專利名稱：鹽芥v-焦磷酸酶基因啟動(dòng)子序列和其缺失突變體的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬農(nóng)作物和林木的生物工程育種領(lǐng)域，具體說，涉及一種植物基因啟動(dòng)子序
列(鹽芥編碼液泡膜焦磷酸酶基因^r/7啟動(dòng)子的序列)的克隆、改造和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鹽脅迫是自然界中主要的非生物脅迫之一，土壤中高濃度Na+對(duì)許多植物的生長(zhǎng)和 發(fā)育造成很大的傷害。土壤鹽堿化和次生鹽堿化問題，已經(jīng)成為世界灌溉農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā) 展的制約因素。隨著人口的增長(zhǎng)以及水資源的匱乏，提高水資源利用效率、充分開發(fā)和 利用鹽堿地已成為關(guān)系國(guó)計(jì)民生的重要課題。近年來，隨著對(duì)擬南芥、水稻等模式生物 的深入研究和生物技術(shù)的迅速發(fā)展，已為培育高度鹽耐性作物新品種提供了新思路、新 方法和新材料，利用分子生物學(xué)方法和手段發(fā)現(xiàn)新的遺傳資源是培育高度耐鹽耐旱新品 種的重要環(huán)節(jié)。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)以及植物基因工程的迅速發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來改變一些作 物的性狀，提高其對(duì)外界脅迫條件的耐受性從而增加作物的產(chǎn)量己經(jīng)成為一種重要的技 術(shù)。外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中低水平表達(dá)和非特異性表達(dá)是制約植物基因工程發(fā)展的一 個(gè)重要因素，主要原因是缺少理想的啟動(dòng)子。
常見的啟動(dòng)子可分為組成型啟動(dòng)子、組織特異啟動(dòng)子和誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子。不同啟動(dòng) 子啟動(dòng)的基因表達(dá)強(qiáng)度有很大差別，往往具有明顯的種屬特異性。在某些情況下， 一種 類型的啟動(dòng)子往往兼有其他類型啟動(dòng)子的特性。組織特異啟動(dòng)子由于其表達(dá)的空間特異 性，可將外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中定位表達(dá)，這不但可以降低植物負(fù)擔(dān)、減輕對(duì)作物農(nóng) 藝性狀的影響，而且可以提高外源基因產(chǎn)物在特定部位的濃度，增加轉(zhuǎn)基因的效果。目 前組織特異性啟動(dòng)子主要應(yīng)用在以下幾方面:①提高作物的抗凍、抗旱、抗鹽能力和防 止水果腐爛，②改良花丼品質(zhì)、控制觀賞花齊的顏色，③提高植物的抗病性、抗蟲性和 抗除草劑能力，④開發(fā)生物反應(yīng)器用于生物制藥，⑤創(chuàng)建雄性不育系和恢復(fù)系，⑥用于 植物的分化發(fā)育研究等(王瑞琲，2008)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可使轉(zhuǎn)基因在特定條件下表達(dá)， 在植物抗逆基因工程中急待開放應(yīng)用。巳報(bào)道的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子和化學(xué) 物質(zhì)誘導(dǎo)啟動(dòng)子兩大類，前一類包括熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子、冷誘導(dǎo)啟動(dòng)子、干早誘導(dǎo)啟動(dòng)子、 損傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子等，后一類有激素誘導(dǎo)啟動(dòng)子、乙醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子、固醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子等。 盡管目前已有一定數(shù)量的器官特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子，但在多數(shù)工作中，所 用的啟動(dòng)子仍為組成型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒35SRNA基因啟動(dòng)子(CaMV35S)、玉 米泛素基因啟動(dòng)子(Ubil)，水稻肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子(Actl)等，其主要原因是可用 的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織特異性啟動(dòng)子或受專利保護(hù)或啟動(dòng)子的啟動(dòng)能力較弱。
在植物基因工程中大量應(yīng)用組成型啟動(dòng)子，使用組成型強(qiáng)啟動(dòng)子可以提高外源基因 的表達(dá)強(qiáng)度，在一定程度上對(duì)目的基因的表達(dá)有很強(qiáng)的促進(jìn)作用，但是隨之也帶來了一 些問題，如組成型啟動(dòng)子使基因產(chǎn)物在宿主的整個(gè)生命周期以及所有的組織器官持續(xù)表 達(dá)不僅造成了宿主體內(nèi)資源的浪費(fèi)，而且往往導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因材料的某些性狀的改變。影響轉(zhuǎn)基因材料正常的生長(zhǎng)發(fā)育，使其出現(xiàn)發(fā)育遲緩，植株矮化等現(xiàn)象。如Shan等在棉花 中組成型表達(dá)GhDREBl基因，雖然提高了植物的抗逆性，但是其開花期與對(duì)照植株相比 明顯推遲。Nakashima等在水稻中用玉米的泛素基因啟動(dòng)子組成型表達(dá)0sNAC6基因，造 成植株生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，產(chǎn)量降低。此外，組成型表達(dá)一些基因雖然可以增加作物的抗逆性， 但是對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的安全性也造成一定的影響，比如組成型表達(dá)抗蟲基因可以在一定程 度上防止病蟲害，但是由于果實(shí)或者種子中也存在該蛋白，往往為轉(zhuǎn)基因材料的釋放造 成一定的困難。
近年來，越來越多的科研者樂意采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或者組織特異性啟動(dòng)子構(gòu)建植物 表達(dá)載體。與組成型表達(dá)啟動(dòng)子相比，它們啟動(dòng)的轉(zhuǎn)基因只有在特定的環(huán)境下或者在特 定的組織中才有高強(qiáng)度表達(dá)，因此可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要來控制目的基因的時(shí)空表達(dá)。Liu 等利用組成型啟動(dòng)子CaMV35S和脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子RD29A分別啟動(dòng)下游基因AtbZIP17 構(gòu)建載體并轉(zhuǎn)化擬南芥，結(jié)果表明這兩種組合均可提高擬南芥的抗逆性，但是在正常生 長(zhǎng)條件下，組成型表達(dá)該基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因材料發(fā)育遲緩，但是誘導(dǎo)型表達(dá)該基因則沒有 這種狀況。同樣，Kazuo等人在水稻中過表達(dá)0sNAC6基因，利用組成型啟動(dòng)子導(dǎo)致水稻 生長(zhǎng)延遲產(chǎn)量降低,但是利用其本身的啟動(dòng)子就可以解決這個(gè)問題。Aryadee等在煙草中 利用其本身啟動(dòng)子表達(dá)基因Rabl6A，只有在脅迫條件下該基因才能在葉中大量表達(dá)，從 而提高其抗逆性，而且轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照相比其形態(tài)發(fā)育以及產(chǎn)量都沒有受到影響。
雖然誘導(dǎo)型啟動(dòng)子與組成型啟動(dòng)子相比具有很多優(yōu)點(diǎn)，但是目前已知的誘導(dǎo)型啟動(dòng) 子很少，應(yīng)用比較廣泛的主要還是RD29A等比較經(jīng)典的啟動(dòng)子，而我國(guó)具有自主知識(shí)產(chǎn) 權(quán)的脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子更是少之又少，因此克隆鑒定新的脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列并找出 其中的核心作用元件具有重要的意義。
鹽芥是一種生長(zhǎng)于鹽堿地中的擬南芥近親物種，也是研究植物抗逆機(jī)制的重要模式 植物。鹽芥和擬南芥的cDNA序列相似性非常高，但是鹽芥對(duì)于非生物脅迫的抗逆性要 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于擬南芥，申請(qǐng)人克隆了鹽芥中編碼液泡膜焦磷酸酶的基因并對(duì)其進(jìn)行了 功能分析。該基因在擬南芥中的同源基因是AVP1。將這兩個(gè)基因分別轉(zhuǎn)入酵母鹽敏感突 變體，發(fā)現(xiàn)它們均能明顯提高酵母的抗鹽性；在煙草中分別過表達(dá)這兩個(gè)基因也可顯著 提高煙草的耐鹽性，表明這兩個(gè)基因的功能具有很高的相似性。分別檢測(cè)這兩個(gè)基因在 鹽芥和擬南芥中的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫條件下，^K/^基因的表達(dá)受到明顯的誘導(dǎo) 作用，而AVP1的表達(dá)基本沒有變化。這說明二者的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制存在很大的差異， 克隆rsK尸7基因的啟動(dòng)子序列并對(duì)其進(jìn)行功能分析，尋找其中的關(guān)鍵作用元件具有重要 的意義。
