專利名稱：自發(fā)高轉(zhuǎn)移傾向小鼠肺癌細胞系及其建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物細胞系領(lǐng)域。具體涉及一種小鼠肺癌自發(fā)高轉(zhuǎn)移傾向細胞系的建 立及其建立方法。背景資料腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學特性之一，也是腫瘤患者死亡的重要 原因。然而，有關(guān)轉(zhuǎn)移的確切機制目前尚不十分清楚。因此，腫瘤轉(zhuǎn)移一直是腫瘤學研究的 一個熱點。目前有關(guān)腫瘤轉(zhuǎn)移的研究還主要局限于手術(shù)切除的腫瘤標本和某些有限轉(zhuǎn)移特 性腫瘤細胞系的轉(zhuǎn)移相關(guān)指標的觀察，而它們均不能精確地反映腫瘤生長轉(zhuǎn)移的整個臨床 過程，直接影響著腫瘤轉(zhuǎn)移機制及其干預(yù)治療的深入研究。為此，有必要建立理想的腫瘤轉(zhuǎn) 移動物模型對腫瘤轉(zhuǎn)移進行深入的研究。肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，而轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌患者死亡 的最主要原因。因此，對肺癌轉(zhuǎn)移的研究已成為當前的熱點之一，建立肺癌轉(zhuǎn)移的動物模型 正是研究腫瘤轉(zhuǎn)移生物學和抗轉(zhuǎn)移實驗治療的重要工具。國內(nèi)外學者在這方面做了大量的 研究和探索，本研究通過首代切除皮下腫瘤獲得肺轉(zhuǎn)移灶，結(jié)合體內(nèi)反復(fù)篩選的方法，篩選 出一個小鼠肺癌皮下植瘤自發(fā)高轉(zhuǎn)移模型，并建立了相應(yīng)高轉(zhuǎn)移細胞系，為研究肺癌轉(zhuǎn)移 機制和抗轉(zhuǎn)移實驗治療提供了較為理想的動物模型及細胞系。本發(fā)明的技術(shù)方案是利用C57BL/6J小鼠肺癌轉(zhuǎn)移灶作為建系瘤源，作為一種新 的篩選自發(fā)高轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞的方法，采用體外原代培養(yǎng)方式，建立了一株具有自發(fā)高轉(zhuǎn) 移傾向的小鼠肺癌細胞系，命名為LLC-F3。本發(fā)明的有益結(jié)果是1. C57BL/6J小鼠動物模型可以用來篩選自發(fā)高轉(zhuǎn)移傾向腫瘤細胞株；2.獲得的自發(fā)高轉(zhuǎn)移傾向小鼠肺癌細胞系可以用于篩選抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物；3.通過與親本細胞的比較，可應(yīng)用自發(fā)高轉(zhuǎn)移傾向小鼠肺癌細胞系用于篩選腫瘤 轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白；4.可用于研究腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)病機理；5.可用于研究制備腫瘤轉(zhuǎn)移的疫苗；6.通過接種動物來檢測抗腫瘤轉(zhuǎn)移的疫苗的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有自發(fā)高轉(zhuǎn)移傾向小鼠肺癌細胞系及其建系方法，為 肺癌的遺傳學改變規(guī)律，肺癌的病因?qū)W，腫瘤轉(zhuǎn)移機制的研究，以及抗轉(zhuǎn)移的藥物篩選提供 理想的實驗對象。本發(fā)明采用小鼠Lewis肺癌(LLC-F0)細胞株作為建系的源細胞，通過C57BL/6J 小鼠體內(nèi)連續(xù)篩選和體外擴增相結(jié)合的方法，建立了一種自發(fā)高轉(zhuǎn)移傾向小鼠肺癌細胞 系，命名為LLC-F3。本發(fā)明通過下述方法和步驟建立自發(fā)高轉(zhuǎn)移傾向小鼠肺癌細胞系LLC-F3。1.按常規(guī)方法建立小鼠肺癌原位移植瘤模型
