專利名稱：一種表達(dá)外源基因的重組瘧原蟲及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表達(dá)外源基因的重組瘧原蟲及其 應(yīng)用。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的表達(dá)載體，特別是用于生物治療和疫苗設(shè)計(jì)的表達(dá)載體，多為細(xì)菌 載體或是病毒載體。這些載體因其自身基因組較小，故能表達(dá)外源基因的容量 也就較小。用瘧原蟲作為表達(dá)載體，特別是作為疫苗的表達(dá)載體，有很多自身
獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)1、誘導(dǎo)強(qiáng)烈的天然免疫反應(yīng)；2、誘導(dǎo)強(qiáng)烈的Thl型免疫反應(yīng)， 刺激T淋巴細(xì)胞增殖，刺激T淋巴細(xì)胞分泌IFN-y，并且能夠刺激樹突狀細(xì)胞的 成熟，促進(jìn)抗原的遞呈，作為一種免疫佐劑；3、外源基因的容量大，瘧原蟲不 但能夠表達(dá)大的外源基因，而且能夠同時(shí)容納，表達(dá)多個(gè)外源基因，從而可以 同時(shí)刺激產(chǎn)生針對(duì)多種抗原的免疫反應(yīng)或表達(dá)免疫輔助因子，誘導(dǎo)產(chǎn)生高效的 免疫保護(hù)；4、外源基因表達(dá)水平高。
但此前，以癡原蟲作為載體表達(dá)外源蛋白，仍停留在構(gòu)建表達(dá)體系的基礎(chǔ) 研究階段。有報(bào)道采用瘧原蟲表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)、熒光素酶(Luciferase) 和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)等報(bào)告基因和異種的瘧原蟲基因，僅限于基礎(chǔ)研究 范圍。
腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的慢性疾病，腫瘤的治療仍然是目前人類面臨的 重要難題。目前的治療方法主要以化療，放療和手術(shù)治療為主，但生物治療越 來越引人注目，逐漸成為一種重要的治療方法，并應(yīng)用于肺瘤治療。生物治療 是指通過生物反應(yīng)修飾劑(BRM)對(duì)^L體進(jìn)行治療的一種方法。生物療法的主要作 用是提高患者的全身免疫功能，尤其在腫瘤治療中，現(xiàn)已成為繼外科、放療和化療后最有發(fā)展前途的重要的治療手段之一。生物治療的主要特點(diǎn)為1、生物 活性功能多，具有抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)活性。2、作用范圍廣，在體外這 些生物制劑幾乎對(duì)所有腫瘤細(xì)胞都有抑制效應(yīng)。3、對(duì)機(jī)體的免疫功能有調(diào)節(jié)增 強(qiáng)作用。
正如前面所述，對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能是生物治療的重要特征之一，而瘧 原蟲感染正好也具有這個(gè)特征。用瘧疾本身作為一種生物療法(瘧疾療法)在 歷史上曾成功地應(yīng)用于治療神經(jīng)性梅毒，發(fā)明該療法的奧地利醫(yī)生Wagner Jauregg因而獲1927年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。腫瘤的治療性疫苗作為腫瘤生物療法的方 法之一在實(shí)驗(yàn)室中廣泛應(yīng)用，并在臨床中逐漸推廣。已有文獻(xiàn)報(bào)道瘧原蟲感染 能夠直接抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長。但是已有證據(jù)表明增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤特異性 或相關(guān)抗原的識(shí)別能更有效的加強(qiáng)抑制腫瘤的效果，因此設(shè)想表達(dá)腫瘤特異性 或相關(guān)抗原的重組癡原蟲用于腫瘤治療更加有效。
艾滋病是直接威脅人類健康的重大傳染病。95%以上的感染者生活在發(fā)展中 國家。迄今為止，宣傳教育及對(duì)高危人群的行為干預(yù)僅能起到減緩傳播速度的 作用，而無法終止其流行。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法雖然有效但不能達(dá)到徹底清 除體內(nèi)病毒的目的，因而需要終身服藥，對(duì)大多數(shù)感染者來說價(jià)格過于昂貴， 毒副作用較大，容易出現(xiàn)耐藥性。艾滋病疫苗被認(rèn)定為預(yù)防和控制艾滋病的最 有效的武器。-f旦艾滋病疫苗的研制面臨嚴(yán)重的"f兆戰(zhàn)，因?yàn)?姿傳統(tǒng)的方法研制的 艾滋病疫苗在臨床試驗(yàn)中累累失敗。近年來，活載體疫苗的研究越來越受到重 視?；钶d體疫苗是將編碼病毒蛋白的基因插入活的表達(dá)載體內(nèi)，通過表達(dá)載體 使外源基因在宿主中表達(dá)，由此刺激機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的特異性免疫應(yīng)答。這可能 是最有希望的艾滋病疫苗之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種表達(dá)外源基因的重組瘧原蟲，并將該重組瘧原蟲應(yīng)用于生 物治療和疫苗設(shè)計(jì)中，尤其是腫瘤的生物治療和HIV疫苗的設(shè)計(jì)。 本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下