高等植物啟動(dòng)子一般由兩部分組成 一部分是形成普遍性轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)所需要的，通常 稱為核心啟動(dòng)區(qū)，包括轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及鄰近的TATA框；另一部分是決定基因轉(zhuǎn)錄特異性 和活性的區(qū)域，由多個(gè)保守序列組成，這些保守序列在不同啟動(dòng)子的位置、種類及拷貝 數(shù)存在較大差異。兩部分都參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，但后一部分起主要的控制作用，尋找 啟動(dòng)子中的關(guān)鍵作用元件對(duì)于啟動(dòng)子的改造和利用具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)目前的研究現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一種植物基因啟動(dòng)子序列(鹽芥編碼液 泡膜焦磷酸酶基因7^F尸/啟動(dòng)子的序列)及其改造和應(yīng)用。本發(fā)明所述的鹽芥v-焦磷酸酶基因啟動(dòng)子及其缺失突變體的應(yīng)用方法是從鹽生植
物鹽芥克隆V-焦磷酸酶基因啟動(dòng)子序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
大體步驟是從鹽生植物鹽芥的基因組文庫中篩選出攜帶7JF尸/啟動(dòng)子的克隆，截取 7SF尸/開放讀碼框5'上游的2200核苷酸序列作為全長(zhǎng)啟動(dòng)子序列，以此為模板通過PCR 擴(kuò)增獲得不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段T2 T7，分別將其與報(bào)告基因融合后轉(zhuǎn)入擬南芥，確定 了 KF尸7啟動(dòng)子和其部分系列缺失突變體是鹽脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其中T5啟動(dòng)子具有 較強(qiáng)的根特異性；7SPT7啟動(dòng)子和T5啟動(dòng)子分別與來自大腸桿菌的^"基因相連轉(zhuǎn)入 煙草和玉米，確定了它們?cè)谵D(zhuǎn)基因煙草和玉米中能正常行使啟動(dòng)功能，是鹽脅迫誘導(dǎo)型 的強(qiáng)啟動(dòng)子。
其中，所述V-焦磷酸酶基因啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列為V-焦磷酸酶基因(R『"上游2200 bp的序列(其序列如序列表SEQIDNO. 3所示)。利用PLANTCARE在線分析軟件分 析發(fā)現(xiàn)，該序列中存在多個(gè)調(diào)控元件，包括厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件ARE，干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件 MBS， ABA響應(yīng)元件ABRE，熱誘導(dǎo)響應(yīng)元件HSE，水楊酸響應(yīng)元件TCAelement,茉 莉酸響應(yīng)元件CGTCAmotif，光誘導(dǎo)響應(yīng)元件SP1 ， ACE， AE-box, G-box等(見附圖1 )。
其中，缺失突變體的構(gòu)建是根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，利用這些預(yù)測(cè)元件的間隔區(qū) 域設(shè)計(jì)上下游引物，通過PCR擴(kuò)增獲得不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段，產(chǎn)生成套缺失突變體(附 圖2)，并將它們分別連接進(jìn)入植物表達(dá)載體pCAMBIA1391z中的多克隆位點(diǎn)，而多克隆 位點(diǎn)的下游為GUS報(bào)告基因，即插入多克隆位點(diǎn)的啟動(dòng)子片段與^ys基因形成融合基因。
其中，所述用于構(gòu)建融合基因的啟動(dòng)子可為啟動(dòng)子的全長(zhǎng)序列，也可以為部分序列， 也可以為根據(jù)部分序列人工合成的脫氧多核苷酸。
所述的應(yīng)用方法是通過在轉(zhuǎn)基因植株中檢測(cè)融合基因的表達(dá)來確定啟動(dòng)子序列的 功能及利用價(jià)值。
其中，所述的應(yīng)用方法還可以是通過轉(zhuǎn)融合基因獲得對(duì)逆境抗性提高或降低的轉(zhuǎn)基 因植株及后代。
本發(fā)明所克隆的鹽芥啟動(dòng)子序列用于構(gòu)建植物表達(dá)結(jié)構(gòu)，插入植物表達(dá)載體后轉(zhuǎn)入 農(nóng)桿菌GV3101，通過花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥。轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生的種子在加有抗生素的瓊脂 培養(yǎng)基平板上篩選，萌發(fā)的小苗移栽到營(yíng)養(yǎng)土中，成活后進(jìn)行PCR檢測(cè)，篩選轉(zhuǎn)基因植 株。轉(zhuǎn)基因植株連續(xù)自交2代產(chǎn)生純合系。后者用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)強(qiáng)度分析。同時(shí)將克隆 的擬南芥」vA/基因的啟動(dòng)子序列與報(bào)告基因相連，構(gòu)建融合基因ZrA -g"s的植物表達(dá) 載體，通過轉(zhuǎn)基因植株中兩個(gè)同源基因表達(dá)模式上的差異分析它們啟動(dòng)子功能的差異及 各自的利用價(jià)值。
本發(fā)明所說的啟動(dòng)子控制的表達(dá)模式分析，包括對(duì)7iPT7-Tl(全長(zhǎng)啟動(dòng)子連接GUS 基因)轉(zhuǎn)基因植株的染色分析，確定該啟動(dòng)子啟動(dòng)基因的表達(dá)部位，包括擬南芥根、莖、 葉、花和莢果，發(fā)現(xiàn)在根和葉中GUS表達(dá)強(qiáng)度要高于其他器官。根染色結(jié)果的組織學(xué)觀 察表明，在根部GUS表達(dá)主要分布在中軸部位,根表皮和皮層組織中的表達(dá)量低。并且 在側(cè)根發(fā)生部位，GUS表達(dá)強(qiáng)度要明顯高于主根的其它部位。
本發(fā)明所說的植物抗逆性是指植物在整株、器官和/或細(xì)胞水平上表現(xiàn)出的耐(抗) 旱性、耐(抗)鹽性、耐冷性、抗寒性、耐澇性、耐熱性、抗(耐)輻射性、抗病性、 抗蟲性、抗除草劑等特性及其組合。這種抗(耐)性在植株水平上可表現(xiàn)在某些發(fā)育階段或全生育期，可通過多種指標(biāo)衡量或評(píng)價(jià)。
本發(fā)明所說的植物主要指高等植物，包括各類作物和經(jīng)濟(jì)植物、觀賞植物、生態(tài)植物、雜草等；包括被子植物、裸子植物；包括草本和木本植物等。
V-焦磷酸酶基因編碼區(qū)5'上游區(qū)域的克隆和分析
用購(gòu)自Merck公司的人BlueSTARTM Xho I Half-site Arms KIT和PhageMaker KIT
構(gòu)建鹽芥小片段基因組文庫。從鹽芥葉片提取基因組DNA，用限制酶y^oI部分消化。對(duì)部分酶解DNA的部分末端補(bǔ)平，然后在0.6%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳完成后用手術(shù)刀切下含有10-23 Kb DNA片段的凝膠塊回收DNA，回收產(chǎn)物純化后用于連接反應(yīng)。連接反應(yīng)分別在3個(gè)無菌的0. 5 mL的離心管中獨(dú)立進(jìn)行。每管A -噬菌體載體1 (500ng~L)，基因組DNA片段分別為2、 4、 6 pL， lnLT4DNA連接酶，加無菌水至體積10pL，于4 °C連接16-24 h。然后將連接產(chǎn)物小心的加到50 |iL融化的包裝提取物中，加入500 SM buffer(50 mM Tris-Cl, pH 7.3,100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 0.01%Glutin)，輕輕渦旋混勻，加入25pL氯仿，輕輕渦旋混勻后分為120個(gè)亞庫保存在4 °C
備用o
根據(jù)鹽芥TsVPl基因的序列信息，在其5'端設(shè)計(jì)PCR引物PTsVP-Pl (5'GTGGCGTCGGCGTTTCTTC 3')和PTsVP-P2 (5' CTTGGCGACGACACTCTGC 3'),
采用PCR方法分級(jí)篩選鹽芥基因組文庫。PCR陽性的亞庫分成次級(jí)庫再次進(jìn)行篩選，經(jīng)過3級(jí)篩選后對(duì)陽性亞庫鋪平板進(jìn)行噬菌斑印跡法篩選。濾膜印跡時(shí)，噬菌斑直徑大約0.5-0.8咖，分散良好，互不相連。濾膜吸印前應(yīng)將平板預(yù)先放入4 。C至少1 h，然后將尼龍膜覆蓋在長(zhǎng)有適量噬菌斑的平板上，用3個(gè)不對(duì)稱小孔進(jìn)行定位。膜全部浸濕后繼續(xù)在平板上放置l min。取出尼龍膜，印跡面朝上，室溫放置IO miri晾干。
取1 ng回收的TsVPlcDNA，采用羅氏公司(Roche)的DIG-High Prime KIT進(jìn)行探針標(biāo)記，標(biāo)記的方法見試劑盒說明書。雜交、顯色使用Roche公司的DIG Nuceic AcidDetection KIT,操作過程和方法見試劑盒說明書。
