專利名稱：分子設(shè)計結(jié)合藻尿膽素的藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)中色素蛋白質(zhì)材料領(lǐng)域，具體涉及一種分子設(shè)計結(jié)合藻尿膽 素的藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)的制備方法。
背景技術(shù)：
藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍藻和紅藻光合作用捕光復合物的功能組 分。根據(jù)其吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱 CPE)、藻紅藍蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱 PEC)、藻藍蛋白(phycocyanin，簡稱 CPC)和 變藻藍蛋白(allophycocyanin，簡稱APC)。CPE、PEC、CPC和APC含α和β亞基，每個亞 基中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein) 半胱氨酸殘基的巰基共價結(jié)合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜 性質(zhì)。藻膽色素與脫輔基蛋白共價結(jié)合形成特定的構(gòu)象，使得CPE主要吸收約560nm的可 見光，發(fā)射約580nm的熒光；PEC吸收約570nm的可見光，發(fā)射約630nm的熒光；CPC吸收約 620nm的可見光，發(fā)射約640nm的熒光；APC吸收約650 660nm的可見光，發(fā)射約660 670nm的熒光。CPE結(jié)合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB) ；PEC的α 亞基結(jié)合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB) ；PEC的β亞基結(jié)合的輔基 色素為藻藍膽素(phycocyanobilin，簡稱PCB) ；CPC和APC結(jié)合的輔基色素都為藻藍膽素 PCB。藻紅藍蛋白PEC的α亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)(Tooley AJ, Glazer AN. Biosynthesis of the cyanobacterial light-harvesting polypeptide phycoerythrocyanin holo-α subunitin a heterologous host. J Bacteriol.2002 ； 184(17) :4666 4671)。我們發(fā)現(xiàn)，藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構(gòu)酶不僅可以催化PCB異 構(gòu)為PVB后與藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白結(jié)合，還能催化藻紅膽素PEB異構(gòu)為PUB后與 藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白結(jié)合。通過基因工程技術(shù)，藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白 基因克隆于表達載體，可以在大腸桿菌內(nèi)表達得到藻紅藍蛋白α亞基類脫輔基蛋白；把藻 紅藍蛋白α亞基裂合/異構(gòu)酶基因、PEB生物酶合成基因克隆于表達載體。利用以上表達 載體，通過基因工程菌，可以直接生成結(jié)合PUB的藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)。藻膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)可以應用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域。結(jié)合PUB 的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)具有與天然藻紅藍蛋白不同的光譜特性可為生物學檢測以及 醫(yī)療檢測提供更多選擇。本發(fā)明為藻紅藍蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料應用于醫(yī)藥和生物工 程領(lǐng)域，特別是檢測領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種分子設(shè)計結(jié)合藻尿膽素的藻紅藍蛋白α亞基類熒光 蛋白質(zhì)的制備方法。它是應用藻紅藍蛋白α亞基裂合酶催化藻紅膽素(PEB)異構(gòu)為藻尿膽素(PUB)與藻紅藍蛋白α亞基類脫輔基蛋白共價結(jié)合，制備結(jié)合PUB的藻紅藍蛋白α亞 基類熒光蛋白質(zhì)。將含有藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構(gòu)酶基因、藻紅藍蛋白α亞基類脫 輔基蛋白基因、藻紅膽素生物合成酶基因的表達質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入宿主菌，得到相應的工程菌， 通過這種方法得到的基因工程菌生產(chǎn)結(jié)合PUB的藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)。為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下
—種分子設(shè)計結(jié)合藻尿膽素的藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，包 括如下步驟(1)采用基因工程方法，將α亞基裂合/異構(gòu)酶基因或其同源基因克隆于表達載 體中，得到α亞基裂合/異構(gòu)酶表達質(zhì)粒；應用基因工程方法將藻紅藍蛋白α亞基類脫輔 基蛋白基因或其同源基因克隆于第二個表達載體中，得到脫輔基蛋白表達質(zhì)粒；應用基因 工程方法將藻紅膽素PEB生物合成酶基因hol、pebA和pebB或其同源基因克隆于第三個和 /或第四個表達載體中，得到PEB合成質(zhì)粒；(2)將α裂合/異構(gòu)酶表達質(zhì)粒、脫輔基蛋白表達質(zhì)粒、PEB生物合成酶質(zhì)粒依次 轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當這些表達質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應的工程菌，應用此工程菌通 過發(fā)酵工程能生產(chǎn)結(jié)合藻尿膽素PUB的藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)，發(fā)酵后，按常規(guī) 蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應的結(jié)合藻尿膽素PUB的藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)；所述的分子設(shè)計結(jié)合藻尿膽素的藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)的制備方法， 其特征在于應用α亞基裂合/異構(gòu)酶催化藻紅膽素異構(gòu)為藻尿膽素后與藻紅藍蛋白α亞 基類脫輔基蛋白進行共價結(jié)合而制備結(jié)合藻尿膽素PUB的藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白 質(zhì)。所述的α亞基裂合/異構(gòu)酶基因是指與Anabaena sp. PCC7120中pecE和pecF 基因或M. Iaminosus sp. PCC7603中pecE和pecF基因同源的基因。藻紅藍蛋白α亞基類 脫輔基蛋白基因是指與Anabaena sp. PCC7120或M. Iaminosus sp. PCC7603中pecA同源的基因。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點1、不使用藻類為原料而是利用大腸桿菌生產(chǎn)藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)， 大腸桿菌繁殖快，可以大大縮短周期；2、與藻類相比，大腸桿菌細胞壁容易破碎，純化過程中可節(jié)省能源；3、通過大腸桿菌生產(chǎn)，目標蛋白含量高，有His-tag標記，且體系中幾乎沒有性質(zhì) 類似的蛋白，提取方便；4、生成結(jié)合PUB的新型藻紅藍蛋白α亞基類色素蛋白，具有與天然藻紅藍蛋白α 亞基類色素蛋白不同的光譜特性，為發(fā)展熒光藻膽蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料提供更多選 擇。


