)的圖譜;圖3是單增李氏菌(A)和英諾克李氏菌(B)組合檢測(cè)的圖譜;圖4是單增李氏菌(A)和西爾李氏(B)菌組合檢測(cè)的圖譜;圖5是單增李氏菌(A)和威爾李氏菌(B)菌組合檢測(cè)的圖譜;圖6是單增李氏菌(A)和格式李氏菌(B)菌組合檢測(cè)的圖譜;圖7是李氏菌屬6種分類(lèi)菌種共同檢測(cè)的圖譜,圖中分別是格式李氏菌(A)、威爾李氏菌(B)、西爾李氏菌(C)、英諾克李氏菌(D)、單增李氏菌(E)、綿羊李氏菌(F);圖8是單增李氏菌精密度試驗(yàn)mPCR-DHPLC譜圖;圖9是綿羊李氏菌精密度試驗(yàn)mPCR-DHPLC譜圖;圖10是英諾克李氏菌精密度試驗(yàn)mPCR-DHPLC譜圖;圖ll是西爾李氏菌精密度試驗(yàn)mPCR-DHPLC譜圖;圖12是威爾李氏菌精密度試驗(yàn)mPCR-DHPLC譜圖;圖13是格式李氏菌精密度試驗(yàn)mPCR-DHPLC譜圖;圖14是實(shí)施例5樣品1的mPCR-DHPLC檢測(cè)圖譜,圖中分別是單增李氏菌(A)和格式李氏菌(B);圖15是實(shí)施例5樣品2的mPCR-DHPLC檢測(cè)圖譜,圖中分別是單增李氏菌(A)和綿羊李氏菌(B);圖16是實(shí)施例5樣品3的mPCR-DHPLC檢測(cè)圖譜,圖中是英諾克李氏菌(A);圖17是實(shí)施例5樣品4的mPCR-DHPLC檢測(cè)圖譜,圖中分別是單增李氏菌(A)和英諾克李氏菌(B).;上述附圖中,橫坐標(biāo)均為保留時(shí)間(單位分鐘min),縱坐標(biāo)表示吸收峰信號(hào)強(qiáng)度(單位毫伏mV)。具體實(shí)施方式下面為本發(fā)明的具體實(shí)施例,其對(duì)本方法的建立及其應(yīng)用作進(jìn)一步的說(shuō)明,但并不以任何形式限制本發(fā)明的內(nèi)容。若無(wú)特殊說(shuō)明,本部分所使用的主要試劑、儀器及其商品來(lái)源為營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液,普通瓊脂培養(yǎng)平板,以及本部分所使用的各菌株的增菌、分離和生化鑒定培養(yǎng)基等均按照相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB)、檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SN)或國(guó)際權(quán)威標(biāo)準(zhǔn)方法中的配方,購(gòu)于美國(guó)BD公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑(TakaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionkit)及ExTaq等試劑購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;三乙胺乙酰鹽(TEAA,色譜純)購(gòu)自Transgenomic公司;乙腈(色譜純)購(gòu)自Fisher公司?;驍U(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司);變性高效液相色譜(簡(jiǎn)稱DHPLC,美國(guó)Transgenomic公司)。本部分試驗(yàn)所使用的標(biāo)準(zhǔn)菌株分分別購(gòu)自美國(guó)典型菌種保藏中心(ATCC)和中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心(CMCC)或由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院菌種保藏中心(IQCC)提供。如表1所示表1序號(hào)菌株名稱拉丁名1單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(la血清型)2單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(2a血清型)3單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(4a血清型)4單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(4b血清型)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