專利名稱：：人角膜內皮細胞培養(yǎng)液及其制備方法和應用的制作方法人角膜內鵬§#^^其制備方法和自默領域本發(fā)B鄰步及一種用于體外i^"增人角膜內皮細胞的i歸液，特別涉及到以牛角膜內皮細WM做為錢活賊份配帶MA^膜內皮細膨^^其制備方法和卿。背景獄角膜內卿敗comealendothelialcdl，CEC)^&于角膜內面的單層細胞，其外貼后彈力層內臨房7k在維躺,明和*能方面擔負著觀的角色。當CEC功倉^feP章礙(如大泡性角鵬變、Fuch角膜內皮營新良、內眼手術后內皮失代j磐)時，CEC不能再生僅靠周邊正常內飾ffiT大術zR3let勤W員失的細鵬;ts代償作用，當超出其代償能力時將嚴驟響正徵見功能?，F(xiàn)今'角賠'是世界i^盲性百嫉的主魏因，角膜移豐錢復明唯一^^的治療手段，但目前鵬于角麟植的角膜#著嚴重的供需矛盾，極大制約了角麟植手術的幵展，這一問題在我國尤為顯著；并且角麟禾鉢后蹄一定的排斥風險需長期用藥以及術后視力不佳等不利因素。隨著臨床眼科學、生物學和材料^#^斗的飛速，角膜內皮移植賴跑織oa確M^解決這一問題的i^i徑，為更多角膜盲患者帶來了希望，但^J^兩種方法頃利開展的關鍵是獲得足夠功倉証常的角膜內皮種子細胞。目前大量研離果顯示體內雜多種調節(jié)因素抑制了角膜內飾胞的再生能力、而且體外i薪角膜內皮細胞增殖困難，條功獸征常的角膜內皮種子細ii^源^m織a:程角腐勾建和角膜內皮移s^廣泛開展的最^ial^t—。以往ff^證實人角膜基質細胞條件培l(xiāng)m中含有基質細胞分泌的減S^纖^飾)3^fe長因子(bFGF)等能iSa角膜內皮細胞的增殖，而目前角膜內自胞i歸液中也多添力口堿f械第翻胞生長因子(bFGF)、表j^fe長因子(EGF)或祌經(jīng)生長因子(NGF)導MJa角膜內^l胞的增殖，但是添加了戰(zhàn)長因子的±^長邦^#角膜內皮細胞在其維持脇、抑偉iJ^^凋t^面未見有明Mfig^。因此，探索人角膜內鄉(xiāng)胞的體外培養(yǎng)體系，尋找制^S其大量擴增、維持規(guī)則絲、綱'J衰老凋亡的歸體系迫額睫。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是掛共一種人角膜內自膨薪^&其制備方法和應用，以彌補現(xiàn)有技術的不足。研^S:現(xiàn)與人角膜內卿胞相比，牛角膜內卿胞在體外容易貼壁、增殖能力強、可以大量銜姐內皮細態(tài)維持好，這正是人角膜內皮細胞體外i嫌所不及的。因ltKE人角膜內皮細胞的i錄體系中加入其中的活i^^^^角膜內鄉(xiāng)胞W^，以超胎詢對^4人角膜內皮細胞體外培養(yǎng)^&i殖、維持MPJ,、W^^老凋亡的目的。本發(fā)明以體外培養(yǎng)的牛角膜內，胞為原材料制備牛角膜內自|液，并以牛角膜內，M^±^活|4^份配制一種人角膜內，胞體外土歸液，專門用于人角膜內自胞的體外培養(yǎng)。本發(fā)明包括主要活|!^￡份蛋白#*占10"200^ml的牛角膜內鵬WM以及縫占10%的胎牛血清、青霉薪口,素各100U/ml其余用D/F12寂股^^補足于無菌容器中配第,成，其中牛角膜內卿的蛋白濃度雌為20掘Mg/ml。本發(fā)明的制備方法首先，體外土歸牛角膜內鄉(xiāng)胞；其次，帝iJ拼角膜內飾JMM，；R/g用主要活(^K份蛋白賴占10-200^g/ml的牛角膜內鄉(xiāng)、賴占10%的胎牛血清、青霉素和鏈霉素各100UM其余用D/F12凝出i^t補^e制j^發(fā)明，即人角膜內鄉(xiāng)Sli^^。本發(fā)明的特點是在人角膜內,胞體外^##過程中能{*^外人角膜內，殖、維,膜內皮細胞的規(guī)則條、抑制人角膜內皮細胞的鼓、凋亡，倉^^鵬高人角膜內鄉(xiāng)胞體外i歸的驢和質量。