專利名稱：：利用2-5A合成酶和RNaseL基因提高水稻品種對(duì)水稻條紋葉枯病抗性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了一種利用2-5A合成酶和RNaseL基因轉(zhuǎn)化水稻獲得對(duì)水稻條紋葉枯病抗性提高的品種的新方法，屬于農(nóng)業(yè)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：水稻條紋病毒(Ricestripetenuivirus，RSV)于1902年首次在曰本分離獲得，現(xiàn)廣泛分布于中國(guó)、朝鮮、曰本及前蘇聯(lián)東部各國(guó)，在田間引起水稻條紋葉枯病。RSV主要侵染禾本科植物，通過(guò)灰飛虱(LaodelphaxstriatellusFallen)以持久性方式傳播，在寄主植物和介體昆蟲(chóng)中均能復(fù)制，并可由灰飛虱帶毒雌蟲(chóng)經(jīng)卵以較高比例傳播給后代。近五年來(lái)水稻條紋葉枯病在江蘇各水稻產(chǎn)區(qū)爆發(fā)流行，發(fā)病面積均在1000萬(wàn)畝以上，2004年更是出現(xiàn)了特大爆發(fā)，全省共有42個(gè)縣發(fā)生水稻條紋葉枯病，波及面積達(dá)2320萬(wàn)畝，全省單季水稻損失在5億斤以上，造成了糧食減產(chǎn)、農(nóng)民減收，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了巨大的損失，同時(shí)也嚴(yán)重挫傷了農(nóng)民的種糧積極性。由于迄今為止幾乎沒(méi)有能有效地從感染病毒的植株上除去病毒的化學(xué)藥劑，而治蟲(chóng)防病的應(yīng)急防治措施也無(wú)法作為一項(xiàng)長(zhǎng)期的策略加以應(yīng)用，這些原因進(jìn)一步加大了病害的防治難度。國(guó)外的防治經(jīng)驗(yàn)表明，利用品種自身的抗病性是防治病毒病最經(jīng)濟(jì)有效的措施，可是生產(chǎn)上目前使用的抗病品種抗性基因的來(lái)源多為巴基斯坦的水稻品種Modan,而隨著病害的連年趨重發(fā)生，病毒亦存在進(jìn)化變異進(jìn)而克服上述抗病基因的可能性。因此有必要發(fā)掘和創(chuàng)制新的抗性資源，為水稻條紋葉枯病的可持續(xù)綜合防控提供材料上的儲(chǔ)備。植物抗病毒轉(zhuǎn)基因工程策略是通過(guò)導(dǎo)入一些植物外源的抗病毒基因來(lái)提高品種對(duì)病毒的抗性，一般分為以病毒基因組介導(dǎo)的抗性、以動(dòng)物干3擾素介導(dǎo)的抗性和以毒蛋白介導(dǎo)的抗性等幾種。而其中以動(dòng)物干擾素介導(dǎo)的抗性由于具有廣譜抗性和環(huán)境友好等特點(diǎn)備受關(guān)注。動(dòng)物的干擾素(Interferon,INF)是動(dòng)物細(xì)胞在病毒或其它誘生劑作用下產(chǎn)生的，具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)，其是目前所知的發(fā)揮作用最快的第一病毒防御體系。目前已見(jiàn)報(bào)道的主要為2，-5，寡腺苷酸酶系統(tǒng)(2-5A系統(tǒng))，該系統(tǒng)在病毒dsRNA的作用下激活2-5A合成酶，產(chǎn)生一系列短的2'-5'寡腺苷酸(2-5A),2-5A再激活2-5A依賴性RNaseL,RNaseL進(jìn)一步非特異的降解mRNA,從而對(duì)高等脊推動(dòng)物體內(nèi)被侵染細(xì)胞內(nèi)蛋白翻譯產(chǎn)生抑制，并可引發(fā)細(xì)胞凋亡，以達(dá)到限制病毒增殖的目的。Mitra將人類的2-5A系統(tǒng)的兩個(gè)酶以不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)導(dǎo)入煙草中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株對(duì)TMV、AMV和TEV的侵染均表現(xiàn)出了侵染部壞死現(xiàn)象。