專利名稱：：一種雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性的預(yù)測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生理生化檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種基于檢測(cè)乳腺癌ERa和ER卩相對(duì)表達(dá)水平的雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性的預(yù)測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：乳腺癌是一種激素誘發(fā)的腫瘤，全球每年約有120萬(wàn)婦女發(fā)生乳腺癌，有50萬(wàn)的婦女死于乳腺癌，在西歐、北美等發(fā)達(dá)國(guó)家，乳腺癌的發(fā)病率占女性惡性腫瘤首位；我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率近年來(lái)不斷地上升，并出現(xiàn)了年輕化的趨勢(shì)。根據(jù)乳腺癌激素誘發(fā)的特點(diǎn)，對(duì)患者進(jìn)行內(nèi)分泌治療已有100多年的歷史。目前，針對(duì)雌激素受體(estrogenreceptor,ER)作為治療靶點(diǎn)，以雌激素受體拮抗劑，作為對(duì)ER陽(yáng)性乳腺癌的第一線療法之一。ER屬于核受體超家族的成員之一，是一種配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，它與雌激素特異性結(jié)合，通過(guò)雌激素應(yīng)答元件(ERE)來(lái)調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。人類ER有兩種亞型，即ERa和ER卩，分別定位于6號(hào)和14號(hào)染色體，其相對(duì)分子量分別為65和59kDa，編碼ERa和ER^的基因其NCBIGenbankERa和ERJ3的GeneID分別為2099和2100。ER是多結(jié)構(gòu)域蛋白，分為6個(gè)結(jié)構(gòu)域，按功能又可分為4個(gè)功能域轉(zhuǎn)錄激活功能域、DNA結(jié)合域、配體結(jié)合域和受體變構(gòu)過(guò)程中的鉸鏈區(qū)。在發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)雌激素受體ERa后約10年，人們于1996年成功地克隆鑒定了第二個(gè)雌激素受體ER卩。兩者具有相似的生化特征，氨基酸序列具有一定的同源性，并且兩者的功能區(qū)非常相似，結(jié)構(gòu)上的相似性使兩種受體均可以識(shí)別并結(jié)合相似的ERE，但是這兩種受體結(jié)合的配體并不完全相同。臨床上使用雌激素受體拮抗劑治療乳腺癌的原理就是利用拮抗劑與17P-雌二醇競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ERa，減低雌激素對(duì)靶器官的剌激作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)許多存在于植物中的非甾體化合物，其結(jié)構(gòu)和生物活性類似于雌激素，被稱為植物雌激素。研究較多的植物雌激素包括異黃酮類、木酚素類、香豆素類、真菌雌激素類及非黃酮類多酚化合物，如白藜蘆醇等。這些植物雌激素主要選擇性的與ER卩結(jié)合，而與ERa親和力較低。ERa主要分布于子宮、乳腺、胎盤、肝臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨骼等雌激素的靶組織，而ERP的分布更為廣泛。除了上述在配體結(jié)合及組織分布方面的不同外，ERa和ER卩的轉(zhuǎn)錄活性及其與協(xié)同因子的相互作用也往往不同，提示兩者的功能和生物學(xué)效應(yīng)存在很大差別。雌激素受體拮抗劑是目前應(yīng)用最多的內(nèi)分泌治療方法，廣泛應(yīng)用于各期乳腺癌一線內(nèi)分泌治療。它能與雌激素競(jìng)爭(zhēng)激素受體，阻斷雌激素相關(guān)基因的表達(dá)，使癌細(xì)胞維持在Gl期，從而減慢細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)。但約有30%的患者接受他莫昔芬(三苯氧胺)類藥物內(nèi)分泌治療并沒(méi)有取得明顯的治療效果，但其抗藥原因目前不清，對(duì)其耐藥機(jī)制的研究也成為熱點(diǎn)。雌激素受體(ER)作為乳腺癌病人預(yù)后因子以及治療靶點(diǎn)有著重要的臨床意義，腫瘤活檢檢測(cè)ER已經(jīng)成為選擇治療方案的常規(guī)步驟。目前，臨床實(shí)驗(yàn)室采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)乳腺癌的ER表達(dá)水平時(shí)，使用的抗體大多只針對(duì)ERa或不能有效的區(qū)分ERa和ER卩。臨床乳腺癌組織活檢只根據(jù)ERa的表達(dá)情況考慮是否使用他莫昔芬類雌激素受體拮抗藥物，而忽視ER卩的檢測(cè)造成部分病人出現(xiàn)耐藥反應(yīng)以及子宮內(nèi)膜癌等副作用。隨著醫(yī)療水平的提高，針對(duì)不同的患者的具體情況，結(jié)合相關(guān)治療靶點(diǎn)的表達(dá)狀態(tài)，提出乳腺癌個(gè)體化治療方法，能夠有效的避免用藥的副作用，提高治療、預(yù)后效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的解決的問(wèn)題在于提供一種雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性的預(yù)測(cè)方法，該方法采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)ERa和ERP在乳腺癌的相5對(duì)表達(dá)水平，預(yù)測(cè)雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性，為指導(dǎo)臨床乳腺癌個(gè)體化用藥提供可行性基