專利名稱：：一種四環(huán)素嚴(yán)緊調(diào)控的真核表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種四環(huán)素嚴(yán)緊調(diào)控的真核表達(dá)載體，特別涉及不同興趣外源性基因方便的重組入該載體，及轉(zhuǎn)染該載體顯陽性的細(xì)胞的篩選。
背景技術(shù)：
：飛速發(fā)展的功能基因組學(xué)的研究需要嚴(yán)緊調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)，以便外源基因在宿主細(xì)胞的表達(dá)能夠得到精確調(diào)控，使得其功能研究順利進(jìn)行。近年來四環(huán)素(tetracycline，Tet)調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)得到廣泛的應(yīng)用。Tet誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)分為兩種一種是Tet關(guān)閉型，另一種是Tet開放型。前者在沒有Tet和其衍生物強(qiáng)力霉素(doxycycline,Dox)存在的情況下組成型表達(dá)，在Tet或者Dox存在的情況下受到調(diào)控，表達(dá)系統(tǒng)關(guān)閉(Lee，YB.,A.S.Cosgrave,C.P.Glover,A.Bienemann,D.Heywood，R丄HobsonandJ.B.Uney.2005.IncreasedutilityintheCNSofapowerfulneuron-specifictetracycline-regulatableadenoviralsystemdevelopedusingapost-transcriptionalenhancer.JGeneMed.7:576-583.);而后者在Tet或Dox存在的條件下表達(dá)系統(tǒng)被激活而表達(dá)(Gossen,M.，S.Freundlieb,G.Bender,G.Muller,W.HillenandHBujard.1995.Transcriptionalactivationbytetracyclinesinmammaliancells.Science.268:1766-1769.)。與Tet關(guān)閉型表達(dá)系統(tǒng)相比，Tet開放型表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是加入誘導(dǎo)劑產(chǎn)生的表達(dá)激活要比從Tet關(guān)閉型系統(tǒng)中去除Tet或Dox產(chǎn)生的表達(dá)激活效應(yīng)快得多，因?yàn)門et關(guān)閉型系統(tǒng)需要一定的藥物洗脫時(shí)間；此外Tet開放型系統(tǒng)可以通過加入不同劑量的誘導(dǎo)劑，控制目的基因的表達(dá)水平(Kistner，A.，M.Gossen，F(xiàn).Zimmermann，J.Jerecic，C.Ullmer,H.LubbertandH.Bujard.1996.Doxycycline-mediatedquantitativeandtissue-specificcontrolofgeneexpressionintransgenicmice.ProcNatlAcadSciUSA.93:10933-10938.4)。雖然目前己經(jīng)有很多Tet或Dox誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的報(bào)道(Georgievska,B.，J.Jakobsson,E.Persson,C.Ericson,D.KirikandC.Lundberg.2004.Regulateddeliveryofglialcellline-derivedneurotrophicfactorintoratstriatum,usingatetracycline-dependentlentiviralvector.HumGeneTher.15:934-944.;Aurisicchio,L.,A.DeTomassi,N.LaMonica,G.Ciliberto,C.TraboniandRPalombo，2005.Regulatedandliver-specifictamarinalphainterferongenedeliverybyahelper-dependentadenoviralvector.JVirol,79:6772-6780)，但存在的問題是，受Tet或Dox調(diào)控的目的基因置換不方便；例如經(jīng)過高通量的方法篩選得到很多待檢測(cè)的興趣基因，就需要根據(jù)不同基因的序列和酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)重組方案，采用傳統(tǒng)的酶切和連接方法，構(gòu)建Tet或Dox調(diào)控系統(tǒng)，工作量大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。此外，在基因功能學(xué)的研究中，對(duì)于興趣基因的轉(zhuǎn)入、表達(dá)以及穩(wěn)定表達(dá)體的獲取，都需要有相應(yīng)的高效的篩選標(biāo)記，這對(duì)于工作的成敗有至關(guān)重要的作用；現(xiàn)有的篩選標(biāo)記還沒有達(dá)到簡(jiǎn)潔、快速、方便的篩選效果。最后，目前報(bào)道的Tet或Dox誘導(dǎo)表達(dá)載體，具有真核復(fù)制子，轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞后，能夠自主復(fù)制；雖然見效較快，但沒有整合到宿主基因組中的外源性基因，表達(dá)不夠穩(wěn)定，在較長(zhǎng)的時(shí)間(數(shù)月)之后有載體表達(dá)的減弱和丟失現(xiàn)象發(fā)生，影響對(duì)基因功能的長(zhǎng)期研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明解決的問題在于構(gòu)建一種四環(huán)素嚴(yán)緊調(diào)控的真核表達(dá)載體，該載體高通量的篩選在真核細(xì)胞的表達(dá)的興趣外源性基因，既能夠方便的置換不同的外源性興趣基因，又具備高效篩選標(biāo)記。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的一種四環(huán)素嚴(yán)緊調(diào)控的真核表達(dá)載體，包括啟動(dòng)子，沿啟動(dòng)子方向分布有編碼四環(huán)素反應(yīng)表達(dá)框抑制子的rtTA2S-M2和四環(huán)素反應(yīng)表達(dá)框，所述的四環(huán)素反應(yīng)表達(dá)框包括四環(huán)素控制的雙向啟動(dòng)子Ptetbi，所述rtTA2S-M2的核苷酸序列如SEQIDNO.l所示，Ptetbi的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。