專利名稱：一種鼻咽癌eb病毒特異性dna酶檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種鼻咽癌EB病毒特異性DNA酶檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
鼻咽癌(Nasopharyngenl Carcinoma, NPC)是發(fā)生于鼻咽部的惡性腫瘤，最常見于 中國南方，如廣東、廣西、湖南、福建等省和東南亞一些國家。全世界80%以上的鼻咽 瘤發(fā)生在中國的南方。目前對鼻咽癌尚無確切的一級預防(從病因上預防)措施，因此 人們把鼻咽癌的預防寄希望于二級預防上，也即是早發(fā)現(xiàn)、早診斷及早治療。目前，NPC 的早期診斷存在較多困難，主要表現(xiàn)在1)鼻咽解剖部位較深，某些患者由于種種原 因無法用間接鼻咽鏡進行檢査；2)早期鼻咽癌病灶一般較小，容易為臨床檢査所忽略 而造成漏診。因此臨床上迫切需要一種簡便，特異性高的檢測方法來提早確診、提高早 期診斷率。通過對高發(fā)區(qū)長期的研究，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌的自然發(fā)展史為健康人一EB抗體 陽性一原位腫瘤一浸潤癌。從開始出現(xiàn)癥狀至死亡平均僅18.7個月，惡性度很高。但鼻 咽癌在病理確診前有較長時間(平均4.36年)，體內(nèi)的多種EB病毒抗體水平就開始升 髙，這一現(xiàn)象提示可以通過血清免疫學和生物化學的方法探測鼻咽癌。
' 針對EB病毒(EBV)某些相關(guān)抗體，如EBV 1B關(guān)的抗原與病毒衣殼抗原 (VCA-IgA)、病毒的早期抗原(EA-IgA)、病毒誘導的膜抗原(MA-IgA)等的血清 學檢測早已應用于鼻咽癌對現(xiàn)場普査、臨床診斷、病程追蹤。但研究表明如以VCA-IgA 作為NPC早期診斷指標或視為癌前可疑指針，則出現(xiàn)較高的假陽性率；而EA-IgA特異 性較高但靈敏性差，漏診可能性大；其它一些抗體如MA—IgA、 EBNA—IgA (病毒的 核抗原)等靈敏性和特異性都較差，因而尋找其它方法作為NPC輔助診斷的指標就顯 得非常急需。1980年鄭永齊等發(fā)現(xiàn)EBV重感染的Raji細胞可以誘導出EBV特異性DNA 酶，并證實NPC患者血清中含有高頻度和高滴度的該酶抗體(DNA酶中和率，EB病 毒特異性DNA酶)。中山大學腫瘤防治中心黃迪教授在此基礎上進一步研究發(fā)現(xiàn)利用化 合物巴豆油和正丁酸可以聯(lián)合激發(fā)原含有EBV基因組的細胞株產(chǎn)生EB病毒特異性DNA酶，酶的活性用"C標記的同位素方法探測，并證實NPC病人的血清可以明顯的 降低該酶活性。臨床前期研究發(fā)現(xiàn)，EBV特異性DNA酶抗體的血清學檢測有很高的特 異性和靈敏性，可以很好的解決VCA、 EA等特異性或靈敏性差的問題，是目前最行之 有效的NPC檢測方法。
經(jīng)過多年的研究，基本探明EB病毒特異性DNA酶檢測的原理與方法，并試用于 臨床輔助診斷，但此方法要用到同位素標記DNA (同位素法)。眾所周知，同位素發(fā)射 出來的射線具有一定的能量，它可以破壞細胞組織，從而對人體造成傷害。而且同位素 的生產(chǎn)、運輸都很不方便，檢測步驟煩瑣，因此現(xiàn)有的DNA酶檢測方法盡管取得較好 的臨床診斷效果，卻沒有得到推廣，也不容易商品化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種鼻嚼癌EB病毒特異性DM酶檢測試劑盒，通過檢測血清中 EBv-DNA酶的抗酶率從而實現(xiàn)對早期鼻咽癌患者的無創(chuàng)傷快速診斷，安全靈敏。本發(fā) 明還提供該檢測試劑盒的制備方法。