用原位雜交的方法來分離陽性噬菌斑，雜交時(shí)，將尼龍膜依次放在被變性液(0.5MNa0H， 1. 5 M NaCl)飽和的濾紙上5 min，中和液(0.5 MTris'Cl， pH7.4; 1.5MNaCl)飽和的濾紙上5min，重復(fù)一次；然后將膜在2XSSC溶液中洗滌5min。尼龍膜處理完畢后，室溫放置30min晾干，然后置于80。C烘干2 h，用保鮮膜包好，存放于4 。C備用。隨機(jī)挑取陽性噬菌斑，將其轉(zhuǎn)換為XBlueSTAR質(zhì)粒。獲得入BlueSTAR質(zhì)粒后，對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序，得到基因編碼區(qū)上游5452 bp的序列。
通過對(duì)鹽芥TsVPl基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析，其近5'端850核酸序列與擬南芥AT1G15670有很高的相似性(87。/。)。對(duì)鹽芥TsVPl基因及其上游基因間隔區(qū)的4587 bp和擬南芥AVP1基因及其上游基因間隔區(qū)的4475 bp的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)鹽芥丁^ 1基因的啟動(dòng)子序列與擬南芥『- 3犯基因」^7的啟動(dòng)子序列的相似性很低(〈10%)。通過NSITE-PL(http:〃www. softberry. com)程序分析啟動(dòng)子序列中的順式作用元件，鹽芥TsVPl基因啟動(dòng)子序列含有18個(gè)不同的順式調(diào)控元件，擬南芥AVP1啟動(dòng)子序列中包含27個(gè)(可以和25個(gè)不同調(diào)控因子相互作用)順式作用元件。其中有5個(gè)順式作用元件(RSP00079， RSP00377, RSP00420， RSP00635, RSP00653)為兩個(gè)啟動(dòng)子序列所共有。而且在鹽芥TsVPl基因啟動(dòng)子序列中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)脅迫相關(guān)順式作用元件(如ABRE順式作用元件RSP00049)。這兩個(gè)基因啟動(dòng)子序列所包含的順式作用元件的個(gè)數(shù)和種類
存在著巨大差異，與它們的不同表達(dá)模式相對(duì)應(yīng)。
v-焦磷酸酶基因啟動(dòng)子的基本特征
根據(jù)測(cè)序和利用生物信息學(xué)工具分析結(jié)果，取近7iFP7基因開放讀碼框上游的2200bp的核甘酸序列(附圖l)作為全長(zhǎng)啟動(dòng)子，利用PLANTCARE在線分析軟件對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在該啟動(dòng)子序列中存在的調(diào)控元件有厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件ARE，干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件MBS， ABA響應(yīng)元件ABRE，熱誘導(dǎo)響應(yīng)元件HSE，水楊酸響應(yīng)元件TCAelement,茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA motif ，光誘導(dǎo)響應(yīng)元件SP1、 ACE、 AE-box、 G-box等，推測(cè)該啟動(dòng)子控制的基因表達(dá)受到鹽或干旱脅迫等的誘導(dǎo)。
v-焦磷酸酶基因啟動(dòng)子的成套缺失突變體構(gòu)建和與報(bào)告基因的重組
根據(jù)V-焦磷酸酶基因7iFP7啟動(dòng)子序列，在預(yù)測(cè)的調(diào)控元件的間隔區(qū)域設(shè)計(jì)上下游引物，采用常規(guī)的分子克隆技術(shù)通過PCR擴(kuò)增獲得不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段，分別連接到植物表達(dá)載體，如pCam系pCAMBIA1391z和pR0K2的報(bào)告基因^/s上游的多克隆位點(diǎn)處，構(gòu)建出成套缺失突變體。
用構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a ，篩選轉(zhuǎn)化克隆，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，然后選擇重組正確的質(zhì)粒采用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 。將克隆的擬南芥基因的啟動(dòng)子序列也與報(bào)告基因相連，構(gòu)建^kp7-^as基因表達(dá)載體，然后采用同樣程序獲得攜帶7^A -^vs基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌。以農(nóng)桿菌為中介將由不同啟動(dòng)子(片段)啟動(dòng)的gt/5基因分別轉(zhuǎn)入擬南芥，檢測(cè)不同啟動(dòng)子(片段)啟動(dòng)基因的表達(dá)模式。擬南芥轉(zhuǎn)化采用花浸染法。
V-焦磷酸酶基因全長(zhǎng)啟動(dòng)子表達(dá)模式分析
通過對(duì)轉(zhuǎn)Tl (7JK尸7全長(zhǎng)啟動(dòng)子連接^/s基因結(jié)構(gòu))結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的GUS染色觀察，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子啟動(dòng)的GUS表達(dá)部位包括根、莖、葉、花和角果。其中在根和葉中的表達(dá)強(qiáng)度要高于其他器官的。在根部，該啟動(dòng)子啟動(dòng)的GUS表達(dá)部位主要是根的中軸位置，根皮層組織中GUS表達(dá)量低，即染色很淺。在主根中，側(cè)根發(fā)生部位GUS表達(dá)量要明顯高于主根的其他部位。通過對(duì)轉(zhuǎn)Tl結(jié)構(gòu)植株的不同器官的GUS酶活性測(cè)定，進(jìn)一步證實(shí)了該啟動(dòng)子啟動(dòng)的《"s基因在植株根和葉中的表達(dá)強(qiáng)度要高于其他器官的(附圖3)。
將轉(zhuǎn)Tl-g"s結(jié)構(gòu)的擬南芥植株用200 mM NaCl處理，在處理3、 6、 12、 16和24小時(shí)分別取材測(cè)量GUS酶活性，同時(shí)進(jìn)行染色觀察。由酶活性測(cè)定結(jié)果得出，GUS表達(dá)在鹽脅迫條件下得到明顯的提高，在16小時(shí)活性達(dá)到最大值，此時(shí)植株地上部分的GUS活性約是未處理植株的4倍，根中約是未處理植株的6倍(附圖4)。染色觀察發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫條件下，根中，尤其是根尖處GUS染色強(qiáng)度大幅度提高。由于未受鹽脅迫處理植株的葉片，GUS的表達(dá)量已很高，通過染色很難看出鹽脅迫處理后GUS染色強(qiáng)度的明顯變化。
V-焦磷酸酶基因啟動(dòng)子缺失突變體的表達(dá)模式分析
將一系列的缺失突變體分別與^a 基因融合，轉(zhuǎn)入擬南芥。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行染色
分析，發(fā)現(xiàn)T2片段(1517 bp)啟動(dòng)的卯s基因表達(dá)在葉中的表達(dá)強(qiáng)度要明顯低于Tl的，而在T2片段、T3片段(905 bp)、 T4片段(788 bp)和T5片段(667 bp)分別啟動(dòng)的基因在表達(dá)特異性和強(qiáng)度方面彼此差異不明顯。T6片段(537 bp)與T5片段的啟動(dòng)活性相比，根中GUS表達(dá)量明顯要低。T6片段和T7片段(328 bp)啟動(dòng)的基因，在表達(dá)強(qiáng)度和特異性方面沒有明顯的區(qū)別。這些結(jié)果表明，與完整的"Z/^啟動(dòng)子相比，T2片段所缺少的序列中存在促進(jìn)報(bào)告基因在葉中高強(qiáng)度表達(dá)的調(diào)控元件；而與T5片段相比，T6片段缺少的序列中存在促進(jìn)報(bào)告基因在根中高效表達(dá)的元件。
對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行染色分析，發(fā)現(xiàn)T2、 T3、 T4、 T5分別啟動(dòng)的^AS基因在鹽脅迫條件下其表達(dá)強(qiáng)度有明顯增加，在根尖處的增強(qiáng)作用非常顯著。而對(duì)轉(zhuǎn)T6—^^基因植
株進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，這種鹽誘導(dǎo)作用消失。
比較T3片段和T4片段的序列，發(fā)現(xiàn)T3片段多出的部分存在與地上組織特異表達(dá)相關(guān)的作用元件。對(duì)該段序列進(jìn)行的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，存在10個(gè)光響應(yīng)元件、1個(gè)ABA響應(yīng)元件、1個(gè)干旱響應(yīng)元件、1個(gè)熱響應(yīng)元件和1個(gè)晝夜節(jié)律調(diào)控元件，還有與葉部柵欄組織發(fā)育相關(guān)的元件有2個(gè)、還有未知功能的元件3個(gè)。