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性的預(yù)測(cè)方法，采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)ERa和ER|3在乳腺癌的相對(duì)表達(dá)水平，以對(duì)雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性做出預(yù)測(cè)，具體包括以下步驟1)設(shè)計(jì)并合成ERa的PCR擴(kuò)增引物對(duì)Pl和ERP的PCR擴(kuò)增引物對(duì)P2:引物對(duì)P1為上游引物gcagggagaggagtttgtgt20;下游弓I物atgtgggagaggatgaggag20;引物對(duì)P2為上游引物tgtctgcagcgattacgca20;下游引物:gcgccggtttttatcgatt19;2)作為對(duì)照的正常組織ERa和ERP基因的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)以乳腺癌旁5cm外的乳腺組織作為正常組織,破碎乳腺癌旁5cm外的乳腺活檢組織細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA基因組作為模板，分別以PI和P2作為引物，相對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)ERa和E鄧基因的mRNA表達(dá)水平作為正常對(duì)照；3)待測(cè)乳腺癌ERa和ERP基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)破碎待測(cè)乳腺癌活檢組織的細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA基因組作為模板，分別以PI和P2作為引物，相對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)ERa和E鄧基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平；4)將待測(cè)乳腺癌活檢組織的ERa和ERp基因的相對(duì)表達(dá)水平與正常對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，分析雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物的耐藥性6當(dāng)待測(cè)乳腺癌活檢組織的ERa/ERP的比值大于正常對(duì)照的ERa/ERp的比值時(shí)，該待測(cè)乳腺癌活檢組織對(duì)雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物表現(xiàn)為不耐藥性；否則，該待測(cè)乳腺癌活檢組織對(duì)雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物表現(xiàn)為耐藥性。所述的雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物為雌激素衍生物、甾體類復(fù)合物或非甾體復(fù)合物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果-1、本發(fā)明提供的基于檢測(cè)乳腺癌ERa和ER(3相對(duì)表達(dá)水平的雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性的預(yù)測(cè)方法，為指導(dǎo)臨床乳腺癌個(gè)體化用藥提供可行性基礎(chǔ)，能夠減少盲目用藥導(dǎo)致的耐藥反應(yīng)和副作用。2、本發(fā)明提供的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析ERa和ERp相對(duì)表達(dá)水平，克服了目前免疫組織化學(xué)法檢測(cè)乳腺癌的ER表達(dá)水平時(shí)忽視ERP的檢測(cè)；而且mRNA水平的檢測(cè)準(zhǔn)確、方便，以病人自身的乳腺活檢組織作為正常對(duì)照，對(duì)其癌組織的ERa和ERp相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)具有特異性，而且在擴(kuò)增引物統(tǒng)一的基礎(chǔ)上便于標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)施。3、本發(fā)明提供的檢測(cè)ERa和ERI3引物的溶解曲線為單一峰，保證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。4、本發(fā)明提供的預(yù)測(cè)方法還與藥物使用的預(yù)后性相關(guān)，ERa/ERp比值大于正常對(duì)照組病例的無(wú)復(fù)發(fā)生存率和總生存率均明顯高于ERo/ER|3比值小于正常對(duì)照組。圖1為是以ERa/ER(3雙陽(yáng)性表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞T-47D的cDNA基因組為模版，實(shí)時(shí)定量PCR絕對(duì)定量檢測(cè)表明引物對(duì)P1擴(kuò)增的ERa溶解曲線為單一峰，其中橫坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為實(shí)時(shí)定量PCR熒光值；圖2為是以ERa/ER(3雙陽(yáng)性表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞T-47D的cDNA基因組為模版，實(shí)時(shí)定量PCR絕對(duì)定量檢測(cè)表明引物對(duì)P2擴(kuò)增的ERP溶解曲線為單一峰，其中橫坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為實(shí)時(shí)定量PCR熒光值；圖3是實(shí)時(shí)定量PCR相對(duì)定量檢測(cè)ERa表達(dá)水平的直方圖，以正常乳腺組織ERamRNA表達(dá)水平作為參照，16例病理報(bào)告ER陽(yáng)性乳腺癌中，6例癌標(biāo)本ERa的表達(dá)高于正常對(duì)照，10例癌標(biāo)本ERa的表達(dá)低于正常對(duì)照；圖4是實(shí)時(shí)定量PCR相對(duì)定量檢測(cè)ERP表達(dá)水平的直方圖，以正常乳腺組織ERpmRNA表達(dá)水平作為參照，16例病理報(bào)告ER陽(yáng)性乳腺癌中，11例癌標(biāo)本ERP的表達(dá)低于正常對(duì)照，5例癌標(biāo)本ERP的表達(dá)與正常對(duì)照無(wú)顯著差異；圖5是基于實(shí)時(shí)定量PCR相對(duì)定量檢測(cè)ERa/ER|3的直方圖，以正常乳腺組織ERa與ER(3mRNA比值作為參照，16例病理報(bào)告ER陽(yáng)性乳腺癌中，7例癌標(biāo)本ERa/ERp比值大于正常組，9例癌標(biāo)本ERa/ER卩比值小于正常組。