本發(fā)明鼻咽癌EB病毒特異性DNA酶檢測試劑盒，包含標準DNA，標準SYBRGreen I， EB病毒特異性DNA酶，稀釋緩沖液。
所述標準DNA的濃度為35Pg/ml，體積為15ml;所述標準SYBR Green I的濃度為 IOX工作液，體積為80 |Lll;所述EB病毒特異性DNA酶的濃度o.08 0,25U/ul，體積為 100W;所述稀釋緩沖液為TE Buffer,其中Tris HC1 0. 01 M， EDTA 0. 001 M， pH 7. 0， 體積為20ml 。
本發(fā)明還提供該鼻咽癌EB病毒特異性DNA酶檢測試劑盒的制備方法，包括以 下步驟
(1) 標準DNA的生產(chǎn)和純化發(fā)酵培養(yǎng)含有p-CL質(zhì)粒的大腸桿菌以生產(chǎn)標準 DNA，所述標準DNA為p-CL質(zhì)粒；提取所述的p-CL質(zhì)粒；
(2) EB病毒特異性DNA酶的生產(chǎn)和純化在培養(yǎng)人Burkitt、s淋巴瘤細胞株 的過程中，以巴豆油和正丁酸作為誘導劑，同時采用Epstein-Barr病毒重復感染Raji 細胞，大量生產(chǎn)EB病毒特異性DNA酶；純化所述的EB病毒特異性DNA酶；
(3) 標準SYBR Green I的濃度配比固定質(zhì)粒DNA含量，設置標準SYBR Green I濃度梯度，確定低濃度SYBR Green I含量得到較敏感的熒光信號；在標 準SYBR Green I濃度確定的情況下，對標準DNA的濃度進行比例稀釋，確定標準 DNA的穩(wěn)定的線性可測濃度范圍。其中，步驟(1)中所述提取p-CL質(zhì)粒的方法優(yōu)選堿裂解法；步驟(2)中純 化所述的EB病毒特異性DNA酶的方法優(yōu)選離子交換層析法。
本發(fā)明提供的鼻咽癌EB病毒特異性DNA酶檢測試劑盒，對門診初診病人的診斷準 確率與病理結(jié)果一致，該檢測安全、靈敏、快速、對患者不造成損傷，病人及正常人均 可接受；結(jié)合我們的回顧性分析結(jié)果說明，該項研究不但可以用于鼻咽癌的早期診斷， 而且適用于鼻咽癌的早期大規(guī)模篩查與患病風險預測，為鼻咽癌的早期診斷與防治提供 了強有力的技術(shù)支持。本試劑盒具有重要的臨床和社會價值1)可做到鼻咽癌的早發(fā) 現(xiàn)、早治療，提高5年生存率，降低鼻咽癌的死亡率，降低醫(yī)療費用，節(jié)約醫(yī)療資源。 早期鼻咽癌患者85%可以治愈，晚期的死亡率則高達90%。而且晚期患者生存質(zhì)量差， 手術(shù)或維持性治療費用高，就會浪費大量的人力、物力和財力，給國家和家庭帶來重大 負擔，不利于和諧社會構(gòu)建。2)檢測方便，儀器和檢測條件要求不高，易于推廣，大 到三甲醫(yī)院小到社區(qū)醫(yī)院都可以檢測，這就極大的方便了患者，減輕了大醫(yī)院的就診壓 力。3)試劑盒的價格較低，可以為廣大中低收入人群所接受，有利于對普査工作的開 展。4)試劑盒的推廣前景廣闊，市場前景可觀。


圖1為EB病毒特異性DNA酶檢測的陰性組與陽性組生存曲線，其中Survival Functions (生存率)為觀察對象經(jīng)歷t個單位時段后仍存活的可能性，Cum Survival為 生存概率，"censored"為缺失；
圖2表示熒光信號與DNA含量之間的線性關(guān)系；
圖3 (i)表示六例陰性病人用鼻咽癌EB病毒特異性DNA酶檢測試劑盒法與 同位素法檢測EB病毒特異性DNA酶的結(jié)果比較；
圖3 (2)表示六例陽性病人用鼻咽癌EB病毒特異性DNA酶檢測試劑盒法與 用同位素法檢測EB病毒特異性DNA酶的結(jié)果比較。
圖3 (1)和圖3 (2)中，" "代表經(jīng)同位素法檢測得到的抗酶率，"■"代 表鼻咽癌EB病毒特異性DNA酶檢測試劑盒法檢測得到的抗酶率。
具體實施例方式
