專利名稱：：一種蠟狀芽孢桿菌菌株及用它制備的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種蠟狀芽孢桿菌菌株，尤其是一種茶樹內(nèi)生、可高效降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的蠟狀芽孢桿菌菌株，還涉及用它制備的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解酶及其制備方法。屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：隨著人們生活水平的不斷提高和健康意識的增強，綠色食品越來越受到人們的青睞。茶葉是一種天然保健飲品，并被稱譽為21世紀的健康飲料，當今全球有近半數(shù)人飲茶。然而由于病蟲害的直接或間接危害，對提高茶葉經(jīng)濟效益造成了一定的負面影響。茶葉是以嫩梢為主要收獲物的經(jīng)濟作物.，傳統(tǒng)的化學防治方法給茶葉產(chǎn)品帶來農(nóng)殘超標、生態(tài)系統(tǒng)惡化等嚴重問題。我國每年由于農(nóng)藥殘留超標被退回或銷毀的茶葉就有上萬噸，損失巨大。目前，化學農(nóng)藥仍是作物病蟲害防治的主體，但它造成了農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、有害生物抗藥性產(chǎn)生、非靶標生物受害，乃至生態(tài)平衡受破壞等重大問題。即使是擬除蟲菊酯類農(nóng)藥低毒、殺蟲譜廣，也存在著降解速度慢等問題，對生態(tài)環(huán)境同樣會產(chǎn)生一定的影響。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織已對它們在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留限量作出了嚴格的規(guī)定。微生物降解農(nóng)藥的研究一直是國內(nèi)外的研究熱點，至今已取得了很大進展，表現(xiàn)在降解農(nóng)藥的微生物種類不斷被發(fā)現(xiàn)，降解機理日趨深入，降解效果穩(wěn)定提高等方面。擬除蟲菊酯類降解菌主要有假單胞菌fAez^咖⑨^spp.)、芽孢桿菌(萬sci^^s卯.)和產(chǎn)堿菌屬(Jh^i^77esspp.)等。人們研究發(fā)現(xiàn)，生長在不同污染環(huán)境中的植物能選擇性地增加含有污染物降解基因的內(nèi)生細菌。微生物對農(nóng)藥的降解研究始于40年代末，一直是國內(nèi)外的研究熱點，至今已取得了很大進展。微生物對農(nóng)藥的作用方式多樣，多數(shù)屬于通過酶促反應降解農(nóng)藥。農(nóng)藥的酶促反應主要是由微生物的胞內(nèi)酶引起的將農(nóng)藥吸附于微生物細胞表面；農(nóng)藥穿透細胞膜進入膜內(nèi)；農(nóng)藥在細胞膜內(nèi)通過與降解酶結(jié)合發(fā)生酶促反應。農(nóng)藥降解酶在農(nóng)藥殘留降解的應用中，具有降解效率高、作用底物濃度低、降解譜廣、安全無毒、環(huán)境適應強等優(yōu)點，具有良好的應用前景。目前生物農(nóng)藥的研發(fā)遠不能滿足無公害茶園防治病蟲害的需要，而國內(nèi)外對直接應用內(nèi)生細菌防治茶樹病害的研究很少。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種枯草芽孢桿菌菌株，其為茶樹內(nèi)生農(nóng)藥降解菌，以便高效能的降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥。所要解決的技術(shù)問題之二是，提供一種從菌株中制備出擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解酶的方法，并且制備出降解酶。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之一是，一株蠟狀芽孢桿菌TR2(勘ciJ7^c6^e^sTR2)菌株，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCCNO:M209001。上述的蠟狀芽孢桿菌TR2(5a"〃"sceretAsTR2)菌株，其為從茶樹體內(nèi)分離得到，其菌體呈桿狀，革蘭氏染色陽性，周生鞭毛，橢圓形芽孢，兼性厭氧，在平板上長成的菌落初為乳白色、圓形、邊緣整齊、略凸起、表面濕潤、半透明、略粘稠，后期為灰白色、近圓形、邊緣波浪狀、凸起呈乳頭狀或中央凹陷、表面干燥、不透明、粘稠。