專利名稱：橙色粘球菌jch-04及抗菌代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及粘球菌及抗菌物質(zhì)的培養(yǎng)方法，具體涉及橙
色粘球菌JCH-04及抗菌代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)方法，屬于生物技
術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
粘細(xì)菌(M少jco^c^/ra)是一類具有復(fù)雜多細(xì)胞行為的原 核生物，是一類可滑動(dòng)的、專性好氧革蘭氏陰性桿菌，在細(xì) 胞分化、發(fā)育和生物進(jìn)化研究中占有重要地位。粘細(xì)菌的次 級(jí)代謝產(chǎn)物與放線菌相似，包含多種化合物結(jié)構(gòu)類型，根據(jù) 己經(jīng)報(bào)道的粘細(xì)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型，絕大多數(shù)是僅 在粘細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)新結(jié)構(gòu)化合物，到目前為止，只有4種化合 物在其他生物中發(fā)現(xiàn)過，粘細(xì)菌的一個(gè)菌株可以產(chǎn)生一種基 本結(jié)構(gòu)的許多衍生物，例如，Sora"g/w附ceZ/w/oww—株菌可 產(chǎn)生soraphen的50多種不同的活性衍生物。同種的不同菌株 產(chǎn)生抗菌物質(zhì)種類也是不同的，差異較大，相同抗菌物質(zhì)的 產(chǎn)生菌的分布也可跨越種、屬、甚至科的界限。因此，粘細(xì)
4菌是重要的、具有巨大藥物開發(fā)潛力的藥源菌類群。
自最近十年來，尤其是德國(guó)人從纖維堆囊菌中發(fā)現(xiàn)抗癌
藥物紫杉醇的類似結(jié)構(gòu)物epothilone以后，粘細(xì)菌作為一類可 產(chǎn)生豐富次級(jí)代謝產(chǎn)物的微生物類群日趨受到重視。在生物
活性物質(zhì)合成方面，粘細(xì)菌的陽性率高于放線菌，并且能夠 產(chǎn)生許多全新結(jié)構(gòu)的活性物質(zhì)，粘細(xì)菌豐富的胞外粘液質(zhì)和 特殊的酶蛋白等，也具有極好的應(yīng)用價(jià)值。根據(jù)已報(bào)道的發(fā) 現(xiàn)物質(zhì)種類排名，粘細(xì)菌在放線菌和芽孢桿菌之后，假單胞 桿菌之前，但產(chǎn)生活性物質(zhì)的陽性率最高。
此外，目前從放線菌等微生物中篩選新抗生素的重復(fù)幾 率越來越高，而粘細(xì)菌在這方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。就目前情 況看，在溶細(xì)菌群粘細(xì)菌中50%的菌株可產(chǎn)生生物活性物質(zhì)， 而溶纖維素群粘細(xì)菌甚至高達(dá)96%，這為新抗菌物質(zhì)的篩選 提供了很好的一類微生物資源。而且近年來作為一種可產(chǎn)生 豐富而有用的次級(jí)代謝物的微生物類群逐漸受到世界青睞， 其中有些可抗細(xì)菌、有些可抗真菌、有些抗癌、有些溶栓， 因此，利用分離純化的粘細(xì)菌發(fā)酵，尋找更有效的抗菌物質(zhì) 具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供橙色粘球菌JCH-04及抗菌 謝產(chǎn)物的培養(yǎng)方法，由橙色粘球菌JCH-04發(fā)酵培養(yǎng)獲得抗 菌物質(zhì)，為抗菌物質(zhì)的篩選提供一類微生物資源，降低篩選新抗生素的重復(fù)幾率。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是該橙色粘球菌JCH-04
，保藏日期為2009年01月22日，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNo.2893。
本發(fā)明的抗菌代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)方法包括以下步驟
(1) 取保藏編號(hào)為CGMCC No.2893的橙色粘球菌JCH-04的菌種，取一環(huán)菌種接種于裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，3(TC180rpm培養(yǎng)5天，得種子液；其中，1000ml種子培養(yǎng)基由10g可溶性淀粉、15g黃豆粉、2.5g葡萄糖、0.5g酵母膏、lg氯化鈣、0.5g硫酸鎂和970.5g水組成，pH為7.4;
