專利名稱：半滑舌鰨抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的獲取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于半滑^(07 o^os幼s s邵i^ew's) DNA ^T遺傳fei己技術(shù)，涉及一 種抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的獲取方法。
背景技術(shù)：
M (6^oWos幼we孤7aew's)屬鰈形目、^ti科、$1|屬，是一種暖溫性 近海大M1魚(yú)類，終年生活棲息在我國(guó)近海海區(qū)，已經(jīng)成為我國(guó)最具有發(fā)展?jié)摿Φ暮?水#^直新品種之一。糊彌是一種生長(zhǎng)快速、抗病力強(qiáng)、肉嚇羊美的優(yōu)良海水辭直魚(yú) 類。判t^的這種優(yōu)良性狀是有其遺傳學(xué)基礎(chǔ)的。探索判t^生長(zhǎng)快和抗病力強(qiáng)的 ^H^基礎(chǔ)，篩選和克隆出與抗病性狀相關(guān)的特殊功能基因和fei己，開(kāi)發(fā)，海水魚(yú)類抗 病育種與防病、治病中的應(yīng)用潛力，對(duì)于海水魚(yú)類#5 具有重要的現(xiàn)實(shí)意義及應(yīng)用價(jià) 值。cDNA-AFLP是一種應(yīng)用于基因組DNA的選擇性擴(kuò)增限制性片段即AFLP (Amplified fragment length polymo卬hism)的基礎(chǔ)上發(fā)明出來(lái)的用于RNA J敏分析的方法。它將 RT-PCR和AFLP結(jié)^來(lái)，由于在PCR中4頓較高的退火 和應(yīng)用特定弓l物對(duì)包含信 息較多的內(nèi)部特異片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，增加了腿斜牛的嚴(yán)離。禾,cDNA-AFLP技 術(shù)分離、克隆半tt^i抗病相關(guān)片段，為糊彌抗病基因的克隆樹(shù)共序歹瞻息，進(jìn)而 培育出天然抗病力增強(qiáng)的海水魚(yú)類新品種，或生產(chǎn)出抗病的功能基因藥物，婦K產(chǎn)I^直 中推廣應(yīng)用就顯得尤為重要和迫切。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克隆出判骨^W:鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段，分析其序列， te:判t^li抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的獲取方法，為， 抗病基因的克隆提 供序列信息支持。
本發(fā)明其技術(shù)內(nèi)容如下包括兩個(gè)方面
一、繼賴曼弧菌和菊il^i弧菌兩種^t^li的cDNA-AFLP差異顯示。 二半tf^li抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的克隆與序列分析。 一、ftl賴l弧菌和未ai^l弧菌兩種判t^ilcDNA-AFLP差異顯示。 半滑，腹腔注射t曼弧菌，注射鰻弧菌可以啟動(dòng)或增強(qiáng)抗病相關(guān)基因的表達(dá)。以 未經(jīng)鰻弧菌注射的半滑舌鰨作X寸照，提取免疫器官脾藏組織中的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。以cDNA作為t對(duì)腿f(wàn)i^M鰻弧菌和未注身賴曼弧菌兩種魚(yú)的AFLP差異顯示，獲得 差異顯示的片段。
二半 t^抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的克隆與序列分析它的技術(shù)內(nèi)容包 括1)半^H抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的回收；2)抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片 段的克??；3)抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的序列分析
1) 、抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的回收
選取能擴(kuò)增出496bp抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP條帶的弓胸組合，進(jìn)行AFLP擴(kuò) 增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙'烯S劃安湊，電泳分離，用刀片切下含有496bp抗鰻弧菌^寺異DNA 條帶的聚丙烯酉劃窮劍狡，溶解后回收目的片段備用。
2) 、 cDNA-AFLP片段的克隆
將回收的抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段，克隆到pMD18-T載體中，連接和轉(zhuǎn)化后， 采用常規(guī)PCR法篩選含有目的片段的克隆，用瓊S識(shí)湊搬電泳檢測(cè)產(chǎn)物的長(zhǎng)度，#^預(yù) 期長(zhǎng)度的樣品可以視為陽(yáng)性克隆。3)、序列分析選取陽(yáng)性克隆，觀,后進(jìn)行序列分析。 將來(lái)自6個(gè)附性克隆的抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的核苷辦列，進(jìn)行多序列慰寸， 其同源性為99.21%，表明於個(gè)體得至啲條帶是同一個(gè)序列。共有序歹胴源性胞寸和 糊以性搜索用BLAST軟件進(jìn)行，在GenBank中沒(méi)有找至Wif可同源的序列。