(4e血清型)6單核細(xì)胞增生李斯特氏菌了單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(1/2a血清型)8單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(1/2b血清型)Z/欲r/"附(7/(7C,,(9^/7^5*79單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(3a血清型)10單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(3b血清型)11單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(4c血清型)12單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(4d血清型)13綿羊李斯特氏菌14英諾克李斯特氏菌15威爾斯李斯特氏菌16西爾李斯特氏菌17格氏李斯特氏菌18脫氮李斯特氏菌19單核細(xì)胞增生李斯特氏菌20綿羊李斯特氏菌21英諾克李斯特氏菌22威爾斯李斯特氏菌23西爾李斯特氏菌24格氏李斯特氏菌25霍亂弧菌01群26霍亂弧菌0139群27霍亂弧菌非01/非0139群28副溶血性弧菌29溶藻性弧菌30創(chuàng)傷弧菌31擬態(tài)弧菌32梅氏弧菌33河弧菌34嗜水氣單胞菌35類(lèi)志賀鄰單胞菌36鼠傷寒沙門(mén)氏菌37豬霍亂沙門(mén)氏菌38豬霍亂沙門(mén)氏菌孔成道夫變種39腸炎沙門(mén)氏菌40綠膿桿菌(銅綠假單胞菌)41熒光假單胞菌尸srai/o腳was1y7wo,cgra42阪崎腸桿菌43大腸埃希氏菌44腸出血性大腸埃希氏菌0157:H745產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌46腸致病性大腸埃希氏菌47腸侵襲性大腸埃希氏菌48摩根氏摩根氏菌49產(chǎn)酸克雷伯氏菌50肺炎克雷伯氏茼51弗勞地檸檬酸桿菌52陰溝腸桿菌53阪崎腸桿菌54產(chǎn)氣腸桿菌55福氏志賀氏菌56金黃色葡萄球菌57小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌58溶血性鏈球菌59普通變形桿菌60奇異變形桿菌61空腸彎曲菌實(shí)施例l、食品中李斯特氏菌屬微生物檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法(1)引物的設(shè)計(jì)、合成與試劑盒的組裝菌株上、下游引物序列(5'-3')擴(kuò)增產(chǎn)物(bp)李斯特氏菌5'-GTTAGTGGCGGACGGGTGAG-3'5'隱TCAGGTCGGCTATGCATCGT-3'210在此基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)用于PCR-DHPLC檢測(cè)的試劑盒該試劑盒中包括一種檢測(cè)溶液,該檢測(cè)溶液中含10mMTris'Cl、50mMKC1、25mMMgCl2、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/nL及上述李斯特氏菌引物對(duì)10pM。.(2)PCR-DHPLC檢測(cè)方法的建立本檢測(cè)方法使用本實(shí)施例建立的PCR-DHPLC檢測(cè)的試劑盒,包括如下步驟①待檢樣品的制備建立表1菌株的DNA模板庫(kù)用于以下實(shí)施例試驗(yàn)按傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法分別增菌培養(yǎng)表l中的菌株。取參考菌株的細(xì)菌培養(yǎng)液lmL,采用細(xì)菌DNA提取試劑盒(TakaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionkit)提取細(xì)菌DNA,保存于-20'C備用以待檢測(cè)。使用前,取表l中所列試驗(yàn)菌種,經(jīng)培養(yǎng)后分別提取基因組DNA,建立模板庫(kù)?;【臃N于3XNaCl營(yíng)養(yǎng)肉湯中(37士i:rC培養(yǎng)1824h,彎曲菌屬的菌株在布氏肉湯中,于42"微需氧環(huán)境下培養(yǎng)(5%氧氣、10%二氧化碳和85%氮?dú)?24h。其他的菌株在胰蛋白胨大豆肉湯中,于37。