專利名稱：沙冬青抗寒基因AmEBP1的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種我國西北荒漠地區(qū)的源于遠(yuǎn)古第三紀(jì)的國家二級瀕危保護(hù)植 物，也是至今在亞洲中部荒漠地帶唯一保留下來的常綠闊葉木本植物沙冬青的抗寒基因 AmEBPI的分子克隆和遺傳轉(zhuǎn)化。通過低溫誘導(dǎo)和差異表達(dá)分析，獲得了低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá) 的沙冬青抗凍基因的EST片段，然后通過RACE擴(kuò)增獲得了沙冬青抗寒基因AmEBPI的全長 cDNA序列，在基因庫中進(jìn)行了注冊，注冊為DQ519359。AmEBPI含有完整的0RF區(qū)域，0RF全 長1188個(gè)核苷酸，編碼395個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子(TGA)。隨后構(gòu)建了沙冬青抗寒基 因AmEBPI的真核表達(dá)載體pCAMBIA2300-AmEBPl，用于轉(zhuǎn)化擬南芥和林木，獲得的轉(zhuǎn)基因植 株抗寒性有所提高。AmEBPI是國際上克隆并完成遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證的第一個(gè)木本植物抗寒基 因，我們擁有完全獨(dú)立自主的知識產(chǎn)權(quán)。它的克隆和成功轉(zhuǎn)化對于木本植物抗寒基因研究 和遺傳育種具有重要意義。
背景技術(shù)：
低溫是限制植物的生長，發(fā)育和分布的重要因素，2007-2008年在我國南方大面積 發(fā)生的那場凍害，我們還記憶猶新，其中對木本植物造成的危害最重，而且其影響將持續(xù)在 其后十幾年。木本植物抗寒基因的研究落后于草本植物，更落后于原核生物及魚類和昆蟲。 但從另一個(gè)角度來看，由于木本植物具有相同的多年生的特性，具有木質(zhì)化構(gòu)造，冬季能夠 發(fā)展出較強(qiáng)的抗寒性，所以從木本植物中應(yīng)該更容易分離到有較強(qiáng)抗寒效果的基因。把這 樣的基因轉(zhuǎn)化到需要的木本植物中可能會比轉(zhuǎn)化來自于其它生物的抗寒基因更為有效。所 以從木本植物中克隆抗寒基因并研究它們的表達(dá)和功能，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià) 值。植物抗寒基因工程與其它抗性基因工程相比起步晚，發(fā)展慢，直到八十年代末，才 報(bào)道了抗寒基因工程方面的研究成果。至今，植物抗寒基因工程主要通過以下五個(gè)途徑進(jìn) 行①魚類及昆蟲抗凍基因途徑；②脂肪酸去飽和代謝關(guān)鍵酶基因途徑；③超氧物岐化酶 (SOD)基因途徑；④糖類基因途徑；⑤本草植物抗凍基因途徑。其中用的最早的是魚類抗凍 基因途徑，魚類抗凍蛋白(AFPS)吸附于凍晶上，使極地魚類有抗冰晶化作用，保護(hù)極地魚。 1989年，Cutler用極地魚黃鰈抗凍蛋白處理植物組織，明顯改善了馬鈴薯、草菁和擬南芥 屬葉子的抗寒性能。George把人工合成的黃蓋鰈AFP基因，通過電激法成功導(dǎo)入玉米原生 質(zhì)體，得到表達(dá)。Sallis以農(nóng)桿菌介導(dǎo)，把合成的PHA-AFP (植物凝集素PHF)轉(zhuǎn)入到馬鈴薯 中，馬鈴薯的抗凍與耐凍能力提高了。近年來植物抗凍基因的研究有了較好的進(jìn)展，美國和 中國的科學(xué)家分別克隆了擬南芥的抗凍基因并導(dǎo)入番茄，得到良好的表達(dá)，獲得了抗寒性 提高的轉(zhuǎn)基因植株。美國DNA植物技術(shù)公司把抗凍基因?qū)氲睫阎?，培育出耐寒蕃茄，?且認(rèn)為抗凍蛋白有可能應(yīng)用于所有蔬菜品種的改良。但木本植物抗寒基因的克隆和轉(zhuǎn)化 方面迄今尚未見成功報(bào)道。本研究結(jié)果正是希望在這個(gè)領(lǐng)域打開突破口而開展起來的。
發(fā)明內(nèi)容
本研究用我國西北荒漠地區(qū)一種常綠闊葉的豆科灌木沙冬青為材料，進(jìn)行了木本 植物冷誘導(dǎo)基因的克隆和功能分析研究。通過低溫誘導(dǎo)處理和差異表達(dá)分析，獲得了低溫 誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的沙冬青抗凍基因的EST序列十三個(gè)(包括八個(gè)全長基因和五個(gè)cDNAs的部 分序列)。其中的一個(gè)(基因庫注冊號DQ519359)包含沙冬青抗寒基因ErbB3結(jié)合蛋白基 因(the geneencoding ErbB3 binding protein of Ammopiptanthus mongolicus)的全長 cDNA序列，命名為AmEBPl，其ORF區(qū)域長1188個(gè)核苷酸，編碼395個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密 碼子(TGA)，與馬鈴薯的StEBPl蛋白有89%的一致性。同時(shí)AmEBPl與擬南芥的AtG2蛋白 及人的EBP1蛋白具有78%和46%的一致性。可見它們屬于在真核界保守性較高的蛋白。 