5本發(fā)明的一種表達(dá)外源基因的重組瘧原蟲，其外源基因包括抗原基因、治 療劑基因、免疫調(diào)節(jié)劑基因或肽基因。
上述重組疾原蟲應(yīng)用在生物治療中。
優(yōu)選的，所述的生物治療包括肺瘤治療。
優(yōu)選的，上述腫瘤治療為將腫瘤相關(guān)抗原基因克隆到表達(dá)質(zhì)粒上，得到 重組質(zhì)粒，在大腸桿菌中復(fù)制后提取并純化，將提取得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到癥 原蟲內(nèi)，得到表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的重組癡原蟲，最后免疫胂瘤機(jī)體。
上述的肺瘤相關(guān)抗原基因包括MUC1。 上述的重組癡原蟲應(yīng)用在疫苗設(shè)計(jì)中。 優(yōu)選的，所述的疫苗設(shè)計(jì)包括HIV-1疫苗設(shè)計(jì)。
優(yōu)選的，所述的HIV-1疫苗設(shè)計(jì)為將HIV-1的編碼基因克隆到表達(dá)質(zhì)粒 上，得到重組質(zhì)粒，在大腸桿菌中復(fù)制后提取并純化，將提取得到的重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染到癡原蟲內(nèi)，得到表達(dá)HIV-1的編碼基因的重組疾原蟲，最后免疫機(jī)體。
優(yōu)選的，所述的HIV-1的編碼基因包括gag基因。 本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明提供的一種重組瘧原蟲，可用于表達(dá)外源基因，包括抗原、治療 劑、免疫調(diào)節(jié)劑、肽等希望傳遞到動(dòng)物和人或其細(xì)胞的任何分子；為在動(dòng)物和 人或其細(xì)胞中引入并表達(dá)異源基因、刺激或激發(fā)免疫應(yīng)答提供了 一種新方法， 特別是應(yīng)用于腫瘤的生物治療和HIV疫苗的設(shè)計(jì)方面。
下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。


圖1是pL0015-gag重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖2-A是pL0015-gag重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠伯氏瘧原蟲NK65蟲4朱得到的NK65-gag重組瘧原蟲抹的血涂片實(shí)驗(yàn)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的結(jié)果圖2-B是pL0015-gag重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠伯氏疾原蟲NK65蟲抹得到的NK65-gag重組疾原蟲抹的western-blot實(shí)-瞼的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的結(jié)果圖2-C是pL0015-gag重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠伯氏瘧原蟲NK65蟲林得到的NK65-
gag重組癥原蟲才朱PCR的 一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的結(jié)果圖3是重組瘧原蟲抹NK65-gag免疫小鼠后ELISPOT檢測(cè)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施
例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖4是重組瘧原蟲抹NK65-gag免疫小鼠后ELISA檢測(cè)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖5是重組癡原蟲林NK65-gag免疫小鼠后，Brdu ELISA檢測(cè)針對(duì)HIV-1 gag 肽的增值的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖6是鼠重組瘧原蟲抹NK65-gag免疫小鼠后，用重組表達(dá)HIV-1 gag的痘 病毒vaccinia-gag攻毒，檢測(cè)保護(hù)性的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng) 理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1:以鼠伯氏癡原蟲NK65蟲抹為載體表達(dá)1型人免疫缺陷病毒 (HIV-1)的gag基因，并將此重組蟲抹作為一種HIV的概念性疫苗免疫小鼠， 用斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)(ELISPOT )、 酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)(ELISA)和大鼠溴脫氧核苷 脲嘧啶酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)(Brdu ELISA)等方法檢測(cè)小鼠針對(duì)gag的免疫反應(yīng)。最 后再用表達(dá)Gag蛋白的疽病毒vaccinia-gag攻毒，觀察對(duì)小鼠的免疫保護(hù)效果。