具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)描述，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。本發(fā)明對(duì)臨床乳腺癌組織ER陽(yáng)性，并服用雌激素受體拮抗藥物的長(zhǎng)期隨訪病人作為檢測(cè)對(duì)象，總結(jié)得到一種雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物(雌激素衍生物、甾體類復(fù)合物或非甾體復(fù)合物)耐藥性的預(yù)測(cè)方法，采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)ERa和ERP在乳腺癌的mRNA相對(duì)表達(dá)水平，以對(duì)雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性做出預(yù)測(cè)，具體包括以下步驟1)設(shè)計(jì)并合成ERa的PCR擴(kuò)增引物對(duì)Pl和ERP的PCR擴(kuò)增引物對(duì)P2:引物對(duì)P1為上游引物gcagggagaggagtttgtgt20;下游弓I物atgtgggagaggatgaggag20;引物對(duì)P2為8上游引物tgtctgcagcgattacgca20;下游引物gcgccggtttttatcgatt19;并以P-actin基因的擴(kuò)增作為內(nèi)參照，其擴(kuò)增的引物對(duì)為上游引物atcatgtttgagaccttcaaca22;下、游引物:catctcttgctcgaatcca19;提取ERa/ER卩雙陽(yáng)性表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞T-47D細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄其基因組cDNA，并以其cDNA為模板實(shí)時(shí)熒光PCR絕對(duì)定量擴(kuò)增ERa和E鄧，檢測(cè)Pl和P2作為擴(kuò)增引物的特異性；結(jié)果如圖1、圖2所示，弓|物對(duì)Pl擴(kuò)增的ERa、引物對(duì)P2擴(kuò)增的ERJ3其溶解曲線均為單一峰，表明引物對(duì)Pl、P2能夠特異性的擴(kuò)增ERa、ERP;所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)出現(xiàn)于1996年，該技術(shù)的核心是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，通過(guò)最后擴(kuò)增的目標(biāo)片段數(shù)量(通過(guò)分析熒光強(qiáng)度得出)對(duì)模板包含的目標(biāo)基因定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩種，探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類則是利用熒光染料或者特殊設(shè)計(jì)的弓I物來(lái)指示擴(kuò)增的增加。前者由于增加了探針的識(shí)別步驟，特異性更高，但后者則簡(jiǎn)便易行，本發(fā)明采用非探針類。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分為絕對(duì)定量和相對(duì)定量，絕對(duì)定量用于判斷引物的優(yōu)劣及擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性；相對(duì)定量用于分析不同樣品的mRNA表達(dá)量的差異。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用Takara公司的SYBRGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCRMasterMix，該Mix里含有SYBRGreenI可用于未標(biāo)記引物的摻入法實(shí)時(shí)熒光定量PCR，每個(gè)樣本分別擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參照基因，并分別設(shè)兩個(gè)復(fù)孔。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為SYBRGreenRealtimePCRMix12.5(ilRox0.5}xlcDNA5^1上游引物(10pM4U)lpl下游引物(10pM4d)1^1水5^1實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件絕對(duì)定量95.0。C預(yù)變性10s，95.0。C變性5s，60.0°C退火及延伸34s，40個(gè)循環(huán);95.0。C變性15s，60.(TC退火及延伸60s，95.0。C變性15s，l個(gè)循環(huán)。相對(duì)定量95.0。C預(yù)變性10s，95.0'C變性5s，60.0'C退火及延伸34s，共45個(gè)循環(huán)；相對(duì)定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR以正常對(duì)照設(shè)定為1，測(cè)出待測(cè)目標(biāo)與正常對(duì)照的相對(duì)比值，分析其mRNA表達(dá)量的差異。