因此，本發(fā)明在體外i^g^人角膜內鵬^ffl方面有顯著的交媒，育^^她iSS^外培養(yǎng)人角膜內皮細胞的增殖，并能^!鵬隹持人角膜內,胞的形東。本發(fā)明的帶恪方法鄉(xiāng)驟如下步驟一、首5fe^外:t錄牛角膜內皮細胞；步驟二、再制齢角膜內卿SfelM，蔬用主要活性成份蛋白含量占10-200pg/ml的牛角膜內皮細ra鞭、含量占10%的胎牛血清、青霉素和素各100U/ml其余用D/F12基礎if^^補足配制成，以專門用于體外i^^人角膜內卿胞。其中步驟一(1)/AJ1宰場獲取芋賴羊牛B艮球，去離艮球外附帶的組織xjg，用PBS沖洗牛眼球，以去除牛眼球上的殘繊只；(2)a種眼鄉(xiāng)A^凈工作臺內，PBS再次浙軀MA含1000U/ml妥布霉^7K中浸泡10-15倂中，取出后再用PBS沖洗牛眼球，以去除牛眼球上殘余的妥布霉素；(3)用無菌0艮科剪沿角膨彖!Tf牛眼球的角膜片，用DMEM-富糖型基礎i錄液沖洗，再把角膜片內皮面向iS于i歸皿中，在解剖顯微鏡下沿角IM^取下角斷上帶有內皮細胞的后彈力層，再鵬彈力層上的內鵬胞面向下貼于另一培養(yǎng)皿內，待戰(zhàn)內皮細鵬占牢后，#^加少許含量占10%的胎牛血清和2ngtolbFGF的DMEM-富糖型i:歸液于i歸皿中浸版彈力層，在37°C、CO2濃度為5%的斜牛下常規(guī)土鎌以得到原代牛角膜內皮細胞；或者是將取下的帶有內鄉(xiāng)胞的后彈力層直接方JfA含量占10%的胎牛血清和2ngto!bFGF的DMEM-^M型i^^中過夜，第二天離心去上清液，力口入濃度為0.02g/ml的EDTA消化液37'C消化1小時，再離心去上清液，蹄加含量占10%的胎牛血清和2ng/mlbFGF的DMEM-高糖型:fel^液吹打自胞懸液，并移Ai^皿內常規(guī)i^牛角膜內皮細胞；(4)次日向i錄皿中補力n^M占10%的胎牛血清和2ng/mlbFGF的DMEM-Slt型;^^t,每3天魏一次J^^皿中的i^im，待原代牛角膜內自^:^#皿面積的80%以上，即可對m^代牛角膜內鵬鵬行銜#緣(5)傳^ffl濃度為0.125g/ml的月,B濃度為0.02g/ml的EDTA消化^37。C、。02為5%的^|牛下消化貼壁的牛角膜內細胞，5^+后〗種角膜內鵬^個圓形細胞時，再用鍾占10%的胎牛血激^#止消化、并蝶牛角膜內皮細胞懸液，1000ipm離心5溯、去上清液、力D^1:占10%的胎牛血清和2ng/mlbFGF的DMEM-寓糖型ig^S，按照1:1^#3&1傳為24i^皿細胞量的比例傳代于直徑9cm:tg^皿內常挪歸，以得到足夠量的牛角膜內^ffl)Kafi^i旨角步fc、制糾角膜內皮細MM(1)將J^銜tt錄的牛角膜內鄉(xiāng)胞，用PBS沖鄉(xiāng)胞二次，再用離為0.125gM的JRSIff鵬為0.02^ml的EDTA消化職37。C、CO2濃度為5%的割牛下消化貼壁的牛角膜內皮細胞，5^H+后寸種角膜內卿M^個圓形細胞時，再用籠占l(f/。的胎牛血清i^S終止消化、并收集牛角膜內鵬胞懸液；(2)1000ipm離心5^H中去上清液，加入D/F12基石股gf^S輕吹打鵬脫懸液，同法重復3次以去除其中的胎牛血清成份，最后再加足量的凝出il^SD/F12以重懸牛角膜內皮細胞，如對^#^直徑9跡的歸皿消化下來的細鵬n10mlD/F12(3)再將牛角膜內Mfl胞懸M-20。C冷凍30併中后37。C解凍，如此反復3次以使牛角膜內鄉(xiāng)胞充分纖；(4)以0.22,濾器濾除戰(zhàn)牛角膜內皮細鵬鞭中的細胞碎片，即得至件角膜內皮細MM，留取lml樣本待用BCA蛋白試劑激則其蛋白含量；雖在無菌容器中配制主要活H^傷嘴白含量占10"200^ml的牛角膜內皮細MM、賴占10%的胎牛血清、青霉素和鏈霉素各訓U/ml其余用D/F12基礎^^夜補足，即得本發(fā)明人角膜內鄉(xiāng)胞培養(yǎng)液。