專利名稱：miR397在培育抗旱性植物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物育種，具體涉及miR397在培育抗旱性植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糧食問(wèn)題是當(dāng)今世界所面臨的幾個(gè)難題之一。通過(guò)提高單產(chǎn)或擴(kuò)大種植面積、增加農(nóng)業(yè)投入改造中低產(chǎn)田等途徑來(lái)增加糧食產(chǎn)量都會(huì)碰到需要克服逆境限制或減輕逆境危害的問(wèn)題。因此，認(rèn)識(shí)植物對(duì)逆境的反應(yīng)機(jī)制，提高植物的抗逆性，已成為農(nóng)業(yè)進(jìn)一步增產(chǎn)的重要基礎(chǔ)研究，倍受世界各國(guó)政府和科學(xué)家的關(guān)注，也是當(dāng)前生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。
隨著人類的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人口膨脹，土壤的鹽漬化和水資源短缺現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，這些因素嚴(yán)重地影響了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境，土壤的鹽漬化和干旱化趨勢(shì)已成全球關(guān)注的問(wèn)題，因此尋求植物特別是農(nóng)作物耐鹽、抗旱途徑是十分必要的。
miRNACmicroRNA)是一組非編碼單鏈RNA，廣泛存在于動(dòng)物和植物等多細(xì)胞生物中，它可以通過(guò)與靶基因mRNA的特定位點(diǎn)結(jié)合，誘導(dǎo)該mRNA的降解或抑制該蛋白質(zhì)的合成，在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平導(dǎo)致基因沉默，從而參與基因的表達(dá)調(diào)控。miRNAs參與了幾乎所有的生命活動(dòng)，并起著重要作用。
在植物中，DCL1酶在細(xì)胞核內(nèi)識(shí)別miRNA前體(pre-miRNA)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，將其切割成miRNA: miRNA*雙體，然后由HST蛋白將其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行進(jìn)一步的加工。在不同的植物組織、器官和發(fā)育時(shí)期，miRNA的表達(dá)譜是不同的，并且部分miRNA在不同的外界環(huán)境下也有著不同的表達(dá)水平。因此，研究miRNA表達(dá)譜對(duì)miRNA生物功能的研究是非常重要的。
植物miRNA主要參與植物發(fā)育調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、自身生物合成調(diào)控等。 例如miR156的靶基因是SPL轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，過(guò)量表達(dá)miR156會(huì)導(dǎo) 致植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的延長(zhǎng)和遲花的現(xiàn)象；在擬南芥中，miR159切割一類受 赤霉素調(diào)控的MYB家族基因，組成型表達(dá)miR159會(huì)引起短日照情況下開花 的推遲和花粉的不正常發(fā)育；miR165/166調(diào)控葉子的極性、維管組織的發(fā)育， 擬南芥有五個(gè)HD-ZIPIII基因(REV、 PHB、 PHV、 ATHB-8及ICU4)參與調(diào) 節(jié)發(fā)育方面重要的方面，比如維管束的形成、在器官中建立或維持離軸及近軸 的極性，所有這些基因內(nèi)部都存在miR165/miR166的靶位點(diǎn)，miRNA調(diào)節(jié)對(duì) 于維持正常器官的極性，維管系統(tǒng)及分生組織的發(fā)育是必不可少的。
另外，還有一些植物miRNA參與逆境生理。例如miR393與生長(zhǎng)素信 號(hào)介導(dǎo)的病原菌抗性，miR393的耙蛋白為F-box類的生長(zhǎng)素因子(TIRl,AFB2， AFB3)，這些蛋白是生長(zhǎng)素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要節(jié)點(diǎn)，miR393的表達(dá)量提高會(huì) 減少TIR1的表達(dá)，并進(jìn)一步抑制生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而使植物對(duì)病菌感染產(chǎn) 生抵抗能力；miR398的表達(dá)受氧化脅迫的作用下下調(diào)表達(dá)，在擬南芥中， miR398的靶蛋白是超氧化物岐化酶CSD1和CSD2，它們?cè)谥参镏锌梢郧宄?