實施例l鼻咽癌患者的生存狀況與EB病毒特異性DNA酶檢測數(shù)值之間的關(guān)系
5圖1為對1824例患者的病例資料進行回顧性分析，采用又2檢驗法，總的誤差 X2=59.304,P=0.000，說明EB病毒特異性DNA酶在鼻咽癌患者和正常人群中分布有高度 顯著性差別，EB病毒特異性DNA酶在鼻咽癌患者中出現(xiàn)的頻率比健康人為高。經(jīng) log-rank檢驗EB病毒特異性咖A酶表達陽性與陰性(抗酶率大于30%為陽性，小于30 %為陰性)患者的生存曲線具有顯著性差異，提示EB病毒特異性DNA酶的檢測可以作 為生存預測的一個指標。
腫瘤分期的目的是通過檢査明確腫瘤的范圍，提供預后的情況，指導并確定治療方 案。腫瘤分期可分為基于臨床檢査為基礎的臨床分期(Clinical Staging)和根據(jù)手術(shù)標 本的組織和病理學檢査為基礎的病理分期(Pathologic Staging)兩種。由于手術(shù)并不是 鼻咽癌的主要治療方法，因此鼻咽癌的分期以臨床分期為主。目前國內(nèi)外公認的鼻咽癌 分期標準是2003年修改的國際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國腫瘤聯(lián)合會(AJCC)聯(lián)合制 定的TOM分期法。本實施例利用EB病毒特異性DNA酶檢測的抗酶率作為分型的基礎， 分別以抗酶率30%， 50%， 80%和100%作為界限，將病人分為四期，結(jié)合TNM分期 法對于五年存活率和十年存活率分別統(tǒng)計，比較兩種分型方法預測的結(jié)果(表l)，說 明EB病毒特異性DNA酶分型與UICC分期對于五年存活率和十年存活率的預測具有可 比性。
表1EB病毒特異性DNA酶酶分型和UICC分期五年和十年存活率比較
DNA酶分例數(shù)中位生存 時間大于五年存活率大于十年存活率例數(shù)百分比例數(shù)百分比
0—30433例137312例72.06%137例31.64%
31—50260例103170例65.38%61例23.46%
51—80819例75451例55.06%126例15.38%
81 — 100312例54140例44.87%39例12.5 c/0
UICC分期例數(shù)中位生存 時間大于五年存活率大于十年存活率例數(shù)百分比例數(shù)百分比l期103例89例86.41 %4139.81 %2期136例111例81.62 c/03626.47%3期684例110462例67.54%16123.54%4期894例56411例45.97%12513.98%6實施例2鼻咽癌EB病毒特異性DNA酶檢測試劑盒
試劑盒由以下試劑組成 (1 )標準DNA，濃度為35Pg/ml，體積為15ml;
(2) 標準SYBR Green I，濃度為IOX工作液，體積為80^x1;
(3) EB病毒特異性DNA酶，濃度0.08 0.25U/nl，體積為100W;
(4 )稀釋緩沖液為TE Buffer,其中Tris HC1 0. 01 M， EDTA 0.001 M， PH 7. 0， 體積為20ml 。
實施例3鼻咽癌EB病毒特異性DNA酶檢測試劑盒的制備及其靈敏性、特異性和穩(wěn)
定性
1.鼻咽癌EB病毒特異性DNA酶檢測試劑盒的制備方法 (I) DNA的生產(chǎn)和純化
經(jīng)過常規(guī)的大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)含有p-CL質(zhì)粒的大腸桿菌，制備DNA。利用堿裂解 法從大腸桿菌中分離純化p-CL質(zhì)粒，對該質(zhì)粒DNA進行鑒定(美國PE ABI公司DNA 測序儀測序)和定量分析(使用分光光度計測量溶液在600nm的吸光度，從而計算出DNA 含量)。理論上每個反應中DNA的用量大約為50 ng - 500 ng，所以在試劑盒中提供的 DNA為3.5Pg (如何確定)。100 ml大腸桿菌大約可生產(chǎn)500 ng DNA，因此每個試劑盒 的制作大約需要發(fā)酵1L太腸桿菌。
