專利名稱：紅曲米固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方法
紅曲米固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制劑制備技術(shù)領(lǐng)域，涉及紅曲米固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方法。背景技術(shù)：
凝乳酶是乳酪制造業(yè)的一種重要酶制劑，可以使牛奶凝固。主要是從未斷奶的小牛胃中提取，其成分為一種天門冬氨酸蛋白酶。隨著乳酪生產(chǎn)逐年增加的需要，凝乳酶的需求量也越來越大，其產(chǎn)值占全世界酶制劑的15%左右。全球每年屠宰小牛5000多萬頭，小牛的數(shù)量急劇減少。乳酪在我國產(chǎn)量很少，而在發(fā)達(dá)國家將近1/ 3 1/ 2的原料乳用于乳酪生產(chǎn)，品種多達(dá)數(shù)百種，國內(nèi)外生產(chǎn)差距十分巨大。乳酪盡管在短期內(nèi)不會成為我國乳制品的主要品種，但從長遠(yuǎn)看，特別是在經(jīng)濟(jì)全球化的大背景下，這一產(chǎn)品必將成為未來國內(nèi)乳品工業(yè)的重要產(chǎn)品之一，對凝乳酶的研究有著廣闊的市場前景。
微生物凝乳酶在干酪生產(chǎn)中的應(yīng)用效果己有報道。與標(biāo)準(zhǔn)凝乳酶相比，在乳成分利用率、蛋白水解率以及干酪出品率和感官質(zhì)量等方面均無明顯差別。報道稱用從大腸桿菌中生產(chǎn)的
重組凝乳酶在凝乳時間、凝乳質(zhì)地、排乳清及酸化、蛋白分解、干酪成熟、最終成分和干酪產(chǎn)量以及干酪感官質(zhì)量方面與小牛凝乳酶相比無明顯差別。這說明利用微生物技術(shù)生產(chǎn)的凝乳酶完全可以替代從小牛鈹胃中提取的天然凝乳酶。
紅曲米異名紅曲；赤曲；紅米；福米。性質(zhì):為棕紅色至紫紅色的米粒。來源以秈稻、粳稻、糯米等稻米為原料，用紅曲霉菌發(fā)酵而成，為棕紅色或紫紅色米粒。紅曲米是中國獨特的傳統(tǒng)食品，距今己經(jīng)有千年歷史。
紅曲米發(fā)酵液作為凝乳劑是發(fā)酵液中的凝乳酶在發(fā)揮作用，紅曲米發(fā)酵液中的凝乳酶其實是紅曲米發(fā)酵液中微生物代謝產(chǎn)物，屬于微生物源凝乳酶，由于紅曲米是我國傳統(tǒng)的食品添加劑，所以從紅曲米發(fā)酵液中凝乳酶無需考慮微生物所產(chǎn)的非酶類代謝產(chǎn)物。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足,本發(fā)明提供一種紅曲米固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種紅曲米固態(tài)發(fā)酵制備凝乳酶的方法，步驟如下
1) 紅曲米粉碎成粉狀,細(xì)度200—400目，將紅曲米粉接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上，28-3(TC恒溫培養(yǎng)90-96h。紅曲米粉與固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量比1:100-1:150
2) 向上述培養(yǎng)物中加入蒸餾水，蒸餾水體積是培養(yǎng)物體積的2-2.5倍，抽濾，取濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積1/3-1/4，得凝乳酶溶液。
3) 向上述凝乳酶溶液加入乙醇進(jìn)行醇沉兩次，兩次醇沉中使用的乙醇體積均是凝乳酶溶液體積的2-3倍，4-6'C低溫離心，冷凍升華干燥，即為凝乳酶粗酶。4) 將上述步驟3)得到的凝乳酶粗酶溶于pH為6. 2的磷酸緩沖液中，即為凝乳酶粗液。
5) 使用S印hadex G-75凝膠柱層析純化凝乳酶粗液，以pH6. 2的磷酸緩沖液作為洗脫液，分步收集，檢驗收集液的活性，合并有活性的洗脫液。
6) 利用DEAE-纖維素52對上述洗脫液進(jìn)一步純化，以pH7. 2的磷酸鹽緩沖液為起始緩沖液，采用NaCl梯度洗脫，分步收集，檢測活性，合并有活性洗脫液，濃縮凍干得到高純度的凝乳酶。
上述步驟1)中的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基是(按干物質(zhì)的質(zhì)量百分比)麩皮40%-50%和豆粕50%-60%,加入麩皮與豆粕總質(zhì)量0.5%-1%的葡萄糖，加水使固液比1:1.5-1:2質(zhì)量比。
上述步驟3)中第一次醇沉中使用的乙醇濃度為72免wt,第二次醇沉中使用的乙醇濃度
為95%wt。
上述步驟6)中所述利用NaCl梯度洗脫優(yōu)選0.15mol/L、 0. 25mol/L 、 0. 35mol/L、0. 45mol/L和0. 55mol/L NaCl濃度的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。