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將小鼠Lewis肺癌細胞株(LLC-FO)細胞體外培養(yǎng)，取5 X IO5個狀態(tài)良好的生長 期細胞，接種于C57BL/6J小鼠背側(cè)皮下，建立小鼠LLC-FO原位移植瘤模型。2.自發(fā)高轉(zhuǎn)移傾向細胞的體外培養(yǎng)在接種后第18天，切除原位瘤，繼續(xù)飼養(yǎng)小鼠；過3個星期后斷頸法處死小鼠，用 75%的酒精消毒。于無菌環(huán)境中打開胸腔，取出肺，肉眼可見許多轉(zhuǎn)移灶；用RPMI 1640培 養(yǎng)液沖洗，盡量洗去血塊，后用鑷子小心取出轉(zhuǎn)移瘤體于另一預(yù)加IOmL RPMI 1640培養(yǎng)液 的培養(yǎng)皿中，剝?nèi)グげ⒈M量撕碎，過篩除去細胞團和間質(zhì)成分。IOOOrpm離心5min，培養(yǎng) 于含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，靜置培養(yǎng)；原代培養(yǎng)每3天換液一次，去除已 經(jīng)漂浮的細胞和殘留的血細胞。3.瘤細胞的體內(nèi)外交替生長瘤細胞體外培養(yǎng)一段時間后，將培養(yǎng)所得的細胞按步驟1接種于C57BL/6J小鼠背 側(cè)皮下，每只小鼠接種量為5X 105(0.1mL)。待原位瘤長至IOOOmm3大小則做手術(shù)切除。按 步驟2，3進行篩選擴增，同法重復(fù)3 4輪篩選。4.建立細胞系將篩選所得的肺轉(zhuǎn)移細胞體外培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。隔天更換培養(yǎng)液。每4天傳 代1次，常規(guī)凍存后，復(fù)蘇，建立具有高自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移的小鼠肺癌細胞系LLC-F3。經(jīng)常規(guī)系列實驗檢測，本發(fā)明的細胞系具有以下特點1.能在體外長期生長和穩(wěn)定傳代。2.經(jīng)實驗觀察，體外生長的LLC-F3具有典型的腫瘤細胞特征，接觸性生長抑制喪 失，染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變嚴重，符合惡性腫瘤的遺傳學特征。3.成瘤性檢測表明，IXlO6細胞(0. ImL)接種于C57BL/6J小鼠背側(cè)皮下的成瘤 率是100%，成瘤潛伏期小于7天。腫瘤生長迅速，至接種42天后，腫瘤平均體積可以達到 1000mm3。接種4周時，其肺轉(zhuǎn)移率可達100 %。4. LLC-FO與LLC-F3的蛋白表達差異分析表明，自發(fā)高轉(zhuǎn)移細胞系LLC-F3與親本 LLC-FO相比，具有特異性表達的蛋白。以上結(jié)果表明，本發(fā)明細胞系具有成瘤率高、轉(zhuǎn)移時間早、轉(zhuǎn)移率穩(wěn)定的特點，是 一種理想的肺癌轉(zhuǎn)移研究模型，其在揭示肺癌轉(zhuǎn)移機制和抗轉(zhuǎn)移藥物篩選的應(yīng)用中將有著 廣闊的前景。


圖1篩選LLC-F3實驗流程圖。圖2體外培養(yǎng)的LLC-FO和LLC-F3細胞(X 10)。顯微鏡下顯示，相比于LLC-FO細 胞，LLC-F3細胞均呈簇樣生長，形狀不規(guī)則，細胞排列緊密，界限清楚，接觸性抑制喪失。圖3LLC-F0與LLC-F3培養(yǎng)上清中細胞因子含量比較圖。圖4LLC-F0 (A)與LLC-F3⑶的蛋白雙向電泳銀染圖比較。圖5LLC-F0與LLC-F3尾靜脈注射后小鼠生存曲線。圖6LLC-F0與LLC-F3尾靜脈注射后小鼠平均存活時間比較。圖7LLC-F3尾靜脈注射后小鼠肺部轉(zhuǎn)移隨時間變化情況。