利用堿裂解法純化大腸桿菌質(zhì)粒DNA的具體步驟
(1) 取培養(yǎng)至對數(shù)生長后期含p-CL質(zhì)粒的大腸桿菌。培養(yǎng)液250ml， 4'C下5000g離心15分鐘,棄上清,將離心管倒置使上清液全部流盡。
(2) 將大腸桿菌沉淀重新懸浮于50ml用冰預冷的STE (STE的成分 為0.1mol/LNaCl、 10醒ol/LTris.Cl、 O.lmol/L EDTA， pH8.0)中。
(3) 同步驟1方法離心以收集細菌細胞。
(4) 將大腸桿菌沉淀物充分重新懸浮于5ml溶液I (成分為50mmol/L 葡萄糖,Tris.Cl (pH8.0) 25mmol/L, EDTA(pH8.0) 10 mmol/L,在101 bmn2(6.895X 104Pa) 高壓下蒸汽滅菌15分鐘，保存于4°C)中。
(5) 向步驟(4)獲得的大腸桿菌懸浮液中加入12ml新配制的溶液 II(含有NaOH 0.2 mol/ L SDS 1%，其中NaOH從5mol/L貯存液中現(xiàn)用稀釋)，蓋緊瓶蓋，緩緩地顛倒離心管數(shù)次以充分混勻內(nèi)容物，然后冰浴10分鐘。
(6)向步驟(5)獲得的混合物中加9邁1用冰預冷的溶液III (5mol/L 乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml 28.5ml，所配成的溶液重鉀的濃度為3mol/L，乙酸根的 濃度為5mol/L)，搖動離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物，冰上放置15分鐘，此時應 形成白色絮狀沉淀。 —(7)繼步驟(6)之后，于4'C下5000g離心15分鐘。
(8) 取離心后的上清液，加入50ml RNA酶A(10mg/ml), 37'C水浴 20分鐘。
(9) 加入等體積的飽和酚/氯仿,振蕩混勻，4'C下12000g離心10分鐘。
(10) 取上層水相，加入等體積氯仿,振蕩混勻,4'C下12000g離心10分鐘。
(11) 取上層水,相，加入1/5體積的4mol/LNaCl和10y。PEG(聚乙二 醇，分子量6000),冰上放置60分鐘。
(12) 4'C下12000g離心15分鐘，沉淀用lml 70%冰乙醇洗滌，4'C 下12000g離心5分鐘。
(13) 干燥沉淀物，將所得沉淀溶于500ml TE ( lOmmol / L Tris.HCl， lmmol/LEDTApH8.0)或水中。
需要注意的是，提取過程中應盡量保持低溫；加入溶液II和溶液III 后揚作應混和，切忌劇烈振蕩；由于RNA酶A中常存在有DNA酶，利用 RNA酶耐熱的特性，使用時應先對該酶液進行熱處理(80'C 1小時)，使DNA 酶失活。
(II) EB病毒特異性DNA酶的生產(chǎn)和純化 RPMI1640培養(yǎng)液(商品化的通用培養(yǎng)基)中添加20%小牛血清，在37'C條件下大 規(guī)模培養(yǎng)Raji細胞(人Burkitt's淋巴瘤細胞株)。培養(yǎng)時間達24小時后，向培養(yǎng) 體系中加入誘導劑巴豆油(終濃度為400 ng/ml)和正丁酸(終濃度4raM)，同時采用 Epstein-Barr病毒(EBV)重復感染Raji細胞，誘導出EB病毒特異性DNA酶。培養(yǎng)時 間達到96h，收獲細胞，用Hanks液洗滌3次，制成混懸液，超聲破碎，取上清液作為 粗制酶液。將該粗酶液采用如下的方法進行EB病毒特異性DNA酶的分離純化(在4° 進行)
8(1)硫酸銨分級鹽析 按不同飽和度將粉末狀固體(NH4)2S04分別加入粗酶液中，進行分級鹽析，定性測
定各個沉淀部分及其對應上清液的酶活以確定鹽析范圍。