pL0015-gag重組質(zhì)粒的構(gòu)建將HIV-1的gag基因克隆到鼠伯氏癡原蟲 NK65蟲林的表達(dá)質(zhì)粒pL0015上，得到pL0015-gag重組質(zhì)粒。具體為設(shè)計(jì)兩端 帶有BamHl酶切位點(diǎn)的gag引物，后用PCR方法擴(kuò)增出gflg基因，將pL0015 質(zhì)粒和此gag產(chǎn)物用BamHl酶切，然后切膠回收，連接，轉(zhuǎn)化到XL-lblue感 受態(tài)細(xì)菌涂板，挑選轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌落PCR鑒定，酶切鑒定，測(cè)序方向鑒定都正確 后得到重組的pL0015-gag質(zhì)粒。重組的pL0015-gag質(zhì)粒結(jié)構(gòu)見圖1。
pL0015-gag重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠伯氏瘧原蟲NK65蟲林將保種的轉(zhuǎn)化了pL0015-gag的大腸桿菌XL-lblue菌抹復(fù)豕于大腸桿菌XL-lblue菌4木中復(fù)制后 提取并純化。大量培養(yǎng)，提取pL0015-gag，將提取的pL0015-gag質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠伯 氏癡原蟲，用該蟲抹接種小鼠24小時(shí)后開始給小鼠每天口服30mg/kg的乙胺嘧 啶，連續(xù)四天。用乙胺嘧，定篩選出重組表達(dá)gag的鼠重組瘧原蟲抹NK65-gag, 見圖2。圖2-A是pL0015-gag重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠伯氏瘧原蟲NK65蟲林得到的重 組癡原蟲抹NK65-gag的血涂片結(jié)果圖，該圖顯示NK65-gag重組癡原蟲抹為陽 性。圖2-B是pL0015-gag重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠伯氏癥原蟲NK65蟲抹得到的重組癥 原蟲林NK65-gag的western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，以NK65蟲抹為空白對(duì)照，以 pVAX-gag為陽性對(duì)照，由圖可見，NK65-gag重組癡原蟲株為gag陽性表達(dá)抹。 圖2-C是pL0015-gag重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠伯氏疾原蟲NK65蟲抹得到的NK65-gag 重組癥原蟲抹PCR的結(jié)果圖；泳道1 - 6分別為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA marker )、 NK65基因組DNA、 NK65-gag基因組DNA、 NK65-gag基因組DNA、 NK65-gag基因組DNA和pVAXl - gag質(zhì)粒。
之后取尾靜脈血10 |a 1溶于0.2ml生理鹽水中，再腹腔接種于一只新的小鼠 體內(nèi)，此小鼠再每天口服乙胺嘧啶30mg/kg,連續(xù)四天。待原蟲感染率達(dá)到5% 以上時(shí)，眼眶采血，保種，并分別提取原蟲DNA和蛋白進(jìn)行鑒定。當(dāng)4僉測(cè)到 Gag蛋白在原蟲內(nèi)有表達(dá)后，再將保種的蟲林復(fù)蘇，然后再單克隆化，單克隆化 后的蟲抹再用同樣的方法鑒定有Gag蛋白表達(dá)后，將此能穩(wěn)定表達(dá)Gag蛋白的 重組蟲抹命名為pbGAGcon。用同樣方法將空質(zhì)粒pLOOl5轉(zhuǎn)染到鼠伯氏癡原蟲 NK65蟲林得到的重組蟲抹命名為pbEMPTYcon。用pbGAGcon和pbEMPTYcon 分別免疫小鼠。
鼠重組瘧原蟲抹NK65-gag免疫小鼠后ELISPOT檢測(cè)用NK65-gag重組 蟲林免疫小鼠7天后，殺鼠取脾臟分出脾淋巴細(xì)胞，體外用HIV-1的gag肽刺 激，檢測(cè)到針對(duì)HIV-1的gag的特異性IFN-y的分泌，見圖3。
鼠重組疾原蟲抹NK65-gag免疫小鼠后ELISA檢測(cè)用NK65-gag重組蟲抹 免疫小鼠30天后，眼眶采血分離出血清，用ELISA法檢測(cè)血清中g(shù)ag抗體的滴 度，見圖4。圖4顯示，用pbGAGcon免疫小鼠后小鼠中的gag抗體滴度明顯高8于用pbEMPTYcon免疫小鼠后及沒有免疫的小鼠中的gag抗體滴度，說明該重 組癡原蟲蟲抹pbGAGcon能較好的剌激機(jī)體對(duì)gag的免疫反應(yīng)。
鼠重組癡原蟲抹NK65-gag免疫小鼠后，Brdu EL1SA檢測(cè)針對(duì)HIV-1 gag 肽的增值用NK65-gag重組蟲林免疫小鼠21天后，殺鼠取脾臟分出脾淋巴細(xì) 胞，體外用HIV-1的gag肽刺激，檢測(cè)到針對(duì)HIV-1的gag肽刺激的特異性淋 巴細(xì)胞的增殖，見圖5。圖5中吸光度表示脾細(xì)胞增殖情況，a表示gag肽刺激 的脾細(xì)胞與對(duì)照相比增殖明顯，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異有顯著性。