圖1為本發(fā)明中PecE/PecF催化下生成的結(jié)合PUB的藻紅藍蛋白α亞基類熒光 蛋白質(zhì)的光譜圖；實線吸收光譜，虛線為熒光光譜。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。實施例1(1)從GeneBank中可以查到，藻種Anabaena sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已經(jīng)測定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中編號 為BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列 在GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通過 基因工程方法，將Anabaena SP.PCC7120中的藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白基因克隆于 Novagen公司購買的ρΕΤ30中，所得質(zhì)粒叫pET30-peCA，在大腸桿菌中能表達藻紅藍蛋白α 亞基脫輔基蛋白，得到藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白的表達質(zhì)粒。根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為 模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。(2)將Anabaena sp. PCC7120中的藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構(gòu)酶基因pecE和 pecF克隆于Novagen公司購買的pETDuet-Ι中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大腸桿 菌中能表達藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構(gòu)酶PecE/PecF，得到藻紅藍蛋白α亞基裂合/異 構(gòu)酶表達質(zhì)粒。(3)將藻紅膽素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1 中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大腸桿菌中能同時表達Hol和PebB。(4)將藻紅膽素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-Ι中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-pebA，在大腸桿菌中能表達PebA。即脫輔基蛋白基因pecA在pET30中是在EcoR V和Xho I兩個酶切位點之間；裂 合酶基因PecE在pETDuet中，處于第一個多克隆位點，酶切位點是Nco I和Pst I之間，裂 合酶基因PecF在pETDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是EcoR V和Xho I之間； PEB合成酶基因是3個(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一個載體pCDFDuet-1中，hoi 在第一個多克隆位點Nco I和Pst I之間，pebB在第二個多克隆位點Nde I和Xho I之間， pebA在pACYCDuet-Ι中第二個多克隆位點Bgl II和Xho I之間。基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游，一對；上游下游引物 分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片 段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載 體用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(5)將 pETDuet-pecE-pecF、pET30_pecA、pCDFDuet-hol-pebB 和 pACYCDuet-pebA 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. O的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-β -D-半乳糖苷 (isoprophylthio-β -D-galactoside，簡稱 IPTG)至終濃度為 lmmol/L，20°C至 37°C振蕩表達約12小時，生產(chǎn)藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)藻尿膽素-藻紅藍蛋白Α;離心收集菌 體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過M2+親和層析，可提純得到相應的 藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻尿膽素_藻紅藍蛋白A。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式如下從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mL LB培養(yǎng) 基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；取100 μ L飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mL LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 至OD6tltl = 0. 3 0. 4時，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10分鐘；離心1分鐘 (10000g，4°C)棄去上清，收集沉淀菌體；用ImL預冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體， 離心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌體沉淀用100 μ L預冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置于冰 上，加入一定量的構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻后冰浴放置30分鐘，42°C熱休克90s，冰浴5分鐘后加 入300 μ LLB培養(yǎng)基，37°C低速振蕩培養(yǎng)45分鐘，無菌涂布在含有相應抗生素的LB培養(yǎng)基 平板上，倒置于37°C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽 和；分別從中取100 μ L轉(zhuǎn)接至5ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中；37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 5-0. 7時，冰浴約30分鐘，加入IPTG誘導表達；避光、20°C、150轉(zhuǎn)/分，表達約12小時。 離心收集細胞，細胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌株 進行大量表達。實施例2(1)從GeneBank中可以查到，藻種Anabaena sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已經(jīng)測定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中編號 為BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列 在GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通過 基因工程方法，將Anabaena SP.PCC7120中的藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白基因克隆于 Novagen公司購買的ρΕΤ30中，所得質(zhì)粒叫pET30-peCA，在大腸桿菌中能表達藻紅藍蛋白α 亞基脫輔基蛋白，得到藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白的表達質(zhì)粒。根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為 模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。(2)將E laminosus sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構(gòu)酶基因pecE和pecF 克隆于Novagen公司購買的pETDuet-Ι中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大腸桿菌中能表達 藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構(gòu)酶PecE/PecF，得到藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構(gòu)酶表達質(zhì)粒。