專利名稱：一種重組鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(mmlv-rt)在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)及純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)的表達(dá)和純化，特別涉及一種鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)的可溶性表達(dá)及純化方法。屬生物化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
RT-PCR作為重要的分子生物學(xué)研究手段，是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。由mRNA到cDNA的過(guò)程稱為反轉(zhuǎn)錄，是由反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)催化反應(yīng)的。反轉(zhuǎn)錄酶又稱RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶。是以RNA為模板合成DNA的酶，這種酶是1970年美國(guó)科學(xué)家特明(H.M.Temin)和巴爾的摩(D.Baltimore)分別于動(dòng)物致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)的，他們并因此獲得1975年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。MMLV (來(lái)自Moloey鼠白血病病毒)是常用的反轉(zhuǎn)錄酶，是依賴于RNA的DNA聚合酶，有5'—3' DNA聚合酶活性。作為最常用的分子生物學(xué)產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)市場(chǎng)需求量巨大，而天然反轉(zhuǎn)錄酶的提取技術(shù)復(fù)雜、產(chǎn)率低。目前，通過(guò)基因工程技術(shù)克隆的重組鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶在pET系統(tǒng)中表達(dá)量高，但是容易形成包涵體，純化后只能得到很少量的活性蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種重組鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)及純化方法，本發(fā)明通過(guò)載體構(gòu)建將MMLV-RT基因和腸激酶酶切位點(diǎn)克隆到pET28a載體中，在低溫的條件下薩LV-RT與分子伴侶TF共表達(dá)，MMLV-RT蛋白的表達(dá)量可以提高到15%,而可溶性是常規(guī)方法表達(dá)的10倍。最后，利用六個(gè)組氨酸標(biāo)簽和腸激酶酶切來(lái)純化得到逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)。
本發(fā)明是以如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的 一種重組鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶
(麗LV-RT)在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)及純化方法，其特征是通過(guò)載體構(gòu)建將MMLV-RT基因和腸激酶酶切位點(diǎn)克隆到pET28a載體中，在低溫條件下與分子伴侶共表達(dá)，來(lái)提高蛋白的表達(dá)量和可溶性。
所述的一種重組鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(畫LV-RT)在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)及純化方法，其特征是將讓LV-RT基因和腸激酶酶切位點(diǎn)克隆到pET28a載體中，在低溫的條件下與分子伴侶共表達(dá)。
所述的一種重組鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)及純化方法，其特征是將畫LV-RT基因克隆到pET28a載體中實(shí)現(xiàn)共表達(dá)。
所述的一種重組鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)及純化方法，其特征是將MMLV-RT和腸激酶酶切位點(diǎn)克隆到pET28a載體中表達(dá)。
所述的MMLV-RT基因在低溫條件下與分子伴侶共表達(dá)。所述構(gòu)建的表達(dá)載體為pET28a-His6-EK(腸激酶)-醒LV-RT。所述表達(dá)的分子伴侶為TF和GroEL-GroES,醒LV-RT與分子伴侶TF 、
GroEL-GroES在宿主菌中共表達(dá)。
所述表達(dá)融合蛋白含六個(gè)組氨酸標(biāo)簽，用Ni-NTA純化融合蛋白。所述表達(dá)的一種重組鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)在大腸桿菌中的