同時(shí)他還發(fā)現(xiàn)壞死現(xiàn)象僅局限于葉片部分，而未延伸至這個(gè)植株，另外他還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株上未接種病毒的葉片沒(méi)有被侵染，這表明2-5A系統(tǒng)在煙草中表達(dá)可以有效的提高植物對(duì)病毒的抗性，并具有廣譜抗性和特異性特點(diǎn)。Tmve則將2-5A系統(tǒng)導(dǎo)入土豆中也獲得了相類似的結(jié)果。由于2-5A系統(tǒng)來(lái)源于高等脊推動(dòng)物，因此其與病毒基因組發(fā)生互作的機(jī)會(huì)很小，這從一定程度上規(guī)避了轉(zhuǎn)基因風(fēng)險(xiǎn)。但目前為止，以2-5A系統(tǒng)轉(zhuǎn)化水稻獲得抗病毒轉(zhuǎn)基因材料的研究未見(jiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用2-5A合成酶和RNaseL基因轉(zhuǎn)化水稻獲得對(duì)水稻條紋葉枯病抗性提高的品種的新方法。本發(fā)明所提供的提高水稻品種對(duì)水稻條紋葉枯病抗性水平的方法，是根據(jù)人類2，-5'寡腺苷酸酶系統(tǒng)的2-5A合成酶和RNaseL可以響應(yīng)于病毒dsRNA,并通過(guò)降解病毒RNA來(lái)限制寄主體內(nèi)病毒增殖的原理，將兩基因全長(zhǎng)序列導(dǎo)入水稻中使之表達(dá)，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因品種(系)對(duì)水稻條紋葉枯病的抗性水平。本發(fā)明所提供的能提高轉(zhuǎn)基因受體品種(系)對(duì)水稻條紋葉枯病抗性水平的方法，是通過(guò)以下方法驗(yàn)證的1)從公共數(shù)據(jù)庫(kù)獲得2-5A合成酶和RNaseL兩基因全序列，將其分別構(gòu)建植物表達(dá)載體'2)轉(zhuǎn)化水稻品種獲得轉(zhuǎn)基因再生植株；3)通過(guò)PCR或Southernblot方法多代篩選獲得的轉(zhuǎn)基因雙陽(yáng)性水稻品種(系)；4)通過(guò)RT-PCR或Northernblot方法確定轉(zhuǎn)基因雙陽(yáng)性水稻品種(系)中兩基因是否正常轉(zhuǎn)錄；5)通過(guò)接種鑒定方法表明轉(zhuǎn)基因雙陽(yáng)性水稻品種(系)對(duì)水稻條紋葉枯病的抗性水平較轉(zhuǎn)基因受體品種(系)有顯著提高。本發(fā)明提供了一種為水稻抗條紋葉枯病材料的創(chuàng)制提供新方法，其具有以下優(yōu)點(diǎn)①鑒于生產(chǎn)上目前使用的抗病品種抗性來(lái)源多為巴基斯坦的水稻品種Modan中的單一主效基因，而隨著病害的連年趨重發(fā)生，病毒亦存在進(jìn)化變異進(jìn)而克服上述抗病基因的可能性，本方法可以為水稻條紋葉枯病的可持續(xù)綜合防控提供材料上的儲(chǔ)備；②由于2-5A系統(tǒng)來(lái)源于高等脊推動(dòng)物，因此其與病毒基因組發(fā)生互作的機(jī)會(huì)很小，不易出現(xiàn)病毒異源包被和重組的情況，較之病毒來(lái)源轉(zhuǎn)基因策略本方法從一定程度上規(guī)避了轉(zhuǎn)基因風(fēng)險(xiǎn)。圖1為2-5A合成酶基因全序列獲得方法示意圖圖2為RNAseL基因全序列獲得方法示意圖圖3為2-5A合成酶基因植物表達(dá)載體構(gòu)建示意圖圖4為RNAseL基因植物表達(dá)載體構(gòu)建示意5為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻圖(a為轉(zhuǎn)化后愈傷組織開(kāi)始分化；b為篩選出新的小苗)圖6為L(zhǎng)代轉(zhuǎn)2-5A系統(tǒng)基因水稻的PCR檢測(cè)結(jié)果示意圖(A為2-5A基因檢測(cè)結(jié)果；B為RNaseL基因檢測(cè)結(jié)果；M為天為時(shí)代MarkerIII;1為植物轉(zhuǎn)化載體擴(kuò)增結(jié)果；2為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諗U(kuò)增結(jié)果；3-10為L(zhǎng)代轉(zhuǎn)2-5A基因水稻植株擴(kuò)增結(jié)果)圖7為L(zhǎng)代轉(zhuǎn)2-5A系統(tǒng)基因水稻的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果示意圖(A為2-5A基因檢測(cè)結(jié)果；B為RNaseL基因檢測(cè)結(jié)果；M為天為時(shí)代MarkerIII;l-4為T(mén)4代轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增結(jié)果；CK為未轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增結(jié)果)具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、2-5A合成酶和RNaseL基因植物表達(dá)載體的獲得目的基因是來(lái)自于人類的2-5A系統(tǒng)的2-5A合成酶基因和RNAseL基因，具體獲得方式為在因特網(wǎng)上輸入網(wǎng)址http:〃匿ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/2379,進(jìn)入圖1頁(yè)面，獲得人類2-5A合成酶基因全序列；在因特網(wǎng)上輸入http://www,ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/485407report-genbank網(wǎng)址，進(jìn)入圖2頁(yè)面，獲得人類RNaseL基因(2-5A依賴性RNase基因)全序列。獲得的兩基因長(zhǎng)度分別為1.3kb和2.8kb,分別編碼364個(gè)和741個(gè)氨基酸。按照?qǐng)D3、4構(gòu)建植物載體pA匿21(^和pA畫(huà)2106,包括目的基因和選擇標(biāo)記兩個(gè)表達(dá)單元。啟動(dòng)子大小為800bp，來(lái)自花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子，啟動(dòng)目的基因組成性表達(dá)。終止子大小為253bp的Nos3，序列，來(lái)自于Ti質(zhì)粒中胭脂堿合成酶基因的終止序列，起終止表達(dá)的作用。標(biāo)記基因用叩tll基因，大小為795bp來(lái)自于Kanr細(xì)菌，編碼產(chǎn)物APH(3，)-II氨基糖苷3'-磷酸轉(zhuǎn)移酶II，亦稱新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II,已證明無(wú)安全問(wèn)題，是第一個(gè)安全使用的標(biāo)記基因。載體中沒(méi)有使用報(bào)告基因。實(shí)施例2、利用2-5A合成酶和RNaseL基因植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻將兩個(gè)植物轉(zhuǎn)化載體pA固2109和pA薩2106以凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，以粳稻品種鹽粳21的幼胚愈傷組織作為轉(zhuǎn)基因的受體材料進(jìn)行同時(shí)轉(zhuǎn)化(圖5),水稻轉(zhuǎn)化方法按Hiei等人的方法稍做改進(jìn)。經(jīng)抗生素篩選獲得8個(gè)T。代再生植株，移栽到坡璃溫室均能正常生長(zhǎng)、開(kāi)花和結(jié)實(shí)，故獲得8個(gè)家系的l代種子。實(shí)施例3、轉(zhuǎn)基因后代的PCR篩選根據(jù)2-5A和RNaseL的序列設(shè)計(jì)特異性引物，其中2-5A為5-TTCCTCAgTCCTCTCACCAC-3和5-gAgCTgCCTTCTCAggTACT-3，擴(kuò)增片斷大小為630bp;RNaseL為5—CCTCTGCATAACGCAGTA-3和5—GCTCCAGAAGCCTCTGCAC-3,,擴(kuò)增片斷大小為590bp。釆用CTAB大量DNA提取方法提取水稻DNA(方法參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，略)。