(2) 將上述種子液以體積比1: 10接種于含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，3(TC180rpm培養(yǎng)8天，得發(fā)酵液；其中，1000ml發(fā)酵培養(yǎng)基由10g可溶性淀粉、15g黃豆粉、2.5g葡萄糖、0.5g酵母膏、lg氯化鈣、0.5g硫酸鎂、5gSIPI-8樹脂和965.5g水組成，pH為7.4;
(3) 將上述發(fā)酵液4000rpm離心10min，得樹脂菌體和
濾液；
(4) 樹脂菌體用與發(fā)酵液等體積的甲醇3(TC180rpm解析24h, 5(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮得抗菌代謝產(chǎn)物A;
(5) 濾液依次由等體積的正已烷和乙酸乙酯抽提，用超濾膜截留分子量1KD以內(nèi)的生物分子，經(jīng)納濾膜得抗菌代謝產(chǎn)物B。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、以橙色粘球菌JCH-04培養(yǎng)得到的抗菌物質(zhì)對(duì)細(xì)菌、真菌具有廣譜的抗菌活性，對(duì)多株致病菌和腐敗菌有顯著的抗菌活性，抗菌產(chǎn)物A對(duì)多種有害細(xì)菌和霉菌具有明顯抑制作用，尤其對(duì)水產(chǎn)品養(yǎng)殖致病菌表現(xiàn)出高效廣譜特性，在防腐劑、水產(chǎn)飼料添加劑及醫(yī)藥方面有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景；2、培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單方便，篩選得到的抗生素重復(fù)幾率低。


圖1為本發(fā)明的橙色粘球菌JCH-04的DNA的G+C含量圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)例橙色粘球菌JCH-04依以下步驟培養(yǎng)得抗菌代謝
產(chǎn)物
(1) 取保藏編號(hào)為CGMCC No.2893的橙色粘球菌JCH-04的菌種，取一環(huán)菌種接種于裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，30。C180rpm培養(yǎng)5天，得種子液；其中，1000ml種子培養(yǎng)基由10g可溶性淀粉、15g黃豆粉、2.5g葡萄糖、0.5g酵母膏、lg氯化鈣、0.5g硫酸鎂和970.5g水組成，pH為7.4;
(2) 將上述種子液以體積比1: 10接種于含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，3(TC180rpm培養(yǎng)8天，得發(fā)酵液；其中，1000ml發(fā)酵培養(yǎng)基由10g可溶性淀粉、15g黃豆粉、2.5g葡萄糖、0.5g酵母膏、lg氯化鈣、0.5g硫酸鎂、5gSIPI-8樹脂和965.5g水組成，pH為7.4;
(3) 將上述發(fā)酵液4000rpm離心10min，得樹脂菌體和
濾液；
(4) 樹脂菌體用與發(fā)酵液等體積的甲醇3(TC180rpm解析24h， 5(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮得抗菌代謝產(chǎn)物A;
(5) 濾液依次由等體積的正已垸和乙酸乙酯抽提除脂溶性雜質(zhì)，用超濾膜截留分子量1KD以內(nèi)的生物分子，經(jīng)納濾膜得抗菌代謝產(chǎn)物B。
本發(fā)明的橙色粘球菌JCH-04的形態(tài)特征橙色粘球菌JCH-04的菌落呈紅橙色圓冠形，具有晶亮的物色擴(kuò)展，單菌落直徑小于5mm，薄膜狀擴(kuò)展，有明顯輻射狀波紋，分泌黃色物質(zhì)；粘孢子接近球形，直徑在0.45 u m X 0.45 ii m 0.51u mX0.47u m之間，根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定竽冊(cè)》(第九版)的形態(tài)描述，該菌株符合粘球菌形態(tài)特征。
本發(fā)明的橙色粘球菌JCH-04的生物特征
1)子實(shí)體觀察
橙色粘球菌JCH-04子實(shí)體為球形隆起，軟，下端收縮，并具有一根明顯的柄，柄通常不能持久；開始是連著的，在
潮濕的情況下后來就潮解； 一般為黃橙色；干了后變成深紅色到褐色；直徑約為60 300um。2) 染色觀察
(一)用革蘭氏染色法對(duì)菌株進(jìn)行觀察，染色后在光顯微鏡下用油鏡觀察，全部顯示為紅色，菌株為革蘭氏陰性菌。