其能在茶樹體內(nèi)內(nèi)生、對茶輪斑病防病效果好以及對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解效能高。本發(fā)明采取的技術(shù)方案之二是，一種從上述菌株中制備擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解酶的方法，包括下列內(nèi)容1、將TR2菌株的新鮮培養(yǎng)物接種于添加50mg/L氯氰菊酯的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37。C、180r/min下培養(yǎng)72h。2、將培養(yǎng)液7500r/min離心10min，分別得上清液和菌體。3、將菌體用0.02mol/L、pH7.0磷酸緩沖液洗滌2次，按31111緩沖液+lg菌體的比例配成菌懸液。4、將菌懸液置于冰浴中超聲波破碎處理7次，每次50s。5、然后，10000r/min離心10min，取上清液，得胞內(nèi)粗酶液，即為擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解酶。上述的方法中，其破碎菌體所用機械為JY92-n型超聲波細胞粉碎機(200W)。一種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解酶，以蠟狀芽孢桿菌TR2菌株(CCTCCNO:M209001)為出發(fā)菌株，應用上述的制備方法制得。上述擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解酶，其降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥適宜的pH為5.5-9.0;適宜的溫度為30-45°C;其米氏常數(shù)(Kj為692.39nmol/mL，最大反應速率(V,)為89.29體ol/min。該降解酶在pH6.0-9.0之間較穩(wěn)定，在pH7.5最穩(wěn)定，在pH4.0-5.0和pH10.0以上則易于變性失活，在4(TC以下穩(wěn)定性好，高于5(TC易于變性失活。3-苯甲基苯甲醛是菌株TR2降解氯氰菊酯的主要中間代謝產(chǎn)物。上述的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解酶，其對氯氰菊酯反應的pH值優(yōu)選8.0;溫度優(yōu)選35。C。菌株TR2(CCTCCNO:M209001)是一株從茶樹體內(nèi)分離到的對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解效能高的細菌菌株，經(jīng)鑒定為蠟狀芽孢桿菌(&^7〗m"rcM)。其胞外粗酶液對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥無降解活性，其胞內(nèi)粗酶液對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥如氯氰菊酯、氟氯氰菊酯和甲氰菊酯的降解效能高，對有機磷農(nóng)藥如樂果、敵敵畏、甲胺磷和毒死蜱等降解效能低。經(jīng)室內(nèi)盆栽試驗測定，菌株TR2對氯氰菊酯的最優(yōu)化降解條件為噴菌后id噴藥、處理時間10d、噴菌量為5mL/株(菌液濃度為108cfu/mL)以及噴藥量為lmg/kg。茶園小區(qū)試驗測定結(jié)果表明，菌株TR2對氯氰菊酯的降解率達83.4%，能將氯氰菊酯殘留量控制在0.15mg/kg以下。下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明迸一步詳細說明。圖1是酪蛋白標準曲線圖；圖2是菌株TR2粗酶液的SDS-PAGE圖譜；圖3是底物對粗酶液酶活力的影響；圖4是pH值對粗酶液酶活力的影響；圖5是粗酶液的pH穩(wěn)定性；圖6是溫度對粗酶液酶活力的影響；圖7是粗酶液的溫度穩(wěn)定性；圖8是粗酶液與氯氰菊酯的Lineweaver-Burk圖。具體實施方式實施例1分離篩選TR2菌株采用植物表面消毒法對不同茶樹品種的健葉和病葉進行表面處理后，以不同培養(yǎng)基進行內(nèi)生細菌的分離。細菌分離培養(yǎng)基為NA、KB和TSA。細菌增殖培養(yǎng)基為NA或NB。真菌培養(yǎng)與拮抗測定用培養(yǎng)基為改良PDA。測定農(nóng)藥降解采用以氯氰菊酯為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等隨機挑取單菌落，按常規(guī)方法純化后保存，供測試鑒定。