本發(fā)明方法中涉及的各種原料均可市場購得。發(fā)酵殘渣的處理簡單，經(jīng)過高溫殺菌后，可作為高級動物飼料。
本發(fā)明所得凝乳酶活力4300 U/mg以上。
凝乳酶活力測定方法利用Arima法，取5mL質(zhì)量濃度為100 g/ L的脫脂乳溶液，40°C保溫5 rnin,備用。取0.5 mL處理后的酶液加入保溫的脫脂乳液，旋渦混合器上混合，準(zhǔn)確記錄從加入酶液到乳凝固的時間。
酶單位定義為40 min將l mL質(zhì)量濃度為lOO g/ L的脫脂乳凝固的酶量即為l個單位(U)。
計算公式為l^2400X5XD/(TX0. 5)
式中T為凝乳時間；D為稀釋倍數(shù)。
本發(fā)明是一種以紅曲米做為微生物源生產(chǎn)凝乳酶的方法，利用我國傳統(tǒng)的食品添加劑紅曲米，并采用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行凝乳酶的生產(chǎn)，采用二次乙醇沉淀法從發(fā)酵液中提取凝乳酶，進(jìn)一步使用S印hadex G-75和DEAE-52純化，得到高純度的凝乳酶。
本發(fā)明的有益效果如下
人本發(fā)明利用傳統(tǒng)發(fā)酵工藝與現(xiàn)代生物制劑技術(shù)相結(jié)合生產(chǎn)凝乳酶，產(chǎn)率高，發(fā)酵殘渣的處理簡單。
2固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基原料為生產(chǎn)小麥粉和豆油質(zhì)的副產(chǎn)品一麩皮與豆粕，來源廣泛，價格低廉。
J.通過對提取純化工藝的優(yōu)化組合能確保得到高純度的凝乳酶，凝乳酶活力4300 U/mg以上。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的方法作進(jìn)一步說明，但不限于此。
實施例中使用的紅曲米濱州市鑫路商貿(mào)有限公司銷售，色價1000—3000u/g,水分小于8%，細(xì)度160—200目，其他指標(biāo)符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB4926—1985的要求。麩皮與豆粕可市場購得。S印hadexG-75凝膠柱上海貝基生物科技有限公司有售、DEAE-纖維素52北京華美生科生物技術(shù)有限公司有售。
實施例1:
紅曲米經(jīng)研缽研碎至200—300目后，按紅曲米粉與固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量比1:100接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上，3(TC恒溫培養(yǎng)96h。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下(按干物質(zhì)的重量份)麩皮45份，豆粕55份，葡萄糖0.6份，加水至固液比1:1.6質(zhì)量比。
向上述培養(yǎng)物中加入2倍體積蒸餾水，抽濾，取濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積1/4，得凝乳酶溶液。再向凝乳酶溶液緩緩加入3倍體積的濃度為72%的乙醇，4'C靜置2h后，以7000r/min離心15min，取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，再用凝乳酶溶液體積3倍的95%的乙醇再次沉淀，4'C靜置24h即以8000 r/min離心15min，冷凍干燥，即為凝乳酶粗酶；溶于pH為6.2的磷酸緩沖液中，即為凝乳酶粗液。
所得凝乳酶粗液首先使用S印hadex G-75凝膠柱層析純化，以p服.2的磷酸緩沖液作為洗脫液，分步收集，檢驗收集液的活性，合并有活性的洗脫液。
利用DEAE-纖維素52對上述有活性的洗脫液進(jìn)一步純化，以pH7. 2的磷酸鹽緩沖液為起始緩沖液，以含0. 15mol/L、 0. 25mol/L 、 0. 35mol/L、 0. 45mol/L及0. 55mol/L NaCl濃度的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，分步收集，檢測活性，合并有活性洗脫液，濃縮凍干得到高純度的凝乳酶。純化后凍干得到凝乳酶，凝乳酶活力達(dá)4462. 1U/mg。
實施例2:
紅曲米經(jīng)研缽研碎至300—400目后，按紅曲米粉與固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量比1:140接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上，29t:恒溫培養(yǎng)94h。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下(按干物質(zhì)的重量份)麩皮50份，豆粕50份，葡萄糖0.7份，加水至固液比1:1.5質(zhì)量比。