(二)用改良的Schaeffer-Fulton氏染色法對(duì)菌株培養(yǎng)一周后的粘細(xì)菌進(jìn)行孔雀綠染色，在油鏡下并未觀察到綠色的芽孢，說明該株菌不產(chǎn)芽孢。
3) 鞭毛情況
將橙色粘球菌JCH-04以穿刺法接種于含0.3%瓊脂的CY培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)3天，取出觀察，菌落成直線狀，未向四周擴(kuò)散,說明8株粘細(xì)菌皆無鞭毛;其中，CY培養(yǎng)基(g/L):酪素水解蛋白胨3，酵母膏1，氯化鈣1，瓊脂15，去離子水定溶至1000mL， pH7.4。
4) 好氧與否的判斷
將粘球菌04制成菌懸液，取一環(huán)接入裝有CY培養(yǎng)基的試管中，3(TC恒溫箱中培養(yǎng)3天，只有液面處形成一層菌膜，液面下很少有菌體生長(zhǎng)，說明菌株屬好氧菌。
5) 生理生化試驗(yàn)
(一) CMC-Na平板測(cè)試菌株都沒有透明圈出現(xiàn)，說明這些菌株都不具有分解纖維素的能力。
(二) 酶的活性試驗(yàn)按沈萍等編《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》中方法試驗(yàn)，淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、尿素酶、氧化酶和過氧化氫酶陽性，說明菌株能產(chǎn)上述各酶。
(三)對(duì)抗生素的藥敏試驗(yàn)將其最適涂布濃度(ODeoo為0. 02-0. 03)涂布于CY平板上，在平板不同位置等距離放置高溫滅菌的牛津杯，再將不同濃度梯度抗生素200^1加于牛津杯(牛津杯直徑5皿，抗生素為綠霉素，鏈霉素，卡那霉素，濃度梯度分別為5， 10， 15， 20昭/ml)，每稀釋度兩個(gè)平行在30。C下培養(yǎng)2-3天，觀察子實(shí)體的形成；結(jié)果顯示橙色粘球菌JCH-04耐15微克的鏈霉素，對(duì)15微克的綠霉素和卡那霉素敏感。6)橙色粘球菌JCH-04的DNA的G+C含量測(cè)定
(1) 菌株培養(yǎng)和收集接種菌種于裝有CY培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)，置200r/min的搖床培養(yǎng)24h后離心，用0.15mol/LNaCl與0.1mol/LEDTA (pH 8.0)緩沖液洗細(xì)胞，最終溶于同樣的緩沖液中，濃度為2 3g濕細(xì)胞/25ml緩沖液。
(2) DNA的提取與純化在上述細(xì)胞懸液中加溶菌酶0.5 lmg/ml(終濃度)，置37t:水浴30min;加質(zhì)量濃度20%十二烷基磺酸鈉至終濃度2%, 6(TC水浴10min;加5mol/LNaC104至終濃度lmol/L，加等體積氯仿-異戊醇(24:1 v/v)，振蕩10min， 5000r/min離心10min;吸取含DNA的上清水層，加上清水層2倍體積質(zhì)量濃度95%乙醇，用玻棒巻出DNA絲，溶于1SSC (0.015mol/LNaCl-0.015mol/L檸檬酸鈉)；加終濃度為50ug/ml的RNA酶，置37。C水浴30min;加等體積氯仿-異戊醇搖10min， 5000r/min離心5min，吸取水相，加水相2倍體積質(zhì)量濃度95%乙醇，用玻棒巻出DNA絲；力口 lml3mol/LNaAC-0.001mol/LEDTApH7.0，邊
攪邊加0. 54倍體積的異戊醇，溶于水用紫外分光光度計(jì)測(cè)定驗(yàn)純，若A26q/A28o在1.9說明DNA已純。
(3) Tm測(cè)定將紫外分光光度計(jì)的波長(zhǎng)固定于260nm，首先記錄25。C的吸光度，然后溫度上升至5(TC，每隔2'C穩(wěn)定一段時(shí)間，記錄溫度和吸光度，直至吸光度不變表示變性完畢。
(4) Tm值計(jì)算以溫度為橫坐標(biāo)，以相對(duì)吸光度(所測(cè)吸光度除以25'C下的吸光度)為縱坐標(biāo)，繪制熱變性曲線，熱變性曲線中點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的溫度即為熔鏈溫度(Tm值)。
(5) G+Cmol。/。含量計(jì)算同等條件下，以枯草芽孢桿菌某菌株DNA的Tm值為參照，DNA中G+C mol%含量計(jì)算可以使用以下公式1SSC， G+C mol%= 42.2+2.44 (Tm測(cè)試菌-Tm枯草桿菌)；用不同溫度下DNA溶液吸光度除以25'C時(shí)大的吸光度，得出各溫度下的相對(duì)吸光度；結(jié)果如圖l。