氧負(fù)離子自由基，在植物抗氧化作用中起重要作用，組成型表達(dá)抗miR398切 斷CSD基因的轉(zhuǎn)基因植物，對(duì)強(qiáng)紫光照射、重金屬等高氧化狀態(tài)的逆境有更 好的抗性；miR399與植物無(wú)機(jī)磷吸收存在聯(lián)系，miR399的表達(dá)受磷(Pi)饑 餓的誘導(dǎo)而上調(diào)，這種上調(diào)在額外加入Pi之后馬上被抑制，miR399的靶基因 為一種UBC (Ubiquitin-conjugating E2 enzyme)蛋白，組成型表達(dá)miR399 會(huì)引起植物體內(nèi)Pi的代謝失調(diào)，使植物體內(nèi)積累過(guò)多的Pi，導(dǎo)致植物呈現(xiàn)Pi中毒的癥狀。
干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫是制約植物生長(zhǎng)發(fā)育的最常見不利環(huán)境因 子。對(duì)需水量極大，并且作為重要糧食作物而言，提高其抗旱性是一項(xiàng)極其重 要的工程。
已有t艮導(dǎo)顯示(Jian-Kang Zhu， Xiangyang Hu， Jian-Hua Zhu， role of microRNA in plant salt tolerance, Pub.No.: US 2007/0214521 Al)，過(guò)表達(dá)
miR397可以顯著提高雙子葉植物擬南芥對(duì)高鹽環(huán)境的抵抗力，由此看以看出m iR397可能會(huì)對(duì)植物起到一定的抗逆作用，但目前尚未有miR397對(duì)植物抗旱作 用的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)當(dāng)前植物尤其是農(nóng)作物生長(zhǎng)需水量大，易受干旱影響 這一重大問(wèn)題，將miRNA調(diào)控技術(shù)引入植物的品種改良中，從而提供miR397
在培育抗旱性植物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下方案予以實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明人首先選擇重要糧食作物——水稻作為研究對(duì)象，通過(guò)分析miR39 7的順式調(diào)控元件，發(fā)現(xiàn)其可能與水稻的逆境應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。于是本發(fā)明人對(duì) 水稻進(jìn)行干旱，高鹽和冷凍處理后，提取處理樣品和未處理樣品(對(duì)照)的總 RNA，并通過(guò)northem blot檢測(cè)樣品中miRNA的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理樣品 中miR397的表達(dá)量均有不同程度上調(diào)趨勢(shì)，其中干旱處理樣品上調(diào)程度最為 顯著，且干旱處理5h時(shí)miR397表達(dá)量的上調(diào)要比干旱處理12h時(shí)miR397表達(dá)量 的上調(diào)更為顯著。由此可以得出初步的結(jié)論，miR397的表達(dá)量可能和水稻抗 旱性有一定的關(guān)系。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR397與水稻抗旱性的關(guān)系，本發(fā)明構(gòu)建了過(guò)表達(dá) miR397的水稻突變株，該突變株在相對(duì)低溫(15~20°C)下生長(zhǎng)狀況優(yōu)于野生 型水稻，結(jié)實(shí)情況與野生型水稻無(wú)明顯差異。對(duì)該條件下生長(zhǎng)至20天的水稻 進(jìn)行模擬干旱和干旱后復(fù)蘇處理，觀察結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR397的突變株存 活率與恢復(fù)生長(zhǎng)程度明顯高于野生型，即突變株水稻的抗旱性優(yōu)于野生型水 稻。
綜上所述可以得出結(jié)論miR397的表達(dá)水平和水稻的抗旱性是有關(guān)系的， 而且過(guò)表達(dá)miR397可以在不減緩生長(zhǎng)或降低結(jié)實(shí)率的前提下，顯著提高水稻 的抗旱性，因此miR397可以用于培育抗旱性水稻。
此外，本發(fā)明人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，miR397及其靶基因在各種高等植物(如 水稻、高粱、油菜、葡萄和楊樹等農(nóng)林作物)中都是保守的，因此miR397的 過(guò)表達(dá)能對(duì)植物(雙子葉、單子葉)都能起到抗旱性的作用，miR397可用于 植物尤其是農(nóng)作物的抗旱性育種中。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