Tffi以本發(fā)明中牛角膜內鵬W^為主要活(4/t份的i^M為^ffi例詳細說明鄉(xiāng)例lMIT'紛析不同濃度的牛角膜內皮細MM液促人角膜內皮細胞增殖的,兄(1)將AJ3臺兒角膜內飾胞以同樣驢的趟臺細胞接種到96孑Lfel:(細胞接種密度為4"5xl04個/ml)，置于37。C、50/oC02剩牛下職(2)次日細M6離，去除原液分別ifet含0、10、20、50、100、200ng/ml蛋白的牛角膜內鄉(xiāng)臓鵬的D/F12i"gl^(龍占歸的胎牛血清)，每組設6個該孔；(3)@#冬5琉，MTT法測定各會fiAffiH維膜內ra胞的增殖情況。結果顯示蛋白賴為1(W00Mg/ml的牛角膜內鵬MW^且i)Sa角膜內飾鵬殖能力:l^t于只含胎牛血^i且，其中以蛋白，為20-100ng/ml的牛角膜內^佳。鄉(xiāng)例2MTT^^析不同i^^SA角膜內^Mfitt殖的情況(1)將A^臺J說膜內Mg胞以同樣M的趟織胞接種到96孑Lfei(細胞接種密度為4-5xl(f個/ml)，置于37。C、50/oCQz餅下職(2)次日細ffite壁后，去除原液分別^g分別&^D/F12培養(yǎng)液、含50^ml蛋白濃度的牛角膜內，MM、50Mgtel蛋白^g的牛角^hJ^Hffiia鞭、50ngtol蛋白的牛角膜基質細液、A^臺兒角膜基質細胞斜牛:t^^和牛角膜內飾胞劍牛i&M的D/F12:t^t(6組±§中鵬含量占腦的胎牛血清)每組設5個鼓孔；(3)繼彰歸4-5Xig，MTT法測定各纟M臺角膜內皮細胞的增殖情況。結果見下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>顯然，本發(fā)明蛋白^S為5(^g/ml的牛角膜內皮細|鞭組，其{4角膜內皮細胞增殖能力均優(yōu)于D/F12培fM組、蛋白^4為50pg/ml的牛角J3fi:皮細MI鞭組、蛋白含量為50j^ml的牛角膜基質細鵬MS、Al臺兒角膜基質細胞斜牛培養(yǎng)漱且和牛角膜內皮細胞割牛i^ma。鄉(xiāng)例3倒，微鏡下觀察牛角膜內，自^^寸人角膜內皮細態(tài)的維持(1)將A^臺兒角膜內鵬胞以同樣M的趟^ffll^^中到24孑L^J:，置于37。C、5%(202斜牛下土歸；(2)次日細鵬離，去除原液分別換作含0、10、20、50、100、200^ml蛋白的牛角膜內卿臓角鞭的D/F12培鎌(含量占10%的胎牛血清)，每組設3個復孔；(3)倒觀微鏡下,見察并照相的生長汰態(tài)。結腿示蛋白纏為10-200pg/ml的牛角膜內鵬M^飽g^itMt^胎兒角膜內飾胞的規(guī)形內態(tài)，隨著培養(yǎng)時間的延長不含牛角膜內^&^容易出現(xiàn)^^凋亡，其中以蛋白為20-100ng/ml的牛角膜內飾|^**佳。魏例4使JSM微鏡下觀^^角膜內劇MM^A^臺兒角膜內MB胞傳代的影響(1)將yy臺兒角膜內飾胞以同樣驢的起鄉(xiāng)胞傳代接種到24孑^J:，置于37。C、5。/oCQ2斜牛下培養(yǎng)；(2)次日細J3fi!te,，去除原液分別換作含0、25、50、100^ml蛋白的牛角膜內細MM的D/F12±歸液(纏占腦的胎牛血清)，每組設3個復孔；(3)倒SM微鏡下繊觀察并照相iB^ffl胞的生長枕態(tài)。結顆示蛋白賴為25-100^ml的牛角膜內鵬ffiW^;t錄的AI臺兒角膜內飾鵬圣消化傳代更易于貼壁，傳f^細MS易于增殖，且可以維持|^的內皮細^。鄉(xiāng)例5牛角膜內皮細lfeSM^寸AJ^兒角膜內皮細胞中S^和增殖相錢因鋭的影響(1)將AJ3臺兒角膜內皮細胞以同樣驢的趟鰂胞接種到24孑L社，置于37。C、5。