結(jié)果顯示，橙色粘球菌JCH-04的Tm值為94°C;在此條件下，以枯草芽孢桿菌某菌株DNA的Tm值為83°C ，DNA中G+C mol。/。含量計(jì)算可以使用以下公式1SSC， G+Cmol%=42.2+2.44 (Tm測(cè)試菌-Tm枯草芽孢桿菌某菌株)，得出結(jié)論，菌株JCH-04的DNA中G+C mol%=42.2+2.44 X(94-83) =69.0%;由《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第九版)及相關(guān)資料可知，這個(gè)數(shù)據(jù)符合粘細(xì)菌的特征。7)16srDNA序列分析方法
DNA的提取按前述6)方法；常規(guī)PCR擴(kuò)增16SrDNA ，PCR產(chǎn)物經(jīng)上海捷生公司純化后測(cè)序；序列如下
aacgaacgctggcggcgtgcctaacacatgcaagtcgagcgcgaataggggcaaccctta gtagagcggcgcacgggtgcgtaacacgtggataatctgcctggatgctcgggataacca gtcgaaagattggctaataccggataagcccacggtttcttcggagactgagggaaaagg tggcctctgtatacaagctatcacaaccagatgagtccgcggcccatcagctagttggcg gggtaatggcccaccaaggcgacgacgggtagctggtctgagaggacgatcagccacact ggaactgagacacggtcc柳ctcctacgggaggcagceigtggggaattttgcgcaatgg gcg犯agcctgacgcagcaacgccgcgtgtgtgatgaaggtctttggattgtaaagcact ttcgaccgggaagaaaacccgtagcccaacacgctacggcttgacggtaccgggagaaga agcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttgttcgg aattattgggcgt犯agcgcgtgtaggcggcgtgacaagtcgggtgtg犯agccctcagc tcaactgaggaagtgcgcccgaaactgtcgtgcttgagtgccgg卿gggtggcggaatt ccccaagteLgaggtgaaattcgtageitatggggaggaacaccggtggcga^ggcggccac ctggacggtaactgacgctgagacgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccct ggtagtccacgccgtaaacgatgagaactaggtgtcgtgggagttgacccccgcggtgcc gtagctaacgcattaagttctccgcctgggaagtacggtcgcaagactaaaactca犯gg aattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgacgcaacgcgcaga accttacctggtcttgacatcctcggaatctctcagagatgagggagtgcccgcaaggga accgagagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtg卿tgttgggttaagt cccgcaacgagcgcaaccctcgcctttagttgccacgcaagtggatctctagagggactg ccggtgttaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcctttatgaccag ggctacacacgtgctacaatggccggtacagagcgttgccaacccgcgagggggagctaa tcgcataaaaccggtctcagttcagattggagtctgcaactcgetctccatgaaggcggaa tcgctagtaatcgcagatcagcacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacacc gcccgtcacaccatgggagtcgattgctccagaagtcatctcaccaagaggtgcccaeigg agtggtcggtaactggggtg犯g
本發(fā)明的橙色粘球菌JCH-04的鑒定