在T5與T6的差異序列中，存在與根部特異表達(dá)相關(guān)的元件，存在響應(yīng)鹽脅迫的元件，后者可以使報(bào)告基因在鹽脅迫的條件下在植株根尖部位的表達(dá)顯著上調(diào)。對(duì)這段差異序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)存在4個(gè)預(yù)測(cè)的作用元件，分別為光誘導(dǎo)響應(yīng)元件G-box、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGCTA-box、與植物防衛(wèi)以及脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件TC-richr印eats以及蛋白結(jié)合位點(diǎn)Box III。將這段序列(130 bp)與擬南芥中AVP1的啟動(dòng)子片段進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這兩段啟動(dòng)子片段具有較高的相似性，但存在著序列差異。
經(jīng)濟(jì)植物的遺傳轉(zhuǎn)化
采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因植物。常用的轉(zhuǎn)化方法有通過花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥、茄科植物葉盤遺傳轉(zhuǎn)化法、禾谷類作物愈傷組織轉(zhuǎn)化法及幼胚感染法、叢生芽塊轉(zhuǎn)化法、無菌苗生長(zhǎng)點(diǎn)轉(zhuǎn)化法等。通常采用PCR方法和分子雜交方法檢測(cè)轉(zhuǎn)化植株，獲得陽性轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行后續(xù)分析。以下以煙草葉盤遺傳轉(zhuǎn)化和玉米自交系無菌苗莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)轉(zhuǎn)化法為例予以說明。
A .煙草葉盤遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的分析
取煙草無菌苗為材料，利用葉盤法迸行轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌菌株為L(zhǎng)BA4404，攜帯含有^as基因和植物篩選標(biāo)記基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因nptll的Mini-Ti質(zhì)?；蛑参锟鼓嫦嚓P(guān)基因6eM (編碼來自大腸桿菌的膽堿脫氫酶，催化由膽堿合成甘氨酸甜菜堿)和除草劑抗性基因，g"s基因和抗逆相關(guān)基因分別由TsVPl啟動(dòng)子或其缺失突變體片段啟動(dòng)。采用常規(guī)轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因小芽在含有選擇劑卡那霉素(Kan) 150 pg/ml的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上篩選，在生根培養(yǎng)基上生根。采用PCR和Southern雜交分析法確定轉(zhuǎn)基因植株。通過PCR方法檢測(cè)出分別含g^基因或耐鹽相關(guān)基因的陽性植株，以不含目的基因的空載體轉(zhuǎn)化植株為對(duì)照。Northern雜交表明轉(zhuǎn)基因在煙草中有很高的表達(dá)水平，而
未轉(zhuǎn)基因植株和不含目的基因的空載體轉(zhuǎn)化植株不出現(xiàn)雜交信號(hào)。轉(zhuǎn)基因煙草植株的分析
為了確定轉(zhuǎn)基因的表達(dá)特異性和表達(dá)強(qiáng)度，對(duì)于轉(zhuǎn)gi/s基因的煙草小苗，檢測(cè)根、葉片和葉柄的GUS酶活性。在正常生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因煙草根系的GUS酶活性在轉(zhuǎn)TsVPl啟動(dòng)子和T5片段的植株之間差異不顯著，而葉片和葉柄的GUS酶活性則是轉(zhuǎn)TsVPl啟動(dòng)子植株的顯著高于轉(zhuǎn)T5片段植株的。用250 mM NaCl溶液浸泡轉(zhuǎn)基因煙草小苗根系24小時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株根系、葉片和葉柄的GUS酶活性均大幅度升高。與轉(zhuǎn)TsVPl啟動(dòng)子的植株相比較，轉(zhuǎn)T5片段植株的根系GUS酶活性無明顯差異，而葉片和葉柄的GUS酶活性升高幅度相對(duì)較小。即在轉(zhuǎn)基因煙草中TsVPl啟動(dòng)子和T5啟動(dòng)子均具有鹽誘導(dǎo)特性，但T5啟動(dòng)子有較強(qiáng)的根特異性。
將轉(zhuǎn)^t/l基因和對(duì)照植株(空載體轉(zhuǎn)化煙草和未轉(zhuǎn)基因植株)的葉片切成0.5cm2的葉盤，分別在含1.0%、 1.5%、 2.0。/。和2.5。/。NaCl的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，并測(cè)定其相對(duì)生長(zhǎng)量。在含有1.0y。NaCl的培養(yǎng)基上，各種葉盤生長(zhǎng)旺盛，產(chǎn)生愈傷組織繼而分化成芽，彼此之間的相對(duì)生長(zhǎng)量沒有顯著差別。在加有1. 5% NaCl的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)TsVPl啟動(dòng)子和T5啟動(dòng)子的煙草葉盤呈綠色，邊緣有愈傷組織生成。在加有2.(F。NaCl的培養(yǎng)基上，各種葉盤間的生長(zhǎng)狀況差異明顯，來自對(duì)照植株的葉盤約半數(shù)死亡，其余生長(zhǎng)較差；轉(zhuǎn)T5啟動(dòng)子的葉盤依然存活，生長(zhǎng)較好；轉(zhuǎn)TsVPl啟動(dòng)子的葉盤相對(duì)生長(zhǎng)量明顯高于來自轉(zhuǎn)T5啟動(dòng)子的，遠(yuǎn)高于對(duì)照植株葉盤的相對(duì)生長(zhǎng)量。即通過檢測(cè)轉(zhuǎn)6e"基因煙草葉盤的鹽耐受性發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)TsVPl啟動(dòng)子的煙草與對(duì)照植株相比，其耐鹽性及耐旱性明顯提高，而轉(zhuǎn)T5啟動(dòng)子的煙草與對(duì)照植株相比耐鹽性及耐旱性提高幅度不如轉(zhuǎn)T5啟動(dòng)子的。用不含目的基因的空載體轉(zhuǎn)化煙草未影響再生植株的生理指標(biāo)，所以轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性及耐旱性的改變是由于轉(zhuǎn)基因6e"的表達(dá)促成，轉(zhuǎn)T5啟動(dòng)子的煙草葉盤耐鹽性提高幅度較小與其啟動(dòng)的Ae"在葉片中表達(dá)強(qiáng)度較低相對(duì)應(yīng)。
為了解由不同啟動(dòng)子啟動(dòng)的6e"基因?qū)D(zhuǎn)基因煙草植株耐旱性影響的差異，將轉(zhuǎn)基因煙草小苗置于含10% (W/V) PEG 6000的MS無機(jī)鹽溶液中進(jìn)行滲透脅迫處理，檢測(cè)葉片相對(duì)含水量的變化。在滲透脅迫過程中，煙草葉片相對(duì)含水量逐漸降低，轉(zhuǎn)TsVPl啟動(dòng)子植株相對(duì)含水量降低速率顯著低于對(duì)照植株的，18 h后葉片相對(duì)含水量從滲透脅迫處理前的94%-99%降低為62%-66%，轉(zhuǎn)T5啟動(dòng)子的葉片相對(duì)含水量從96%-98%降低為64%-65%，而未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓耆~片的相對(duì)含水量從94%-98%降低到54%-60%。這說明不同啟動(dòng)子啟動(dòng)的6e"基因在煙草葉片中的表達(dá)強(qiáng)度有差異，但啟動(dòng)子之間的差異達(dá)不到顯著程度。
B.玉米自交系遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的分析
套袋獲取玉米骨干自交系或雜交種種子，用70%乙醇浸泡10分鐘，再用0.1%氯化汞浸泡10-12分鐘，然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷晃動(dòng)種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子放在無菌三角瓶?jī)?nèi)萌發(fā)，瓶?jī)?nèi)放入少量無菌水(30-40 mL水/250mL三角瓶)，封口后放在黑暗條件(23-3(TC)下l-2天。待種子萌動(dòng)(露白)后，將其放在改良MS培養(yǎng)基上，在黑暗條件下繼續(xù)萌發(fā)。待胚芽伸長(zhǎng)至3-5厘米時(shí)，剝離胚芽鞘及2-3片幼葉，露出莖尖生長(zhǎng)錐。
將帶有雙元載體(Mini-Ti質(zhì)?；驇в蠺sVPl啟動(dòng)子一6et4和除草劑綠黃隆抗性基因ah或T5啟動(dòng)子一^M和a7s， Ws基因來自抗綠黃隆的擬南芥植株并進(jìn)過修飾，李國(guó)圣等，2000， <〈科學(xué)通報(bào)》，45: 2181-2184)的根瘤農(nóng)桿菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP培養(yǎng)基中28°C震蕩培養(yǎng)，使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。然后在3000 r/min下離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2改良MS液體培養(yǎng)基洗滌，離心收集。再將菌體用添加100 mg/1乙酰丁香酮的1/2 MS改良液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋5-20倍用于轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化時(shí)首先將菌液倒在培養(yǎng)皿中，傾斜培養(yǎng)皿，將露出莖尖生長(zhǎng)錐的玉米無菌苗頂端減壓浸泡在菌液中4-8分鐘(AGL1 6分鐘，LBA4404 8分鐘)。然后將浸染后的芽尖用無 菌濾紙吸干，將根部插入改良MS培養(yǎng)基中于黑暗中培養(yǎng)2-3天，培養(yǎng)溫度為22-24 °C， 然后將無菌苗放在散射光下培養(yǎng)2天，再將照光培養(yǎng)后的無菌苗移栽到鋪有上層蛭石和 下層壤土的花盆中，蛭石覆蓋植株頂部。然后讓植株在自然光照下生長(zhǎng)，日溫22-28 °C， 夜溫18-23 。C，隔天澆灌1/2改良MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽。