測定所有分離菌株對茶葉斑病菌的拮抗性以及在氯氰菊酯平板上的生長能力。內(nèi)生細菌的鑒定參照東秀珠等(東秀珠，蔡妙英常見細菌鑒定手冊[M]，科學出版社，2001:43~66頁)的方法，對目標菌株進行常規(guī)鑒定及生理生化測定如革蘭氏染色、鞭毛染色、芽孢染色、接觸酶、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣等，以枯草芽孢桿菌(^j""mswZ^j7A)作為標準菌株。細菌分離培養(yǎng)試驗結(jié)果見表l。茶樹體內(nèi)存在大量的內(nèi)生細菌，分離到的內(nèi)生細菌數(shù)量為2.9X10639.4X106cfu/(g'fw)，不同培養(yǎng)基間差異并不顯著，不同品種間有一定的差異，同一品種間病葉與健葉的內(nèi)生細菌數(shù)量差異顯著。表l不同品種茶葉分離的內(nèi)生細菌數(shù)量培養(yǎng)基mecU謹鐵觀音黃旦毛蟹肉桂率均病葉健葉疬葉健時病葉健葉病時健葉AverageDiseased35"13.S3.220.16.719.7aJCB!5.7則則TSA25—42.918.96.5平均Average34.0aH9c27》a9.幅34.Sbc9,So！-經(jīng)測定(結(jié)果見表2)，上述的分離菌株中有14株對四種茶樹葉斑病菌表2目標菌株對四種茶樹葉斑病菌的抑制率_m_<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>都有不同程度的拮抗效果，且在氯氰菊酯平板上生長良好，將它們作為目標菌株，編號為TR1至TR14;其中，TR2和TR3對四種茶樹葉斑病菌菌絲具有較強的抑制率。進一步鑒定顯示，TR2為枯草芽孢桿菌(Aaci""s6Y/6"7i60，其生理生化特征見表3。表3TR2的生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注"+"代表陽性反應，"-"代表陰性反應eNete:Symbol'+fme纖拜他，ereaciio仏s，bolmeansnegativefeadkm—內(nèi)生性測定采用抗利福平和拮抗茶輪斑病菌的雙抗法，測定目標菌株對茶樹苗的內(nèi)生定殖能力。定殖試驗結(jié)果表明，14個目標菌株都能在接種后不同時間取的茶葉樣品中分離到與原始菌株相同菌落形態(tài)的細菌菌株，而對照樣品中未分離到細菌。其中TR1、TR2和TR7在接種茶樹苗30d后仍能分離到相當數(shù)量的目標細菌，證明它們有較強的內(nèi)生定殖能力。幾項關(guān)健性生理生化測定結(jié)果表明，這些分離菌株均為枯草芽孢桿菌。拮抗試驗表明，14個目標菌株對茶輪斑病菌菌絲、分生孢子的形成和萌發(fā)都有一定程度的抑制作用，結(jié)果見表4。表4目標菌株對茶輪斑病菌的影響菌株Strains對病窗窗絲的抑制作用It^ibitionagainst133ycelius1ofgatliogea対分逢抱子的拗制,兩aga紐steo這她她抑菌蹈直徑'〖MH1)抑菌帶寬度(mm)購她of"i她ttioflzone辭戒搏鑭率(％》萌禁狗制:率(％〗嫁食指數(shù)，!2.05—350.0TR241.513.5自86-9兆3aTR33.2力自94,3SO.38隱bTE4U-5銀S32.325—68.220-549.7c.測5力20.135.425:2de25J'2卯.O5^8TESB力34.939.0cd卿i90』訓35.724她lino7—22i，S24.SdeTK!！i2.9TR12歸55.2柳化WTR"4.725,6TK，415■2U注綜合指鼓是以備項的最大值作為郎，其它值按與最大值的比率計算其攝應值；然后計算各項的平均值，卞簡。Note3ven1ge'va!aeofeachEumeric3〗vslue，wlikhis:a￡3tiooforiginvaluetothemasimumvalue其中TR2和TR3對病菌菌絲有明顯的抑制作用，對峙培養(yǎng)7d后，出現(xiàn)直徑為41.5mm禾卩32.0mm的抑菌圈?？拷黅R2生長邊緣處的病菌菌絲不能向外擴展生長，而且變黑而形成一條黑色抑菌帶，其寬達13.5mm。鏡檢發(fā)現(xiàn)受抑制的菌絲絕大部分變畸形，頂端和中間形成大量圓球形囊狀體，有的菌絲細胞囊狀體的壁己消融、破裂。同時，TR2、TR3和TR7對茶輪斑病菌分生孢子形成的抑制率較高，分別可達89.5%、94.3%和90.0%。