橙色粘球菌JCH-04的16SrDNA核苷酸序列為1463bp，將其與GeneBank等數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行最大同源性比較，發(fā)現(xiàn)橙色粘球 菌JCH-04的16SrDNA序列與粘球菌屬16SrDNA序列同源性 達(dá)到100%;橙色粘球菌JCH-04和橙色粘球菌16SrDNA核苷 酸序列相差16bp ，在NCBI網(wǎng)BLAST,序列同源性為99%; 本發(fā)明的橙色粘球菌JCH-04菌株和M;aococcws/M/vw在生理生 化特性上比較相似，僅在淀粉酶和氧化酶活性和藥敏試驗(yàn)上有 所差異，這表明兩個(gè)菌株在系統(tǒng)分類上的親緣關(guān)系非常接近；從 形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特性以及16SrDNA序列的綜合 分析結(jié)果，結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第九版)所闡述的 原理，我們認(rèn)為橙色粘球菌JCH-04是M戸ococcws屬成員/w/ms 種下一個(gè)亞種。
本發(fā)明的橙色粘球菌JCH-04的發(fā)酵代謝產(chǎn)物的抗菌譜 測(cè)定
1)供試菌種
大腸桿菌toc/zen'c/z/fl[ co//)，霍亂弧菌(附W c/zo/era)， 次副溶血性弧菌(W6Wo / flra/^ewo/聲/cM)，嗜水氣單胞菌 C4ero附o"os /y;c ro/7/ '/flr)， 銅鄉(xiāng)錄假單胞菌(i^ewdowo"s aerwg/"osfl)，鮑氏不動(dòng)桿菌C4c/"eto6fif"e : 6"wwflf""http://)， 水生 黃桿菌CF/flvo6acter/ww Af《wfl"7e)， 蠟狀芽孢桿菌C6tfc/〃ws ce ws)，藤黃八疊球菌(5^ r/"fl Zw&fl)，枯草芽孢桿菌 C6fl。7/ws sw6她、)，金黃色葡萄球菌(S鄉(xiāng)/^/ococcws , 米曲霉C4s/^g/〃M51 o^yzae)，毛霉(Mwco/y'ava"/cws)，黑曲霄C4s/7erg/〃ws w/ge》，釀酒酵母CS"cc/2aram少ces cerev/s/ae)由本 院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；小麥赤霉病菌(i^^W"m grflfw/wearwm )、 f帛花枯菱病菌 (Fwsar/w附 vos/^cfww ACCC3. 224 )、稻瘟病菌(Mflgwapw^egr/wflf )由淮安農(nóng)科 院提供。
2) 細(xì)菌抗菌試驗(yàn)細(xì)菌培養(yǎng)采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基MH， 其中，培養(yǎng)次副溶血性弧菌時(shí)MH中加質(zhì)量3%的鹽；用無 菌生理鹽水稀釋成不同梯度，涂平板并測(cè)定OD6。。，確定不 同細(xì)菌最適涂布濃度(OD6(K)為0.02-0.03 ，將不同指示菌0.2ml 均勻涂于直徑為9cm平板表面,晾干后，在平板不同位置等 距離放置高溫滅菌的牛津杯，再將抗菌產(chǎn)物20(^1加于牛津 杯(牛津杯直徑5mm )，在37。C下培養(yǎng)16-24小時(shí)，記錄 抑菌圈直徑大小。
3) 真菌抗菌試驗(yàn)真菌培養(yǎng)采用馬鈴薯PDA培養(yǎng)基； 用無菌生理鹽水將孢子洗下，制成孢子懸液，稀釋至最適涂 布濃度(以指示菌生長(zhǎng)布滿平皿為宜)，吸取0.21111涂平板， 晾干后，在平板不同位置等距離放置高溫滅菌的牛津杯，再 將抗菌產(chǎn)物20(^1加于牛津杯，3(TC下培養(yǎng)48-72小時(shí)，記 錄抑菌圈直徑大小。
4) 橙色粘球菌JCH-04的發(fā)酵代謝產(chǎn)物A和B的抗菌 譜，如表l:表1橙色粘球菌jch-04的發(fā)酵代謝產(chǎn)物a和b的抗菌譜
指示菌種抑菌圈直徑(mm) A B革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Esc/ enWH'a co/,')10.4-
霍亂弧菌(W6W c/jo/era)12.1-
次副溶血性弧菌(7訪r!'o; ara/wewjo(vft'CK5)12.7-
嗜水氣單胞菌(」ero附o"os /7>^*0/ / 7。)13.7-
銅綠假單胞菌(尸sew^o柳"s ?！?"g/"?！秈)11.5-
鮑氏不動(dòng)桿菌C4c!'""ofea"er.6aM附a朋fO13.3-
水生黃桿菌(F/ovo6a"e"'M附叫w加7e)14.1-
革蘭氏陽性菌蠟狀芽孢桿菌(A^7/w cereus)12.314.1
藤黃八疊球菌(Sarc7'"a14.815.2
枯草芽孢桿菌(5a"7/us犯A礎(chǔ)s)10.612.5
金黃色葡萄球菌OStopAy/ococcus ai/A"ei/5)15.616.7