1. 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR397可以在不減緩生長(zhǎng)或降低結(jié)實(shí)率的前提下， 顯著提高水稻的抗旱性，這一結(jié)果為培育抗旱性水稻以及抗旱性植物提供了一 種全新的并且簡(jiǎn)單有效的方法，可投入大規(guī)模推廣使用；
2. 本發(fā)明通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)培育抗旱性水稻，不但水稻的抗旱性效果 好，而且不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，食用安全。


圖1為northern檢測(cè)干旱處理后水稻中miR397的表達(dá)水平電泳圖； 其中，l為5h未處理對(duì)照，2為干旱處理5h樣品，3為高鹽處理5h樣品，4為12h未處理對(duì)照，5為千旱處理12h樣品，6為高鹽處理12h樣品； 圖2為southern blot鑒定電泳圖； 其中，l為野生型對(duì)照，2 11為各T2代突變株； 圖3為northern檢測(cè)各T3代突變株中miR397的表達(dá)水平電泳； 其中，l為野生型對(duì)照，2 10為各T3代突變株； 圖4為干旱處理前的野生型與突變株水稻；
其中，1為野生型，2為過(guò)表達(dá)miR397a的突變株，3為過(guò)表達(dá)miR397b 的突變株；
圖5為干旱處理1天后的野生型與突變株水稻；
其中，1為野生型，2為過(guò)表達(dá)miR397a的突變株，3為過(guò)表達(dá)miR397b 的突變株；
圖6為干旱處理1天，復(fù)蘇10天后的野生型與突變株水稻；
其中，1為野生型，2為過(guò)表達(dá)miR397a的突變株，3為過(guò)表達(dá)miR397b
的突變株。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)
明做任何限定。
實(shí)施例l水稻干旱處理及總RNA提取
本實(shí)施例對(duì)2周齡的水稻幼苗(使用Yoshida培養(yǎng)液)進(jìn)行干旱處理，即用 20。/。PEG6000模擬干旱條件對(duì)水稻幼苗分別處理5h和12h，然后提取處理后水 稻幼苗的總RNA，同時(shí)提取未進(jìn)行干旱處理的水稻幼苗的總RNA作為對(duì)照組。
本實(shí)施例采用本領(lǐng)域常用的酚氯仿異戊醇法提取水稻總RNA，其具體步驟如下
(1) 稱lg水稻樣品液氮研磨成細(xì)粉，加入10mL RNA zol (100ml中含有異硫氰酸胍47.2g ， lMPH7.0的檸檬酸鈉2.5ml， 10%月桂?；徕c5ml)和lmL醋酸鈉(2M， pH4.0)，繼續(xù)研磨；
(2) 加入10mL的水飽和酚，4mL的氯仿異戊醇(49:1，體積比)混合液，混勻后轉(zhuǎn)入離心管，渦旋lmin，冰上放置5分鐘，然后4X:， 12000rpm離心15min;
(3) 離心后取上清，并向上清液中加入等體積的酚氯仿異戊醇(50:49:1，體積比)混合液，渦旋lmin，冰上放置5分鐘，然后4°C ， 12,000rpm離心15min;
(4) 離心后取上清，重復(fù)步驟(3) 2~3次；
(5) 離心后取上清，并向上清液中加入異丙醇(異丙醇和上清液的體積比為0.6: 1)，冰上放置30min lh;
(6) 4°C， 12,000rpm離心15min，棄上清，往管中加入1.2mL DEPC處理水溶解管底沉淀，然后每管600|il分裝轉(zhuǎn)入1.5mL的離心管；
(7) 向上述1.5L離心管中加入600^d的酚:氯仿:異戊醇(50:49:1，體積比)混合液，上下顛倒混勻后，冰上放置5分鐘，室溫12,000rpm離心15min;
(8) 離心后取上清，重復(fù)步驟(7) 2~3次；
(9) 離心后取上清，將上清液每管分裝300)aL分裝入新的離心管中，并向分裝后的離心管中加入1/10上清體積的3M NaAc (pH 5.2)和3倍上清體積的無(wú)水乙醇，混勻，-20"放置過(guò)夜；
(10) 4°C， 12,000rpm離心15min，棄除上清，70%乙醇洗兩次，95%乙醇洗一次，晾干，用15~3(HiL DEPC處理水溶解，-20匸保存?zhèn)溆茫传@得水稻總RNA。
本實(shí)施例總RNA提取時(shí)所用到的各種試劑均為市售。實(shí)施例2 miRNA的Northern雜交
本實(shí)施例對(duì)實(shí)施例1提取的處理樣品組總RNA和對(duì)照組總RNA進(jìn)行Northern blot檢測(cè)，所用方法均可參考本領(lǐng)域Northern雜交的常規(guī)操作。
取實(shí)施例1制備的水稻總RNA lpL進(jìn)行甲醛變性膠電泳，變性電泳采用本領(lǐng)域的常規(guī)操作。