(2 ) DEAE-Sephadex A-50離子交換層析 將鹽析后的沉淀溶于0.25邁01/1:， pH8.5Tris-HCl緩沖液中，透析脫鹽后上柱。采 用含有不同濃度NaCl(O、 0.1、 0.15 、 0.20、 0.25和1.0 M)的0.25 mol / L， pH7.5Tris-HCI 緩沖液進行洗脫，收集活性峰。將所獲得的活性峰用PEG20000濃縮至適當體積， (3) Sephadex G-75凝膠過濾 將濃縮后的活性峰上柱，ffl0.25mol/L， pH7.5Tris-HCl緩沖液洗脫，自動部分收 集器收集，收集各活性峰，用PEG20000濃縮至適當體積，分裝保存。
對該酶的活力單位的測定基本上按照Hoffmann等的方法進行一個酶單位(U)定義 為在37'C時，每10分鐘將Uig DNA分解為單核苷酸的酶量。
當EB病毒特異性DNA酶用量為0. 08—0. 20 U時，同一個NPC患者的血清標本的抗 酶率基本一致。試劑盒中EB病毒特異性DNA酶的量為65個反應的用量，保證同一個 NPC患者六個平行樣，每個試劑盒可進行10人次的檢測。這樣可以保證在較短時間內(nèi)將 EB病毒特異性DNA酶充分利用。
(III) SYBR Green I的濃度配比
SYBR Green I的優(yōu)化分析，對于試劑盒中提供的質(zhì)粒DNA，根據(jù)其大小和濃度， 優(yōu)化分析SYBR Green I (購買于Invitrogen公司)使用濃度為1: 10000到1: 70000, 通過測試后，稀釋到使用范圍，每個反應加入工作濃度的SYBR Green I為5W-10W， 每個試劑盒中提供IOX工作濃度的SYBR Green I為80 W。
為了建立一個合理的數(shù)學模型，需要考慮的因素首先是SYBR Green I分析的優(yōu) 化主要包括2個因素SYBR Green I濃度和質(zhì)粒DNA濃度。
① SYBR Green I濃度
為了找到最適的SYBR Green I濃度，獲得最強和最穩(wěn)定的熒光信號，固定質(zhì)粒 DNA含量，設置SYBR Green I濃度梯度，檢測熒光強度，保證在低濃度SYBR Green I含量得到較敏感的熒光信號。推薦的SYBR Green I終濃度變動范圍是l: 5000到 1: 100000，經(jīng)常用到的濃度范圍是l: 10000到l: 70000。
② 質(zhì)粒DNA濃度
在SYBR Green I濃度確定的情況下，為了獲得合適的SYBR Green I與質(zhì)粒DNA
9作用的線性范圍，需要對DNA的濃度進行比例稀釋，從而尋找一個穩(wěn)定的線性可測濃 度范圍，我們已建立了應用于檢測的線性范圍(圖2)。
從圖3 (1)圖3 (2)可知，鼻咽癌EB病毒特異性DNA酶無論用本試劑盒檢測或 用同位素法檢測，其檢測數(shù)據(jù)基本相符，對于病人的診斷均具有相同的效力。
2. 鼻咽癌EB病毒特異性DNA酶檢測試劑盒靈敏性，特異性，穩(wěn)定性的檢測
在96孔板各孔中分別加入0, 10， 20, 50, 100, 200， 500, 1000 ng的質(zhì)粒DNA， 每個樣品六個平行樣，然后加入0.08 0.251]/^1的EB病毒特異性DNA酶lul, 37'C孵育 30min后加入5 W工作濃度的SYBR Green I ，振蕩混勻后上酶標儀檢測，在激發(fā)光 的作用下，在520nm波長下通過熒光強度檢測DNA濃度。通過檢測最低的DNA濃度，結(jié) 果顯示可以檢測到10ng DNA的含量，說明本發(fā)明的試劑盒具有較高的靈敏度。通過統(tǒng) 計學分析六個平行樣本之間無顯著性差異，均為有效數(shù)據(jù)，說明該檢測方法具有穩(wěn)定性。 同時利用該方法和以前的同位素方法同時檢測六個病人，所得到的結(jié)果基本一致，說明 該方法具有特異性。.