真菌 米曲霉0is;wgz7/itf o y^e)6.2-
7.8-
6.5-
釀酒酵母(SaccAaTO/M[yces cerev&!'ae)7.8-
小麥赤霉病菌(Fwsa"'鵬gra柳'"ear"ffj)7.8-
棉花枯萎病菌(尸wsa"'柳va57'/^"鵬ACCC3.224 )6.9-
稻瘟病菌(AfagnaportAe gn'seot)8.1-
注抑菌圈直徑(mm )為3次重復(fù)平均值，A:代謝產(chǎn)物A抑菌圈直徑，B:代謝產(chǎn)物B抑菌圈直徑
由表1抑菌效果可見，橙色粘球菌JCH-04 (M戸ococcms JCH-04)的抗菌產(chǎn)物A對(duì)4種革蘭氏陽性菌(蠟樣芽抱
15桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、枯草芽抱桿菌)和
7種革蘭氏陰性菌(大腸埃希氏桿菌、霍亂弧菌、次副溶血 性弧菌、嗜水氣單胞菌、鮑氏不動(dòng)桿菌、水生黃桿菌、銅綠 假單胞菌)以及7種真菌(啤酒酵母、米曲霉、黑曲霉、毛 霉、小麥赤霉病菌、棉花枯萎病菌、稻瘟病菌)均具有顯著 的抑菌效果，尤其對(duì)造成水產(chǎn)品養(yǎng)殖直接經(jīng)濟(jì)損失的致病菌 嗜水氣單胞菌、鮑氏不動(dòng)桿菌、水生黃桿菌表現(xiàn)出高效抗性， 因此可以開發(fā)成為一種天然水產(chǎn)品養(yǎng)殖用詞料添加劑以及 防腐劑或藥品，具有重要應(yīng)用價(jià)值；橙色粘球菌JCH-04 (M少jcococcm /w/vws JCH-04)的發(fā)酵代謝產(chǎn)物B雖然只對(duì)4種 革蘭氏陽性菌有抗菌活性，但它的抗性強(qiáng)于發(fā)酵代謝產(chǎn)物A， 也是一種待開發(fā)抗菌活性產(chǎn)物。序列表
〈110 〉淮陰工學(xué)院
〈120 〉橙色粘球菌JCH-04及抗菌代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)方法
〈160 > 1 〈210 〉 1 < 211 〉 1463 〈212 〉 DNA
〈222 〉 ( 1 )…(1463) 〈400 〉 1
aacgaacgctggcggcgtgcctaacacatgc犯gtcgagcgcgaataggggcaaccctta gtagagcggcgcacgggtgcgtaacacgtggataatctgcctggatgctcgggataacca gtcgaaagattggctaataccggataagcccacggtttcttcggagactgagggaaaagg tggcctctgtatacaagctatcacaaccagatgagtccgcggcccatcagctagttggcg gggtaatggcccaccaaggcgacgacgggtagctggtctgagaggacgatcagccacact ggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaattttgcgcaatgg gcgaaagcctgacgcagcaacgccgcgtgtgtgatgaaggtctttggattgtaaagcact ttcgaccgggaagaa^acccgtagcccaacacgctacggcttgacggtaccgggagaaga agcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttgttcgg aattattgggcgtaaagcgcgtgtaggcggcgtgacaagtcgggtgtgaaagccctcagc tcaactgaggaagtgcgcccgaaactgtcgtgcttgagtgccgg卿gggtggcgg犯tt ccccaagtagaggtgaaattcgtagatatggggaggaacaccggtggcgaaggcggccac ctggacggtaactgacgctgagacgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccct ggtagtccacgccgtaaacgatgagaactaggtgtcgtgggagttgacccccgcggtgcc gtagctaacgcattaagttctccgcctgggaagtacggtcgcaagactaaaactcaaagg aattgacgggggcccgc3caagcggtggagcatgtggtttaattcg3cgc犯cgcgcaga accttacctggtcttgacatcctcggaatctctcagagatgagggagtgcccgcaaggga accgagagac鄉(xiāng)tgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtg卿tgttgggttaagt