鼠重組癡原蟲林NK65-gag免疫小鼠后，用重組表達(dá)HIV-1 gag的疸病毒 vaccinia-gag攻毒，檢測(cè)保護(hù)性用NK65-gag重組蟲抹免疫小鼠30天后，腹腔接 種vaccinia-gag痘病毒，4天后，處死小鼠取卵巢，超聲粉碎，研磨卵巢，檢測(cè) 小鼠卵巢內(nèi)vaccinia-gag的病毒滴度，檢測(cè)到經(jīng)鼠重組瘧原蟲株NK65-gag免疫 后，小鼠卵巢內(nèi)病毒載量在免疫組較對(duì)照組低，見圖6。圖6中承表示重組gag 的癡原蟲免疫的小鼠與空載體瘧原蟲免疫的小鼠相比，對(duì)vaccinia-gag的攻毒實(shí) 驗(yàn)后的病毒滴度有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異顯著性。
實(shí)施例2:用鼠伯氏疾原蟲NK65蟲抹為表達(dá)載體，并應(yīng)用于腫瘤疫苗的設(shè) 計(jì)。將腫瘤相關(guān)抗原mucl基因克隆到鼠伯氏瘧原蟲NK65蟲林的表達(dá)質(zhì)粒 pL0015上，得到pL0015-mucl重組質(zhì)粒。經(jīng)鑒定方向正確后，于大腸桿菌 XL-lblue菌株中復(fù)制后提取并純化。將提取的重組質(zhì)粒pL0015-mucl轉(zhuǎn)染到鼠 伯氏癡原蟲NK65蟲抹內(nèi)，用該蟲林接種小鼠24小時(shí)后開始給小鼠每天口服乙 胺嘧啶30mg/kg,連續(xù)四天。之后取尾靜脈血10^1溶于0.2ml生理鹽水中，再 腹腔接種于一只新的小鼠體內(nèi)，此小鼠再每天口服乙胺嘧啶30mg/kg,連續(xù)四天。 待原蟲感染率達(dá)到5%以上時(shí)，眼眶采血，保種，并分別提取原蟲DNA和蛋白 進(jìn)行鑒定。當(dāng)檢測(cè)到MUC1蛋白在原蟲內(nèi)有表達(dá)后，再將保種的蟲林復(fù)蘇，然 后再單克隆化，單克隆化后的蟲株再用同樣的方法鑒定有MUC1蛋白表達(dá)后免 疫小鼠，觀察對(duì)接種有轉(zhuǎn)染mucl基因的腫瘤的荷瘤小鼠的腫瘤生長抑制效果和 荷瘤小鼠生存時(shí)間。最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1、一種表達(dá)外源基因的重組瘧原蟲，其特征在于，所述外源基因包括抗原基因、治療劑基因、免疫調(diào)節(jié)劑基因或肽基因。
2、 權(quán)利要求1所述的重組瘧原蟲在生物治療中的應(yīng)用。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的生物治療包括腫瘤治療。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的肺瘤治療為將腫瘤 相關(guān)抗原基因克隆到表達(dá)質(zhì)粒上，得到重組質(zhì)粒，在大腸桿菌中復(fù)制后提取并 純化，將提取得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到癡原蟲內(nèi)，得到表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的重組 癡原蟲，最后免疫腫瘤機(jī)體。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的腫瘤相關(guān)抗原基因包 括MUC1。
6、 權(quán)利要求1所述的重組瘧原蟲在疫苗設(shè)計(jì)中的應(yīng)用。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的疫苗設(shè)計(jì)包括HIV-1 疫苗設(shè)計(jì)。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的HIV-1疫苗設(shè)計(jì)為 將HIV-1的編碼基因克隆到表達(dá)質(zhì)粒上，得到重組質(zhì)粒，在大腸桿菌中復(fù)制后提取并純化，將提取得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到瘧原蟲內(nèi)，得到表達(dá)HIV-1的編碼 基因的重組癥原蟲，最后免疫機(jī)體。
9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的HIV-1的編碼基因包 括gag基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表達(dá)外源基因的重組瘧原蟲，該重組瘧原蟲中的外源基因包括抗原基因、治療劑基因、免疫調(diào)節(jié)劑基因或肽基因。本發(fā)明還將該重組瘧原蟲應(yīng)用于生物治療和疫苗設(shè)計(jì)中，尤其是腫瘤的生物治療和HIV疫苗的設(shè)計(jì)。本發(fā)明該種重組瘧原蟲，可用于表達(dá)外源基因，包括抗原、治療劑、免疫調(diào)節(jié)劑、肽等希望傳遞到動(dòng)物和人或其細(xì)胞的任何分子；為在動(dòng)物和人或其細(xì)胞中引入并表達(dá)異源基因、刺激或激發(fā)免疫應(yīng)答提供了一種新方法，特別是應(yīng)用于腫瘤的生物治療和HIV疫苗的設(shè)計(jì)方面。
文檔編號(hào)C12N1/11GK101492643SQ20091003718
公開日2009年7月29日 申請(qǐng)日期2009年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月13日
發(fā)明者波 姜, 莉 秦, 陳小平 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院