C培養(yǎng)24h。②PCR擴(kuò)增取lul待測(cè)樣品DNA溶液,加入10ul試劑盒檢測(cè)溶液和14ul滅菌超純水,總體積25ul;將以上各組分加入0.2mLPCR反應(yīng)管中,混勻,5000r/min離心10s,然后按下列參數(shù)進(jìn)行PCR循環(huán)預(yù)變性94°C,3min;進(jìn)入循環(huán)94。C變性60s,6(TC退火60s,72'C延伸60s,35次循環(huán);終止延伸72°C,7min;③DHPLC分析色譜柱PS-DVB&C18DNASep色譜柱,4.6mmx50mm,粒度3柱溫61°C;流動(dòng)相(體積比)O.Omin,53.7%緩沖溶液A,46.3%緩沖溶液B;0.5min,48,7%緩沖溶液A,51.3%緩沖溶液B;5.0min,39.7%緩沖溶液A,60.3%緩沖溶液B;其中,緩沖溶液A是濃度0.1mM的TEAA水溶液;緩沖溶液B是濃度為0.1MTEAA水溶液與乙腈按體積比3:1的混合溶液;流速0.9mL/min;檢測(cè)器熒光檢測(cè)器,光源150WXenon燈;激發(fā)譜帶寬15nm;發(fā)射譜帶寬15.3nm;檢測(cè)靈敏度在波長(zhǎng)350nm積分2s;上樣量PCR產(chǎn)物5lLlL。實(shí)施例2、特異性試驗(yàn)(1)以標(biāo)準(zhǔn)李斯特菌為檢測(cè)原料,按照實(shí)施例1所建立的試劑盒及方法對(duì)六種菌進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果如附圖17所示。李斯特氏菌引物在6rc部分變性的檢測(cè)結(jié)果圖譜。由圖i可見(jiàn),單增李氏菌、綿羊李氏菌、英諾克李氏菌、西爾李氏菌、威爾李氏菌、格式李氏菌均達(dá)到了部分變性的差異檢測(cè)效果。6種菌在6rc部分變性條件下,從各自差異基因位點(diǎn)不同程度地解鏈,隨著片段的解鏈域不同,各自核苷酸片段在TEAA分子中的三個(gè)乙基與固定相C18表面的垸基發(fā)生疏水作用力相互吸引,通過(guò)流動(dòng)相中的乙腈的梯度洗脫達(dá)到將不同性質(zhì)的6種菌種核苷酸片段分子的分離,因而各自出現(xiàn)了特異性的分離圖譜,可以很明顯地從檢測(cè)圖譜上將6種菌種區(qū)分開(kāi)來(lái)。如圖l-A所示,單增李斯特氏菌在4.8min和5.5min出現(xiàn)吸收峰;如圖l-B所示,綿羊李斯特氏菌在5.2min出現(xiàn)吸收峰;如圖1-C所示,英諾克李斯特氏菌在4.9min和5.5min出現(xiàn)吸收峰;如圖l-D所示,西爾李斯特氏菌在4.9min和5.3min出現(xiàn)吸收峰;如圖l-E所示,威爾李斯特氏菌在5.2min和5.5min出現(xiàn)吸收峰;如圖1-F所示,格氏李斯特氏菌在5.5min出現(xiàn)吸收峰。且各種李斯特氏菌株的吸收峰型具有明顯差異,可以清楚區(qū)分。圖2圖7分別顯示了不同的李斯特菌的混合檢測(cè)的結(jié)果。實(shí)施例3、靈敏度試驗(yàn)分別取李氏菌屬6個(gè)分類(lèi)菌種標(biāo)準(zhǔn)菌株,加入10mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液于37X:振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。用比濁法定量所培養(yǎng)的6種李氏菌的菌液濃度。首先用麥?zhǔn)媳壬茉噭┖兄谱鱋D550值——每mL菌液里的細(xì)菌個(gè)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,再測(cè)定所培養(yǎng)菌液的OD550值,將OD55。值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到所培養(yǎng)菌液的濃度,單位為CFU/mL。把菌液稀釋成lxlO'CFU/mL、lxl02CFU/mL、lxl03CFU/mL、lx104CFU/mL、lxl05CFU/mL、lxl06CFU/mL等梯度。將幾個(gè)梯度的6種李氏菌菌液采用細(xì)菌DNA提取試劑盒(TakaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionkit)提取DNA,各取2|_iL做為模板,按照實(shí)施例1所建立的方法進(jìn)行PCR-DHPLC檢觀U,將檢測(cè)結(jié)果與稀釋梯度結(jié)果比較,確定檢測(cè)靈敏度。