PCR反應(yīng)體系為lOngDNA模板，0.7ulPrimer(4pmol/ul)，lul10xBuffer(freeMgCh)，0.2uldNTP(2.5mM),0.6ulMgCl2(25mM)，0.lulTa"5u/ul)，6.4ulddH20。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5。C變性5min;95。C變性30s、55-62。C退火30s、72。C延伸lmin，共進(jìn)行35次循環(huán)72'C延伸7min。用0.8%的瓊脂糖檢測(cè)其擴(kuò)增產(chǎn)物，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄試驗(yàn)結(jié)果。采用PCR方法對(duì)T「L代連續(xù)進(jìn)行選擇，對(duì)以鹽粳21為受體的1個(gè)L代轉(zhuǎn)基因雙陽(yáng)性株的200個(gè)后代進(jìn)行選擇，獲得17個(gè)雙陽(yáng)性L代株，2-5A和RNaseL兩對(duì)引物從轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株中分別擴(kuò)增出630bp和590bp的帶；選擇10個(gè)T2代播種8株進(jìn)行鑒定，PCR鑒定篩選獲得27個(gè)雙陽(yáng)性T3代株，但來(lái)源于同一T2代的T3代株系沒(méi)有全表現(xiàn)為雙陽(yáng)性的株系；對(duì)其中的編號(hào)為4的T3代轉(zhuǎn)基因株的8個(gè)后代進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)8株均表現(xiàn)為雙陽(yáng)性(圖6)。從8株中選擇4株4-2、4-4、4-5和4-6的后代各20個(gè)株系進(jìn)一步鑒定發(fā)現(xiàn)，其后代亦均表現(xiàn)為雙陽(yáng)性。實(shí)施例4、2-5A系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因水稻植株的轉(zhuǎn)錄檢測(cè)釆用TRIzol法提取水稻總RNA對(duì)4-5等4個(gè)1"3代轉(zhuǎn)基因雙陽(yáng)性株進(jìn)行RT-PCR,取水稻葉片組織O.lg，加入lmLTRIzolreagent充分研磨，室溫放置5min;加入氯仿200ML,充分震蕩15sec,室溫放置3min;12，000g,4匸離心15min;取上層水相加入另一離心管中，加入0.5mL異丙醇；12，000g，4°C，離心10min(可見(jiàn)RNA沉淀)，棄去上清；加入lmL70%乙醇(渦漩，7，000g離心5min);干燥RNA沉淀，加ddH2040jaL溶解即可。取一Eppendorf管，加入各樣品RNA3|aL,3、-端引物1juL，D.D.W6iaL,置于70°C下變性5min，立即取出置于冰上放置5min。再依次加入下列試劑2jliL5xM-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、0.5juL40mmol/LdNTPs(每種10mmol/L)、0.5|aLRNasin(40U/|aL)、0.5jaLM—MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(20U/jaL)和1.5jaL加入DEPC處理過(guò)的D.D.W。42。C水浴1h，7(TC滅活10min,-2(TC保存?zhèn)溆谩Ｔ侔瓷弦徊匠绦蜻M(jìn)行PCR,結(jié)果顯示2-5A和RNaseL兩對(duì)引物從4個(gè)轉(zhuǎn)基因雙陽(yáng)性株中分別擴(kuò)增出630bp和590bp的帶，表明在4個(gè)轉(zhuǎn)基因雙陽(yáng)性株中2-5A和RNaseL兩基因均能正常轉(zhuǎn)錄(圖7)。實(shí)施例5、2-5A系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因水稻株系對(duì)水稻條紋葉枯病的抗性表現(xiàn)利用上述研究確定的方法鑒定4個(gè)以鹽粳21為受體的轉(zhuǎn)基因株系的抗性表現(xiàn)，試驗(yàn)預(yù)設(shè)水稻條紋葉枯病抗病對(duì)照鎮(zhèn)稻88、感病對(duì)照武育粳3號(hào)及受體對(duì)照鹽粳21。