具體實(shí)施例方式
采用分子克隆技術(shù)，克隆出判t^ii抗鰻弧菌特異的cDNA-AFLP片段，粒半滑舌鰨抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的獲取技術(shù)，進(jìn)而獲取判骨彌抗病相關(guān)基因，具有重 要的現(xiàn)實(shí)意義。下面Sil '半滑^ti抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的獲取方法'的實(shí)施 例，結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明
一、注射鰻弧菌和未湖鰻弧菌兩種半^t^的cDNA-AFLP差異顯示。
1、 鰻弧菌注射
采用腹腔注射^^W^iiai寸0. 5mL 10D的鰻弧菌懸液，注身賴曼弧菌可以啟動(dòng)或 增強(qiáng)抗病相，因的皿。以未經(jīng)鰻弧菌注射的半滑，作對(duì)照。
2、 RNA的提取
采用Trizol法提取脾藏組織中的總RNA:取適量的組織勻漿懸液，加入5mLTrizo1， 充分吹打混勻，室ia&夂置5min。力口l. 2 mL CHC13(4°C)，渦流混勻3次，每次IO s，室溫 方爐5min。 11000 g， 4°C，離心10min。小心吸取上清，加入^f本積的異丙醇(-20°C)， 上下顛倒混勻，室^J文置15min， 11000g， 4°C，離心10rain。棄上清，沉淀中加入75%(4 。C)的乙l^先滌，11000 g， 4°C，離心10min。棄上清，倒置于吸7KI氏上，盡量吸干液體。 3000g， 4'C，離心10 s。，將管壁上的殘余液體甩到管底，用微量加樣器盡量將其吸干， 冰上^B喿10 min。用50 HL，ase的水溶解RNA。
3、 PCR反轉(zhuǎn)錄
，層反轉(zhuǎn)錄酶法選用50 ML反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反/S體系包含10X Buffer, dNTP， MgCL，混合引物，腦A酉敏卬制齊U，鍵反轉(zhuǎn)錄酶及RNA模板。反應(yīng)^j牛為 42 。C， 60 rain。然后立即進(jìn)行PCR反應(yīng)或于-20。C保絲用。
4、 cDNA-AFLP
各取10條aM鰻弧菌和未 il賴曼弧^M種魚(yú)的cDNA tlt反^U^S因f也，進(jìn)行AFLP 差異顯示，獲得差異顯示的片段。細(xì)標(biāo)準(zhǔn)的AFLP禾辦首5feX寸cDNA進(jìn)行限帝勝酶切， 然后分別進(jìn)，ff頁(yè)擴(kuò)增和選掛生擴(kuò)增，變性聚丙烯醐錢(qián)掛交電泳分離擴(kuò)增片段，最后銀染 顯色。二半^^抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的克隆與序列分析，包括1、抗鰻弧 菌特異cDNA-AFLP片段的回收；2、 cDNA-AFLP片段的克?。?、序列分析。
1、 抗f曼弧菌特異cDNA-AFLP片段的回收
根據(jù)抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的篩選結(jié)果，選取能擴(kuò)增出496 bp抗鰻弧菌特 異AFLP條帶的弓胸組合，進(jìn)行AFLP擴(kuò)增，然后進(jìn)行聚丙烯醐安繊交電泳，獲得496bp 的抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP條帶，用刀片切下含有目的DNA片段的聚丙烯翻安凝咬，加 20W超纟feK， 4"C過(guò)夜溶解，得到了微量的DNA，回收目的片段備用。
2、 AFLP片段的克隆
采用商品化的pMD 18-T連接試劑盒將回收的抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段，克隆 到pMD18-T載體中，采用標(biāo)準(zhǔn)的CaCl2轉(zhuǎn)化方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，將轉(zhuǎn)化產(chǎn) 物涂布LB培養(yǎng)皿，37。C過(guò)夜i歸。次日，用滅菌的牙^^兆取單m， SA3mlLB(， 卞青毒素)液體培養(yǎng)基中，37°C、 250 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。然后采用PCR法篩選目的克隆， 從齡樣品中取菌液做為模板，用所X寸應(yīng)的選擇性擴(kuò)增的弓l物和反應(yīng)禾驕進(jìn)行擴(kuò)增， 用瓊SgH湊掛交電泳檢測(cè)產(chǎn)物的長(zhǎng)度，符^f鵬月長(zhǎng)度的樣品可以視為陽(yáng)性克隆。
3、 序列分析
選取陽(yáng)性克隆，用AB13730須Uima行序列分析。將來(lái)自6個(gè)陽(yáng)性克隆的抗鰻弧菌 特異cDNA-AFLP片段的核苷,列，用DNAstar Version 7. 1進(jìn)行多序列比對(duì)，其同源 性為99. 21%，表明各個(gè)個(gè)體得至啲條帶是同一個(gè)序列。^W序列同源性的寸和相似性 搜索用BLAST軟件進(jìn)行，在GenBank中沒(méi)有找到樹(shù)可同源的序列。^i^抗鰻弧菌特 異cDNA-AFLP片段的核苷,列(示于