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)施例1所建立的方法檢出李氏菌屬6個(gè)分類(lèi)菌種的靈敏度可達(dá)到103CFU/mL菌濃度。實(shí)施例4、精密度試驗(yàn)取在靈敏度試驗(yàn)中以"比濁度法"制備的1X103CFU/mL濃度的6種李氏菌菌液,按照實(shí)施例1所建立的方法進(jìn)行10次重復(fù)DNA提取及PCR-DHPLC檢測(cè),以確定方法的精密度。li檢測(cè)結(jié)果如附圖813所示,結(jié)果顯示,本發(fā)明的方法檢測(cè)精密度非常高。實(shí)施例5、在實(shí)際樣品檢測(cè)中的應(yīng)用試驗(yàn)自2008年1月至2008年5月,將上述建立的李斯特氏菌的mPCR-DHPLC檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法用于實(shí)際樣品中李斯特氏菌的檢驗(yàn),同時(shí)采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法(GB/T4789.30-2003)進(jìn)行比較。試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>經(jīng)統(tǒng)計(jì),用mPCR-DHPLC方法檢出的26份陽(yáng)性樣本采用經(jīng)典的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB)方法驗(yàn)證,均證實(shí)為陽(yáng)性。mPCR-DHPLC方法檢測(cè)出的陰性結(jié)果與GB方法結(jié)果符合。試驗(yàn)中mPCR-DHPLC方法吻合率為100%,顯示該方法具有廣泛而且良好的適用性。本實(shí)施例中,使用GB/T4789.30-2003的方法,檢測(cè)每個(gè)樣品平均總耗時(shí)(包括樣品制備)168h,檢測(cè)耗時(shí)(不包括樣品制備)167h;使用mPCR-DHPLC方法,檢測(cè)每個(gè)樣品平均總耗時(shí)(包括樣品制備)25h,檢測(cè)耗時(shí)(不包括樣品制備)0.5h。下面為實(shí)際樣品檢測(cè)中的部分具體試驗(yàn)。(1)從樣品1的增菌后的MMA平板上選取疑似李氏菌的多個(gè)單菌落,分別接種于三糖鐵瓊脂斜面?zhèn)溆糜谏b定,另取這些菌落同時(shí)接種于同一管的營(yíng)養(yǎng)肉湯中,培養(yǎng)2448h后,取10mL以實(shí)施例1的方法提取DNA并mPCR-DHPLC檢測(cè)。結(jié)果顯示檢出如附圖14所示的單增李氏菌和格式李氏菌的特征圖譜。為驗(yàn)證該檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,從接種于三糖鐵上的菌落中,經(jīng)生化鑒定,確實(shí)分離出了單增李氏菌和格式李氏菌的分離株。(2)從樣品2的增菌后的MMA平板上選取疑似李氏菌的多個(gè)單菌落,分別接種于三糖鐵瓊脂斜面?zhèn)溆糜谏b定,另取這些菌落同時(shí)接種于同一管的營(yíng)養(yǎng)肉湯中,培養(yǎng)2448h后,取10mL以實(shí)施例1的方法提取DNA并mPCR-DHPLC檢測(cè)。結(jié)果顯示檢出如附圖15所示的單增李氏菌和綿羊李氏菌的特征圖譜。為驗(yàn)證該檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,從接種于三糖鐵上的菌落中,經(jīng)生化鑒定,確實(shí)也分離出了單增李氏菌和綿羊李氏菌的分離株。(3)從樣品3的增菌后的MMA平板上選取疑似李氏菌的多個(gè)單菌落,分別接種于三糖鐵瓊脂斜面?zhèn)溆糜谏b定,另取這些菌落同時(shí)接種于同一管的營(yíng)養(yǎng)肉湯中,培養(yǎng)2448h后,取10mL以實(shí)施例1的方法提取DNA并mPCR-DHPLC檢測(cè)。結(jié)果顯示檢出如附圖16所示的英諾克李氏菌的特征圖譜。為驗(yàn)證該檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,從接種于三糖鐵上的菌落中,經(jīng)生化鑒定,確實(shí)分離出了英諾克李氏菌的分離株。