(3)將藻紅膽素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet_l 中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大腸桿菌中能同時表達Hol和PebB。(4)將藻紅膽素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-Ι中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-pebA，在大腸桿菌中能表達PebA。即脫輔基蛋白基因pecA在pET30中是在EcoR V和Xho I兩個酶切位點之間；裂 合酶基因PecE在pETDuet中，處于第一個多克隆位點，酶切位點是Nco I和Pst I之間，裂 合酶基因PecF在pETDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是EcoR V和Xho I之間；PEB合成酶基因是3個(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一個載體pCDFDuet-1中，hoi 在第一個多克隆位點Nco I和Pst I之間，pebB在第二個多克隆位點Nde I和Xho I之間， pebA在pACYCDuet-Ι中第二個多克隆位點Bgl II和Xho I之間。基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游，一對；上游下游引物 分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片 段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載 體用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(5)將 pETDuet-pecE-pecF、pET30_pecA、pCDFDuet-hol-pebB 和pACYCDuet-pebA 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. O的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-β -D-半乳糖苷 (isoprophylthio-β -D-galactoside，簡稱 IPTG)至終濃度為 lmmol/L，20°C至 37°C振蕩表 達約12小時，生產(chǎn)藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)藻尿膽素-藻紅藍蛋白Α;離心收集菌 體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過M2+親和層析，可提純得到相應的 藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻尿膽素_藻紅藍蛋白A。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式如下從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mL LB培養(yǎng) 基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；取100 μ L飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mL LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 至OD6tltl = 0. 3 0. 4時，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10分鐘；離心1分鐘 (10000g，4°C)棄去上清，收集沉淀菌體；用ImL預冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體， 離心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌體沉淀用100 μ L預冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置于冰 上，加入一定量的構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻后冰浴放置30分鐘，42°C熱休克90s，冰浴5分鐘后加 入300 μ LLB培養(yǎng)基，37°C低速振蕩培養(yǎng)45分鐘，無菌涂布在含有相應抗生素的LB培養(yǎng)基 平板上，倒置于37°C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽 和；分別從中取100 μ L轉(zhuǎn)接至5ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中；37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 5-0. 7時，冰浴約30分鐘，加入IPTG誘導表達；避光、20°C、150轉(zhuǎn)/分，表達約12小時。 離心收集細胞，細胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌株 進行大量表達。實施例3(1)從GeneBank中可以查到，藻種Anabaena sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已經(jīng)測定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中編號 為BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列 在GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通過基 因工程方法，將M. laminosus sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白基因克隆于 Novagen公司購買的ρΕΤ30中，所得質(zhì)粒叫pET30-peCA，在大腸桿菌中能表達藻紅藍蛋白α 亞基脫輔基蛋白，得到藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白的表達質(zhì)粒。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為 模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。(2)將Anabaena sp. PCC7120中的藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構(gòu)酶基因pecE和 pecF克隆于Novagen公司購買的pETDuet-Ι中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大腸桿 菌中能表達藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構(gòu)酶PecE/PecF，得到藻紅藍蛋白α亞基裂合/異 構(gòu)酶表達質(zhì)粒。(3)將藻紅膽素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1 中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大腸桿菌中能同時表達Hol和PebB。