cccgcaacgagcgcaaccctcgcctttagttgccacgcaagtggatctctagagggactg ccggtgttaaaccggaggaaggtggggatgacgtc犯gtcctcatggcctttatgaccag ggctacacacgtgctacaatggccggtacagagcgttgccaacccgcgagggggagctaa tcgcataaaaccggtctcagttcagattggagtctgcaactcgactccatgaaggcggaatcgctagtaatcgcagatcagcacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacacc gcccgtcacaccatgggagtcgattgctccageiagtcatctcaccaageiggtgcccaagg agtggtcggtaactggggtgaag
權(quán)利要求
1.橙色粘球菌JCH-04，其特征在于該橙色粘球菌JCH-04(Myxococcus fulvus JCH-04)的保藏編號(hào)為CGMCCNo.2893。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的橙色粘球菌JCH-04的抗菌代 謝產(chǎn)物的培養(yǎng)方法，其特征在于橙色粘球菌JCH-04依以 下步驟培養(yǎng)得抗菌代謝產(chǎn)物(1) 取一環(huán)保藏編號(hào)為CGMCC No.2893的橙色粘球 菌JCH-04的菌種，菌種接種于裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中， 3(TC180rpm培養(yǎng)5天，得種子液；其中，1000ml種子培養(yǎng) 基由10g可溶性淀粉、15g黃豆粉、2.5g葡萄糖、0.5g酵母 膏、lg氯化鈣、0.5g硫酸鎂和970.5g水組成，pH為7.4;(2) 將上述種子液以體積比1: 10接種于含有發(fā)酵培 養(yǎng)基的三角瓶中，3(TC180rpm培養(yǎng)8天，得發(fā)酵液；其中， lOOOml發(fā)酵培養(yǎng)基由10g可溶性淀粉、15g黃豆粉、2.5g葡 萄糖、0.5g酵母膏、lg氯化鈣、0.5g硫酸鎂、5gSIPI-8樹脂 和965.5g水組成，pH為7.4;(3) 將上述發(fā)酵液4000rpm離心10min，得樹脂菌體和濾液；(4) 樹脂菌體用與發(fā)酵液等體積的甲醇3(TC180rpm解析24h， 5(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮得抗菌代謝產(chǎn)物A;(5)濾液依次由等體積的正已垸和乙酸乙酯抽提，用 超濾膜截留分子量1KD以內(nèi)的生物分子，經(jīng)納濾膜得抗菌代 謝產(chǎn)物B。
全文摘要
本發(fā)明公開了橙色粘球菌JCH-04及抗菌代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)方法，該橙色粘球菌JCH-04(Myxococcus fulvus JCH-04)的保藏編號(hào)為CGMCC No.2893；取保藏編號(hào)為CGMCCNo.2893的一環(huán)菌種接種于裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，30℃180rpm培養(yǎng)5天得種子液；將種子液以體積比1∶10接種于含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃180rpm培養(yǎng)8天得發(fā)酵液；將發(fā)酵液4000rpm離心10min，得樹脂菌體和濾液；樹脂菌體用甲醇30℃180rpm解析24h，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮得抗菌代謝產(chǎn)物A；濾液依次由等體積的正己烷和乙酸乙酯抽提，用超濾膜截留分子量1KD以內(nèi)的生物分子，經(jīng)納濾膜得抗菌代謝產(chǎn)物B。本發(fā)明提供微生物資源，降低篩選新抗生素的重復(fù)幾率。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101638625SQ200910024678
公開日2010年2月3日 申請(qǐng)日期2009年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月26日
發(fā)明者號(hào) 時(shí), 賈建波 申請(qǐng)人:淮陰工學(xué)院