可溶性表達(dá)及純化方法，其特征是通過(guò)Ni-NTA純化，再通過(guò)腸激酶酶切后得到
逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)。
所述表達(dá)宿主菌是i&c力eric/ iacoJi BL21 (DE3)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)載體構(gòu)建將MMLV-RT基因和腸激酶酶切位點(diǎn)克隆到pET28a載體中，在低溫的條件下MMLV-RT與分子伴侶共表達(dá)，使表達(dá)蛋白的可溶性大大增加。另外，組氨酸標(biāo)簽和腸激酶酶切位點(diǎn)的加入則使反轉(zhuǎn)錄酶的純化更加簡(jiǎn)化、高效。


下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明
圖l是融合蛋白His6-MMLV-RT在大腸桿菌中的表達(dá)圖1A是重組表達(dá)載體pET28-MMLV-RT的質(zhì)粒圖譜圖1B是重組His6-MMLV-RT蛋白表達(dá)的SDS—PAGE分析圖2是逆轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)條件的優(yōu)化
圖2A是低溫發(fā)酵和分子伴侶共表達(dá)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶可溶性的影響
圖2B是在不同條件下，His6-MMLV可溶性和產(chǎn)量的比較
圖3是純化后His-麵LV-RT和麗LV-RT的SDS-PAGE (10%)分析
圖4是純化后的逆轉(zhuǎn)錄酶活性測(cè)定
圖4A是起始轉(zhuǎn)錄速率測(cè)定
圖4B是Atg7cDNA合成試驗(yàn)
圖l、圖2中
泳道l:蛋白marker(kD); -泳道2和3:分別為IPTG誘導(dǎo)的含有對(duì)照質(zhì)粒pET28a和重組質(zhì)粒pET28-MMLV-RT的BL21 (DE3)細(xì)胞裂解物細(xì)胞裂解物。
GroEL/ES +TF
總蛋白量％
相對(duì)總蛋白量
可溶性(％)
含有pET28-固LV-RT和pG-tf2的BL21 (DE3)的培養(yǎng)和處理如上所述，醒LV-RT、 TF和GroEL-GroES的表達(dá)條帶如圖所示。T、 S和I分別代表總蛋白、上清和沉淀。將單獨(dú)在37。C表達(dá)的gro叩A(chǔ)中的總MMLV-RT (泳道1)設(shè)為1. 0，其表達(dá)總量占菌體總蛋白的15%,以此為參照，經(jīng)過(guò)定量與校正，其它泳道的畫LV-RT所占的比例如圖下方所示，四環(huán)素的使用濃度為20Pg /1，IPTG為0. 6mM。
圖2B在不同條件下，His6-MMLV可溶性和產(chǎn)量的比較SDS-PAGE凝膠灰度掃描分析MMLV-RT蛋白的可溶性和相應(yīng)的產(chǎn)率
圖3中純化的His6-MMLV-RT和麗LV-RT蛋白樣品用10% SDS-PAGE分析.M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道l:大量表達(dá)超聲上清；泳道2: Ni2+-NTA穿過(guò)；泳道3:buffer C洗滌；泳道4: Buffer D洗脫液(1. 5 Pg);泳道5:對(duì)照，沒(méi)加EK的洗脫液；泳道6: EK酶切的洗脫液(5 Pg);泳道7: Q離子交換穿過(guò)(3 Pg).
圖4中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在37"條件下進(jìn)行。純化的MMLV-RT(圓圈)和陽(yáng)性對(duì)
—+—+
15141313
1. 00. 950. 870.87
563095
6照MMLV RT (Invitrogen Corp)(方框)的用量均為5 nM， poly(rA)-p(dT)12-18的濃度為25mM.每個(gè)反應(yīng)重復(fù)三次，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明通過(guò)重組MMLV-RT原核表達(dá)載體pET28a-MMLV-RT的構(gòu)建，成功將密碼子優(yōu)化的MMLV-RT基因克隆至His6-tag編碼序列的下游并與之處于同一閱讀框，在His6-tag和廳LV-RT之間加入腸激酶的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建了融合蛋白MMLV-RT的的原核表達(dá)載體，測(cè)序結(jié)果表明閱讀框及DNA序列全部正確。通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在低溫的條件下MMLV-RT與分子伴侶TF共表達(dá)，蛋白的表達(dá)量提高到15%，而可溶性是常規(guī)方法表達(dá)的10倍。通過(guò)鎳親和層析、EK酶切以及離子交換層析收穿過(guò)，得到了不帶任何親和標(biāo)簽的薩LV-RT。鎳親和層析去除了絕大部分菌體雜蛋白，用腸激酶酶切后將不帶任何冗余氨基酸的MMLV-RT與His6標(biāo)簽分離開(kāi)，最后用離子交換層析去除EK和痕量的DNA，一升發(fā)酵液中得到了約23mg的MMLV-RT (純度約95%)。 10% SDS-PAGE分析表明，純化的MMLV-RT與理論分子量70kD相符。純化的逆轉(zhuǎn)錄酶表現(xiàn)出禾n商品化酶相似的活性，比活約為2><105units/mg。