實施例4鼻咽癌EB病毒特異性DNA酶檢測試劑盒檢測EB病毒特異性DNA酶的 方法
1.對患者靜脈采血2m1,將取得的血樣，離心，靜置于37'C溫水中，直至血清析出， 開始利用本試劑盒對本患者的EBv特異性DNA酶的抗酶率進行檢測。
3. 在待測孔A3、 B3、 C3、 D3、 E3、 F3和G3中，分別加入標準DNA (含500ng) 100 W,每個病人血清5W和EB病毒特異性DNA酶1W，各樣本均加六孔；對照孔A2、 B2、 C2、 D2、 E2、 F2和G2中以正常血清代替病人血清，其它添加成分一致；然后將酶 標板在37'C搖床以100轉(zhuǎn)/分鐘的速度孵育30min。
4.各反應孔中分別加入工作濃度的SYBR Green I (以稀釋緩沖液將標準 SYBRGreenI稀釋10倍)5W，放置5分鐘后，在激發(fā)光作用下，520nra波長的酶標 儀下讀數(shù)；
5.根搪測得的熒光強度值，根據(jù)公式計算抗酶傘 抗酶率的計算過程如下
(1)標準曲線FI=AX+B 其中FI (熒光強度信號，fluorescence intensi訂L X (DNA的質(zhì)量，單位是ng)
10FI標準500ng的質(zhì)粒DNA的標準熒光強度信號。
(2)熒光強度值標準化 受試者血清FAR值=受試者血清FI - FI標準 正常新鮮血清FAR值=受試者血清.FI _ FI標準
其中，F(xiàn)AR表示熒光信號衰減數(shù)(fluorescence attenuation rate, FRA乂
(3)抗酶率計^:
,—^^_ 正常l l聘平
6.以30%作為評判指標，大于30%認為是陽性，低于30%認為是陰性'
正常新鮮血清FAR值、，1rt ,
抗酶率-i--xioo%
權(quán)利要求
1. 一種鼻咽癌EB病毒特異性DNA酶檢測試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包含標準DNA，標準SYBR Green I，EB病毒特異性DNA酶，稀釋緩沖液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼻咽癌EB病毒特異性DNA酶檢測試劑盒，其特 征在于所述標準DNA的濃度為35Mg/ml，體積為15ml;所述標準SYBR Green I 的濃度為IOX工作液，體積為80 所述EB病毒特異性DNA酶的濃度o.08~ 0.25U/ul，體積為所述稀釋緩沖液為TE Buffer,其中Tris HC1 0. 01 M， EDTA 0.001 M， pH 7.0，體積為20ml。
3. —種制備權(quán)利要求1的鼻咽癌EB病毒特異性DNA酶檢測試劑盒的 方法，包括以下步驟-(1) 標準DNA的生產(chǎn)和純化發(fā)酵培養(yǎng)含有p-CL質(zhì)粒的大腸桿菌以生 產(chǎn)標準DNA，所述標準DNA為p-CL質(zhì)粒；提取所述的p-CL質(zhì)粒；(2) EB病毒特異性DNA酶的生產(chǎn)和純化在培養(yǎng)Raji細胞的過程中， 以巴豆油和正丁酸作為誘導劑，同時采用Epstein-Barr病毒重復感染Raji細 胞，大量生產(chǎn)EB病毒特異性DNA酶；純化所述的EB病毒特異性DNA酶；(3) 標準SYBR Green I的濃度配比固定質(zhì)粒DNA含量，設置標準 SYBR Green I濃度梯度，確定低濃度SYBR Green I含量得到較敏感的熒光 信號；在標準SYBR Green I濃度確定的情況下，對標準DNA的濃度進行比例 稀釋，確定標準DNA的穩(wěn)定的線性可測濃度范圍。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述鼻咽癌EB病毒特異性DNA酶檢測試劑盒的方法， 其特征在于步驟(1)中所述提取p-CL質(zhì)粒的方法為堿裂解法。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述鼻咽癌EB病毒特異性DNA酶檢測試劑盒的方法， 其特征在于步驟(2)中純化所述的EB病毒特異性DNA酶的方法為離子交換 層析法。
全文摘要
本發(fā)提供一種鼻咽癌EB病毒特異性DNA酶檢測試劑盒及其制備方法。所述的試劑盒包含標準DNA，標準SYBR Green I，EB病毒特異性DNA酶，稀釋緩沖液。該試劑盒的制備過程為(1)標準DNA的生產(chǎn)和純化；(2)EB病毒特異性DNA酶的生產(chǎn)和純化；(3)標準SYBR Green I的濃度配比。采用該試劑盒，可以通過檢測血清中EB病毒特異性DNA酶的抗酶率從而實現(xiàn)對早期鼻咽癌患者的無創(chuàng)傷快速診斷，安全靈敏。
文檔編號C12Q1/44GK101586158SQ200910033490
公開日2009年11月25日 申請日期2009年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月22日
發(fā)明者強 劉, 艷 趙 申請人:常州生奧基因生物科技有限公司