2)作為對(duì)照的正常組織ERa和ERP基因的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)-醫(yī)學(xué)上判定乳腺癌旁5cm外的乳腺組織為正常組織，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)其ERa和ER卩基因的mRNA表達(dá)水平作為正常對(duì)照；待測(cè)乳腺癌旁5cm外的乳腺活檢組織中加入試劑Trizol，使用勻漿器破碎細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA基因組作為模板，以l3-actin的擴(kuò)增作為內(nèi)參照，分別以P1和P2作為引物，相對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)ERa和ERJ3的表達(dá)量作為正常對(duì)照；3)待測(cè)乳腺癌組織ERa和ERp基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)分離待測(cè)乳腺癌活檢組織中加入試劑Trizol,使用勻槳器破碎細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA基因組作為模板，以P-actin基因的擴(kuò)增作為內(nèi)參照，分別以Pl和P2作為引物，相對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)ERa和ERP基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平；按照上述2)、3)所述方法，對(duì)臨床乳腺癌組織ER陽(yáng)性，并服用他莫昔芬類雌激素受體拮抗藥物的長(zhǎng)期隨訪病人作為檢測(cè)對(duì)象，以其自身的乳腺癌旁5cm的乳腺活檢組織的ERa和ERPmRNA表達(dá)水平作為正常對(duì)照；分析其乳腺癌活檢組織ERa和ERpmRNA相對(duì)表達(dá)水平實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明16例長(zhǎng)期隨訪乳腺癌病人中，6例癌標(biāo)本ERa的表達(dá)高于正常對(duì)照，10例癌標(biāo)本ERa的表達(dá)低于正常對(duì)照，參見(jiàn)圖3;11例癌標(biāo)本ER卩的表達(dá)低于正常對(duì)照，5例癌標(biāo)本ERP的表達(dá)與正常對(duì)照無(wú)顯著差異，參見(jiàn)圖4;4)將待測(cè)乳腺癌ERa和ERp基因的相對(duì)表達(dá)水平與正常對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，分析雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物的耐藥性上述16例長(zhǎng)期隨訪乳腺癌病人中，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明7例癌標(biāo)本ERa/ER卩比值大于正常組，9例癌標(biāo)本ERct/E鄧比值小于正常組；結(jié)合病人的隨訪資料，7例ERa/ERJ3比值大于正常組的乳腺癌患者均未出現(xiàn)耐藥，而另外9例ERa/ERp比值小于正常組的患者有5例出現(xiàn)耐藥，而且ERa/ERj3比值大于正常組病例的無(wú)復(fù)發(fā)生存率和總生存率均明顯高于ERo/ERp比值小于正常組病例，具體數(shù)據(jù)參見(jiàn)表l，根據(jù)表1繪制的直方圖參見(jiàn)圖5。表1ERa/ER|3檢測(cè)結(jié)果及對(duì)于服用藥物的耐藥反應(yīng)對(duì)照表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>6<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>其中，三苯氧胺屬于雌激素衍生物，法樂(lè)通屬于雌激素衍生物，氟維司群屬于甾體類復(fù)合物，樞瑞屬于雌激素衍生物?？偨Y(jié)得到ERa和ERP基因的相對(duì)表達(dá)水平與雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物的耐藥性的相關(guān)性為當(dāng)待測(cè)乳腺癌活檢組織的ERa/ERp比值大于正常對(duì)照時(shí)，待測(cè)乳腺癌活檢組織對(duì)雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物表現(xiàn)為不耐藥性；當(dāng)待測(cè)目標(biāo)ERa/ERp比值小于正常對(duì)照組時(shí)，其雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性為耐藥性；雖然上述隨訪結(jié)果表明ERo/ER(3比值小于正常對(duì)照組時(shí)可能為不耐藥性，但由于ERa/ERp比值大于正常組病例的無(wú)復(fù)發(fā)生存率和總生存率均明顯高于ERa/ER(3比值小于正常組病例，因此，總體上將待測(cè)乳腺癌活檢組織的ERa/ER卩比值小于正常對(duì)照組時(shí)，待測(cè)乳腺癌活檢組織對(duì)雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物表現(xiàn)為歸結(jié)為耐藥性。