AmEBPl的核苷酸序列和推導(dǎo)出的氨基酸序列見附圖1。隨后克隆了 AmEBPl基因的核DNA 序列，結(jié)構(gòu)分析表明，AmEBPl基因核DNA序列含有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，與水稻、擬南 芥同源基因的結(jié)構(gòu)一致。構(gòu)建目的基因所用的載體是目前國內(nèi)外植物遺傳工程研究中廣泛應(yīng)用、并已商品 化的雙元載體pCAMBIA2300(購自公司澳大利亞Cambia公司)，其結(jié)構(gòu)見附圖2，該載體 無致病性。它本身帶有一套完整的遺傳操作系統(tǒng)和克隆位點(diǎn)(T-DNA區(qū)域，以左、右兩個(gè) 邊界表示出來)，進(jìn)行目的基因克隆時(shí)，選擇合適的克隆位點(diǎn)，將目的基因插入。啟動子是 CaMV35S，終止子是0CS，來源于Ti質(zhì)粒。在構(gòu)建目的基因AmEBPl的表達(dá)載體時(shí)，將分子克 隆得到的AmEBPl基因片段在Xba I和Sal I雙酶切位點(diǎn)插入到載體pCAMBIA2300中，建成 的表達(dá)載體被命名為pCAMBIA2300-AmEBPl，如附圖3所示。所用的標(biāo)記基因是廣泛應(yīng)用的 新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTII)，它編碼的產(chǎn)物對氨基葡糖苷類抗生素如卡那霉素等具有 抗性。在構(gòu)建本表達(dá)載體時(shí)考慮到融合基因太大會影響表達(dá)，因此沒包含報(bào)告基因GUS.該基因轉(zhuǎn)化到植物體內(nèi)后可以抑制冰晶生長及新冰晶的形成，從而保護(hù)細(xì)胞免受 損傷，提高植物的耐寒性。由于AmEBPl基因來源于木本植物，轉(zhuǎn)化后在木本植物宿主體內(nèi) 更容易表達(dá)，轉(zhuǎn)化的植物對環(huán)境沒有任何影響。
四

圖1. AmEBPl基因的編碼序列及推導(dǎo)的氨基酸序列




圖2廣泛應(yīng)用、并已商品化的雙元載體PCAMBLA2300的結(jié)構(gòu)示3AmEBPl基因構(gòu)建圖
五具體實(shí)施例方式(一 )以木本植物的離體再生體系作為轉(zhuǎn)化材料，利用農(nóng)桿菌浸染、花粉管通道、 基因槍等方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。( 二)轉(zhuǎn)化操作步驟
1.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(1)通過三親株雜交法將AmEBPl基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，用 做農(nóng)桿菌浸染轉(zhuǎn)化植物。(2)菌液制備1)用接種環(huán)刮拭含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株凍結(jié)的培養(yǎng)物表面，劃線于含有相應(yīng) 抗生素的上述YEP平板上，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天，待平板上有菌落長出來的時(shí)候， 即可用于液體培養(yǎng)。長出菌落的平板置于4°C冰箱保存。一個(gè)月后轉(zhuǎn)接到新的YEP平板上， 以保持菌的活性。2)從平板上挑取單菌落，接種于含IOml附加相應(yīng)抗生素的YEP液體培養(yǎng)基 (pH7. 0)中，在恒溫?fù)u床上，于28°C，180-200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。3)次日早晨，當(dāng)菌液OD6tltl = 0.4-0. 8時(shí)，可用于轉(zhuǎn)化。(經(jīng)驗(yàn)上一般為頭天下午5 點(diǎn)左右進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，次日早晨8點(diǎn)左右菌液濃度可達(dá)到標(biāo)準(zhǔn))備注培養(yǎng)基中加入抗生素的時(shí)候，一定要等到培養(yǎng)基冷卻但未凝固時(shí)(即人手 所能忍耐的溫度)加入，否則抗生素在高溫下會失效。(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化1)預(yù)培養(yǎng)將無菌離體再生組織橫向切割2-3個(gè)切口，后接種在分化培養(yǎng)基上進(jìn) 行預(yù)培養(yǎng)1-2天。2)共培養(yǎng)用無菌水將農(nóng)桿菌菌液稀釋5-20倍，將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的離體再生組織浸 泡在稀釋液中10-20分鐘，取出莖段，用無菌濾紙吸干后，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2-4天， 對照處理是將剪傷的離體再生組織在無菌水中浸10-20分鐘，其它處理與實(shí)驗(yàn)材料一樣。