具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。實施例本發(fā)明的材料1. C57BL/6J小鼠由南京大學分子醫(yī)學研究所提供。2. RPMI 1640細胞培養(yǎng)液和新生牛血清購自Gibico公司。3. pH 3-10 Pharmacia IPG 膠條購自 Bio-Rad 公司。4. VEGF和PlGF測量試劑盒購自R&D Systems公司。一、自發(fā)高轉(zhuǎn)移性的小鼠肺癌細胞系LLC-F3的建立LLC-FO細胞體外培養(yǎng)，取5X IO5個狀態(tài)良好的生長期細胞，接種于C57BL/6J小 鼠的背側(cè)皮下，正常飼養(yǎng)荷瘤小鼠；在接種后第18天，切除原位瘤，繼續(xù)飼養(yǎng)小鼠；過3個 星期后斷頸法處死小鼠，用75%的酒精消毒。于無菌環(huán)境中打開胸腔，取出肺，肉眼可見許 多轉(zhuǎn)移灶；用RPMI 1640培養(yǎng)液沖洗，盡量洗去血塊，后用鑷子小心取出轉(zhuǎn)移瘤體于另一預(yù) 加IOmLRPMI 1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，剝?nèi)グげ⒈M量撕碎，過篩除去細胞團和間質(zhì)成分。 IOOOrpm離心5min，培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中。體外傳代3次后再 次接種C57BL/6J小鼠。18天切除，3個星期后處死分離肺轉(zhuǎn)移灶，并體外培養(yǎng)。這樣的循 環(huán)3次，最后一次得到的細胞即為LLC-F3，大量擴增后備用。二、LLC-FO與LLC-F3的細胞形態(tài)觀察將LLC-FO細胞與LLC-F3細胞體外培養(yǎng)至50%融合后，在顯微鏡下觀察。三、培養(yǎng)上清中VEGF和PlGF表達量比較在24孔細胞培養(yǎng)板中接種密度為IX 105/mL的LLC-FO和LLC-F3細胞，用含有 10%新生牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，觀察細胞生長良好，換用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h。 收獲上清，4°C 13200rpm離心15min，取上清用于細胞因子的測量。采用購自R&D Systems的ELISA試劑盒進行測量，測量時嚴格按照試劑盒說明書 所述進行。四、LLC-FO與LLC-F3蛋白組學比較(1)蛋白樣品準備LLC-FO與LLC-F3細胞等密度接種于55cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37°C孵箱培養(yǎng)24h， 無血清培養(yǎng)12h后，收獲細胞。用預(yù)冷的PBS洗滌細胞3次。最后，將細胞團加入裂解液 (8M 尿素，4% CHAPS, 65mM DTT,40mM Tris-HCl，35 μ g/mL 蛋白酶抑制劑混合液)，在 4°C裂 解lh，13200rpm離心30min，取上清，用BCA方法測量好蛋白濃度，保存于_80°C。(2)雙向電泳將準備好的樣品等蛋白濃度上樣，上樣量為300yg。用長度為13cm的pH 3-10PharmaciaIPG 膠條，在電泳儀(Amersham Pharmacia Biotech)聚焦，聚焦完成后， 將膠條放于平衡液(50mM Tris-HCl，6M尿素，2% SDS，30%甘油和DTT，pH 8.8)平衡 3X 15min，將平衡好的膠條放在12. 5% SDS-PAGE電泳上方，用1 %瓊脂封好，30mA恒流電泳 至溴酚藍到底部，大約5h。(3)銀染取下膠，銀染后觀察兩種細胞系的蛋白組學上的差別。