12核苷酸序列表<110>中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)<120>—種雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性的預(yù)測(cè)方法<160>6<210>1<211>20<212>DNA〈13〉人工合成的引物對(duì)P1的上游引物<400>1gcagggagaggagtttgtgt20<210>2<211>20<212>DNA〈13〉人工合成的引物對(duì)P1的下游引物<400>2atgtgggagaggatgaggag20<210>3<211>20<212>DNA〈213〉人工合成的引物對(duì)P2的上游引物<400>3tgtctgcagcgattacgca20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工合成的引物對(duì)P2的下游引物<400>4gcgccggtttttatcgatt19<210>5<211>22<212>DNA<213>人工合成的P-actin基因擴(kuò)增的上游引物<400>5atcatgtttg3gaccttc肌cs22<210>6<211>19<212>DNA<213>人工合成的(3-actin基因擴(kuò)增的下游引物<400>6catctcttgctcgaatcca191權(quán)利要求1、一種雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性的預(yù)測(cè)方法，其特征在于，采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)ERα和ERβ在乳腺癌的相對(duì)表達(dá)水平，以對(duì)雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物的耐藥性做出預(yù)測(cè)，具體包括以下步驟1)設(shè)計(jì)并合成ERα的PCR擴(kuò)增引物對(duì)P1和ERβ的PCR擴(kuò)增引物對(duì)P2引物對(duì)P1為上游引物gcagggagaggagtttgtgt20；下游引物atgtgggagaggatgaggag20；引物對(duì)P2為上游引物tgtctgcagcgattacgca20；下游引物gcgccggtttttatcgatt19；2)作為對(duì)照的正常組織ERα和ERβ基因的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)以乳腺癌旁5cm外的乳腺組織作為正常組織，破碎乳腺癌旁5cm外的乳腺活檢組織細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA基因組作為模板，分別以P1和P2作為引物，相對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)ERα和ERβ基因的mRNA表達(dá)水平作為正常對(duì)照；3)待測(cè)乳腺癌ERα和ERβ基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)破碎待測(cè)乳腺癌活檢組織的細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA基因組作為模板，分別以P1和P2作為引物，相對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)ERα和ERβ基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平；4)將待測(cè)乳腺癌活檢組織的ERα和ERβ基因的相對(duì)表達(dá)水平與正常對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，分析雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物的耐藥性當(dāng)待測(cè)乳腺癌活檢組織的ERα/ERβ的比值大于正常對(duì)照的ERα/ERβ的比值時(shí)，該待測(cè)乳腺癌活檢組織對(duì)雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物表現(xiàn)為不耐藥性；否則，該待測(cè)乳腺癌活檢組織對(duì)雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物表現(xiàn)為耐藥性。2、如權(quán)利要求1所述的雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性的預(yù)測(cè)方法，其特征在于，所述的雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物為雌激素衍生物、甾體類復(fù)合物或非甾體復(fù)合物。全文摘要本發(fā)明公開了一種雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性的預(yù)測(cè)方法，采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)ERα和ERβ在乳腺癌的相對(duì)表達(dá)水平，以對(duì)雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性做出預(yù)測(cè)，將待測(cè)目標(biāo)ERα和ERβ基因的相對(duì)表達(dá)水平與正常對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，分析雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物的耐藥性當(dāng)待測(cè)目標(biāo)ERα/ERβ比值大于正常對(duì)照組時(shí)，其雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性為陰性；當(dāng)待測(cè)目標(biāo)ERα/ERβ比值小于正常對(duì)照組時(shí)，其雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性為陽(yáng)性。本發(fā)明提供的耐藥性的預(yù)測(cè)方法，為指導(dǎo)臨床乳腺癌個(gè)體化用藥提供可行性基礎(chǔ)，能夠減少盲目用藥導(dǎo)致的耐藥反應(yīng)和副作用。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101659994SQ20091002359公開日2010年3月3日申請(qǐng)日期2009年8月14日優(yōu)先權(quán)日2009年8月14日發(fā)明者劉新平,燕李,李紹青,藥立波申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)