轉(zhuǎn)化植株長(zhǎng)出3片葉后，噴灑20—30 mg/l綠黃隆(用量因自交系抗性而變化，沈 陽農(nóng)藥廠生產(chǎn)，有效成分25%)水溶液，以未轉(zhuǎn)化植株為對(duì)照。噴灑量以植株掉液滴為 宜。對(duì)照植株在噴灑后3天停止生長(zhǎng)，12天左右開始死亡。轉(zhuǎn)化處理后的植株， 一些個(gè) 體的變化與對(duì)照植株相似，另一些個(gè)體則持續(xù)生長(zhǎng)，無明顯變化。存活植株長(zhǎng)到5葉期， 將其定植到田間?？钩輨┲仓晟L(zhǎng)到7-8葉時(shí)，取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測(cè) 外源基因，對(duì)PCR陽性植株套袋自交或姊妹交結(jié)實(shí)。
轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生的種子播種在大田或溫室，植株長(zhǎng)到4-6葉期時(shí)取葉片提取DNA，采 用PCR技術(shù)檢測(cè)是否帶有外源基因，對(duì)PCR陽性植株進(jìn)行Southern blotting檢測(cè)和 RT-PCR檢測(cè)，從中選出轉(zhuǎn)基因植株。同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行套袋自交留種，分析下一代 中轉(zhuǎn)基因個(gè)體的比例，選出轉(zhuǎn)基因純合系進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)分析和植株抗性檢測(cè)。
轉(zhuǎn)基因玉米植株的分析及利用
釆為了解轉(zhuǎn)基因的表達(dá)特異性和表達(dá)強(qiáng)度，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法分別檢測(cè)玉 米轉(zhuǎn)基因小苗根和葉片器官中^"基因的表達(dá)強(qiáng)度。由于來自同一轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)的不同轉(zhuǎn) 基因株系^M基因的表達(dá)強(qiáng)度差異大，因此，從10個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化體的后代株系中，剔除 2個(gè)表達(dá)量偏高和2個(gè)表達(dá)量偏低株系的測(cè)定值，取其它6個(gè)株系的測(cè)定值的平均數(shù)來 表示轉(zhuǎn)基因表達(dá)強(qiáng)度。在正常生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因玉米根系的6e"基因的轉(zhuǎn)錄豐度在 轉(zhuǎn)TsVPl啟動(dòng)子和T5啟動(dòng)子的株系之間差異不顯著；而在葉片中，轉(zhuǎn)TsVPl啟動(dòng)子的 顯著高于轉(zhuǎn)T5啟動(dòng)子的。用250mM NaCl溶液浸泡轉(zhuǎn)基因玉米小苗根系24小時(shí)，轉(zhuǎn)基 因植株根系和葉片的/^M基因的轉(zhuǎn)錄豐度均大幅度升高。與轉(zhuǎn)TsVPl啟動(dòng)子的植株相 比較，轉(zhuǎn)T5啟動(dòng)子植株的根系6eM基因的轉(zhuǎn)錄豐度無明顯變化，而葉片te"基因的 轉(zhuǎn)錄豐度升高幅度也相對(duì)較小。即在轉(zhuǎn)基因玉米中TsVPl啟動(dòng)子和T5啟動(dòng)子均表現(xiàn)鹽 脅迫誘導(dǎo)特性，但T5啟動(dòng)子具有較強(qiáng)的根特異性。
轉(zhuǎn)6e"基因的種子播種在砂盆中，澆灌0. 8% NaCl水溶液，以未轉(zhuǎn)基因自交系為 對(duì)照。轉(zhuǎn)基因植株的不同株系在鹽水澆灌下表現(xiàn)出不同的耐鹽性，多數(shù)轉(zhuǎn)TsVPl啟動(dòng)子 的株系表現(xiàn)出比對(duì)照顯著提高的耐鹽性，半數(shù)以上株系的5葉期成活率在70%以上，而 對(duì)照自交系出苗后很快死亡，5葉期成活率不到20%，且植株嚴(yán)重受害。轉(zhuǎn)T5啟動(dòng)子的 株系也表現(xiàn)出比對(duì)照明顯提高的耐鹽性，耐鹽性與轉(zhuǎn)TsVPl啟動(dòng)子的差異不明顯。選出 耐鹽性優(yōu)異的轉(zhuǎn)基因植株套袋自交純合，并進(jìn)行配合力測(cè)定，挑選出配合力與供體自交 系相同或有提高的轉(zhuǎn)基因自交系用于耐鹽玉米雜交種培育。
將轉(zhuǎn)6et4基因的玉米種子和未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照自交系種子播在花盆中，分別在苗期 (3-7葉期)、雌雄穗發(fā)育期(9-13葉期)、開花授粉期進(jìn)行干旱脅迫處理，檢測(cè)干旱處 理對(duì)玉米生長(zhǎng)發(fā)育的影響、細(xì)胞膜受損程度、單株產(chǎn)量及其它經(jīng)濟(jì)性狀和生理指標(biāo)的差 異等。綜合多方面的測(cè)試結(jié)果，轉(zhuǎn)TsVPl啟動(dòng)子和T5啟動(dòng)子的玉米分別比對(duì)照植株表 現(xiàn)出明顯提高的耐旱性，且不因啟動(dòng)子不同而有明顯差異。選出耐旱性優(yōu)異的轉(zhuǎn)基因植株套袋自交純合，并進(jìn)行配合力測(cè)定，選擇配合力與供體自交系相同或有提高的轉(zhuǎn)基因 自交系用于玉米單交種選育。 本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明公開了鹽芥編碼液泡膜焦磷酸酶基因7SPT7啟動(dòng)子序列和其不同區(qū)段的功 能元件，構(gòu)建了系列缺失突變體，通過檢測(cè)由它們分別啟動(dòng)的^AS基因在擬南芥中的表 達(dá)，初步確定了它們的應(yīng)用價(jià)值。進(jìn)而在轉(zhuǎn)基因煙草和玉米植株中進(jìn)行驗(yàn)證，，確定了 7SKP7啟動(dòng)子和T5啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因煙草和玉米中能正常行使功能，是鹽脅迫誘導(dǎo)型的 強(qiáng)啟動(dòng)子。該發(fā)明的價(jià)值在于
1) 為植物抗逆育種提供鹽脅迫誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動(dòng)子7ifT/和T5啟動(dòng)子。在植物轉(zhuǎn)基因 抗逆育種中，目前缺少這類脅迫誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子。
2) T5啟動(dòng)子啟動(dòng)的基因表達(dá)不僅強(qiáng)度高，而且表達(dá)強(qiáng)度因器官不同而異，根中高 強(qiáng)度表達(dá)，這對(duì)于啟動(dòng)植物抗逆相關(guān)基因的表達(dá)有重要意義。另外，由于序列短，便于 基因重組和植物多基因遺傳轉(zhuǎn)化。
3) 在7>fT/啟動(dòng)子區(qū)域鑒定出一系列轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，并通過成套缺失突變體的構(gòu) 建和轉(zhuǎn)基因植株的分析，初步確定了一些元件在啟動(dòng)基因表達(dá)中的左右，為7JF尸/啟動(dòng) 子和T5啟動(dòng)子改造打下了基礎(chǔ)。


圖1: 757尸/啟動(dòng)子序列及順式元件分析；
圖2:不同的TsVP7基因啟動(dòng)子片段與報(bào)告基因連接示意圖
(+1代表該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))； 圖3: Tl—^^基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株根和葉中的表達(dá)強(qiáng)度要高于其他器官；
圖4:在0.2 M NaCI處理?xiàng)l件下TsW"啟動(dòng)子啟動(dòng)的GUS酶活性擬南芥各組織 中的變化。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:轉(zhuǎn)TsVPl啟動(dòng)子啟動(dòng)的2fePZ5基因創(chuàng)造玉米耐旱自交系及應(yīng)用
1) 構(gòu)建7JKP/啟動(dòng)子與Z歷/Y5的融合基因
采用常規(guī)的基因重組方法將7SKP7啟動(dòng)子與Z/^Z5"相連，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后重組到植物 表達(dá)載體pCUA質(zhì)粒的T-DNA區(qū)。pCUA質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，攜帶植物選擇標(biāo)記基因ah。 然后采用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404或AGL0中。
2) 受體系統(tǒng)的建立 以我國(guó)生產(chǎn)上所用的玉米骨干自交系為材料，如鄭58、掖 478、掖515等，取自交種子滅菌，離體培養(yǎng)誘導(dǎo)莖尖產(chǎn)生叢生芽塊，以叢生芽塊為受 體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。所用培養(yǎng)基有