下面通過(guò)優(yōu)選實(shí)例對(duì)本發(fā)明做更詳細(xì)的論述。下述實(shí)驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn)方法，如果無(wú)特殊說(shuō)明，均屬于常規(guī)方法。
1 、重組醒LV-RT原核表達(dá)載體pET28-畫LV-RT的構(gòu)建以合成醒LV-RT為模板，用PCR的方法擴(kuò)增麗LV-RT編碼序列，所用的正向引物為5' -CGGGATCCGACGACGACGACAAGATGGGGCAGCCCCTGC AAG-3'，反向引物為5' -CCGCGGCCGCTTAAGTCTCTGTGATGGCTGCC-3，。在正向引物中有一個(gè)BamHI的酶切位點(diǎn)(黑體)以及編碼腸激酶識(shí)別位點(diǎn)DDDDK的序列(下劃線部分)，反向引物中有一個(gè)Not I的酶切位點(diǎn)(黑體)。PCR反應(yīng)的條件為94°C熱變性一分鐘，55。C退火一分鐘，72。C延伸90秒，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。純化的PCR產(chǎn)物采用BamH I和Not I進(jìn)行雙酶切，然后插入pET28a的多克隆位點(diǎn)。pET28a是一個(gè)T7系列的N端融合His6-tag的原核表達(dá)載體。對(duì)重組表達(dá)載體pET28a-MMLV-RT進(jìn)行DNA測(cè)序，分析其閱讀框和編碼序列的正確性。
按照方法中所述的步驟，將密碼子優(yōu)化的顧LV-RT基因克隆至His6-tag編碼序列的下游并與之處于同一閱讀框，為了便于釋放并純化野生型的MMLV-RT，本發(fā)明在His6-tag和MMLV-RT之間設(shè)計(jì)并加入腸激酶的酶切位點(diǎn)，重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，成功構(gòu)建了融合蛋白畫LV-RT的的原核表達(dá)載體，閱讀框及DNA序列全部正確，其簡(jiǎn)圖參見(jiàn)圖1A。2. MMLV-RT的表達(dá)
(1) 融合蛋白國(guó)LV-RT的表達(dá)
分別將MMLV-RT融合蛋白表達(dá)載體pET28a-MMLV-RT和對(duì)照載體pET28a 轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌五."http://81^21(0￡3)，挑取單克隆接種至新鮮的1^液體培養(yǎng)基(含 50 mg/1的卡那霉素)。待細(xì)菌長(zhǎng)至OD,為0.6左右，分別加入終濃度為0.6 mM 的IPTG誘導(dǎo)MMLV-RT的表達(dá)。誘導(dǎo)兩個(gè)小時(shí)后收集菌體，處理后的菌體蛋白 樣品走12% SDS-PAGE，使用UVP white/ultraviolet transilluminator對(duì)考馬斯亮蘭 染色的凝膠進(jìn)行掃描記錄，采用專業(yè)分析軟件Grab-it 2.5和Gelwork分析目的 蛋白占菌體總蛋白的比例。
(2) 在不同的溫度下，麗LV-RT和分子伴侶共表達(dá) pG-TG是一個(gè)具有ColEl復(fù)制子、氯霉素抗性的原核表達(dá)載體。在四環(huán)素誘
導(dǎo)的啟動(dòng)子控制下能夠同時(shí)表達(dá)大腸桿菌的伴侶分子TF和GroEL-GroES，該 載體由Hideki Yanagi博士 ( HSP Research Institute, Japan )惠贈(zèng)[2]。將 pET28-MMLV-RT和pG-TG共同轉(zhuǎn)入￡ co/z' BL21 (DE3),在雙抗性的LB培養(yǎng) 基平板(含有50mg/l的卡那霉素和34mg/l的氯霉素)上篩選得到陽(yáng)性克隆。
單克隆的過(guò)夜培養(yǎng)菌液分別接種至含有3ml液體LB的試管中,每只試管含有 50 mg/l卡那霉素和34 mg/l氯霉素，將上述試管均分成1,2,3和4組。l組和2組置 37t:搖床培養(yǎng)，3組和4組在28'C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為250rpm，在細(xì)菌生長(zhǎng)至006()()約為 0.5時(shí)，向2組和4組的試管中加入終濃度為20 pg/l的四環(huán)素誘導(dǎo)分子伴侶的表達(dá)， 二十分鐘后，向四組所有試管中加入終濃度為0.6 mM的IPTG誘導(dǎo)MMLV-RT的表 達(dá)，誘導(dǎo)后繼續(xù)培養(yǎng)3個(gè)小時(shí)(l組和2組)或者5個(gè)小時(shí)(3組和4組)。
(3) 蛋白表達(dá)的分析和定量 為了比較在不同的表達(dá)條件下MMLV-RT可溶性的高低，收集數(shù)量相同的細(xì)
胞，而后用300 pl冰浴的PBS緩沖液重懸菌體，充分超聲處理后，采用離心的方 法將細(xì)菌裂解物分成總蛋白、上清和沉淀三個(gè)組分，并跑12。/。SDS-PAGE。凝膠 的染色、掃描以及蛋白的定量如上所述。本文中，可溶性定義為可溶性的目的 蛋白/總的目的蛋白"00%。