待電泳完畢，取下電泳板后揭板，用一張和目標(biāo)區(qū)域差不多大小的干濾紙覆在凝膠樣品區(qū)域上，用刀片切去多余的凝膠，利用濾紙把膠翻轉(zhuǎn)，剝離另一塊電泳板。在膠上蓋一張等面積的預(yù)先用0.5xTBE浸潤(rùn)的Hybond W尼龍膜，將濾紙-凝膠-尼龍膜放于電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Bio-Rad)電極之間，膠在上面，尼龍膜在下面，上下各墊10層用0.5xTBE浸濕并趕走氣泡的濾紙。用0.8 mA/cm2尼龍膜的電流強(qiáng)度，通電45分鐘。之后關(guān)閉電源，取下尼龍膜。尼龍膜在253nm紫外燈下正反兩面分別交聯(lián)3分鐘，將RNA及分子量標(biāo)記固定于膜上。將交聯(lián)好的尼龍膜放入雜交管中，加入5 10mL雜交液(雜交液的配制可參考本領(lǐng)域Northern雜交所采用的常規(guī)雜交液配制)，42"C預(yù)雜交1小時(shí)，然后加入同位素標(biāo)記探針20pL， 42"C雜交過(guò)夜。雜交完畢，將雜交液倒出，用洗膜液(2XSSPE， 0.5% SDS)于室溫下洗3次，每次10分鐘。將雜交膜包入保鮮膜中，壓磷屏3小時(shí)以上，再用磷屏掃描儀Typhoon 8600 imager掃描，并保存結(jié)果。
本實(shí)施例的Northern雜交檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，干旱，高鹽，冷凍處理的樣品中miR397的表達(dá)量均有不同程度上調(diào)趨勢(shì)，其中干旱處理樣品上調(diào)程度最為顯著，且干旱處理5h時(shí)miR397表達(dá)量的上調(diào)要比干旱處理12h時(shí)miR397表達(dá)量的上調(diào)更為顯著。
實(shí)施例3過(guò)表達(dá)miR397水稻突變株的構(gòu)建
本實(shí)施例在實(shí)施例2的檢測(cè)結(jié)果基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建了過(guò)表達(dá)miR397的水稻突變株，其具體步驟如下所示
1. miR397組成型表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
本實(shí)施例選擇載體pCAMBIA1390 (市售)，并且在該載體的酶切位點(diǎn)///"dll和之間插入CaMV35S啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子以后可以作為控制miR397表達(dá)的組成型啟動(dòng)子。這里的試驗(yàn)操作采用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。
從以實(shí)施例1制備的處理樣品總RNA為模板，克隆miR397基因，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示，并且在擴(kuò)增產(chǎn)物兩端加上ZZwI和五coi I的酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件參考PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒說(shuō)明。
PCR結(jié)束后回收擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行和雙酶切，同時(shí)對(duì)pCAMBIA1390載體也進(jìn)行力d和Ecoi I雙酶切，然后將兩個(gè)雙酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接起來(lái)即構(gòu)建成miR397組成型表達(dá)質(zhì)粒。
上述所涉及的擴(kuò)增產(chǎn)物回收，雙酶切反應(yīng)，T4連接等反應(yīng)均采用本領(lǐng)域的常規(guī)操作，實(shí)驗(yàn)中所涉及的載體、試劑等均為市售。
2、 miR397組成型表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織
將上述構(gòu)建的miR397組成型表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(市售)，所述轉(zhuǎn)化方法為本領(lǐng)域常規(guī)操作，然后將該轉(zhuǎn)化有miR397過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌菌種，在含有利福平，卡那霉素和潮霉素的YEP培養(yǎng)基(10g酵母膏，10 g蛋白胨，5 gNaCl， 15 g瓊脂)上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，28t:黑暗培養(yǎng)2 3天后挑取單菌落涂布于含有相同抗生素的YEP培養(yǎng)基上，28'C黑暗培養(yǎng)2天，刮取適量菌體懸浮于含有100 li M乙酰丁香酮的液體共培養(yǎng)基中，使之稀釋至OD550為0.3左右，28i:搖床(140rpm)培養(yǎng)40分鐘，即制備得到根癌農(nóng)桿菌浸染液，可用于侵染。