所述啟動(dòng)子Ptetbi—側(cè)為外源性興趣基因的讀碼框RFC;所述RFC的核苷酸序列如SEQIDN0.3所示。所述啟動(dòng)子Ptetbi另一側(cè)為編碼螢光素酶(luciferase)的元件，其核苷酸序列如SEQIDN0.4所示。所述四環(huán)素嚴(yán)緊調(diào)控的真核表達(dá)載體，在"丁八2、]^12元件后還插入￡0-Puro序列，EGFP-Puro序列是編碼綠色熒光蛋白EGFP和嘌羅霉素(Puromicine)抗性蛋白的融合基因，其核苷酸序列如SEQIDN0.5所示。所述四環(huán)素嚴(yán)緊調(diào)控的真核表達(dá)載體，在11丁八23-]^2元件和￡0-Puro序列之間還插入核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，其核苷酸序列如SEQIDN0.6所示。所述的四環(huán)素嚴(yán)緊調(diào)控的真核表達(dá)載體是重組質(zhì)粒pEll-IGR-RFC,其引入的DNA元件排列如下hCMV-rtTA2s-M2-IRES-EGFP-Puro-編碼螢光素酶的元件(Luc)-Ptetbi-RFC,其核苷酸序列如SEQIDN0.7所示。所述的四環(huán)素嚴(yán)緊調(diào)控的真核表達(dá)載體pEll-IGR-RFC應(yīng)用于外源性興趣基因在真核細(xì)胞中表達(dá)的篩選。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果1、在無Tet和Dox存在時(shí)，抑制子編碼的rtTA2S-M2蛋白通過與四環(huán)素反應(yīng)元件結(jié)合，抑制其控制的基因(啟動(dòng)子Ptetbi兩側(cè)的基因)的轉(zhuǎn)錄；在Tet和Dox存在下，Tet和Dox與rtTA2S-M2蛋白結(jié)合，從而解除其對(duì)于Tet或Dox反應(yīng)元件的抑制，而開放基因的表達(dá)；經(jīng)過優(yōu)化的rtTA2S-M2比傳統(tǒng)的rtTA對(duì)于Dox有更高的敏感性。興趣基因引入到本發(fā)明所提供的表達(dá)載體中，其表達(dá)受到Tet或Dox嚴(yán)緊控制，并且基因的表達(dá)水平通過加入Tet或Dox的量進(jìn)行定量調(diào)節(jié)。2、將Tet誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的反應(yīng)元件rtTA與Ptetbi整合于同一個(gè)載體之中，通過對(duì)普通細(xì)胞系單次轉(zhuǎn)染就可以實(shí)現(xiàn)興趣基因(geneofinterest)的誘導(dǎo)表達(dá)，而不必先篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染rtTA的細(xì)胞系，再轉(zhuǎn)染Ptetbi-興趣基因(Ptetbi-geneofinterest)，可以節(jié)約大量的時(shí)間和費(fèi)用。3、啟動(dòng)子Ptetbi控制的RFC來源于商品化的Gateway重組系統(tǒng)(Invitrogen,USA)，中間載體pENTR-geneofinterest與表達(dá)載體的RFC讀碼框經(jīng)過重組酶催化，得到最終的表達(dá)載體pEll-IGR-geneofinterest,從而不必針對(duì)不同的興趣基因重新設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)重組方案，利用本發(fā)明提供的表達(dá)載體通過重組技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)多種興趣基因的批量檢測(cè)，提高工作效率，降低實(shí)驗(yàn)成本。4、雙向啟動(dòng)子Ptetbi—側(cè)為用于置換入興趣基因的讀碼框RFC，另一側(cè)為螢光素酶(luciferase，Luc),螢光素酶的表達(dá)水平可以間接反映興趣基因的表達(dá)狀態(tài)；通過檢測(cè)Luc的活性就可以間接檢測(cè)興趣基因的表達(dá)水平，使得確定興趣基因的表達(dá)簡(jiǎn)潔、方便。5、IRES(internalribosomeentrysite)被加在rtTA2SM2和EGFP-Puro的序列之間，實(shí)現(xiàn)這兩個(gè)基因被一個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。EGFP-Puro是綠色熒光蛋白和嘌羅霉素抗性蛋白的融合基因，可以用于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染該表達(dá)載體后的陽性轉(zhuǎn)染體的篩選。載體的轉(zhuǎn)染效率可以通過檢測(cè)綠色熒光細(xì)胞(EGFP陽性)的比例來完成；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀分選，結(jié)合嘌羅霉素篩選來完成，比現(xiàn)行的單一方法(如用抗生素)篩選，所需時(shí)間大為縮短。6、本表達(dá)載體由于沒有真核復(fù)制子，轉(zhuǎn)染入真核宿主細(xì)胞后，不能自主復(fù)制，只能整合到宿主的基因組才能表達(dá)；因此經(jīng)過篩選得到的穩(wěn)定細(xì)胞系，興趣基因己經(jīng)整合于宿主的基因組，具有長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)的特性和優(yōu)勢(shì)。圖1是RFC的DNA元件連接示意圖。圖2是表達(dá)載體pEll-IGR-RFC引入的DNA元件的連接示意圖。圖3是構(gòu)建表達(dá)載體pEll-IGR-外源性興趣基因的流程示意圖。圖4是表達(dá)載體pEll-IGR-p-catenin-ERa轉(zhuǎn)染HTEB56細(xì)胞后的熒光素酶的活性檢測(cè)結(jié)果圖；橫坐標(biāo)表示不同濃度Tet或Dox誘導(dǎo)的細(xì)胞，縱坐標(biāo)表示相對(duì)熒光素酶活性。圖5是表達(dá)載體pEll-IGR-p-catenin-ERa轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，以(3-catenin作為內(nèi)參照的Westem雜交檢測(cè)結(jié)果圖；橫坐標(biāo)表示不同濃度Tet或Dox誘導(dǎo)的細(xì)胞。