在IPTG誘導(dǎo)后，出現(xiàn)了一條約為80 kD的蛋白條帶，略高于MMLV-RT的理 論分子量，經(jīng)凝膠掃描灰度分析，MMLV-RT約占菌體總蛋白的15。/。左右(圖1B), 然而絕大部分MMLV-RT以包涵體的形式存在于胞質(zhì)中。為了提高目的MMLV-RT 的可溶性及具有生物活性MMLV-RT的產(chǎn)率，本發(fā)明嘗試了低溫以及分子伴侶共 表達(dá)的方法。如圖2A所示，MMLV-RT與分子伴侶TF禾B GroEL-GroES在37"C
8共表達(dá),并沒(méi)有明顯提高M(jìn)MLV-RT的可溶性；當(dāng)降低發(fā)酵溫度至28"C時(shí)，可溶形 式的MMLV-RT比例從原來(lái)的5%上升至30%;將MMLV-RT與分子伴侶TF和 GroEL-GroES在28。C共表達(dá)時(shí)，目的蛋白的可溶性驟增至95%，與37。C單獨(dú)表達(dá) 相比，可溶性目的蛋白的產(chǎn)率提高了約10倍，SDS-PAGE灰度分析以及對(duì)純化后 的目的蛋白的定量分析都確證了上述結(jié)果的可靠性(圖2B)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，分子伴 侶的超量表達(dá)僅僅略微降低了MMLV-RT總的表達(dá)水平，由于低溫加分子伴侶對(duì) 目的蛋的可溶性貢獻(xiàn)巨大，最終這一發(fā)酵策略還是極大地提高了自然折疊的 MMLV-RT的產(chǎn)量。由此得出結(jié)論低溫發(fā)酵以及分子伴侶共表達(dá)都是必要的, 二者以協(xié)同作用的方式促進(jìn)了在大腸桿菌內(nèi)的可溶性表達(dá)，進(jìn)而將其可溶性提高 了約10倍。
3、蛋白的純化
收集一升發(fā)酵液的細(xì)胞，并用40 ml冰浴的bufferA (20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 0.5%Triton-X100, 10mM咪唑，10%甘油，pH7.4)重懸，超聲裂解細(xì)胞，離 心取上清，上清通過(guò)buffer A預(yù)平衡的N產(chǎn)親和柱，上樣完畢用bufferA充分洗 滌至基線，而后用buffer B (20mM Tris-HCl, 300 mM NaCl， 80 mM咪唑，0.5% Triton-Xl00, 10%甘油，pH7.4)洗滌雜蛋白，最后用buffer C (20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 250 mM咪唑，0.5% Triton-XlOO, 10%甘油，pH7.4)洗脫目的蛋白。
對(duì)于無(wú)His6親和標(biāo)簽MMLV-RT的純化，將結(jié)合了 His6-MMLV-RT的 Ni2+-NTA親和介質(zhì)用上述buffers A and B充分洗滌，接著EK酶切buffer D (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-IOO， 5%甘油，pH 8.0)洗兩個(gè)柱體積。 最后按照EK (mg):目標(biāo)蛋白(mg"l: 10000的比例將EK加入25%的介質(zhì)懸 浮液中起始酶切反應(yīng)。酶切條件為4。C/16小時(shí)。酶切洗脫出來(lái)的MMLV-RT進(jìn) 一步經(jīng)強(qiáng)陰離子交換吸附層析Q-Sepharose純化。純化后的酶采用Micro BCA 試劑盒定量及凝膠灰度掃描分析。 '
通過(guò)鎳親和層析、EK酶切以及離子交換層析收穿過(guò)，得到了野生型的不帶 任何親和標(biāo)簽的MMLV-RT。鎳親和層析去除了絕大部分菌體雜蛋白，用腸激酶 酶切，避免了高咪唑洗脫帶來(lái)的蛋白沉淀副效應(yīng)，并將不帶任何冗余氨基酸的 MMLV-RT與His6標(biāo)簽分離開(kāi)，最后離子交換層析去除EK和痕量的DNA，最終從 一升發(fā)酵液中得到了約23mg的野生型MMLV-RT(純度約95%) 。 12.5% SDS-PAGE分析表明，純化的MMLV-RT與理論分子量70kD相符(圖3)。純化的得 率概括于下表中純化流程 細(xì)菌超聲裂解物 離心上清 Ni2+-NTA親和層析 EK酶切
MMLV-RT總量(mg/L)
36. 5
34. 5
27. 2
23
純化效率(%)
100
95
79
85
4.逆轉(zhuǎn)錄酶的活性檢測(cè)方法 逆轉(zhuǎn)錄酶的活性采用[3H]dTTP參入法進(jìn)行定量分析，具體流程參考文獻(xiàn)(J. Biochem. 143 (2008) 261-268)。在一個(gè)cDNA合成的實(shí)例中，以人源的mRNA抽 提物作為逆轉(zhuǎn)錄的模板，將200個(gè)活力單位的酶加入反應(yīng)體系中，具體為(25raM Tris-HCl (pH8. 3)， 50 mM KC1, 10慮DTT， 4 mM MgC12， 1 MM oligo(dT) 18, 5 Pg RNA and 200 U逆轉(zhuǎn)錄酶)，在42° C反應(yīng)60分鐘。然后以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作 為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，采用的引物對(duì)為5' - ATGGCGGCAGCTACGGGGG -3'和 5' -GATGGTCTCATCATCGC TC-3，。