取水稻的成熟種子剝?nèi)シf殼，用75%酒精浸泡1分鐘后用無(wú)菌水清洗多次，然后用1%次氯酸鈉處理兩次，每次20分鐘，期間搖動(dòng)多次，無(wú)菌水清洗多次后用無(wú)菌濾紙吸干水分，接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基(N6大量元素，B5微量元素，B5維生素，F(xiàn)e-EDTA， 2mg/L2，4-D， 30g/L蔗糖，500mg/L谷氨酰胺，500mg/L脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，3.0g/L植物凝膠)上，將誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織接到新鮮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 3個(gè)星期再挑取生長(zhǎng)狀態(tài)好的愈傷組織接到新鮮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。
挑取淡黃色、顆粒狀、結(jié)構(gòu)致密、生長(zhǎng)狀態(tài)好的愈傷組織到無(wú)菌三角瓶中適當(dāng)干燥處理后，加入上述制備好的根癌農(nóng)桿菌侵染液侵染20分鐘，期間適當(dāng)搖動(dòng)幾次。侵染后將愈傷組織放在加有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中，風(fēng)干1 2小時(shí)。然后把愈傷組織接到加有一層濾紙的共培養(yǎng)基上，再風(fēng)干半小時(shí)左右后，置于26。C黑暗培養(yǎng)2 3天。
3、轉(zhuǎn)基因水稻陽(yáng)性愈傷組織的篩選與分化
取出共培養(yǎng)后的愈傷組織放在加有三層濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，干燥1天左右，再接到篩選培養(yǎng)基上，置于26"C黑暗培養(yǎng)14 21天。共篩選兩次。挑取生長(zhǎng)狀態(tài)好的抗性愈傷組織接到預(yù)分化培養(yǎng)基上，26t:光照培養(yǎng)。21天后，把生長(zhǎng)狀態(tài)好及出現(xiàn)綠點(diǎn)的抗性愈傷組織接到分化培養(yǎng)基上，使愈傷組織進(jìn)行200910037075.6
再生。
待抗性愈傷組織分化出的小苗長(zhǎng)到4 6 cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上， 繼續(xù)在26"C光照培養(yǎng)。待小苗長(zhǎng)至10 12cm，葉片寬大、顏色深綠且根系生 長(zhǎng)健全后，洗掉培養(yǎng)基及其基部附著的愈傷組織，在室外進(jìn)行盆栽種植，即得 到轉(zhuǎn)基因水稻(過(guò)表達(dá)miR397)。
上述篩選培養(yǎng)基的配方為N6培養(yǎng)基大量+MS培養(yǎng)基微量+B5培養(yǎng)基少 量+lg/L水解酪蛋白+lg/L脯氨酸+2mg/L (2， 4-D) +30g/L蔗糖+潮霉素 50mg/L+頭孢500mg/L+4g/L植物凝膠，篩選培養(yǎng)基的終PH=5.8。
上述預(yù)分化培養(yǎng)基的配方為MS培養(yǎng)基+lg/L水解酪蛋白+20g/L蔗糖 +lmg/L (2， 4-D) +頭孢50011^/1>潮霉素5011^/1^+4§^植物凝膠，預(yù)分化培 養(yǎng)基的終PH:5.8。
上述分化培養(yǎng)基的配方為MS培養(yǎng)基+2mg/L (6-BA) +0.5mg/L萘乙酸 + lmg/L激動(dòng)素+30g/L蔗糖+3。/。山梨醇+4g/L植物凝膠，分化培養(yǎng)基的終 PH=5.8。
上述生根培養(yǎng)基的配方為1/2 MS培養(yǎng)基。
本實(shí)施例中所采用的MS培養(yǎng)基、1/2MS培養(yǎng)基和N6培養(yǎng)基等的配方均 采用本領(lǐng)域的常規(guī)配方。上述各培養(yǎng)基配方中所涉及的試劑均為市售。 實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因水稻的southern blot鑒定
本實(shí)施例采用southern blot檢測(cè)來(lái)篩選實(shí)施例3所得轉(zhuǎn)基因水稻的陽(yáng)性突 變株。
以水稻基因組DNA為模版，克隆miR397基因，上游引物的核苷酸序列 如SEQIDNO:l所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件同實(shí)施例3，均參考PCR擴(kuò)增試劑盒的說(shuō)明，將擴(kuò)增得到的miR397 序列作為本實(shí)施例southernblot檢測(cè)的探針。
本實(shí)施例的southern blot檢測(cè)可參考本領(lǐng)域的常規(guī)做法，檢測(cè)結(jié)果如圖2 所示，大部分突變株檢測(cè)為陽(yáng)性，成功在基因組中插入目的片斷。