圖6是以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，表達(dá)載體pE11-IGR-(3-catenin-ERa轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，以EGFP作為標(biāo)記進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分選的結(jié)果，與未進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分選的細(xì)胞對(duì)照?qǐng)D；橫坐標(biāo)為EGFP熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為相對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)；圖A是轉(zhuǎn)染32D細(xì)胞，圖B轉(zhuǎn)染HTB56細(xì)胞。圖7是純化的表達(dá)載體表達(dá)陽性的綠色細(xì)胞熒光顯微鏡照片。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明，所述實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是對(duì)本發(fā)明的限定。本發(fā)明所述的四環(huán)素嚴(yán)緊控制表達(dá)系統(tǒng)，是基于Tet開放型表達(dá)系統(tǒng)，Tet調(diào)控所需要的元件由兩個(gè)表達(dá)框(expressioncassettes)組成，其中一個(gè)編碼Tet或Dox反應(yīng)元件，另一個(gè)編碼抑制子。沿啟動(dòng)子方向插入抑制子rtTA2S-M2元件，其序列如SEQIDNO.l所示，編碼rtTA2S-M2蛋白；rtTA2S-M2是優(yōu)化的四環(huán)素反應(yīng)元件的抑制子。在無Tet和Dox存在時(shí)，rtTA2S-M2蛋白通過與四環(huán)素反應(yīng)表達(dá)元件(Tet或Dox反應(yīng)元件)結(jié)合，抑制其控制的基因轉(zhuǎn)錄；而Tet和Dox可以與rtTA2S-M2蛋白結(jié)合，從而解除對(duì)于Tet或Dox反應(yīng)元件的抑制，啟動(dòng)其控制基因的表達(dá)。四環(huán)素反應(yīng)表達(dá)框包括四環(huán)素控制的雙向啟動(dòng)子Ptetbi，Ptetbi—側(cè)為外源性興趣基因的讀碼框RFC，另一側(cè)為編碼螢光素酶(luciferase，Luc)的元件；所述Ptetbi的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示，RFC讀碼框的弓I入是為了能夠方便置換不同的興趣外源性基因，其核苷酸序列如SEQIDN0.3所示；Luc元件的引入是為了快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)真核表達(dá)載體的表達(dá)，其核苷酸序列如SEQIDN0.4所示。Ptetbi作為雙向啟動(dòng)子，Luc元件的表達(dá)水平可以間接反映興趣基因的表達(dá)狀態(tài)；通過檢測(cè)螢光素酶的活性間接檢測(cè)興趣基因的表達(dá)水平。為了具備高效篩選標(biāo)記，篩選表述載體表達(dá)陽性的細(xì)胞克隆，在表達(dá)載體Tet調(diào)控元件之后還引入表達(dá)融合蛋白EGFP-Puro的序列，其核苷酸序列如SEQIDN0.5所示；同時(shí)在兩者之間插入IRES序列，其核苷酸序列如SEQIDN0.6所示，實(shí)現(xiàn)這兩個(gè)基因被一個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，從而同時(shí)表達(dá)。EGFP-Puro是綠色熒光蛋白和嘌羅霉素抗性蛋白的融合蛋白，可以用于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染該表達(dá)載體后的陽性轉(zhuǎn)染體的篩選。載體的轉(zhuǎn)染效率可以通過檢測(cè)綠色熒光細(xì)胞(EGFP陽性)的比例來完成，同時(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞通過流式細(xì)胞術(shù)以EGFP標(biāo)記進(jìn)行分選，結(jié)合嘌羅霉素篩選來轉(zhuǎn)染細(xì)胞的純化。上述RFC的結(jié)構(gòu)參見Invitrogen公司的Gatewayvectorconversionsystem,目錄號(hào)11828-029，如圖l所示；RFC兩端的attRl和attR2是重組酶識(shí)別位點(diǎn)，primerl和primer2是測(cè)序引物，用于檢測(cè)attRl和attR2是否完整；氯霉素抗性基因Cm11(chloramphenicolresistancegene)用于篩選含有RFC的載體；ccdB基因，在沒有外源性基因插入的情況下，表達(dá)毒蛋白，會(huì)殺死沒有ccdB抗性的宿主菌，外源性興趣基因的導(dǎo)入會(huì)置換掉ccdB基因，從而有外源性基因插入的載體可以在沒有ccdB抗性的宿主菌中復(fù)制。如圖3所示，外源性興趣基因克隆入RFC的重組反應(yīng)興趣基因替換掉原有的ccdB毒蛋白序列，克隆入載體pENTR，獲得中間載體pENTR-geneofinterest;表達(dá)載體的RFC讀碼框和pENTR-geneofinterest經(jīng)過重組酶(GatewayClonaseenzymemixtures,Invitrogen)《崔j七，通過基因重纟且f尋至!j最纟冬的表達(dá)載體pEll-IGR-geneofinterest,從而不必針對(duì)不同的興趣基因重新設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)重組方案。pENTR的結(jié)構(gòu)(參見Invitrogen公司GatewaypENTRVectors,目錄號(hào)11813陽011,11816-014，11817-012，11818-010,11819-018)。RFC與pENTR-geneofinterest的重組反應(yīng)采用LR重組酶混合物II(Invitrogen，GatewayLRClonase.IIEnzymeMix,目錄號(hào)11791畫020)，該混合物含有細(xì)菌噬菌體的重組酶(Integrase)和切除酶(Excisionase)和整合宿主因子(IntegrationHostFactor,IHF)，可以識(shí)別attL與attR，催化上述目的載體(destinationnvector)和pENTR-geneofinterest的重組，將attLl和attL2之間的興趣基因?qū)肽康妮d體的attRl和attR2之間，從而完成LR重組反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)DNA序列的重組互換。