3)選擇培養(yǎng)離體再生組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，即可看到離體再生組織邊緣有乳 白色的農(nóng)桿菌菌落出現(xiàn)，用無菌水沖洗莖段，然后用無菌濾紙吸干。將離體再生組織轉(zhuǎn)移到 加有選擇壓的脫菌分化培養(yǎng)基上，在光照4000-1200()lX，25°C條件下進(jìn)行選擇培養(yǎng)。4)繼代選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)3-4周后，離體再生組織的轉(zhuǎn)化細(xì)胞將分化出抗性不 定芽，將這些抗性材料轉(zhuǎn)入相應(yīng)的加大選擇壓的脫菌選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。5)生根培養(yǎng)待不定芽長到2厘米以上時(shí)，切下并插入含有選擇壓的脫菌生根培 養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，兩周左右長出不定根，獲得轉(zhuǎn)化植株。2、花粉管通道、基因槍等轉(zhuǎn)化法(1)將AmEBPl基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，配制不同濃度，在植物開花初期 利用授粉時(shí)期，使目的基因嵌入植物內(nèi)，收集果實(shí)，培育再生苗木，獲得轉(zhuǎn)化植株。(2)將AmEBPl基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，配制不同濃度，利用基因槍等轉(zhuǎn) 化設(shè)備，將菌液與彈丸混合后，利用外界力量射入植物體內(nèi)，培育再生苗木，獲得轉(zhuǎn)化植株。(三)PCR分子檢測1、植物總DNA的提取(采用CTAB法)(1)稱取2克左右植物試管苗新鮮葉片，置研缽中，加入1/10植物材料體積的 PVPP,倒入液氮將植物材料研磨成細(xì)末。(2)將此粉末放入大離心管中，加入65°C預(yù)熱過的與植物材料等體積的2XCTAB 提取液，再加入1 %的β _巰基乙醇，反復(fù)顛倒混勻，65°C保溫15-20min.(3)取出，冷卻到室溫，加入等體積的氯仿，輕輕的反復(fù)顛倒約lOmin，室溫12000rpm離心15分鐘。(4)將上清液置于另一離心管中，重復(fù)上一步驟1-2次。(5)加入2倍體積無水乙醇，充分混勻，用玻璃鉤撓出絮狀沉淀，置于預(yù)先放滿 70%乙醇的Eppendorf管中，洗滌DNA，12000rpm離心，倒掉乙醇。(6)加入2倍體積70 %乙醇，洗滌DNA 2次。(7)吹干，溶于ΤΕ(ρΗ8· 0)緩沖液中，加入RNase (終濃度10mg/ml)，_20°C保存。2、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(1)反應(yīng)體系以質(zhì)粒DNA作為陽性對照，以未經(jīng)轉(zhuǎn)化的組培苗作為陰性對照，對轉(zhuǎn)化再生苗進(jìn) 行PCR擴(kuò)增檢測。根據(jù)所提供的AmEBPl基因的序列資料，設(shè)計(jì)一對特異性引物。引物 1:5' -ATGTCGGATGATGAAAGGGAGGAGAAGGA-3'，引物 2 5 ‘ -TAGGGAAGGGAGGTCAATCTTGAGGTGT-3 ‘，引物1設(shè)計(jì)在5'端載體序列上，引物2設(shè)計(jì)在目的基因的3'端，用這對特異性 引物擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為1. 2Kb，包含是目的基因的全序列，這樣可以保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物只 能來自導(dǎo)入的AmEBPl基因序列，而不可能來自內(nèi)源基因序列，提高了檢測的特異性和準(zhǔn)確 性。PCR-Southern雜交所用的探針是目的基因中的部分序列，即PCR擴(kuò)增出的1. 2Kb的片 段，經(jīng)32P-dCTP標(biāo)記后用作PCR-Southern雜交的探針，PCR和PCR-Southern雜交檢測雙重 陽性的則被認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因植株。1)反應(yīng)液
ddH2017μ 1
Buffer2. 5μ 1
dNTP2μ 1
Primerl1 μ 1
Primer21 μ 1
Template DNA1 μ 1
TaqE0. 5μ 1
Total25 μ 1
2)反應(yīng)程序
預(yù)變性:94°C,5min
在以下條件下擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)變性，94°C 60sec ；復(fù)性，55°C 40sec ；延伸，72°C，
Imin ；最后延伸:72°C,5min
4 °C，保存?zhèn)溆谩?br> 權(quán)利要求