種子萌發(fā)培養(yǎng)基KN03 1 900 mg/l， NH4N03 1650 mg/l， CaCl2 2 H20 440 mg/l， MgS04 7H20 370 mg/l， KH2P04 H20 170 mg/l， FeS04 7H20 27. 8 mg/l， ZnS04 7H20 10 mg/l， MnS04 4H20 22 . 3 mg/l， H3B03 10 mg/l， KI 0. 83 mg/l， Na2Mo04 2 H20 0. 5 mg/1 ， CuS04 5H20 0 . 025 mg/1 ， CoCl2 6H20 0. 025 mg/1 ，鹽酸硫胺素10. 0 mg/1 ， 鹽酸吡哆醇1.0 mg/l， 煙酸1.0 mg/l，甘氨酸2.0 mg/l，肌醇100.0 mg/l，生物素 0.05 mg/l，酪蛋白水解物500 mg/1,蔗糖30 g/l，瓊脂粉7 g/l， pH 5.8-6.0。用于 種子萌發(fā)。液體培養(yǎng)基則去掉瓊脂粉。A培養(yǎng)基種子萌發(fā)培養(yǎng)基附加6-BA 4. 5-9. 0 ,1/1和2， 4一D 1. 0-3. 0 ,1/1， 用于誘導(dǎo)離體培養(yǎng)芽尖產(chǎn)生叢生芽組織塊和叢生芽組織塊繼代培養(yǎng)。
B培養(yǎng)基種子萌發(fā)培養(yǎng)基附加6-BA 4. 5 |imol/l和IBA (吲哚丁酸)1. 8 ,ol/l， 用于叢生芽組織塊分化小苗。
成苗培養(yǎng)基種子萌發(fā)培養(yǎng)基附加6-BA 2.25 lamol/l和IBA 3.6 |amol/l，用于叢 生小芽發(fā)育成小苗。
生根培養(yǎng)基種子萌發(fā)培養(yǎng)基附加IBA 2.8-3.6 )Ltmo1/1，用于無根小苗生根。 基本培養(yǎng)基及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)熱壓滅菌；抗生素和除草劑等活性成分過濾滅菌，
在培養(yǎng)基滅菌后加入。
種子滅菌和萌發(fā)..玉米種子用70%乙醇浸泡10分鐘，再用0. 1%氯化汞浸泡10-15 分鐘，然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌后種子放在無菌三角瓶?jī)?nèi)萌發(fā)，瓶?jī)?nèi)放入少量 (30-40 mL/250 mL三角瓶)無菌水，封口后放在黑暗條件(23-30°C)下1—2天。萌 動(dòng)(露白)后種子放在基本培養(yǎng)基上于黑暗條件下繼續(xù)萌發(fā)。
莖尖培養(yǎng)和叢生芽組織塊誘導(dǎo)、繼代、分化萌發(fā)種子的胚芽伸長(zhǎng)止3-5厘米時(shí)， 剝離胚芽鞘及幼葉，切取長(zhǎng)約5毫米左右的上胚軸及莖尖，接種到A培養(yǎng)基上于黑暗下 (24-27°C)培養(yǎng)，并及時(shí)切去伸長(zhǎng)的胚軸和剝?nèi)ビ兹~。培養(yǎng)6-10天后，莖尖開始不規(guī) 則膨大生長(zhǎng)，在膨大的分生組織上出現(xiàn)數(shù)個(gè)瘤狀或指狀突起。20天后，在瘤狀或指狀突 起的表面開始形成不定芽及胚狀體。 一般每4周繼代培養(yǎng)一次。在繼代培養(yǎng)中，若叢生 芽組織塊叢生小芽偏多，2,4-D濃度取3.0 |nm0l/l;若叢生芽組織塊愈傷組織化較重， 雖有大量的分生細(xì)胞團(tuán)，但表面很少出現(xiàn)不定芽，可將2， 4-D濃度降為l.O pmo1/1， 繼續(xù)培養(yǎng)則重新產(chǎn)生大量瘤狀或指狀突起。A培養(yǎng)基上的叢生芽組織塊，少數(shù)有不定根 的產(chǎn)生。與幼葉存在一樣，不定根也影響組織塊的膨大生長(zhǎng)及胚狀體和叢生小芽的產(chǎn)生， 需要及早去掉。叢生芽組織塊在轉(zhuǎn)移到B培養(yǎng)基上2-3天后，色澤逐漸變黃，質(zhì)地較柔 韌，5-6天后表面出現(xiàn)微小突起。掃描電鏡下觀察可見各期胚狀體及不定芽。胚狀體及 不定芽迅速發(fā)育，在組織塊表面形成叢生小芽。
3)以叢生芽組織塊為受體的轉(zhuǎn)化和植株再生
將帶有雙元載體(Mini-Ti質(zhì)粒帶有選擇劑抗性基因和7iW>7啟動(dòng)子一Z/^/S基因) 的根瘤農(nóng)桿菌(如AGL0和LBA4404)在附加抗生素的LB培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含胰化 蛋白胨10 g，酵母提取物5 g， NaCl 10 g， pH 7.0，熱壓滅菌)中28 'C下震蕩培養(yǎng)， 震蕩速率為110 rpm (轉(zhuǎn)/分)，使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。然后在3000 rpm下離心10分 鐘，棄上清液。菌體用1/2濃度的液體種子萌發(fā)培養(yǎng)基(即種子萌發(fā)培養(yǎng)基成分減半， 去掉瓊脂粉)洗滌，再離心收集。再將菌體用添加乙酰丁香酮(acetosyringone, As) 100 的1/2濃度的液體叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮，稀釋5—20倍用于轉(zhuǎn)化。
取繼代后培養(yǎng)13-20天的叢生芽組織塊為轉(zhuǎn)基因受體。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化， 轉(zhuǎn)化后材料在暗中進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。農(nóng)桿菌感染的叢生小芽或叢生芽組織塊在加有頭孢霉 素(Cefotaxime ) 250 mg/1或羧節(jié)青霉素(Carb) 500 mg/1的培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng) 7-12天，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)?；謴?fù)培養(yǎng)后或抑菌培養(yǎng)后的叢生小芽或叢生芽組織塊在加有選 擇劑的培養(yǎng)基上連續(xù)篩選3-4代，獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及小芽。在篩選培養(yǎng)中絕大數(shù)叢生芽 組織塊逐漸死亡。將存活的組織塊轉(zhuǎn)移到無選擇劑的去掉2， 4-D的A培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)后產(chǎn)生小芽。
將小芽放在成苗培養(yǎng)基上照光下生長(zhǎng)，光強(qiáng)2000-3000 1x，光照14-15小吋/天。 小苗長(zhǎng)到3-4片葉時(shí)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根。培養(yǎng)15天左右，約40%的小苗產(chǎn)生新根。 對(duì)于未生根苗，切傷其基部，轉(zhuǎn)移到新的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，io天后大多數(shù)植株產(chǎn)生根 系。生根苗洗去培養(yǎng)基后，移栽到以蛭石為栽培介質(zhì)的花盆中生長(zhǎng)。植株在自然光照下 生長(zhǎng)，日溫22-28'C，夜溫15-2rC，隔天澆灌1/2濃度的種子萌發(fā)培養(yǎng)基的無^l鹽成 分。生長(zhǎng)2周左右，移植苗產(chǎn)生發(fā)達(dá)根系，然后定植于田間。
4)轉(zhuǎn)基因植株的抗性檢測(cè)和選擇利用
取移栽成活植株的葉片進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)確定轉(zhuǎn)基因植株。將轉(zhuǎn)基因植株套袋自 交結(jié)實(shí)。取種子播種在砂盆中，用0. 7%NaCl水溶液進(jìn)行連續(xù)澆灌30天，將存活小苗移 栽到大田，待植株長(zhǎng)大后套袋自交結(jié)實(shí)。對(duì)其下一代繼續(xù)進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和耐鹽性 檢測(cè)，并套袋自交純合，獲得了耐鹽自交系。
實(shí)施例2:轉(zhuǎn)T5-Z歷尸/S基因創(chuàng)造小麥優(yōu)良抗旱育種材料
1) 構(gòu)建T5啟動(dòng)子與Z歷P/5"的融合基因
采用常規(guī)的基因重組方法將T5啟動(dòng)子與Z邁尸i"5相連，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后重組到植物表 達(dá)載體pCUA—6ar質(zhì)粒的T-DNA區(qū)。pCUA—6ar質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，攜帶植物選擇標(biāo) 記基因6ar，然后采用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404或AGL0中。
2) 小麥無菌苗獲得
小麥優(yōu)良品種的種子，用70%乙醇浸泡1-3分鐘，再用O. 1%氯化汞浸泡8-12分鐘， 然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷晃動(dòng)種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子 放在無菌三角瓶?jī)?nèi)萌發(fā)，瓶?jī)?nèi)放入少量無菌水于黑暗條件(20-25°C)下1-2天。待種 子萌動(dòng)(露白)后，將其放在改良MS培養(yǎng)基上于黑暗條件下萌發(fā)。待胚芽伸長(zhǎng)止3-4 厘米時(shí)，剝離胚芽鞘及2-3片幼葉，露出莖尖頂端生長(zhǎng)錐。
3) 農(nóng)桿菌培養(yǎng)及活化