具體實(shí)驗(yàn)步驟和條件如下(1)于室溫下在1.5ml的離心管加入以下成分，并混勻pENTR-geneofinterest(50-150ng/li1)，17y1，含RFC的四環(huán)素嚴(yán)緊控制表達(dá)系統(tǒng)，(150ng/tU)lulTE緩沖液(pH8.0)，8ul(2)LR重組酶混合物II冰浴解凍2min，振蕩混勻(2s/次)；(3)步驟(l)的離心管中加入LR重組酶混合物I1(2lU/管)，混勻；(4)25°C保溫l小時(shí)；(5)每管力口lul蛋白酶K溶液，37°C保溫10min，終止反應(yīng)；(6)取lul反應(yīng)液轉(zhuǎn)化DH5oc感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)獲取大量重組入興趣基因的四環(huán)素嚴(yán)緊控制表達(dá)載體。本發(fā)明將RFC引入四環(huán)素嚴(yán)緊控制表達(dá)載體，為方便、快捷的置換入不同的興趣基因做好準(zhǔn)備。因此，本發(fā)明提供的載體既能在真核細(xì)胞中有效表達(dá)和篩選興趣外源性基因，又能夠方便的置換不同的外源性興趣基因。以重組質(zhì)粒pEll-IGR-RFC來詳細(xì)說明上述元件的引入和表達(dá)載體的構(gòu)建。所構(gòu)建的重組質(zhì)粒以hCMV作為啟動(dòng)子，其DNA元件排列如圖2所示hCMV-rtTA2s-M2-IRES-EGFP-Puro-Luc-Ptetbi-RFC,其核苷酸序列如SEQIDN0.7所示。其構(gòu)建過程如下9第一步重組質(zhì)粒pIGR的制備以pUHrT62-l載體為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到831bp的產(chǎn)物片段，其兩端在引物合成時(shí)引入NheI和SacI酶切位點(diǎn)；PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切、純化，連接入pMA87(IRES/EGFP-Puro)載體，得到pIGR(hCMV-rtTA-IRES-EGFP-Puro)。pUHrT62-l和pMA87(IRES/EGFP-Puro)均由德國明斯特大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液與腫瘤學(xué)系CarstenMuller-Tidow教授惠贈(zèng)。第二步克隆pIGR(hCMV-rtTA-IRES-EGFP-Puro)和RFC(readingframeC，購自Invitrogen公司)以獲得足夠量的片段以pIGR為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到3695bp的產(chǎn)物，該產(chǎn)物采用ZeroBluntTOPOPCR亞克隆試劑盒(Invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)K2830-20)，構(gòu)建成pTOPO-IGR亞克?。粚FC(readingframeC，購自Invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)l1828-029),采用ZeroBluntTOPOPCR亞克隆試劑盒(Invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)K2830-20)構(gòu)建成pTOPO-RFC亞克隆；pTOPO-RFC和pTOPO-IGPR分別經(jīng)NsiI酶切獲得RFC(1826bp)和IGR(hCMV-rtTA-IRES國EGFP-P跳3741bp)。第三步重組質(zhì)粒pEll-RFC的制備pEll-CyclinAl(由德國明斯特大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液與腫瘤學(xué)系CarstenMuller-Tidow教授惠贈(zèng))和pTOPO-RFC分別經(jīng)PsiI和NsiI(PsiI和NsiI是同尾酶，即切出的末端相同)酶切，進(jìn)而將RFC片段連接入pEll，得到pEll-RFC(Luc國Ptetbi畫RFC)。第四步表達(dá)載體pEll-IGR-RFC的制備pEll-RFC經(jīng)過Clal酶切，連接入人工合成的接頭(linker),目的在于引入NsiI酶切位點(diǎn)，經(jīng)NsiI酶切，連接進(jìn)來自pTOPO-IGR的IGR片段，得到最終載體pEll-IGR-RFC(pEll-hCMV-rtTA-IRES-EGFP-Puro-Luc-Ptetbi-RFC)。10下面給出以P-catenin-ERa融合基因作為興趣基因克隆入表達(dá)載體pEll-IGR-RFC，構(gòu)建表達(dá)載體pEll-IGR-卩-catenin-ERa，并將其轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞為實(shí)施例說明本發(fā)明的載體應(yīng)用于外源性興趣基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)的篩選。融合基因P-catenin-ERa編碼一個(gè)包括野生型卩-catenin和雌激素受體a激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合體蛋白，P-catenin-ERa的基因序列由兩部分組成其中，3-catenin的序列參見GenBankaccessionno.Z19054;ERa的序列和結(jié)構(gòu)參見TrevorD.Littlewood,DavidC.Hancock,PaulS.Danielian,MalcolmG.Parker,andGerardI.EvanAmodifiedoestrogenreceptorligand國bindingdomainasanimprovedswitchfortheregulationofheterologousproteinsNucl.AcidsRes.199523:1686-1690。P-catenin-ERot融合蛋白和P《&16^11的分子量分別為136和92kD。按照上述表達(dá)載體的構(gòu)建方法，首先將P-catenin-ERa融合基因克隆進(jìn)入pENTR，形成中間載體pENTR-卩-catenin-ERa;其次，pENTR-卩-catenin-ERa與pEll-IGR-RFC體外重組，得到重組載體pEll-IGR-(3-catenin-ERa，并分別將pEll-IGR-卩-catenin-ERa分別轉(zhuǎn)染貼壁生長(zhǎng)的人肺癌細(xì)胞系HTB56和懸浮生長(zhǎng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系32D，評(píng)價(jià)載體中各個(gè)元件的效果，說明本發(fā)明提供的表達(dá)載體，在篩選真核細(xì)胞的表達(dá)的興趣外源性基因，具備簡(jiǎn)潔、高效、方便的篩選標(biāo)記，便于得到高純度的表達(dá)載體表達(dá)陽性的細(xì)胞。