另外，TR2培養(yǎng)液處理24h后，茶輪斑病菌分生孢子的萌發(fā)率僅有3.5%，而清水處理中分生孢子萌發(fā)率達95.0%，其萌發(fā)抑制率為86.9%;48h后清水中萌發(fā)的分生孢子均能形成附著胞，而培養(yǎng)液中萌發(fā)的孢子未見附著胞形成。拮抗性測定結(jié)果表明，與TR2的野生菌株相比，分離菌株對茶輪斑病菌仍具有很強的拮抗性。經(jīng)測定，上述分離菌株在氯氰菊酯平板上生長良好。對病原真菌生長的影響采用對峙生長法，測定目標菌株對茶輪斑病菌菌絲、分生孢子形成的抑制作用。采用載玻片懸滴法室溫培養(yǎng)，測定目標菌株對茶輪斑病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用。目標菌株防病試驗結(jié)果表明，14個目標菌株除TR10外對茶輪斑病都有不同程度的防治效果，如表5。其中TR2和TR3對茶輪斑病的防病效果最好，先接種目標菌株24h后再接種茶輪斑病菌其防病效果分別可達到90.3%和80.2%，這與前面的拮抗測定結(jié)果基本吻合。表5目標菌株對茶輪斑病的防病效果巡菌株Strains處瑰ITreatmentsI處瑰KTfeatmeats11IVeamientsIII平均AverageTR!33.640.2S-5TK2卯.356S77.<SaTR379.680.244、3680aIR420.50》15;de■35.95G力12.433.0bcd則32.431.5'2.522.1cdemo30.5TK8銀7T民9儀55.1T蹈—0.20.90力eTRH4"26.720」HU3■13-515.50》IO.她TRH65.535;平均44.4a限lb-注處理i為罔時接種目標薪株和茶輪斑病菡；處瑰ii為先接稱目標蔬株24h后接種茶輪斑病繭；處建ni為先接稗茶輪斑病菡^h后接種目標菌株Nore:Treaf雄nfIiiatre3加enfttemocul;m:解thescreenedba(ferbstxa2i5/力^eshimlMeity.TreatmenrIIisa5reatK!enttlminc'ciiiati33g^e^f"'/or:^:7r/;m;'《pathogen24iiowrsafiei"inocnistingthescreeue.dbacteria4tfains.TfewnieutinisasreatnieiH加tiiiocu她ugthescreenedtucferisstrains24lioimalteriuocul3fiiig:/^/Wor:/"W鄉(xiāng)《pathogen.防病測定室內(nèi)盆栽采用灌根法和噴霧法測定目標菌株對茶輪斑病的防病效果。設(shè)同時接種目標菌株和茶輪斑病菌、先接種目標菌株24h后接種茶輪斑病菌和先接種茶輪斑病菌24h后接種目標菌株等3個處理。表6目標菌株對氯氰菊酯的降解率(%》菡株MStrain24k48hl雄綜食攆數(shù)Compositeindes測iu■33.031.!MeTO225》35力59-6SQ.981.，575力bT狡S1^525.254.!T歸2—05—85:75.9'9;sa"g■msI"13.523.5efT恥""力25.625.9TR7".455.9S2.iSO:IK囂14.228力5"船71.5騰2.85.2.則20.515-U經(jīng)聰O204.界6旭則網(wǎng)TH"3.520.525:S41.241.0".3d環(huán)25力5.825.833.1復0.52<U20.525-《25;23.MT駆"45.85^7虹3亂5平均Meanli3c32勉43.5a4.容a4tla農(nóng)藥降解效能測定采用外標法制作氯氰菊酯的標準曲線。以100mg/L氯氰菊酯為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中接種目標菌株后，30°C,150r/min振蕩培養(yǎng)，設(shè)不接菌的處理為對照，分別于6、12、24、48、72h和120h取樣。石油醚液相萃取法處理樣品，HP6890氣相色譜儀(色譜柱型號為HP-5)檢測，采用常規(guī)測試條件，計算降解率。氯氰菊酯降解試驗結(jié)果表明，14個目標菌株對氯氰菊酯都有不同程度的降解作用，見表6。其中TRIO、TR7和TR2對氯氰菊酯的降解效能較高。從時間上來看，648h內(nèi)目標菌株對氯氰菊酯的降解率呈直線增長，而48h后降解率就沒有太大變化。本實施例中，通過對茶樹內(nèi)生細菌的分離與篩選，獲得一株能在茶樹體內(nèi)內(nèi)生、對茶輪斑病防病效果好以及對氯氰菊酯降解效能高的枯草芽孢桿菌TR2，其菌體呈桿狀，革蘭氏染色陽性，周生鞭毛，橢圓形芽孢，兼性厭氧，在平板上長成的菌落初為乳白色、圓形、邊緣整齊、略凸起、表面濕潤、半透明、略粘稠，后期為灰白色、近圓形、邊緣波浪狀、凸起呈乳頭狀或中央凹陷、表面干燥、不透明、粘稠。