將帶有雙元載體(Mini-Ti質(zhì)粒帶有除草劑抗性基因&r和Z歷/Y5"基因)的根瘤農(nóng) 桿菌LBA4404在附加抗生素的LB培養(yǎng)基中28'C下震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為110 r/min， 使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。然后在3000 r/min下離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2 MS 液體培養(yǎng)基洗滌，離心收集。再將菌體用添加100 mg/1乙酰丁香酮的1/2 MS液體培養(yǎng) 基懸浮，稀釋5-20倍用于轉(zhuǎn)化。
4) 小麥無菌苗轉(zhuǎn)化
(1) 將菌液倒在4.5厘米直徑的培養(yǎng)皿中，傾斜培養(yǎng)皿，使露出莖尖生長(zhǎng)錐的無 菌苗浸泡在菌液中，在0. 5X 105 Pa大氣壓下處理3-6分鐘。
(2) 浸染后的芽尖用無菌濾紙吸干，萌發(fā)種子放在附加200 rag/1谷氨酰胺的改良 MS培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng)2-3天，培養(yǎng)溫度為22-24°C 。然后將無菌苗放在散射光下培 養(yǎng)2天。
(3) 將照光培養(yǎng)后的無菌苗移栽到鋪有上層蛭石下層壤土的花盆中，并用蛭石覆 蓋植株頂部。然后讓植株在自然光照下生長(zhǎng)，日溫22-28°C，夜溫15-21°C，隔天澆灌 1/2改良MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽。5) 轉(zhuǎn)化植株篩選與定植
轉(zhuǎn)化植株長(zhǎng)出3片葉后，噴灑除草劑Finale8 (Hoechst Schering AgrEvo GmbH，含 有除草劑glufosinate ammonium)水溶液，濃度為9. 6 ral-10. 8 ml Finale7L，以植株 掉液滴為宜。未轉(zhuǎn)化對(duì)照植株在噴灑后5天后停止生長(zhǎng)，15天左右死亡。轉(zhuǎn)化植株在噴 灑后， 一些個(gè)體變化同對(duì)照植株相似，另一些個(gè)體持續(xù)生長(zhǎng)，變化不明顯。待存活植株 長(zhǎng)到7-8葉時(shí)，將其定植到田間，并促進(jìn)分蘗。
6) 轉(zhuǎn)化植株的分子檢測(cè)
抗除草劑植株經(jīng)春化處理后,在起身-拔節(jié)期取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn) 化植株。PCR陽性植株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),在獲得的抗除草劑植株中，約15%左右為轉(zhuǎn)基 因個(gè)體。
6.轉(zhuǎn)基因植株子代分析
通過春化階段(低溫處理?xiàng)l件因品種而異)的植株在長(zhǎng)日照下起身、拔節(jié)、開花結(jié) 實(shí)。轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生的種子，在浸水萌動(dòng)后放冰箱(0 2°0中進(jìn)行春化處理30-65天。 部分春化處理后的種子用10.8 ml Finale7L水溶液處理，觀察統(tǒng)計(jì)抗性和敏感性個(gè)體 比例；另一部分春化處理后的種子播種在大田和砂盆，分別進(jìn)行干旱脅迫處理和高鹽脅 迫處理，篩選耐旱和/或耐鹽轉(zhuǎn)基因植株。提取抗逆植株的葉片DNA，采用PCR技術(shù)檢測(cè) 外源基因，并統(tǒng)計(jì)外源基因在子代植株中的分離比例，獲得純系后用于小麥育種或直接 進(jìn)入安全性實(shí)驗(yàn)和區(qū)域?qū)嶒?yàn)。
實(shí)施例3、轉(zhuǎn)T5啟動(dòng)子啟動(dòng)的6e"基因創(chuàng)造棉花優(yōu)良抗逆育種材料
1) T5啟動(dòng)子與6eM基因的融合基因及質(zhì)粒構(gòu)建和農(nóng)桿菌培養(yǎng) 采用常規(guī)的基因重組方法將T5啟動(dòng)子與^M基因相連，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后重組到植物
表達(dá)載體pCUA質(zhì)粒的T-DNA區(qū)。pCUA質(zhì)粒攜帶植物選擇標(biāo)記基因sh，然后采用凍融 法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404或AGL0中。農(nóng)桿菌培養(yǎng)及活化同實(shí)例2。
2) 棉花無菌苗獲得
取棉花自交系或優(yōu)良品種的種子，用濃硫酸脫去表面絨毛，用70%乙醇浸泡1分鐘， 再用O. 1%氯化汞浸泡10-12分鐘，然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷晃動(dòng)種子， 以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子放在無菌三角瓶?jī)?nèi)萌發(fā)，瓶?jī)?nèi)放入少量無菌水(30-40 毫升水/250毫升三角瓶)，封口后放在黑暗條件(23-3(TC)下1-2天。待種子萌動(dòng)(露 白)后，將其放在銨鹽減半的改良MS培養(yǎng)基上于黑暗條件下萌發(fā)。待胚軸伸長(zhǎng)至3 5 厘米時(shí)，剝?nèi)ヒ黄尤~，露出莖端生長(zhǎng)錐。
3) 棉花無菌苗轉(zhuǎn)化
(1) 將菌液涂到用解刨針刺傷的莖尖生長(zhǎng)錐上，并用農(nóng)桿菌浸濕的棉花球覆蓋在 其上，然后在黑暗中培養(yǎng)2-3天，培養(yǎng)溫度為24-26'C。再將無菌苗放在散射光下培養(yǎng) 2天。
(2) 將照光培養(yǎng)后的無菌苗移栽到上層蛭石下層壤土的花盆中，讓植株在自然光 照下生長(zhǎng)，日溫22-28°C，夜溫18-23t:，隔天澆灌1/2改良MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽。
4) 轉(zhuǎn)化植株篩選與定植
轉(zhuǎn)化植株長(zhǎng)出3片葉后，噴灑8mg/l綠黃隆(沈陽農(nóng)藥廠生產(chǎn)，有效成分25%)水溶液，以植株掉液滴為宜。未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植株在噴灑后3天停止生長(zhǎng)，12天左右開始死 亡。轉(zhuǎn)化植株在噴灑后， 一些個(gè)體變化同對(duì)照植株相似，另一些個(gè)體有很強(qiáng)抗性，持續(xù) 生長(zhǎng)。存活植株長(zhǎng)到5葉期時(shí)，將其定植到田間。
5) 抗除草劑植株的分子生物學(xué)鑒定
抗除草劑植株長(zhǎng)到7-8葉時(shí)，取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測(cè)外源基因。PCR 陽性植株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。在獲得的抗除草劑植株中，10%以上的植株為轉(zhuǎn)基因個(gè)體。
6) 轉(zhuǎn)基因植株子代的分子生物學(xué)鑒定
轉(zhuǎn)基因植株開花后自交或姊妹交結(jié)實(shí)。種子播種在大田或溫室，在植株4-6葉期取 葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測(cè)子代植株是否帶有外源基因，并統(tǒng)計(jì)外源基因在子代 分離比例，結(jié)果表明，在20%左右的轉(zhuǎn)基因株系中，外源基因在子代植株中的分離比例 符合孟德爾定律。
7) 轉(zhuǎn)基因植株的抗性鑒定和利用
取純合的轉(zhuǎn)基因植株的種子,播種在花盆中，植物2葉期時(shí)進(jìn)行低溫處理，通過存活 率統(tǒng)計(jì)和生理指標(biāo)測(cè)定，篩選出耐冷株系，用于生產(chǎn)。進(jìn)行砂盆中，用0.7%NaCl水溶液 進(jìn)行連續(xù)澆灌30天，將存活小苗移栽到大田，待植株長(zhǎng)大后套袋自交結(jié)實(shí)。對(duì)其下一代 繼續(xù)進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和耐鹽性檢測(cè)，并套袋自交純合，獲得了耐鹽自交系。該自交 系可用于配制玉米耐鹽雜交種。
實(shí)施例4、轉(zhuǎn)T5啟動(dòng)子啟動(dòng)的Z^"基因創(chuàng)造大豆耐旱育種材料
1) T5啟動(dòng)子與6e"基因的融合基因及質(zhì)粒構(gòu)建和農(nóng)桿菌培養(yǎng)
同實(shí)例3。但離心收集的農(nóng)桿菌菌體用添加100 mg/1乙酰丁香酮的1/2改良B5液 體培養(yǎng)基懸浮，稀釋5-IO倍用于轉(zhuǎn)化。
2) 大豆無菌苗獲得和遺傳轉(zhuǎn)化
取優(yōu)良品種的種子，用70%乙醇浸泡2-3分鐘，用0. 1%氯化汞浸泡10-12分鐘，然 后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷晃動(dòng)種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子放 在無菌三角瓶?jī)?nèi)萌發(fā)，瓶?jī)?nèi)放入少量無菌水(50-60 mL水/250 mL三角瓶)，封口后放 在黑暗條件(23-3(TC)下2-3天。待種子萌動(dòng)(露白)后，將其放在改良B5培養(yǎng)基上 于黑暗條件下萌發(fā)。待胚軸長(zhǎng)至3-5厘米時(shí)，剝?nèi)ヒ黄尤~并露出莖端生長(zhǎng)錐。
轉(zhuǎn)化步驟為
(1) 將菌液倒在4.5厘米直徑的培養(yǎng)皿中，傾斜培養(yǎng)皿，使露出莖尖生長(zhǎng)錐的無 菌苗頂端浸泡在菌液中，在0. 5X 105 Pa大氣壓下處理3-6分鐘。
(2) 浸染后的苗頂用無菌濾紙吸干，把小苗根端插入改良B5培養(yǎng)基上于黑暗中培 養(yǎng)3-4天，培養(yǎng)溫度為22-24°C。