(4)將藻紅膽素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-Ι中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-pebA，在大腸桿菌中能表達PebA。即脫輔基蛋白基因pecA在pET30中是在EcoR V和Xho I兩個酶切位點之間；裂 合酶基因PecE在pETDuet中，處于第一個多克隆位點，酶切位點是Nco I和Pst I之間，裂 合酶基因PecF在pETDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是EcoR V和Xho I之間； PEB合成酶基因是3個(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一個載體pCDFDuet-1中，hoi 在第一個多克隆位點Nco I和Pst I之間，pebB在第二個多克隆位點Nde I和Xho I之間， pebA在pACYCDuet-Ι中第二個多克隆位點Bgl II和Xho I之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游，一對；上游下游引物 分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片 段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載 體用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(5)將 pETDuet-pecE-pecF、pET30_pecA、pCDFDuet-hol-pebB 和 pACYCDuet-pebA 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. O的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-β -D-半乳糖苷 (isoprophylthio-β -D-galactoside，簡稱 IPTG)至終濃度為 lmmol/L，20°C至 37°C振蕩表 達約12小時，生產(chǎn)藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)藻尿膽素-藻紅藍蛋白Α;離心收集菌 體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過M2+親和層析，可提純得到相應的 藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻尿膽素_藻紅藍蛋白A。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式如下從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mL LB培養(yǎng) 基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；取100 μ L飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mL LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 至OD6tltl = 0. 3 0. 4時，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10分鐘；離心1分鐘 (10000g，4°C)棄去上清，收集沉淀菌體；用ImL預冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體， 離心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌體沉淀用100 μ L預冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置于冰 上，加入一定量的構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻后冰浴放置30分鐘，42°C熱休克90s，冰浴5分鐘后加 入300 μ LLB培養(yǎng)基，37°C低速振蕩培養(yǎng)45分鐘，無菌涂布在含有相應抗生素的LB培養(yǎng)基 平板上，倒置于37°C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。
提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽 和；分別從中取100 μ L轉(zhuǎn)接至5ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中；37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 5-0. 7時，冰浴約30分鐘，加入IPTG誘導表達；避光、20°C、150轉(zhuǎn)/分，表達約12小時。 離心收集細胞，細胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌株 進行大量表達。實施例4(1)從GeneBank中可以查到，藻種Anabaena sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已經(jīng)測定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中編號 為BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列 在GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通過基 因工程方法，將M. laminosus sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白基因克隆于 Novagen公司購買的ρΕΤ30中，所得質(zhì)粒叫pET30-peCA，在大腸桿菌中能表達藻紅藍蛋白α 亞基脫輔基蛋白，得到藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白的表達質(zhì)粒。根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為 模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。(2)將Μ. laminosus sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構(gòu)酶基因pecE 和pecF克隆于Novagen公司購買的pETDuet-Ι中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大腸 桿菌中能表達藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構(gòu)酶PecE/PecF，得到藻紅藍蛋白α亞基裂合/ 異構(gòu)酶表達質(zhì)粒。(3)將藻紅膽素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet_l 中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大腸桿菌中能同時表達Hol和PebB。(4)將藻紅膽素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-Ι中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-pebA，在大腸桿菌中能表達PebA。即脫輔基蛋白基因pecA在pET30中是在EcoR V和Xho I兩個酶切位點之間；裂 合酶基因PecE在pETDuet中，處于第一個多克隆位點，酶切位點是Nco I和Pst I之間，裂 合酶基因PecF在pETDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是EcoR V和Xho I之間； PEB合成酶基因是3個(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一個載體pCDFDuet-1中，hoi 在第一個多克隆位點Nco I和Pst I之間，pebB在第二個多克隆位點Nde I和Xho I之間， pebA在pACYCDuet-Ι中第二個多克隆位點Bgl II和Xho I之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游，一對；上游下游引物 分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片 段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載 體用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(5)將 pETDuet-pecE-pecF、pET30_pecA、pCDFDuet-hol-pebB 和pACYCDuet-pebA 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH7. O的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-β -D-半乳糖苷 (isoprophylthio-β -D-galactoside，簡稱 IPTG)至終濃度為 lmmol/L，20°C至 37°C振蕩表 達約12小時，生產(chǎn)藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)藻尿膽素-藻紅藍蛋白Α;離心收集菌 體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過M2+親和層析，可提純得到相應的 藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻尿膽素_藻紅藍蛋白A。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式如下從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mL LB培養(yǎng) 基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；取100 μ L飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mL LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 至OD6tltl = 0. 