實施例2從蠟狀芽孢桿菌TR2菌株(CCTCCN(hM209001)中制備擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解酶本實施例中涉及的培養(yǎng)基降解菌的保存采用添加氯氰菊酯(50mg/L)的NA培養(yǎng)基。降解菌的降解效能測定采用添加氯氰菊酯(50mg/L)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。本實施例中涉及的供試農(nóng)藥10%氯氰菊酯乳油(南京紅太陽集團有限公司)、2.5%氟氯氰菊酯乳油(蘇州富美實植物保護劑有限公司)、20%甲氰菊酯乳油(浙江威爾達化工有限公司)、40%樂果乳油(重慶民豐農(nóng)化股份有限公司)、80%敵敵畏乳油(江蘇梅蘭集團有限公司)、70%甲胺磷原油和40%毒死蜱乳油(山東華陽科技股份有限公司)、氯氰菊酯標樣(北京康林科技有限公司)。粗酶液的制備將菌株TR2的新鮮培養(yǎng)物接種于添加氯氰菊酯(50mg/L)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基r/min離心10min,分別得上清液和菌體。取上清液，邊攪拌邊加硫酸銨至飽和度為100%，4"C鹽析過夜。離心收集蛋白沉淀，用O.02mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)溶解后用同一種緩沖液透析(MWCO=5000)至無硫酸根離子，得胞外粗酶液。將菌體用O.02mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)洗滌2次，按31111緩沖液+lg菌體的比例配成菌懸液。將菌懸液置于冰浴中用JY92-II型超聲波細胞粉碎機(200W)超聲波破碎處理7次，每次50s。然后，10，000r/min離心10min，取上清液，得胞內(nèi)粗酶液，即為擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解酶。粗酶液的可溶性蛋白含量測定用Folin-酚法(中國科學院上海植物生理研究所編.現(xiàn)代植物生理學實驗指南[M].第1版，北京科學出版社，1999，35-38.頁)測定粗酶液的可溶性蛋白質(zhì)含量。制作如圖l所示標準酪蛋白曲線，根據(jù)測定結(jié)果與標準曲線分別計算出胞外粗酶液和胞內(nèi)粗酶液的可溶性蛋白含量。根據(jù)圖l所示酪蛋白標準曲線，可以看出酪蛋白的標準含量在650nm下的吸光值近似呈一線性直線關(guān)系。測定結(jié)果顯示，菌株TR2提取出來的胞外粗酶液和胞內(nèi)粗酶液在650mn下的吸光值分別為1.35和1.21,相對應于圖1的標準曲線，可以計算出菌株TR2胞外粗酶液和胞內(nèi)粗酶液的可溶性蛋白質(zhì)含量分別為O.540mg/ml和O.502mg/ml。粗酶液的SDS-PAGE電泳分別灌制12%的分離膠和5%的濃縮膠，配方參照《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》(汪家政、范明蛋白質(zhì)技術(shù)手冊[M].北京科學出版社，2001，77-108頁)。粗酶液與2xLSB按l:l比例在Ep2pendorf管內(nèi)混勻，10(TC加熱35min,冷切后8，000rpm離心10min，上樣，最外側(cè)加樣孔內(nèi)上蛋白質(zhì)分子標準品(Marker)。電泳，810V/cm膠，當溴酚藍距凝膠底部約l5mm處停止電泳，下膠?？捡R斯亮藍R-250染色、脫色，拍照。如圖2所示，胞外粗酶液和胞內(nèi)粗酶液的SDS-PAGE圖譜顯示胞內(nèi)粗酶液的蛋白條帶數(shù)目多于胞外粗酶液的，其在25KDa和40KDa左右有兩條明顯的粗條帶。影響ii酶的底物特異性測定反應體系2.7ml己預熱的0.02mol/L磷酸緩沖液(pH7.0，含50mg/L氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、樂果、甲胺磷、毒死蜱和敵敵畏)中，加入O.3ml預熱的粗酶液，總體積為3ml。35°C反應20min后，加入O.2ml1.Omol/LHC1終止酶反應。每處理重復3次，以不加粗酶液的作為對照。石油醚三步萃取法處理樣品，并定容至10ml。氣相色譜法檢測樣品的底物含量，根據(jù)結(jié)果計算粗酶液對不同底物的降解率。取降解率的最大值為100計算各處理的相對酶活力(％)，以確定粗酶液對不同底物的降解差異。