向培養(yǎng)物中加入2倍體積蒸餾水，抽濾，取濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積1/3。
再向其中緩緩加入3倍體積的濃度為72%的乙醇，5'C靜置2h后，以7000r/min離心10min,取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，再用3倍體積95%的乙醇再次沉淀，5。C靜置20h即以7500 r/min離心10min，冷凍干燥，即為凝乳酶粗酶；溶于pH為6. 2的磷酸緩沖液中，即為凝乳酶粗液。首先利用使用S印hadex G-75凝膠柱層析純化凝乳酶粗液，以pH6. 2的磷酸緩沖液作為洗脫液，分步收集，檢驗收集液的活性，合并有活性的洗脫液。利用DEAE-纖維素52進(jìn)一步純化，以pH7. 2的磷酸鹽緩沖液為起始緩沖液，以含0. 15mol/L、 0. 25mol/L 、0.35mol/L、 0.45mol/L及0.55mol/LNaCl濃度的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，分布收集，檢測活性，合并有活性洗脫液，濃縮凍干得到高純度的凝乳酶。純化后凍干得到凝乳酶，凝乳酶活力達(dá)4326. 7U/mg。
權(quán)利要求
1.一種紅曲米固態(tài)發(fā)酵制備凝乳酶的方法，步驟如下1)紅曲米粉碎成粉狀，細(xì)度200-400目，將紅曲米粉接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上，28-30℃恒溫培養(yǎng)90-96h；2)向上述培養(yǎng)物中加入蒸餾水，蒸餾水體積是培養(yǎng)物體積的2-2.5倍，抽濾，取濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積1/3-1/4，得凝乳酶溶液；3)向上述凝乳酶溶液加入乙醇進(jìn)行醇沉兩次，兩次醇沉中使用的乙醇體積均是凝乳酶溶液體積的2-3倍，4-6℃低溫離心，冷凍升華干燥，即為凝乳酶粗酶；4)將上述步驟3)得到的凝乳酶粗酶溶于pH為6.2的磷酸緩沖液中，即為凝乳酶粗液；5)使用Sephadex G-75凝膠柱層析純化凝乳酶粗液，以pH6.2的磷酸緩沖液作為洗脫液，分步收集，檢驗收集液的活性，合并有活性的洗脫液；6)利用DEAE-纖維素52對上述洗脫液進(jìn)一步純化，以pH7.2的磷酸鹽緩沖液為起始緩沖液，采用NaCl梯度洗脫，分步收集，檢測活性，合并有活性洗脫液，濃縮凍干得凝乳酶。
2. 如權(quán)利要求1所述的紅曲米固態(tài)發(fā)酵制備凝乳酶的方法，其特征在于步驟l)中的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基是:按干物質(zhì)的質(zhì)量百分比麩皮40%-50%和豆粕50%-60%，加入麩皮與豆粕總質(zhì)量0. 5%-1%的葡萄糖，加水使固液比1:1.5-1:2質(zhì)量比。
3. 如權(quán)利要求1所述的紅曲米固態(tài)發(fā)酵制備凝乳酶的方法，其特征在于步驟3)中第一次醇沉中使用的乙醇濃度為72%wt，第二次醇沉中使用的乙醇濃度為95%wt。
4. 如權(quán)利要求1所述的紅曲米固態(tài)發(fā)酵制備凝乳酶的方法，其特征在于步驟6)中所述利用NaCl梯度洗脫優(yōu)選0. 15mol/L、0. 25mol/L 、0. 35mol/L、0. 45mol/L和0. 55mol/L NaCl濃度的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種紅曲米固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方法。將紅曲米粉接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上，28-30℃恒溫培養(yǎng)90-96h；培養(yǎng)水提、濃縮得凝乳酶溶液；加入乙醇進(jìn)行醇沉兩次，冷凍升華干燥得凝乳酶粗酶，然后純化得凝乳酶。本發(fā)明利用傳統(tǒng)發(fā)酵工藝與現(xiàn)代生物制劑技術(shù)相結(jié)合生產(chǎn)凝乳酶，本發(fā)明原料來源廣泛、價格低廉、產(chǎn)率高，所產(chǎn)凝乳酶活力高。
文檔編號C12R1/66GK101514336SQ20091002023
公開日2009年8月26日 申請日期2009年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月30日
發(fā)明者于功明, 王成忠, 顧振磊 申請人:山東輕工業(yè)學(xué)院 被以下專利引用 (2),