3 0. 4時，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10分鐘；離心1分鐘 (10000g，4°C)棄去上清，收集沉淀菌體；用ImL預冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體， 離心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌體沉淀用100 μ L預冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置于冰 上，加入一定量的構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻后冰浴放置30分鐘，42°C熱休克90s，冰浴5分鐘后加 入300 μ LLB培養(yǎng)基，37°C低速振蕩培養(yǎng)45分鐘，無菌涂布在含有相應抗生素的LB培養(yǎng)基 平板上，倒置于37°C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽 和；分別從中取100 μ L轉(zhuǎn)接至5ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中；37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 5-0. 7時，冰浴約30分鐘，加入IPTG誘導表達；避光、20°C、150轉(zhuǎn)/分，表達約12小時。 離心收集細胞，細胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌株 進行大量表達。實施例5(1)從GeneBank中可以查到，藻種Anabaena sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已經(jīng)測定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中編號 為BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列 在GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通過 基因工程方法，將Anabaena SP.PCC7120中的藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白基因克隆于 Novagen公司購買的pCOLADuet-Ι中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-pecA，在大腸桿菌中能表達藻 紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白，得到藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白的表達質(zhì)粒。根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為 模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。(2)將Anabaena sp. PCC7120中的藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構(gòu)酶基因pecE和 pecF克隆于Novagen公司購買的pETDuet-Ι中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大腸桿 菌中能表達藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構(gòu)酶PecE/PecF，得到藻紅藍蛋白α亞基裂合/異 構(gòu)酶表達質(zhì)粒。(3)將藻紅膽素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1 中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大腸桿菌中能同時表達Hol和PebB。(4)將藻紅膽素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet_l中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-pebA，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因pecA的片段在pCOLADuet-Ι中是在第一個多克隆位點的EcoR I和Pst I兩個酶切位點之間；裂合酶基因pecE在pETDuet中，處于第一個多克隆位點，酶 切位點是Nco I和Pst I之間，裂合酶基因pecF在pETDuet中，處于第二個多克隆位點，酶 切位點是EcoR V和Xho I之間；PEB合成酶基因是3個(hoi、pebA和pebB)，hoi禾口 pebB 在同一個載體P⑶FDuet-I中，hoi在第一個多克隆位點Nco I和Pst I之間，pebB在第二 個多克隆位點Nde I和Xho I之間，pebA在pACYCDuet-Ι中第二個多克隆位點Bgl II和 Xho I之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游，一對；上游下游引物 分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片 段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載 體用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5)將 pETDuet-pecE-pecF、pCOLADuet-pecA、pCDFDuet-ho 1-pebB 禾口 pACY⑶uet-pebA轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此 工程菌接種于PH 7. O的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 5至0. 8，加入異丙基硫 代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，簡稱 IPTG)至終濃度為 lmmol/ L，20°C至37°C振蕩表達約12小時，生產(chǎn)藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)藻尿膽素-藻紅 藍蛋白A ；離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層 析，可提純得到相應的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻尿膽素-藻紅藍蛋白Α。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式如下從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mL LB培養(yǎng) 基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；取100 μ L飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mL LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 至OD6tltl = 0. 3 0. 4時，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10分鐘；離心1分鐘 (10000g，4°C)棄去上清，收集沉淀菌體；用ImL預冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體， 離心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌體沉淀用100 μ L預冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置于冰 上，加入一定量的構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻后冰浴放置30分鐘，42°C熱休克90s，冰浴5分鐘后加 入300 μ LLB培養(yǎng)基，37°C低速振蕩培養(yǎng)45分鐘，無菌涂布在含有相應抗生素的LB培養(yǎng)基 平板上，倒置于37°C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽 和；分別從中取100 μ L轉(zhuǎn)接至5ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中；37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 5-0. 