具體實(shí)施過程如下①細(xì)胞培養(yǎng)HTB56非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系培養(yǎng)于含10%無Tet胎牛血清(FCS)的MEM培養(yǎng)液(ModifiedEagle'smedium,Invitrogen，Calsbad,CA,USA)，培養(yǎng)液中補(bǔ)充1%的非必需氨基酸、lmM丙酮酸鈉、2mML-谷氨酰胺、100u/ml青霉素和IOOpg/ml鏈霉素，培養(yǎng)于37。C含5n/。C02的孵箱中。所述非必需氨基酸i是一種商品化的溶液，由七種IOmM的非必需氨基酸(丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸)溶液組成，購自HyClone公司，目錄號(hào)SH30236.01。小鼠骨髓瘤細(xì)胞系32D的培養(yǎng)按照已有報(bào)道的方法進(jìn)行(Mizuki，M.,R.Fenski，H.Halfter，I.Matsumura,R,Schmidt,C.Muller,W.Griming,K.Kratz-Albers，etal.2000.Flt3mutationsfrompatientswithacutemyeloidleukemiainducetransformationof32DcellsmediatedbytheRasandSTAT5pathways.Blood.96:3907-3914.)。②基因轉(zhuǎn)染HTB56細(xì)胞于轉(zhuǎn)染8h前接種于6孔培養(yǎng)板，密度為300，000細(xì)胞/孔。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體(Invitrogen,Carlsbad，CA，USA)，每孔轉(zhuǎn)染未經(jīng)線性化處理的lpEll-IGR國卩-catenin畫ERa，Tet或Dox(Sigma,St.Louis，MO，USA)在轉(zhuǎn)染后24h加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，不同孔的細(xì)胞加入的濃度線性遞增Tet:0-5pg/ml，Dox:0.01-l|ag/ml。在轉(zhuǎn)染32D細(xì)胞前，將pE11-IGR-卩-catenin-ERa用限制性內(nèi)切酶(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA，USA)處理，從而使其線性化。采用電穿孔轉(zhuǎn)染法，將含有3xl0632D細(xì)胞的300pl細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至直徑4mm的電轉(zhuǎn)杯，加入含32pg線性化的pEll-IGR-卩-catenin-ERa的懸浮液。電穿孔條件為采用EPI2500型電轉(zhuǎn)儀(PulseGeneratorEPI2500，F(xiàn)ischer,Heidelberg,Germany)，300V，6ms。③熒光素酶(Luciferase，Luc)活性檢測(cè)對(duì)于熒光素酶活性檢測(cè)，0.1pg編碼花蟲熒光素酶的pRLSV40與pEll-IGR-P-catenin-ERa共轉(zhuǎn)染，以便作為內(nèi)參照來標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染效率。同一樣品中熒光素酶和花蟲熒光素酶的活性，依次采用熒光素酶雙報(bào)告系統(tǒng)(Dual國LuciferaseReportAssaySystem,Promega,Madison,Wisconsin,USA)進(jìn)行測(cè)定(參照Promega公司螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)技術(shù)手冊(cè)，http:〃www.promega.com.cn/techserv/ctbs/yingguangTB281.pdf)。會(huì)圣過Tet或Dox處理24h，細(xì)胞經(jīng)PBS緩沖液(NaC116g，Na2HP04(12H20)，5.65g，KC10.4g，KH2PO40.4g加雙蒸水至1000mlpH7.0)洗2次，加入120pl裂解液，室溫裂解15min。取10(il細(xì)胞裂解產(chǎn)物，迅速與100pl螢火蟲熒光素酶測(cè)定試劑在發(fā)光管中混合；在5s預(yù)測(cè)定延遲之后，熒光素酶發(fā)射的光被記錄10s的時(shí)間，實(shí)驗(yàn)采用TD-20/20螢光光度計(jì)(TurnerDesignsInstrument,CA,USA)。隨后，100^螢火蟲熒光素酶測(cè)定試劑加入到同一發(fā)光管中，滅活螢火蟲熒光素酶的同時(shí)激活花蟲熒光素酶。檢測(cè)熒光素酶活性間接得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染效率的波動(dòng)，通過熒光素酶活性除以花蟲熒光素酶活性得以標(biāo)準(zhǔn)化校正。④Western雜交轉(zhuǎn)染表達(dá)載體的細(xì)胞經(jīng)過冰的PBS沖洗，在冰浴中以含150mMNaCl的RIPA緩沖液裂解30min(Tickenbrock,L.,J.Schwable,M.Wiedehage，B.Steffen，B.Sargin,C.Choudhary，C.Brandts,W.E.Berdel，etal.2005.Flt3tandemduplicationmutationscooperatewithWntsignalinginleukemicsignaltransduction.Blood.105:3699-3706.)，細(xì)胞裂解后離心20000gx10min去除細(xì)胞碎片和其他的不溶物。測(cè)定濃度后，裂解液在SDS加樣緩沖液中煮沸5min，SDS聚丙烯酰胺凝膠(PAGE,4-12%,Invitrogen)電泳分離。凝膠經(jīng)過轉(zhuǎn)PVDF(polyvinylidenedifluoride,Millipore,Bedford,MA,USA)膜，Western蛋白雜交采用抗人-卩-catenin為一抗(0.38|ig/ml，BDBiosciences,NJ，USA),進(jìn)而結(jié)合辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)標(biāo)記的二抗，最終以化學(xué)發(fā)光法(chemoluminescencedetection,ECLPlus,AmershamPharmacia,Uppsala,Sweden)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，來反映待檢抗原的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析定量數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS10.0(SPSSScience,Chicago,IL,USA)，多組間差異比較采用單因素方差分析，；O.05認(rèn)為有顯著差異。