/oCQ2斜牛下J:歸；(2)次日細胞貼離，去除原液分別換作含0、10、20、50、100、200Hg/ml蛋白的牛角膜內皮細角對夜的D/F12培M(^!:占10%的胎牛血清)；(3)收^ffii^培^^歸的人角膜內皮細胞，提取細胞的總RNA并反轉成cDNA，以用于RT-PCR翻；(4)RT-PCR方法檢測W1f品中增殖相關基因Ki67&S老相關基因SOD2、P16的^iM。結果顯示蛋白賴為20-謂一ml的牛角膜內皮細鵬^^歸的AI臺兒角胰內皮細胞中SOD2、pl6^iil:明顯低于不含牛角膜內皮細lfiM^培養(yǎng)的AJ!臺兒角膜內皮細胞，而Ki67載翻湘反，這充分表明牛角膜內，ra鞭制sa人角膜內皮細胞的增殖、抑制角膜內皮細胞的衰老凋亡。顯然，本發(fā)明的人角膜內皮細l&fe&im比含AI臺兒角膜基質細胞斜牛培鎌、牛角膜內鄉(xiāng)胞^f牛i歸液、牛角Mi:Mtllfiia鞭、牛角膜SM細MW3:D/F12力口含量占10n/。胎牛血清的i^^SS人角膜內鄉(xiāng)胞的增殖玄M強，能輸子的〈&af本外i歸的人角膜內MS胞;^擴增、維持角膜內皮細胞的#征、抑制細M老和凋亡，并且更利于內皮細胞的傳f^t咅養(yǎng)。其中以含蛋白^l:為20-100^ml的牛角膜內皮細Ma游fi^R佳。另外，本發(fā)明的原材爭件角膜內皮細fe^源豐富易于體外培養(yǎng)，且制備方法簡單，便于敘包，有利于產(chǎn)業(yè)化，具有廣闊的鵬開發(fā)前景。權利要求1、人角膜內皮細胞培養(yǎng)液，其特征在于該培養(yǎng)液包括主要活性成份為蛋白含量占10-200μg/ml的牛角膜內皮細胞裂解液以及含量占10％的胎牛血清、青霉素和鏈霉素各100U/ml其余用DMEM/F12基礎培養(yǎng)液補足于無菌容器中配成。2、如權利要求1所述的人角膜內皮細胞培養(yǎng)液，其特征在于上述的主要活性成份牛角膜內皮細胞裂解液的蛋白濃度優(yōu)選為20-100ug/ml。3、如權利要求1所述的人角膜內皮細胞培養(yǎng)液的制備方法步驟一、首先體外培養(yǎng)牛角膜內皮細胞；步驟二、然后制備牛角膜內皮細胞裂解液，最后按蛋白含量占10-200^g/ml的牛角膜內皮細胞裂解液、含量占10%的胎牛血清、青霉素和鏈霉素各100U/ml以及DMEM/F12基礎培養(yǎng)液補足混勻配制于無菌容器中；其中上述步驟一中的體外培養(yǎng)牛角膜內皮細胞的方法如下(1)從屠宰場獲取新鮮牛眼球，去除眼球外附帶的組織后，用大量的PBS沖洗牛眼球；(2)將上述牛眼球移入超凈工作臺內，用PBS再次沖洗后浸入含1000U/ml妥布霉素水中浸泡10-15分鐘，取出后再用PBS沖洗牛眼球；(3)用無菌眼科剪沿角膜緣剪下上述牛眼球的角膜片，用DMEM-高糖型基礎培養(yǎng)液沖洗，再把角膜片的內皮面向上置于培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下沿角膜緣取下角膜片上帶有內皮細胞的后彈力層后，再把后彈力層上的內皮細胞面向下貼于另一培養(yǎng)皿內，待內皮細胞貼牢后，再添加含量占10%的胎牛血清和2ng/mlbFGF的DMEM-高糖型培養(yǎng)液于培養(yǎng)皿中浸沒后彈力層，并在37°C、C02濃度為5%的條件下常規(guī)培養(yǎng)即得到原代牛角膜內皮細胞；(4)次日向該培養(yǎng)皿中補加含量占10%的胎牛血清和2ng/mlbFGF的DMEM-高糖型培養(yǎng)液，每3天更換一次培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，待原代牛角膜內皮細胞達到培養(yǎng)皿面積的80%以上，即可對該牛角膜內皮細胞進行傳代培養(yǎng)以得到足夠量的牛角膜內皮細胞來制備牛角膜內皮細胞裂解液；其中上述步驟二中的制備牛角膜內皮細胞裂解液的制備方法(l)將上