菌株TR2胞內(nèi)粗酶液對不同底物的降解率測定結(jié)果如圖3所示。在所有測定的底物中酶對氯氰菊酯的降解效能最高(在pH7.0和35t:的反應條件下反應20min的降解率為71.5%)，其次是甲氰菊酯、氟氯氰菊酯、甲胺磷和毒死蜱，對樂果和敵敵畏最低。不同pH值對酶活力的影響分另iJ用pH為4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0的磷酸緩沖液(含50mg/L氯氰菊酯)與粗酶液配成不同的反應體系。35。C反應20min后，加入O.2ml的l.Omol/LHC1終止酶反應。每處理重復3次，分別設(shè)不加粗酶液的作為對照。樣品的提取和檢測同上，根據(jù)結(jié)果計算不同反應pH值下粗酶液對氯氰菊酯的降解率。取降解率的最大值為100計算各處理的相對酶活力(％)，以確定粗酶液的最適反應pH。菌株TR2胞內(nèi)粗酶液在不同反應pH值下對氯氰菊酯的降解率測定結(jié)果如圖4所示。粗酶液在pH4.010.O之間對氯氰菊酯都有不同程度的降解，其反應適宜的pH應在5.59.O，最適pH為8.0(35t:下反應20min的降解率為80.3%)。酶的pH穩(wěn)定性測定將粗酶液于pH4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0的磷酸緩沖液中35'C保溫lh，各對應的pH梯度分別設(shè)不加粗酶液的作為對照。然后再和氯氰菊酯(終濃度為50mg/L)在35。C、最適pH值下反應20min后，加入0.2ml1.Omol/LHC1終止酶反應。樣品的提取和檢測同上，根據(jù)結(jié)果計算粗酶液對氯氰菊酯的降解率。取降解率的最大值為ioo計算各菌株TR2胞內(nèi)粗酶液對不同pH的穩(wěn)定性測定結(jié)果見圖5。粗酶液在pH4.010.O的磷酸緩沖液中保溫lh后對氯氰菊酯的降解都有不同程度的變化，其在p服.09.0之間較為穩(wěn)定，在pH7.5下最穩(wěn)定(35°C、pH8.0下反應20min的降解率為82.3%)，而在pH4.05.O和pHlO.O易于變性失活。不同溫度對酶活力的影響用O.02mol/L磷酸緩沖液(最適pH值，含50mg/L氯氰菊酯)與粗酶液配成反應體系。反應體系分別在15。C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、5(TC等不同溫度下反應20min后，加入0.2ml1.Omol/LHC1終止酶反應。每處理重復3次，分別設(shè)不加酶液的作為對照。樣品的提取和檢測同上，根據(jù)結(jié)果計算不同反應溫度下粗酶液對氯氰菊酯的降解率。取降解率的最大值為100計算各處理的相對酶活力(％)，以確定粗酶液的最適反應溫度。菌株TR2胞內(nèi)粗酶液在不同反應溫度下對氯氰菊酯的降解率測定結(jié)果如圖6。粗酶液在155(TC之間對氯氰菊酯都有不同程度的降解，其反應適宜的溫度應在3045。C之間，最適溫度為35。C(pH8.0下反應20min的降解率為85.9%)。酶的熱穩(wěn)定性測定將粗酶液于最適pH值的緩沖液中，在20、30、40、50、60、7(TC下保溫lh，各對應的溫度梯度分別設(shè)不加粗酶液的作為對照。然后再和氯氰菊酯(終濃度為50mg/L)在最適反應條件下反應20min后，加入O.2ml1.Omol/LHC1終止酶反應。樣品的提取和檢測同上。取降解率的最大值為100計算各處理的相對酶活力(％),根據(jù)結(jié)果計算粗酶液對氯氰菊酯的降解率，以確定粗酶液在不同溫度條件下的穩(wěn)定性。菌株TR2胞內(nèi)粗酶液對不同溫度的穩(wěn)定性測定結(jié)果見圖7。粗酶液在4(TC以下穩(wěn)定性良好(35。C、pH8.0下反應20min的降解率為84.6%),在50°C、6(TC和7(TC下保溫lh后對氯氰菊酯的降解隨著溫度的升高而迅速下降。粗酶液米氏常數(shù)Km和最大反應速率Vmax的測定分別用含有不同氰氰菊酯濃度(10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L)的磷酸緩沖液(0.02mol/L，最適pH值)與粗酶液配成不同的反應體系。在最適溫度下反應20min，最后用O.2ml的l.Omol/L的鹽酸終止反應。每處理重復3次，分別設(shè)不加酶液的作為對照。樣品的提取和檢測同上，根據(jù)結(jié)果計算粗酶液對不同氯氰菊酯濃度的降解率。根據(jù)氯氰菊酯的初始濃度和測得的反應速率作Lineweaver-Burk圖，求得粗酶液降解氯氰菊酯的米氏常數(shù)Km和最大反應速率Vmax。根據(jù)菌株TR2胞內(nèi)粗酶液對不同氯氰菊酯濃度的降解率測定結(jié)果，然后以氯氰菊酯的初始濃度和測得的反應速率作Lineweaver-Burk圖，見圖8。結(jié)果表明，粗酶液的反應速率倒數(shù)(y)與氯氰菊酯濃度倒數(shù)(x)的線性方程為y=7.7548x+0.0112，決定系數(shù)r=0.9970;因此，粗酶液對氯氰菊酯的米氏常數(shù)為Km=692.39nmol/ml,最大反應速率Vmax^89.29nmol/min。權(quán)利要求1、一種蠟狀芽孢桿菌菌株，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCCNOM209001。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的蠟狀芽孢桿菌菌株，其為從茶樹體內(nèi)分離得到，其菌體呈桿狀，革蘭氏染色陽性，周生鞭毛，橢圓形芽孢，兼性厭氧，在平板上長成的菌落初為乳白色、圓形、邊緣整齊、略凸起、表面濕潤、半透明、略粘稠，后期為灰白色、近圓形、邊緣波浪狀、凸起呈乳頭狀或中央凹陷、表面干燥、不透明、粘稠。3、一種由權(quán)利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌菌株中制備擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解酶的方法，包括下列內(nèi)容a、將TR2菌株的新鮮培養(yǎng)物接種于添加50mg/L氯氰菊酯的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37。C、180r/min下培養(yǎng)72h;b、將培養(yǎng)液7500r/min離心10min,分別得上清液和菌體；c、將菌體用0.02mol/L、pH7.0磷酸緩沖液洗滌2次，按31111緩沖液+lg菌體的比例配成菌懸液；d、將菌懸液置于冰浴中超聲波破碎處理7次，每次50s;e、然后，10000r/min離心10min，取上清液，得胞內(nèi)粗酶液，即為擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解酶。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于在其步驟d中，破碎菌體所用機械為JY92-n型200W超聲波細胞粉碎機。5、一種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解酶，以蠟狀芽孢桿菌菌株CCTCCNO:M209001為出發(fā)菌株，應用權(quán)利要求3所述的制備方法制得。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解酶，其特征在于其降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥適宜的pH為5.5-9.0;適宜的溫度為30-45。C;其米氏常數(shù)L為692.39nmol/mL，最大反應速率V,為89.29nmol/min。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解酶，其特征在于其降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的pH值為8.0;溫度為35'C。全文摘要本發(fā)明公開了一種蠟狀芽孢桿菌菌株，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCCNOM209001。還公開了一種由所述的蠟狀芽孢桿菌菌株為出發(fā)菌株制備的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解酶及其制備方法。該菌株是一株從茶樹體內(nèi)分離到的對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解效能高的蠟狀芽孢桿菌，其胞內(nèi)粗酶液對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥如氯氰菊酯、氟氯氰菊酯和甲氰菊酯的降解效能高，對有機磷農(nóng)藥如樂果、敵敵畏、甲胺磷和毒死蜱等降解效能低。文檔編號C12N1/20GK101591623SQ20091002063公開日2009年12月2日申請日期2009年4月15日優(yōu)先權(quán)日2009年4月15日發(fā)明者蘭孝幫,洪永聰,王軍強,紀國才申請人:洪永聰;王軍強;紀國才