a、熒光素酶的活性檢測(cè)結(jié)果顯示，Tet或Dox嚴(yán)緊且定量的控制興趣基因的表達(dá)熒光素酶的活性檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)染pE11-IGR-p-catenin-ERa的HTEB56細(xì)胞暴露于不同濃度的Tet(0-5jig/ml)或Dox(0.01-1jig/ml)，橫坐標(biāo)表示經(jīng)不同Tet或Dox濃度誘導(dǎo)的細(xì)胞，縱坐標(biāo)表示相對(duì)熒光素酶活性(熒光素酶活性除以花蟲熒光素酶活性)，*表示P0.05,**表示P<0.001，以未經(jīng)Tet或Dox處理的對(duì)照細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性值設(shè)定為l。結(jié)果顯示0.055pg/mlTet或0.01~1pg/mlDox劑量依賴性的誘導(dǎo)熒光素酶表達(dá)，從表達(dá)幅度來看該表達(dá)載體對(duì)Dox比對(duì)Tet更加敏感。當(dāng)Dox的濃度達(dá)到lpg/ml，熒光素酶的活性比沒有Tet和Dox存在的情況下升高80倍左右(p<0.001)。這種劑量依賴性的誘導(dǎo)效應(yīng)顯示，興趣基因的表達(dá)水平可以通過加入不同劑量的Te域Dox人為調(diào)控。而熒光素酶的活性間接反映另一側(cè)(3-catenin-ERa的表達(dá)活性，說明通過Tet或Dox的劑量依賴性的誘導(dǎo)表達(dá)，興趣基因不但可以定性，還可以定量的在宿主細(xì)胞中表達(dá)。b、Tet或Dox對(duì)于p-catenin-ERa表達(dá)的誘導(dǎo)效應(yīng)融合基因卩-catenin-ERa編碼一個(gè)包括野生型卩-catenin和雌激素受體a激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合體蛋白。轉(zhuǎn)染pENTR-卩-catenin-ERa的32D細(xì)胞或者HTB56細(xì)胞經(jīng)過Dox或Tet處理24h之后，經(jīng)Western雜交檢觀!jp-catenin-ERa的表達(dá)。p-catenin-ERa融合蛋白和p-catenin的分子量分別為136和92kD，與預(yù)期分子量一致?？谷?P-catenin可以同時(shí)識(shí)別卩-catenin-ERa融合蛋白和野生型的卩-catenin，因此以野生型的P-catenin作為內(nèi)參照，結(jié)果如圖5所示，橫坐表示14經(jīng)不同濃度Tet(0-5(ig/ml)或Dox(0.01-1pg/ml)誘導(dǎo)的細(xì)胞。與熒光素酶的檢測(cè)結(jié)果相吻合，0.011pg/ml的Dox劑量依賴性的誘導(dǎo)卩-catenin-ERa表達(dá)，5嗎/ml的Tet也可以顯著誘導(dǎo)P-catenin-ERa的表達(dá)，并且在無Tet存在時(shí)卩-catenin-ERa的背景表達(dá)很低。無Tet或Dox時(shí)，卩-catenin-ERa的低背景表達(dá)提示，該表達(dá)系統(tǒng)的誘導(dǎo)控制非常嚴(yán)緊。c、EGFP是流式細(xì)胞術(shù)篩選表達(dá)載體陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞的有效標(biāo)記在表達(dá)載體pEll-IGR-j3-catenin-ERa中，EGFP-Puro組成型表達(dá)，與Tet或Dox控制的表達(dá)框被一個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，分別獨(dú)立表達(dá)。綠色熒光蛋白EGFP作為一種篩選標(biāo)記，轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞后會(huì)表達(dá)綠色熒光蛋白EGFP，流式細(xì)胞儀可以檢測(cè)到該綠色熒光，并且以此作為分選標(biāo)記，經(jīng)過流式細(xì)胞術(shù)可以檢測(cè)到EGFP陽性細(xì)胞，以此來評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率；同時(shí)經(jīng)過流式細(xì)胞術(shù)分選，還可以得到純度相當(dāng)高的EGFP陽性細(xì)胞，起到純化陽性細(xì)胞的作用。分選過程在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)就可以完成，相對(duì)于幾周甚至幾個(gè)月的抗生素篩選節(jié)省了時(shí)間，提高了效率。如圖6所示，采用正常(未轉(zhuǎn)染)HTB56或32D細(xì)胞作為陰性對(duì)照細(xì)胞，表達(dá)載體pEll-IGR-卩-catenin-ERa轉(zhuǎn)染細(xì)胞后以EGFP作為標(biāo)記進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分選的結(jié)果，與未進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分選的細(xì)胞對(duì)照?qǐng)D；圖中所示的細(xì)胞分為"未轉(zhuǎn)染"(沒有轉(zhuǎn)染pEll-IGR-p-catenin-ERa表達(dá)載體，陰性對(duì)照)、"轉(zhuǎn)染后未分選"(轉(zhuǎn)染pEll-IGR-卩-catenin-ERa表達(dá)載體后，沒有通過EGFP標(biāo)記分選的總體細(xì)胞)和"轉(zhuǎn)染后經(jīng)分選"(轉(zhuǎn)染pEll-IGR-卩-catenin-ERa表達(dá)載體后，以EGFP標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)分選的具有綠色熒光的細(xì)胞)，而"陽性細(xì)胞范圍"是指在選定的熒光強(qiáng)度范圍內(nèi)(x軸)，陰性細(xì)胞即不發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞計(jì)數(shù)(y軸)小于l%。如圖6A所示，在選定的熒光強(qiáng)度范圍內(nèi)，"未轉(zhuǎn)染"、"轉(zhuǎn)染后未分選"和"轉(zhuǎn)染后經(jīng)分選"的32D細(xì)胞中，陽性細(xì)胞的比例分別為0.84%，7.97%和67.76%;如圖6B所示，在選定的熒光強(qiáng)度范圍內(nèi)，"未轉(zhuǎn)染"、"轉(zhuǎn)染后未分選"和"轉(zhuǎn)染后經(jīng)分選"的HTB56細(xì)胞中，EGFP陽性細(xì)胞的比例分別為0.16%,9.80%和79.05%。