7時，冰浴約30分鐘，加入IPTG誘導表達；避光、20°C、150轉(zhuǎn)/分，表達約12小時。 離心收集細胞，細胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌株 進行大量表達。實施例6(1)從GeneBank中可以查到，藻種Anabaena sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已經(jīng)測定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中編號 為BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通過 基因工程方法，將Anabaena SP.PCC7120中的藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白基因克隆于 Novagen公司購買的pCOLADuet-Ι中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-pecA，在大腸桿菌中能表達藻 紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白，得到藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白的表達質(zhì)粒。根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為 模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。(2)將Μ. Iaminosus sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構(gòu)酶基因pecE 和pecF克隆于Novagen公司購買的pETDuet-Ι中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大腸 桿菌中能表達藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構(gòu)酶PecE/PecF，得到藻紅藍蛋白α亞基裂合/ 異構(gòu)酶表達質(zhì)粒。(3)將藻紅膽素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1 中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大腸桿菌中能同時表達Hol和PebB。(4)將藻紅膽素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-Ι中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-pebA，在大腸桿菌中能表達PebA。即脫輔基蛋白基因pecA的片段在pCOLADuet-Ι中是在第一個多克隆位點的EcoR I和Pst I兩個酶切位點之間；裂合酶基因pecE在pETDuet中，處于第一個多克隆位點，酶 切位點是Nco I和Pst I之間，裂合酶基因pecF在pETDuet中，處于第二個多克隆位點，酶 切位點是EcoR V和Xho I之間；PEB合成酶基因是3個(hoi、pebA和pebB)，hoi和pebB 在同一個載體P⑶FDuet-I中，hoi在第一個多克隆位點Nco I和Pst I之間，pebB在第二 個多克隆位點Nde I和Xho I之間，pebA在pACYCDuet-Ι中第二個多克隆位點Bgl II和 Xho I之間。基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游，一對；上游下游引物 分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片 段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載 體用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(5)將 pETDuet-pecE-pecF、pCOLADuet-pecA、pCDFDuet-ho 1-pebB 禾口 pACY⑶uet-pebA轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此 工程菌接種于PH 7. O的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 5至0. 8，加入異丙基硫 代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，簡稱 IPTG)至終濃度為 lmmol/ L，20°C至37°C振蕩表達約12小時，生產(chǎn)藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)藻尿膽素-藻紅 藍蛋白A ；離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層 析，可提純得到相應的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻尿膽素-藻紅藍蛋白Α。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式如下從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21 (DE3)單菌落，接種于5mL LB培養(yǎng) 基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；取100 μ L飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mL LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 至OD6tltl = 0. 3 0. 4時，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10分鐘；離心1分鐘(10000g，4°C)棄去上清，收集沉淀菌體；用ImL預冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體，離心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌體沉淀用100 μ L預冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置于冰 上，加入一定量的構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻后冰浴放置30分鐘，42°C熱休克90s，冰浴5分鐘后加 入300 μ LLB培養(yǎng)基，37°C低速振蕩培養(yǎng)45分鐘，無菌涂布在含有相應抗生素的LB培養(yǎng)基 平板上，倒置于37°C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽 和；分別從中取100 μ L轉(zhuǎn)接至5ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中；37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 5-0. 7時，冰浴約30分鐘，加入IPTG誘導表達；避光、20°C、150轉(zhuǎn)/分，表達約12小時。 離心收集細胞，細胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌株 進行大量表達。實施例7(1)從GeneBank中可以查到，藻種Anabaena sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已經(jīng)測定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中編號 為BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列 在GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通過基 因工程方法，將M. laminosus sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白基因克隆于 Novagen公司購買的pCOLADuet-Ι中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-pecA，在大腸桿菌中能表達藻 紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白，得到藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白的表達質(zhì)粒。根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為 模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。