述得到的牛角膜內皮細胞，用PBS沖洗細胞二次，再用濃度為0.125g/ml的胰酶和濃度為0.02g/ml的EDTA消化液在37°C、(202濃度為5%的條件下消化貼壁的牛角膜內皮細胞，5分鐘后待牛角膜內皮細胞形成單個圓形細胞時，即用含量占10%的胎牛血清培養(yǎng)液終止消化、并收集牛角膜內皮細胞懸液于離心管中；(2)1000卬m離心5分鐘去上清液，加入DMEM/F12基礎培養(yǎng)液輕輕吹打成細胞懸液，同法重復3次，以去除其中的胎牛血清成份，最后再加足量的基礎培養(yǎng)液DMEM/F12重懸牛角膜內皮細胞；(3)再將上述牛角膜內皮細胞懸液在-20。C冷凍30分鐘后37。C解凍，如此反復3次，以使牛角膜內皮細胞充分裂解；(4)用0.22pm濾器濾除上述牛角膜內皮細胞裂解液中的細胞碎片，得到牛角膜內皮細胞裂解液，留取lml樣本待用BCA蛋白試劑盒測其蛋白含量；最后在無菌容器中配制蛋白含量占10-200pg/ml的牛角膜內皮細胞裂解液、含量占10%的胎牛血清、青霉素和鏈霉素各100U/ml其余用DMEM/F12基礎培養(yǎng)液補足，即得人角膜內皮細胞培養(yǎng)液。4、如權利要求3所述的人角膜內皮細胞培養(yǎng)液的制備方法，其特征是上述傳代培養(yǎng)方法是(1)首先用濃度為0.125g/ml的胰酶和濃度為0.02g/ml的EDTA消化液在37°C、濃度為5%的C02條件下消化貼壁的牛角膜內皮細胞，5分鐘后待牛角膜內皮細胞成單個圓形細胞時，再用含量占10%的胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化、并收集牛角膜內皮細胞懸液；(2)將上述收集的牛角膜內皮細胞懸液以1000rpm離心5分鐘、去上清液后加含量占10%的胎牛血清和2ng/mlbFGF的DMEM-高糖型培養(yǎng)液，按照1:2-1:4的比例傳代并常規(guī)培養(yǎng)。5、如權利要求3所述的人角膜內皮細胞培養(yǎng)液的制備方法，其特征是上述歩驟一中，原代牛角膜內皮細胞體外培養(yǎng)方法還可將取下的帶有內皮細胞的后彈力層放入含量占10%的胎牛血清和2ng/mlbFGF的DMEM-高糖型培養(yǎng)液中過夜，第二天離心去上清液，加入濃度為0.02g/ml的EDTA消化液37'C消化1小時，再離心去上清液，加入含量占10%的胎牛血清和2ng/mlbFGF的DMEM-高糖型培養(yǎng)液吹打成細胞懸液并移入培養(yǎng)皿內常規(guī)培養(yǎng)牛角膜內皮細胞6、人角膜內皮細胞培養(yǎng)液應用于人角膜內皮細胞的體外培養(yǎng)。全文摘要本發(fā)明涉及一種人角膜內皮細胞培養(yǎng)液及其制備方法和應用。包括主要活性成份為蛋白含量占10-200μg/ml的牛角膜內皮細胞裂解液及含量占10％的胎牛血清、青霉素和鏈霉素各100U/ml其余用D/F12基礎培養(yǎng)液補足。方法首先體外培養(yǎng)牛角膜內皮細胞；然后制備牛角膜內皮細胞裂解液，最后在無菌容器中配制即得。本發(fā)明首次將牛角膜內皮細胞裂解液制成細胞培養(yǎng)液并應用到人角膜內皮細胞的體外培養(yǎng)，能促進體外培養(yǎng)的人角膜內皮細胞大量擴增、維持角膜內皮細胞的形態(tài)特征、抑制細胞衰老和凋亡，并且更利于內皮細胞的傳代培養(yǎng)。其中的原材料牛角膜內皮細胞來源豐富易于體外培養(yǎng)，培養(yǎng)液的制備方法簡單，便于實施，有利于產(chǎn)業(yè)化，具有廣闊的應用開發(fā)前景。文檔編號C12N5/08GK101597592SQ20091001634公開日2009年12月9日申請日期2009年6月11日優(yōu)先權日2009年6月11日發(fā)明者史偉云,周慶軍,楊玲玲,彥高申請人:山東省眼科研究所