鑒定方法具體如下(l)浸種，催芽，至0.5葉時(shí)播于燒杯中，每個(gè)材料鑒定35株左右，3次重復(fù)；(2)到1.5葉齡時(shí)，接種帶毒灰飛虱2-5齡若蟲(chóng)，有效接種蟲(chóng)量為4蟲(chóng)/苗，接種前要齊苗；(3)燒杯用紗布封口，48小時(shí)后，將灰飛虱移走。移栽接種苗至秧盤(pán)，置于玻璃房中，注意水、溫管理；(4)接種后7天開(kāi)始調(diào)查病害發(fā)生情況，其后每隔三天調(diào)查一次，連續(xù)調(diào)查5次。病害調(diào)查參照周彤等制訂的標(biāo)準(zhǔn)0級(jí)，無(wú)癥狀；1級(jí)，有輕微黃綠色斑駁癥狀，病葉不卷曲，植株生長(zhǎng)正常；2級(jí)，病葉上褪綠擴(kuò)展相連成不規(guī)則黃白色或黃綠色條斑，病葉不卷曲或略有卷曲，生長(zhǎng)基本正常；3級(jí)，病葉嚴(yán)重褪綠，病葉卷曲呈捻轉(zhuǎn)狀，少數(shù)病葉出現(xiàn)黃化枯萎癥狀；4級(jí)，大部分病葉卷曲呈捻轉(zhuǎn)狀，葉片黃化枯死，植株呈假枯心狀或整株枯死。其中2-4級(jí)直接記為發(fā)病，l級(jí)在2天后再次調(diào)查確認(rèn)，0級(jí)記為不發(fā)病，計(jì)算發(fā)病率。結(jié)果顯示4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系對(duì)水稻條紋葉枯病的抗性水平較受體鹽粳21和感病對(duì)照武育粳3號(hào)有顯著性提高(表l)。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>鑒于生產(chǎn)上目前使用的抗病品種抗性來(lái)源多為巴基斯坦的水稻品種Modan中的單一主效基因，而隨著病害的連年趨重發(fā)生，病毒亦存在進(jìn)化變異進(jìn)而克服上述抗病基因的可能性，本方法可以為水稻條紋葉枯病的可持續(xù)綜合防控提供材料上的儲(chǔ)備。同時(shí)由于2-5A系統(tǒng)來(lái)源于高等脊椎動(dòng)物，因此其與病毒基因組發(fā)生互作的機(jī)會(huì)很小，不易出現(xiàn)病毒異源包被和重組的情況，較之病毒來(lái)源轉(zhuǎn)基因策略本方法從一定程度上規(guī)避了轉(zhuǎn)基因風(fēng)險(xiǎn)。上述實(shí)施不以任何形式限定本發(fā)明。權(quán)利要求1、2-5A合成酶和RNaseL基因在提高水稻品種(系)對(duì)水稻條紋葉枯病抗性上的應(yīng)用，其特征在于將2-5A合成酶和RNaseL兩基因全序列分別構(gòu)建植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化水稻品種獲得轉(zhuǎn)基因再生植株，通過(guò)PCR多代篩選獲得的轉(zhuǎn)基因雙陽(yáng)性水稻品種(系)對(duì)水稻條紋葉枯病的抗性水平較轉(zhuǎn)基因受體品種(系)有顯著提高。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種利用2-5A合成酶和RNaseL基因轉(zhuǎn)化水稻獲得對(duì)水稻條紋葉枯病抗性提高的品種的新方法。本發(fā)明的實(shí)質(zhì)是根據(jù)2-5A合成酶和RNaseL向應(yīng)于病毒dsRNA，進(jìn)而降解病毒RNA以限制寄主體內(nèi)病毒增殖的原理，將兩基因全長(zhǎng)序列導(dǎo)入水稻中表達(dá)來(lái)提高轉(zhuǎn)基因品種(系)對(duì)水稻條紋葉枯病的抗性水平。鑒于現(xiàn)有抗病品種存在抗性喪失的風(fēng)險(xiǎn)，本方法可以為水稻條紋葉枯病的可持續(xù)綜合防控提供材料上的儲(chǔ)備。文檔編號(hào)C12N15/82GK101580847SQ200910032718公開(kāi)日2009年11月18日申請(qǐng)日期2009年6月26日優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日發(fā)明者于嘉林,任春梅,劉偉華,彤周,周益軍,季英華,熊如意,程兆榜,潔陳申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院