(2)將Anabaena sp. PCC7120中的藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構(gòu)酶基因pecE和 pecF克隆于Novagen公司購買的pETDuet-Ι中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大腸桿 菌中能表達藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構(gòu)酶PecE/PecF，得到藻紅藍蛋白α亞基裂合/異 構(gòu)酶表達質(zhì)粒。(3)將藻紅膽素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet_l 中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大腸桿菌中能同時表達Hol和PebB。(4)將藻紅膽素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-Ι中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-pebA，在大腸桿菌中能表達PebA。即脫輔基蛋白基因pecA的片段在pCOLADuet-Ι中是在第一個多克隆位點的EcoR I和Pst I兩個酶切位點之間；裂合酶基因pecE在pETDuet中，處于第一個多克隆位點，酶 切位點是Nco I和Pst I之間，裂合酶基因pecF在pETDuet中，處于第二個多克隆位點，酶 切位點是EcoR V和Xho I之間；PEB合成酶基因是3個(hoi、pebA和pebB)，hoi禾口 pebB 在同一個載體P⑶FDuet-I中，hoi在第一個多克隆位點Nco I和Pst I之間，pebB在第二 個多克隆位點Nde I和Xho I之間，pebA在pACYCDuet-Ι中第二個多克隆位點Bgl II和 Xho I之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游，一對；上游下游引物 分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載 體用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(5)將 pETDuet-pecE-pecF、pCOLADuet-pecA、pCDFDuet-ho 1-pebB 禾口 pACY⑶uet-pebA轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此 工程菌接種于PH 7. 0的LB培養(yǎng)基中， 37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 5至0. 8，加入異丙基硫 代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，簡稱 IPTG)至終濃度為 lmmol/ L，20°C至37°C振蕩表達約12小時，生產(chǎn)藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)藻尿膽素-藻紅 藍蛋白A ；離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層 析，可提純得到相應的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻尿膽素-藻紅藍蛋白Α。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式如下從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mL LB培養(yǎng) 基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；取100 μ L飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mL LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 至OD6tltl = 0. 3 0. 4時，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10分鐘；離心1分鐘 (10000g，4°C)棄去上清，收集沉淀菌體；用ImL預冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體， 離心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌體沉淀用100 μ L預冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置于冰 上，加入一定量的構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻后冰浴放置30分鐘，42°C熱休克90s，冰浴5分鐘后加 入300 μ LLB培養(yǎng)基，37°C低速振蕩培養(yǎng)45分鐘，無菌涂布在含有相應抗生素的LB培養(yǎng)基 平板上，倒置于37°C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽 和；分別從中取100 μ L轉(zhuǎn)接至5ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中；37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 5-0. 7時，冰浴約30分鐘，加入IPTG誘導表達；避光、20°C、150轉(zhuǎn)/分，表達約12小時。 離心收集細胞，細胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌株 進行大量表達。實施例8(1)從GeneBank中可以查到，藻種Anabaena sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已經(jīng)測定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中編號 為BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列 在GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通過基 因工程方法，將M. laminosus sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白基因克隆于 Novagen公司購買的pCOLADuet-Ι中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-pecA，在大腸桿菌中能表達藻 紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白，得到藻紅藍蛋白α亞基脫輔基蛋白的表達質(zhì)粒。根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為 模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相 應質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。(2)將Μ. laminosus sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構(gòu)酶基因pecE 和pecF克隆于Novagen公司購買的pETDuet-Ι中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大腸桿菌中能表達藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構(gòu)酶PecE/PecF，得到藻紅藍蛋白α亞基裂合/異構(gòu)酶表達質(zhì)粒。(3)將藻紅膽素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1 中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大腸桿菌中能同時表達Hol和PebB。(4)將藻紅膽素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-Ι中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-pebA，在大腸桿菌中能表達PebA。