(4)從樣品4的增菌后的MMA平板上選取疑似李氏菌的多個(gè)單菌落,分別接種于三糖鐵瓊脂斜面?zhèn)溆糜谏b定,另取這些菌落同時(shí)接種于同一管的營(yíng)養(yǎng)肉湯中,培養(yǎng)2448h后,取10mL以實(shí)施例1的方法提取DNA并mPCR-DHPLC檢測(cè)。結(jié)果顯示檢出如附圖17所示的單增李氏菌和英諾克李氏菌的特征圖譜。為驗(yàn)證該檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,從接種于三糖鐵上的菌落中,經(jīng)生化鑒定,確實(shí)也分離出了單增李氏菌和英諾克李氏菌的分離株。權(quán)利要求1、食品中李斯特氏菌屬微生物檢測(cè)試劑盒,其特征在于該試劑盒中包括一種檢測(cè)溶液,該檢測(cè)溶液中含10mMTris·Cl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/μL及李斯特氏菌引物對(duì)10μM;其中,李斯特氏菌的特異性引物對(duì)序列如下<tablesid="tabl0001"num="0001"wi="161"></tables>2、食品中李斯特氏菌屬微生物的檢測(cè)方法,包括如下步驟①PCR反應(yīng)取lul待測(cè)樣品DNA溶液,加入10ul檢測(cè)溶液和14ul滅菌超純水,總體積25ul;將以上各組分加入0.2mLPCR反應(yīng)管中,混勻,5000r/min離心10s,然后按下列參數(shù)進(jìn)行PCR循環(huán)預(yù)變性94°C,3min;進(jìn)入循環(huán)94。C變性60s,60。C退火60s,72。C延伸60s,35次循環(huán);終止延伸72°C,7min;②將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DHPLC分析色譜柱PS-DVB&C18DNASep色譜柱,4.6mmx50mm,粒度3柱溫5965°C;流動(dòng)相(體積比)O.Omin,53.7%緩沖溶液A,46.3%緩沖溶液B;0.5min,48.7%緩沖溶液A,51.3%緩沖溶液B;5.0min,39.7%緩沖溶液A,60.3%緩沖溶液B;其中,緩沖溶液A是濃度O.lmM的TEAA水溶液;緩沖溶液B是濃度為0.1MTEAA水溶液與乙腈按體積比3:1的混合溶液;流速0.9mL/min;檢測(cè)器熒光檢測(cè)器,光源150WXenon燈;激發(fā)譜帶寬15nm;發(fā)射譜帶寬15.3nm;檢測(cè)靈敏度在波長(zhǎng)350nm積分2s;上樣量PCR產(chǎn)物5iiL。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的食品中李斯特氏菌屬微生物的檢測(cè)方法,其特征在于步驟②DHPLC分析的柱溫61°C。全文摘要食品中李斯特氏菌屬微生物檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法,該試劑盒中包括一種檢測(cè)溶液,該檢測(cè)溶液中含10mMTris·Cl、50mMKCl、25mMMgCl<sub>2</sub>、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/μL及李斯特氏菌引物對(duì)10μM。本發(fā)明采用mPCR結(jié)合部分變性條件下的DHPLC技術(shù),針對(duì)食品中李斯特氏菌屬微生物進(jìn)行靈敏便捷的檢測(cè),并建立應(yīng)用于該方法的快速檢測(cè)試劑盒。使用本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法,可以高靈敏度地檢測(cè)食品中李斯特氏菌屬微生物,并且檢側(cè)耗時(shí)短,操作簡(jiǎn)捷,可以節(jié)省大量的勞力和財(cái)力,適合快速檢測(cè)的要求。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101649349SQ20091001079公開(kāi)日2010年2月17日申請(qǐng)日期2009年3月20日優(yōu)先權(quán)日2009年3月20日發(fā)明者曹際娟,王振國(guó)申請(qǐng)人:曹際娟;王振國(guó)
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