圖1) o<110>中國(guó)海洋大學(xué)
<120>半滑舌鰨抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的獲取方法 <160> 1 <210> 1 <211〉 496 <212> ■
<213>半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)
<220>
〈400〉 1
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權(quán)利要求
1. 一種半滑舌鰨抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的克隆與序列分析，其特征在它的技術(shù)內(nèi)容包括如下三個(gè)方面1)抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的回收；2)特異cDNA-AFLP片段的克?。?)抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的序列分析1)、抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的回收選取能擴(kuò)增出496bp抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP條帶的引物組合，進(jìn)行AFLP擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，用刀片切下含有496bp抗鰻弧菌特異DNA條帶的聚丙烯酰胺凝膠，溶解后回收目的片段備用；2)、特異cDNA-AFLP片段的克隆將回收的抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段，克隆到pMD18-T載體中，采用標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，采用常規(guī)PCR法篩選含有目的片段的克隆，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物的長(zhǎng)度，符合預(yù)期長(zhǎng)度的樣品可以視為陽(yáng)性克?。?)、抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的序列分析選取陽(yáng)性克隆，測(cè)序后進(jìn)行序列分析；將來(lái)自6個(gè)陽(yáng)性克隆的抗鰻弧菌特異AFLP片段的核苷酸序列，用DNAstar進(jìn)行多序列比對(duì)，其同源性為99.21％，表明各個(gè)個(gè)體得到的條帶是同一個(gè)序列；半滑舌鰨抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的序列為tgtgggagccctgggtggcctcacaggtcacagtggtcaccttcatccactggtcagcagggagcctcagcgtgctgctccagctgtagtggccgtccttctccatcagcccacggctcctgctctcctcccagctgctgctgctgatgataccgcccaccttccaggacagagtccagtctgaggggaagcccttgttggccagacacgtgagcgtggccttaccctgctgcagctcctggctggagggaggcagcactgtcagggtggggggggcaaaaactccaacatcgagtctggttcctccaccaaaagtgtacagttcccatttgctagcatcaaattcacccagacagtagtaaactgcagcatcttcagcctggactccactgatggtcagagaaaagtcagagtttgatccactgcctgtaaaacgatctggaattcctgattctcgagggggggcccggtacccaattcgccctatagtgagtcg
全文摘要
一種半滑舌鰨抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的獲取方法，包括抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的回收、cDNA-AFLP片段的克隆與序列分析；建立了分離和克隆半滑舌鰨抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段的技術(shù)，獲得了抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段。本發(fā)明系首次分離到半滑舌鰨抗鰻弧菌特異cDNA-AFLP片段。本發(fā)明的特點(diǎn)是可快捷的獲得半滑舌鰨抗鰻弧菌特異片段，方法簡(jiǎn)便；所得結(jié)果可應(yīng)用于半滑舌鰨抗病基因的定位克隆。
文檔編號(hào)C12P19/34GK101509027SQ20091001468
公開(kāi)日2009年8月19日 申請(qǐng)日期2009年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月6日
發(fā)明者劉云國(guó) 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)