以上結(jié)果顯示，EGFP是一個(gè)有效的流式細(xì)胞術(shù)分選標(biāo)記。表達(dá)載體轉(zhuǎn)染48h后只有不到10%的綠色細(xì)胞，經(jīng)過流式細(xì)胞術(shù)分選后，綠色細(xì)胞占70%左右。相對(duì)較低的轉(zhuǎn)染效率可能是由于該表達(dá)載體大于10kb。盡管瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的效率不高，但是，低背景表達(dá)和高效的誘導(dǎo)特性能夠保證該載體易于篩選、擴(kuò)增。而且綠色細(xì)胞偏少的另外一個(gè)原因是該載體中沒有真核復(fù)制子，因此轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞后，不能在胞漿中自主復(fù)制。有報(bào)道顯示，一些游離復(fù)制載體(沒有整合到宿主的基因組)不能長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，其原因就是抗生素的篩選不能分辨出興趣基因是游離的，還是整合于基因組的OJrlinger,S.,U.Baron,M.Thdlmann，M.丁.Hasan,RBujardandW.Hillen.2000.Exploringthesequencespacefortetracycline-dependenttranscriptionalactivators:novelmutationsyieldexpandedrangeandsensitivity.ProcNatlAcadSciUSA.97:7963-7968.)?？紤]到表達(dá)穩(wěn)定性，在表達(dá)載體的構(gòu)建過程中，去除了該表達(dá)載體中的真核復(fù)制原。這樣做的優(yōu)點(diǎn)是，一旦得到穩(wěn)定的細(xì)胞系，興趣基因一定是已經(jīng)整合于基因組中，有利于長(zhǎng)期研究興趣基因的功能。另外與轉(zhuǎn)染HTB56細(xì)胞相比，成功的用電穿孔方法將線性化的pEll-IGR-卩-catenin-ERa轉(zhuǎn)染進(jìn)入32D細(xì)胞；這表明，無論對(duì)于貼壁生長(zhǎng)還是懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，該載體是否線性化，都能有效轉(zhuǎn)染和表達(dá)。d、流式細(xì)胞術(shù)對(duì)EGFP分選，結(jié)合嘌羅霉素篩選可以獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系針對(duì)EGFP-Puro融合蛋白，HTB56細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEll-IGR-卩-catenin-ERa,48h后，以0.5ng/ml的嘌羅霉素(Sigma，St.Louis,MO,USA)篩選，同時(shí)每過1-2周，采用流式細(xì)胞術(shù)分選、純化綠色的EGFP陽性細(xì)胞。經(jīng)過2-3月，得到純度高于90%的綠色細(xì)胞，也即表達(dá)載體表達(dá)陽性的細(xì)胞，如圖7所示熒光顯微鏡照片。核苷酸序列表<110〉中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)〈120〉一種四環(huán)素嚴(yán)緊調(diào)控的真核表達(dá)載體〈160〉7〈210〉1〈211〉771〈212〉腿〈213〉人工合成〈400〉1tcgacaattcaccatgtct已gactggacaagagca已a(bǔ)gtcataaacggcgctctggaattGOactcaatggsgtcggtatcgaaggcctgacgscaaggaaactcgctcaaaagctgggagt120tgagcagcctaccctgtactggcacgtgaagaacaagcgggccctgctcgatgccctgcc180aatcgagatgctggacaggcatcatacccacttctgccccctggaaggcgagtcatggca240agactttctgcggaacaacgccaagtcattccgctgtgctctcctxtcacatcgcgacgg300ggctaaagtgcatctcggcacccgcccaacagagaaacagtacgaaaccctgg犯aatca360gctcgcgttcctgtgtcagcaaggcttctccctggagaacgcactgtacgctctgtccgc420cgtgggccactttacactgggctgcgtattggaggaacaggagcatc犯gtagcaaaaga480ggaaagagagacacctaccaccgsttctatgcccccscttctgagscaagcaattgagct540gttcgaccggcagggagccgaacctgccttccttttcggcctggaactaatcatatgtgg600cctggaga犯cagctaaagtgcgaaagcggcgggccggccgacgcccttgacgattttga660cttagacatgctcccagccgatgcccttgacgactttgaccttgatatgctgcctgctga720cgctcttgacgattttgaccttgacatgctccccgggtaactaagtaagga771〈210〉2〈211〉618〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉2ctagcacgcgtcagctgactagaggatxcccgggtaccgagctcgaattcggggccgcgg60aggctggatcggtcccggtgtcttctatggaggtcaaaacagcgtggatggcgtctccag120gcgatctgacggttcactaaacgagctctgcttatataggcctcccaccgtacacgccta180ctcgacccgggtaccgagctcgactttcacttttctctatcactgatagggagtggtaaa240ctcgactttcacttttctctatcactgatagggagtggtaaactcgactttcacttttct300ctatcactgatagggagtggtaaactcgactttcacttttctctatcactgatagggagt360ggtaaactcgactttcacttttctctatcactgatagggagtggtaaactcgactttcac420ttttctctatcactgatagggagtggtaaactcgactttcacttttctctatcactgata480gggagtggtaaactcgacctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctg54018gagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccg600cggccccgaattcctgca618<210>3〈211〉3434〈212〉■〈213〉人工合成〈400〉3atcaaac33gtttgtac3as已33gctg33cgsgaaacgt3333tg3tat383tatc33t360tattaaattagattttgcataa已a(bǔ)aac已gactacataatactgta已a(bǔ)acacsacatatcc120agtcctatgggcggccgcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgta180taatgtgtgg已ttttgagttaggatccgtcgagattttcaggagctasggaagct已a(bǔ)aat240ggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaaca300ttttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataacc已gaccgttcagctggatat兆0tacggcctttttaaagsccgtaaagaa犯ataagcacaagttttatccggcctttattca420cattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatga已a(bǔ)gscggtga480gctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaac540gttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattc600gcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaa660tatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggc720caatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcga780caaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtttgtgatggcttccatgt840cggcagaatgcttaatga已ttacsacsgtactgcgatg已gtggcaggcggggcgtaatct900agaggatccggcttactaaaagccagataacagtatgcgtatttgcgcgctgatttttgc960ggtataagaatatatactgatatgtatacccg犯gtatgtcaaaaagaggtatgctatga1020agcagcgtattacagtgacagttgacagcgacagctatcagttgctcaaggcatatatga1080tgtcaatatctccggtctggtaagcacaaccatgcagaatgaagcccgtcgtctgcgtgc1140cgaacgctggaaagcggaaaatcaggsagggatggctgaggtcgcccggtttattgaaat1200gaacggctcttttgctgacgagaacaggggctggtgaaatgcagtttaaggtttacacct1260ataaaagagagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacgc1320ccgggcgacggatggtgatccccctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtccccc1380gtgaactttacccggtggtgcatatcggggatgaaagctggcgcatgatgaccaccgata1440tggccagtgtgccggtctccgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaa1500atgacatcaaaaacgccattaacctgatgttctggggaatataaatgtcaggctccctta1560tacacagccagtctgcaggtcgaccatagtgactggatatgttgtgttttacagtattat1620gtagtctgttttttatgcaaaatctaatttaatatattgatatttatatcattttacgtt1680tctcgttcagctttcttgtacaaagtggttcgatrvrscmatcgaaccactttgtacaag1740aaagctgaacgagaaacgtaaaatgatataaatatcaatatattaaattagattttgcat1800aaaaaacagactacataatactgtaaaacacaacatatccagtcactatggtcgacctgc1860agactggctgtgtataagggagcctgacatttatattcccc已gaacatcaggttaatggc1920gtttttgatgtcattttcgcggtggctgagatcagccacttcttccccgataacggagac198019cggcacactggccatatcggtggtcatcatgcgccagctttcatccccgatatgcaccac2040cgggtaaagttcacgggggactttatctgacagcagacgtgcactggccagggggatcac2100catccgtcgcccgggcgtgtcaataatatcactctgtacatccacaaacagacgataacg2160gctctctcttttataggtgtaaaccttaaactgcatttcaccagcccctgttctcgtcag2220caaaagagccgttcatttcaataaaccgggcgacctcagccatcccttcctgattttccg2280ctttccagcgttcggcacgcagacgacgggcttcattctgcatggttgtgcttaccagac2340cggagatattgacatcatatatgccttgagcaactgatagctgtcgctgtcaactgtcac2400tgtaatacgctgcttcatagcatacctctttttgacatacttcgggtatacatatcagta2460tatattcttataccgcaaaastceigcgcgcaaatacgcatactgttatctggcttttagt2520aagccggatcctctagattacgccccgcctgccactcatcgcagtactgttgtaattcat2580taagcattctgccgacatggaagccatcacaaacggcatgatgaacctgaatcgccagcg2640gcatcagcaccttgtcgccttgcgtataatatttgcccatggtgaaaacgggggcgaaga2700agttgtccatattggccacgtttaaatcaaaactggtgaaa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