將上述southern blot鑒定篩選出的陽(yáng)性突變株培養(yǎng)至T3代，培養(yǎng)結(jié)果發(fā) 現(xiàn)突變株的生長(zhǎng)與結(jié)實(shí)情況與野生型水稻無(wú)明顯差異，然后進(jìn)一步使用 northern blot檢測(cè)(參照northern blot操作試劑盒的說(shuō)明)各T3代突變株的 miR397表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示，所有突變株的miR397的表達(dá)水平均有 不同程度的上調(diào)。選擇miR397表達(dá)量最高的T3代突變株進(jìn)行隨后試驗(yàn)。
含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的愈傷組織誘導(dǎo)分化而成的植株用T。代表， T,代表示To代自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株，T2代表示T,代自交產(chǎn)生 的種子及由它所長(zhǎng)成的植株。T3代表示T2代自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的 植株。
實(shí)施例5干旱處理野生型與轉(zhuǎn)基因水稻
將野生型水稻和實(shí)施例4篩選得到的miR397表達(dá)量最高的T3代突變株 于相對(duì)低溫(15~20°C)下萌發(fā)，并用水培養(yǎng)20天。
將幼苗同時(shí)轉(zhuǎn)入含有15% PEG6000 (1L水中含有15g PEG6000)的水中 模擬干旱處理24h，至幼苗葉子巻曲干枯，然后更換成水進(jìn)行復(fù)蘇10天。
本實(shí)施例對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱處理以及旱后復(fù)蘇研究結(jié)果如圖 4、圖5和圖6所示，處理1天后，野生型與突變株水稻均千枯，但復(fù)蘇10 天后，野生型水稻基本枯死，而突變株的水稻均恢復(fù)正常生長(zhǎng)。miR397在培育抗旱性植物中的應(yīng)用序列表 SEQUENCE LISTING
<110〉中山大學(xué)華南師范大學(xué)
〈120〉 niiR397在培育抗旱性植物中的應(yīng)用
〈130〉
<160> 2
<170> Patentln version 3.5
〈210〉 1
〈211〉 31
<212〉 腿 <213>人工序列
<400> 1
gaatctagaa cacgctctac ctacatcgtg t 31
<210> 2
<211> 31
〈212〉 腿 <213〉人工序列
<400> 2
attgaattct cacctcgtct gctggggacc t 3權(quán)利要求
1、miR397在培育抗旱性植物中的應(yīng)用。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述應(yīng)用，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子 葉植物。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述應(yīng)用，其特征在于所述植物為水稻、高粱、油菜、 葡萄或楊樹。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于該應(yīng)用是通過(guò)篩選過(guò)表達(dá) miR397的植物從而得到抗旱性植物。
全文摘要
本發(fā)明公開miR397在培育抗旱性植物中的應(yīng)用。本發(fā)明人通過(guò)對(duì)水稻進(jìn)行干旱處理并檢測(cè)處理后樣品miRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)干旱處理后樣品中miR397的表達(dá)量呈顯著上調(diào)趨勢(shì)，且干旱處理5h時(shí)miR397表達(dá)量的上調(diào)要比干旱處理12h時(shí)miR397表達(dá)量的上調(diào)更為顯著。然后本發(fā)明人構(gòu)建了過(guò)表達(dá)miR397的水稻突變株，該突變株在相對(duì)低溫下生長(zhǎng)狀況優(yōu)于野生型水稻，結(jié)實(shí)情況與野生型水稻無(wú)明顯差異，并且模擬干旱和干旱后復(fù)蘇處理的結(jié)果顯示，突變株水稻的抗旱性優(yōu)于野生型水稻。這一結(jié)果為培育抗旱性水稻及抗旱性植物提供了一種全新的并且簡(jiǎn)單有效的方法，可投入大規(guī)模推廣使用，且不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，食用安全。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101487021SQ20091003707
公開日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2009年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月6日
發(fā)明者清 劉, 張玉嬋, 杰 徐, 李洪清, 王小菁, 王聰穎, 陳月琴 申請(qǐng)人:中山大學(xué);華南師范大學(xué)