本發(fā)明從我國西北荒漠地區(qū)的源于遠(yuǎn)古第三紀(jì)的國家二級瀕危保護(hù)植物，也是至今在亞洲中部荒漠地帶唯一保留下來的常綠闊葉木本植物沙冬青中克隆了其抗寒基因AmEBP1的抗寒基因AmEBP1。AmEBP1含有完整的ORF區(qū)域，ORF全長1188個(gè)核苷酸，編碼395個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子(TGA)。隨后構(gòu)建了沙冬青抗寒基因AmEBP1的真核表達(dá)載體，用于轉(zhuǎn)化擬南芥和林木，獲得的轉(zhuǎn)基因植物抗寒性有所提高。AmEBP1是國際上克隆并完成遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證的第一個(gè)木本植物抗寒基因，我們擁有完全獨(dú)立自主的知識產(chǎn)權(quán)。AmEBP1來源于木本植物，因此轉(zhuǎn)化后在木本植物體內(nèi)更容易表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株對環(huán)境沒有不良影響。它的克隆和成功轉(zhuǎn)化對于木本植物抗寒研究和遺傳育種具有重要意義。
2.克隆的沙冬青抗寒基因AmEBPl的編碼序列全長1188個(gè)核苷酸，它編碼395個(gè)氨基 酸和一個(gè)終止密碼子(TGA)，見圖1。在構(gòu)建本表達(dá)載體時(shí)，CaMV35S啟動子、目的基因、終 止子0CS和標(biāo)記基因NPTII整合在一起構(gòu)建成嵌合基因，有利于轉(zhuǎn)化和表達(dá)。
3.所用的標(biāo)記基因是廣泛應(yīng)用的來源于細(xì)菌的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTII)，它編 碼的產(chǎn)物對氨基葡糖苷類抗生素如卡那霉素等具有抗性，本表達(dá)載體不含報(bào)告基因GUS。
4.設(shè)計(jì)了檢測導(dǎo)入的AmEBPl基因的兩個(gè)特異PCR引物，它們的序列如下 引物 1 5 ‘ -ATGTCGGATGATGAAAGGGAGGAGAAGGA-3 ‘，引物 2 5 ‘ -TAGGGAAGGGAGGTCAATCTTGAGGTGT-3 ‘，這兩個(gè)PCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為1.2Kb，包含了導(dǎo)入的AmEBPl基因的序列，其中一個(gè)引 物設(shè)計(jì)在5'端的載體序列上，而另一個(gè)引物則設(shè)計(jì)在導(dǎo)入的AmEBPl基因的3'末端序列 上，這樣可以保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物只能來自導(dǎo)入的AmEBPl基因序列，而不可能來自內(nèi)源基因 序列，提高了檢測的特異性和準(zhǔn)確性。
5.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測1)反應(yīng)液 ddH20 Buffer dNTP Primerl Primer2 Template DNA TaqE Total2)反應(yīng)程序 預(yù)變性94°C，5min在以下條件下擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)變性，94°C 60sec ；復(fù)性，55°C 40sec ；延伸，72°C，lmin ； 最后延伸72°C，5min 4°C，保存?zhèn)溆谩?7u 1 2. 5u 1 2u 1 1 u 1 1 u 1 1 u 1 0. 5u 1 25 u 全文摘要
沙冬青抗寒基因AmEBP1涉及一種我國西北荒漠地區(qū)的源于遠(yuǎn)古第三紀(jì)的國家二級瀕危保護(hù)的常綠闊葉木本植物。該基因的分子克隆，通過低溫誘導(dǎo)和差異表達(dá)分析獲得了低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的沙冬青抗凍基因的EST片段，然后通過RACE擴(kuò)增獲得了該基因全長cDNA序列，并在基因庫中進(jìn)行了注冊，注冊號為DQ519359。AmEBP1含有完整的ORF區(qū)域，ORF全長1188個(gè)核苷酸，編碼395個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子(TGA)；以真核表達(dá)載體pCAMBIA2300-AmEBP1轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得的轉(zhuǎn)基因植株抗寒性有所提高；沙冬青抗寒基因AmEBP1是國際上克隆并完成遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證的第一個(gè)木本植物抗寒基因。
文檔編號C12N15/11GK101892242SQ20091001518
公開日2010年11月24日 申請日期2009年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月20日
發(fā)明者馮殿齊, 劉靜, 曹鵬秀, 王斌, 翁曼麗 申請人:泰安市泰山林業(yè)科學(xué)研究院;王斌