對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳和測(cè)序分析。 如圖4A所示，純化的逆轉(zhuǎn)錄酶表現(xiàn)出和商品化酶相似的活性，比活約為2X105 units/mg。該酶成功的合成了人源的自吞噬基因atg7。
權(quán)利要求
1、一種重組鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)及純化方法其特征是通過(guò)載體構(gòu)建將MMLV-RT基因和腸激酶(enterokinase，EK)酶切位點(diǎn)克隆到pET28a載體中，在低溫條件下通過(guò)與分子伴侶(TF，GroEL和GroES)共表達(dá)，來(lái)提高蛋白表達(dá)量和可溶性。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)在 大腸桿菌中的可溶性表達(dá)及純化方法，其特征是將醒LV-RT基因和腸激酶酶切 位點(diǎn)克隆到pET28a載體中，在低溫的條件下與分子伴侶共表達(dá)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)在 大腸桿菌中的可溶性表達(dá)及純化方法，其特征是將MMLV-RT基因克隆到pET28a 載體中實(shí)現(xiàn)共表達(dá)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種重組鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)在 大腸桿菌中的可溶性表達(dá)及純化方法，其特征是MMLV-RT腸激酶酶切位點(diǎn)克隆 到pET28a載體中表達(dá)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種重組鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)在 大腸桿菌中的可溶性表達(dá)及純化方法，其特征是隨LV-RT基因在低溫條件下與 分子伴侶共表達(dá)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種重組鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)在 大腸桿菌中的可溶性表達(dá)及純化方法，其特征是原核表達(dá)載體表達(dá)的重組蛋白 為His6-EK-MMLV-RT。
7、 根據(jù)權(quán)利要求3和4所述的一種重組鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT) 在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)及純化方法，其特征是His6-EK-MMLV-RT與分子伴 侶TF和GroEL-GroES在宿主菌中共表達(dá)。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的的一種重組鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)及純化方法，其特征是表達(dá)的融合蛋白含六個(gè)組氨酸(His6)標(biāo)簽，用鎳親和柱(Ni-NTA)純化融合蛋白。
9、 根據(jù)權(quán)利要求6和7所述的的一種重組鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)及純化方法，其特征是先通過(guò)Ni-NTA純化融合蛋白，.再通過(guò)腸激酶酶切得到逆轉(zhuǎn)錄酶(麗LV-RT)。
10、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種重組鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)及純化方法，其特征是所述表達(dá)宿主菌是^ c力aric力iaco力'BL21 (DE3)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)的表達(dá)和純化，特別涉及一種鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)的可溶性表達(dá)及純化方法。屬生物化學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)載體構(gòu)建將MMLV-RT基因和腸激酶酶切位點(diǎn)克隆到pET28a載體中，在低溫的條件下MMLV-RT與分子伴侶共表達(dá)，蛋白的表達(dá)量提高到15％，而可溶性是常規(guī)方法表達(dá)的10倍。
文檔編號(hào)C12R1/93GK101684474SQ200910024869
公開(kāi)日2010年3月31日 申請(qǐng)日期2009年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月19日
發(fā)明者孫啟明, 徐衛(wèi)國(guó), 宇 陳 申請(qǐng)人:孫啟明;徐衛(wèi)國(guó)