(3) 將無菌苗移栽到鋪有上層蛭石下層壤土的花盆中，頂部覆蓋蛭石，自然光照 下生長(zhǎng)，日溫23-28。C，夜溫20-25°C，隔天澆灌1/2改良B5培養(yǎng)基無機(jī)鹽。
3) 轉(zhuǎn)化植株篩選與定植
轉(zhuǎn)化植株在長(zhǎng)日照(13-14小時(shí)/天)下生長(zhǎng)，長(zhǎng)出3片葉后，噴灑1.5-2.0呢/1 (因基因型而不同)綠黃隆(沈陽農(nóng)藥廠生產(chǎn)，有效成分25%)水溶液，以植株掉液滴 為宜，未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植株在噴灑后4天停止生長(zhǎng)，15天左右開始死亡。轉(zhuǎn)化植株在噴灑后， 一些個(gè)體的變化與對(duì)照植株相似，另一些個(gè)體持續(xù)生長(zhǎng)，變化不明顯。存活植株長(zhǎng) 到5葉期，將其定植到田間。
抗除草劑植株生長(zhǎng)到7-8葉時(shí)，取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測(cè)外源基因。PCR 陽性植株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。在獲得的抗除草劑PCR陽性植株中，約20%的植株為轉(zhuǎn)基因 個(gè)體。
4)轉(zhuǎn)基因植株后代的分子生物學(xué)鑒定和抗逆性測(cè)定及利用
將轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生的種子，播種在大田或溫室。植株(Tl代)3-4葉期時(shí)取葉片提 取DNA，采用PCR技術(shù)檢測(cè)外源基因，并進(jìn)行Southern blotting驗(yàn)證，同時(shí)統(tǒng)計(jì)外源 基因在子代植株中的分離比例。獲得轉(zhuǎn)基因純合系后進(jìn)行抗逆性測(cè)定，篩選抗逆株系。序列表
<110〉山東大學(xué)
〈120〉鹽芥V-焦磷酸酶基因啟動(dòng)子序列和其缺失突變體的應(yīng)用
〈141〉2009-9-1
<160〉3
〈210>1
<211>19
〈212〉DNA
〈213〉PTsVP-Pl
〈400〉1
gtggcgtcgg cgUtcttc 19
〈210>2
〈211〉19
<212>醒
〈213〉PTsVP-P2
<400>2
cttggcgacg acactctgc 19
<210〉3
〈211〉2203
〈212>DNA
〈213〉7^T7啟動(dòng)子序列 <400>3
肪gatttgct acctcccatt acgcca肪aa taa_ttttaEia aaatcatcta gatattatac 60
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3t3CC3tt3Cctcg犯tat3ccatggataagC3t33g3ttcacctaatta1680
att犯tttccaccagtgagatttctacacgtagacaattg1740
￡lCt￡LCg￡ia/tCELetaaageLgcgctaatcgtgtacctgacagtcggacggacacaagcgcatg1800
gatgcacscgtagUggtgtctcttaccct犯aatcgacggtga聊tggacacgsgcgt1860
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tttggagcgtcggctgcacgcgctttct朋g犯3Cg3ggg1980
gtgtagcgta3卿3Cggtgt犯ctaaccgtaccagattccaactttcgttgtggatgtg2040
agcatccaag鄉(xiāng)agg卿gtcagtgttat肌aacgEtcgLCgatatcctcaccgagtttac2100
gccttcatttcatcatctcgtCg犯犯C3Cttcccttcctttctctctactctctctctc2160
tcgttatcttcggtttctgctttctctattcggagg卿gatg220權(quán)利要求
1.鹽芥V-焦磷酸酶基因(TsVP1)啟動(dòng)子序列和其缺失突變體的應(yīng)用，其特征是，從鹽生植物鹽芥的基因組文庫中篩選出攜帶TsVP1啟動(dòng)子的克隆，截取TsVP1開放讀碼框5′上游的2200核苷酸序列作為全長(zhǎng)啟動(dòng)子序列，以此為模板通過PCR擴(kuò)增獲得不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段T2～T7，分別將其與報(bào)告基因融合后轉(zhuǎn)入擬南芥，確定了TsVP1啟動(dòng)子和其部分系列缺失突變體是鹽脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其中T5啟動(dòng)子具有較強(qiáng)的根特異性；TsVP1啟動(dòng)子和T5啟動(dòng)子分別與來自大腸桿菌的betA基因相連轉(zhuǎn)入煙草和玉米，確定了它們?cè)谵D(zhuǎn)基因煙草和玉米中能正常行使啟動(dòng)功能，是鹽脅迫誘導(dǎo)型的強(qiáng)啟動(dòng)子。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是，7JWV啟動(dòng)子來源于鹽生植物鹽芥的基因 組，長(zhǎng)度為KFP/開放讀碼框5'上游的2200核苷酸，其序列如序列表SEQ ID NO. 3 所示，與啟動(dòng)子克隆方法無關(guān)。
3. 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征是，以KFP7啟動(dòng)子為模板，構(gòu)建出不同缺 失突變體以開發(fā)新的啟動(dòng)子，不受突變體產(chǎn)生方法的限制，新的啟動(dòng)子或是7SFP7啟 動(dòng)子中的連續(xù)片段，或是KF尸/啟動(dòng)子中的幾個(gè)片段的組合。
4. 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征是，7SF/V啟動(dòng)子和其派生的啟動(dòng)子被用于植 物轉(zhuǎn)基因抗逆育種，其中7S^T7啟動(dòng)子和T5啟動(dòng)子是鹽脅迫誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動(dòng)子。
5. 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征是，T5啟動(dòng)子是7iF尸7啟動(dòng)子的缺失突變體， 即只要7iKP/啟動(dòng)子靠近開放讀碼框的667個(gè)核苷酸組成的連續(xù)序列，具有較強(qiáng)的根 特異性。
6. 如權(quán)利要求1或3所述的應(yīng)用，其特征是，派生啟動(dòng)子產(chǎn)生采用缺失突變體構(gòu)建、 核苷酸代換、新的順式作用元件的引入、來自于7^PT/啟動(dòng)子中的幾個(gè)片段的不同組 合，序列中有大于300 bp的核苷酸片段與7iF」P7啟動(dòng)子中的片段存在90%以上相似 性的啟動(dòng)子都視為派生啟動(dòng)子。
7. 如權(quán)利要求1或5所述的應(yīng)用，其特征是，r^T/啟動(dòng)子和T5啟動(dòng)子分別與抗 逆相關(guān)基因融合轉(zhuǎn)入植物，可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的鹽脅迫誘導(dǎo)型表達(dá)。
8. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征是，轉(zhuǎn)基因植物是指農(nóng)作物、經(jīng)濟(jì)林木、牧草 或草坪草。
9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征是，所述農(nóng)作物是玉米、小麥、棉花、大豆或 水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開一種鹽芥V-焦磷酸酶基因(TsVP1)啟動(dòng)子序列和其缺失突變體的應(yīng)用，是從鹽生植物鹽芥的基因組文庫中篩選出攜帶TsVP1啟動(dòng)子的克隆，截取TsVP1編碼框5′上游的2200核甘酸序列為全長(zhǎng)啟動(dòng)子，通過PCR擴(kuò)增獲得不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段，然后分別與gus基因融合，重組到植物表達(dá)載體中轉(zhuǎn)化擬南芥。檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株的GUS酶活性，確定了TsVP1啟動(dòng)子和其部分缺失突變體是鹽脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。其中T5啟動(dòng)子不僅序列短(667bp)，而且具有根特異性。將TsVP1啟動(dòng)子和T5啟動(dòng)子分別與來自大腸桿菌的betA基因相連，轉(zhuǎn)入煙草和玉米，確定了TsVP1啟動(dòng)子和T5啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因煙草和玉米中能正常行使功能，是鹽脅迫誘導(dǎo)型的強(qiáng)啟動(dòng)子，并在植物基因工程的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)中有重要應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101643745SQ200910018649
公開日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2009年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月9日
發(fā)明者孫清華, 張舉仁, 李坤朋, 峰 高, 強(qiáng) 高 申請(qǐng)人:山東大學(xué)