具體方法如下取下膠，用去離子水洗3次，每次5min;用固定液(40%甲醇，10%冰醋酸)固定Ih ；用去離子水洗3次，每次5min ；用5%戊二醛溶液固定增明Ih ；用去離子水洗3次，每次 5min ；放入銀染溶液(0. 02N NaOH, 0. 5%氨水，0. 4gAgN03)中，染色30min ；用去離子水洗3 次，每次5min ；放于顯影液(0.005%檸檬酸溶液，2%甲醛溶液)中，顯影IOmin ；用5% HAc 終止反應(yīng)；用去離子水洗3次，每次5min ；用掃描儀完成掃描工作。五、LLC-FO與LLC-F3轉(zhuǎn)移能力的比較1. 5 X IO6細胞量的LLC-FO與等細胞量的LLC-F3尾靜脈注射C57BL/6J小鼠，記錄 小鼠的存活時間，死亡當天，解剖尸體查看肺轉(zhuǎn)移情況。實驗結(jié)果( 一 ) LLC-FO與LLC-F3的細胞形態(tài)觀察LLC_F0和LLC-F3在相同的培養(yǎng)調(diào)節(jié)下， LLC-FO較為分散，細胞之間較不易成團。兩種細胞均貼壁不緊密，容易消化(圖2)。( 二)培養(yǎng)上清中VEGF和PlGF表達量比較LLC_F0和LLC-F3在無血清條件下培 養(yǎng)24h，LLC-F3分泌到培養(yǎng)上清中的VEGF與PlGF的含量顯著比LLC-FO顯著高(圖3)。(三)LLC-FO與LLC-F3蛋白組學比較從LLC-FO和LLC-F3的雙向電泳圖譜可以 看出，大量的蛋白點是一致的，有某些蛋白點的表達量有顯著差異(圖4圓圈)，可以說明， LLC-FO與LLC-F3是同一來源的，在蛋白水平上大部分是一致的，但是它們又有明顯的區(qū) 別，可能就是這些區(qū)別造成了兩者行為上的差別。(四)LLC-FO與LLC-F3轉(zhuǎn)移能力的比較1)相同細胞量尾靜脈注射后，LLC-FO的生存曲線顯著比LLC-F3后延緩(圖5)， LLC-F3組小鼠平均存活時間為兩周，而LLC-FO組小鼠平均存活時間為三周，延長了一個星 期(圖6)。2)取不同的時間解剖小鼠，可以觀察到小鼠肺部被腫瘤細胞侵襲，形成轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn) 移灶發(fā)展成腫瘤的情況(圖7)。死亡后解剖尸體發(fā)現(xiàn)小鼠有嚴重的肺轉(zhuǎn)移和胸腔積血，說 明小鼠死于肺轉(zhuǎn)移。LLC-F3組小鼠存活時間短于LLC-FO組說明了 LLC-F3比LLC-FO轉(zhuǎn)移 性更高。因而我們獲得了比LLC-FO有更高轉(zhuǎn)移性的LLC-F3細胞系。
權(quán)利要求
一種自發(fā)高轉(zhuǎn)移傾向小鼠肺癌細胞系LLC F3，具有生物學特征，還具備特殊的轉(zhuǎn)移表型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自發(fā)高轉(zhuǎn)移傾向小鼠肺癌細胞系LLC-F3，其生物學特征是1)能在體外長期生長和穩(wěn)定傳代2)接觸性生長抑制喪失3)可無限繼代培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自發(fā)高轉(zhuǎn)移傾向小鼠肺癌細胞系LLC-F3，其特殊轉(zhuǎn)移表型病 理學特征是C57BL/6J小鼠接種成瘤率和皮下接種轉(zhuǎn)移率為100%。