即脫輔基蛋白基因pecA的片段在pCOLADuet-Ι中是在第一個多克隆位點的EcoR I和Pst I兩個酶切位點之間；裂合酶基因pecE在pETDuet中，處于第一個多克隆位點，酶 切位點是Nco I和Pst I之間，裂合酶基因pecF在pETDuet中，處于第二個多克隆位點，酶 切位點是EcoR V和Xho I之間；PEB合成酶基因是3個(hoi、pebA和pebB)，hoi和pebB 在同一個載體P⑶FDuet-I中，hoi在第一個多克隆位點Nco I和Pst I之間，pebB在第二 個多克隆位點Nde I和Xho I之間，pebA在pACYCDuet-Ι中第二個多克隆位點Bgl II和 Xho I之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游，一對；上游下游引物 分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片 段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載 體用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(5)將 pETDuet-pecE-pecF、pCOLADuet-pecA、pCDFDuet-ho 1-pebB 禾口 pACY⑶uet-pebA轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此 工程菌接種于PH 7. O的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 5至0. 8，加入異丙基硫 代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，簡稱 IPTG)至終濃度為 lmmol/ L，20°C至37°C振蕩表達約12小時，生產(chǎn)藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)藻尿膽素-藻紅 藍蛋白A ；離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層 析，可提純得到相應的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻尿膽素-藻紅藍蛋白Α。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式如下從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mL LB培養(yǎng) 基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；取100 μ L飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mL LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 至OD6tltl = 0. 3 0. 4時，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10分鐘；離心1分鐘 (10000g，4°C)棄去上清，收集沉淀菌體；用ImL預冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體， 離心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌體沉淀用100 μ L預冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置于冰 上，加入一定量的構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻后冰浴放置30分鐘，42°C熱休克90s，冰浴5分鐘后加 入300 μ LLB培養(yǎng)基，37°C低速振蕩培養(yǎng)45分鐘，無菌涂布在含有相應抗生素的LB培養(yǎng)基 平板上，倒置于37°C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽 和；分別從中取100 μ L轉(zhuǎn)接至5ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中；37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 5-0. 7時，冰浴約30分鐘，加入IPTG誘導表達；避光、20°C、150轉(zhuǎn)/分，表達約12小時。 離心收集細胞，細胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌株進行大量表達。 上述制備方法適用于采用各種藍藻中的α亞基裂合/異構(gòu)酶、藻紅藍蛋白α亞基類脫輔基蛋白和PEB生物合成酶基因或其同源基因來制備結(jié)合PUB的藻紅藍蛋白α亞 基類熒光蛋白質(zhì)，但涉及到微生物菌種公開的問題，本發(fā)明只選用了 GenBank中已公開全 序列的藍藻Anabaena sp. PCC7120和已公開部分序列的藍藻M. Iaminosus sp. PCC7603、 Calothrixsp. PCC7601為例對本發(fā)明方法加以說明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述公開 的內(nèi)容采用其它原料實施本發(fā)明。
權(quán)利要求
一種分子設(shè)計結(jié)合藻尿膽素的藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)采用基因工程方法，將α亞基裂合/異構(gòu)酶基因或其同源基因克隆于表達載體中，得到α亞基裂合/異構(gòu)酶表達質(zhì)粒；應用基因工程方法將藻紅藍蛋白α亞基類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆于第二個表達載體中，得到脫輔基蛋白表達質(zhì)粒；應用基因工程方法將藻紅膽素PEB生物合成酶基因或其同源基因克隆于第三個和/或第四個表達載體中，得到PEB合成質(zhì)粒；(2)將α裂合/異構(gòu)酶表達質(zhì)粒、脫輔基蛋白表達質(zhì)粒、PEB生物合成酶質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當這些表達質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應的工程菌，應用此工程菌通過發(fā)酵工程能生產(chǎn)結(jié)合藻尿膽素PUB的藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)，發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應的結(jié)合藻尿膽素PUB的藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)；
2 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子設(shè)計結(jié)合藻尿膽素的藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì) 的制備方法，其特征在于應用α亞基裂合/異構(gòu)酶催化藻紅膽素異構(gòu)為藻尿膽素后與藻 紅藍蛋白α亞基類脫輔基蛋白進行共價結(jié)合而制備結(jié)合藻尿膽素PUB的藻紅藍蛋白α亞 基類熒光蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的方法，其特征在于α亞基裂合/異構(gòu)酶基因是指與魚 腥藻 Anabaena sp. PCC7120 中 pecE 和 pecF 基因或?qū)永肀拗υ?M. Iaminosus sp. PCC7603 中pecE和pecF基因同源的基因，藻紅藍蛋白α亞基類脫輔基蛋白基因是指與Anabaena sp. PCC7120 或 M. Iaminosus sp. PCC7603 中 pecA 同源的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子設(shè)計結(jié)合藻尿膽素的藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì) 的制備方法，其特征在于所述的宿主菌采用大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分子設(shè)計結(jié)合藻尿膽素的藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，通過應用藻膽蛋白α亞基裂合/異構(gòu)酶催化藻紅膽素異構(gòu)為藻尿膽素PUB后與藻紅藍蛋白α亞基類脫輔基蛋白共價結(jié)合，制備結(jié)合PUB的藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)，本發(fā)明的方法應用生物過程生產(chǎn)結(jié)合PUB的藻紅藍蛋白類α亞基熒光蛋白質(zhì)，是一種環(huán)境友好的生產(chǎn)方法；藻紅藍蛋白α亞基類熒光蛋白質(zhì)能應用于生物學和醫(yī)藥功能材料領(lǐng)域，特別是應用為生物學和醫(yī)學檢測領(lǐng)域的熒光探針。
文檔編號C12N15/70GK101824427SQ200910037628
公開日2010年9月8日 申請日期2009年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月6日
發(fā)明者佟順剛, 夏坤 申請人:廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司