4.一種自發(fā)高轉(zhuǎn)移傾向小鼠肺癌細胞系的建立方法，其特征在于用LLC-FO接種 C57BL/6J小鼠；確認轉(zhuǎn)移部位；篩選自發(fā)高轉(zhuǎn)移傾向小鼠肺癌細胞系；細胞體內(nèi)成瘤。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種自發(fā)高轉(zhuǎn)移傾向小鼠肺癌細胞系的建立方法，其特征在 于取肺癌親本LLC-FO細胞懸液，用濃度為5X 105/0. ImL接種于C57BL/6J小鼠背側(cè)皮下， C57BL/6J小鼠由南京大學分子醫(yī)學研究所提供。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種自發(fā)高轉(zhuǎn)移傾向小鼠肺癌細胞系的建立方法，其特征在 于將C57BL/6J小鼠斷頸處死，對各個組織進行肉眼觀察，確立其轉(zhuǎn)移灶的部位為肺臟、肝 臟。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種自發(fā)高轉(zhuǎn)移傾向小鼠肺癌細胞系的建立方法，獲得自發(fā) 高轉(zhuǎn)移傾向小鼠肺癌細胞系，其特征在于取5 X IO5個體外培養(yǎng)的狀態(tài)良好的生長期LLC-FO 細胞，接種于C57BL/6J小鼠的背側(cè)皮下，正常飼養(yǎng)荷瘤小鼠；在接種后第18天，切除原位 瘤，繼續(xù)飼養(yǎng)小鼠；過3個星期后斷頸法處死小鼠，用75%的酒精消毒。于無菌環(huán)境中打開 胸腔，取出肺，肉眼可見許多轉(zhuǎn)移灶；用無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液沖洗，盡量洗去血塊，后 用鑷子小心取出轉(zhuǎn)移瘤體于另一預(yù)加IOmL RPMI 1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，剝?nèi)グげ⒈M量 撕碎，過篩除去細胞團和間質(zhì)成分。IOOOrpm離心5min，培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，靜置培養(yǎng)；原代培養(yǎng)每3天換液一次，去除已經(jīng)漂浮的細胞和殘留的血細 胞；體外傳代3次后再次接種C57BL/6J小鼠。18天切除，3個星期后處死分離肺轉(zhuǎn)移灶，并 體外培養(yǎng)。這樣的循環(huán)3次，最后一次得到的細胞即為LLC-F3，大量擴增后備用。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種自發(fā)高轉(zhuǎn)移傾向小鼠肺癌細胞系的建立方法，LLC-F3細 胞體內(nèi)成瘤實驗，其特征在于當LLC-F3細胞體外培養(yǎng)穩(wěn)定后，將細胞再回注到C57BL/6J 小鼠皮下，方法同前，成瘤率達到100%，并且在C57BL/6J小鼠的肺臟和肝臟出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶。
9.一種自發(fā)高轉(zhuǎn)移傾向小鼠肺癌細胞系的用途，其特征在于，用于篩選抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥 物；或用于體外腫瘤轉(zhuǎn)移的研究。
全文摘要
本發(fā)明屬于動物細胞系領(lǐng)域。本發(fā)明采用小鼠肺癌LLC-F0細胞株作為源細胞，通過C57BL/6J體內(nèi)篩選和體外培養(yǎng)相結(jié)合的方法，建立了具有自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移表形的小鼠肺癌高轉(zhuǎn)移細胞系LLC-F3。所述的鼠肺癌自發(fā)高轉(zhuǎn)移傾向細胞亞系具有肺癌轉(zhuǎn)移率高且惡性程度高的特點，是一種理想的研究腫瘤轉(zhuǎn)移的模型，在揭示肺癌的轉(zhuǎn)移機制和抗轉(zhuǎn)移藥物的篩選的應(yīng)用中將有著廣闊的前景。
文檔編號C12Q1/02GK101906400SQ200910032910
公開日2010年12月8日 申請日期2009年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月8日
發(fā)明者劉建寧, 張菁, 蘇藝晶 申請人:南京大學