專利名稱：利用淀粉廢水生產(chǎn)微生物絮凝劑的生產(chǎn)菌及其生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水處理、食品生產(chǎn)和發(fā)酵等工業(yè)中使用的絮凝劑，具體涉及一種微生 物絮凝劑。
背景技術(shù)：
絮凝劑被廣泛的應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)工程包括飲用水處理、廢水處理、下游工藝、食品 以及發(fā)酵工藝等。絮凝劑通常被分成三類(1)無機(jī)絮凝劑如硫酸鋁和聚合氯化鋁，(2)有 機(jī)合成高聚合絮凝劑如聚丙烯酰胺衍生物和聚乙烯亞胺，(3)自然存在的絮凝劑如殼聚糖， 海藻酸鈉和微生物絮凝劑。在這些絮凝劑當(dāng)中，有機(jī)合成高聚合絮凝劑如PAC(聚合氯化 鋁)和PAM(聚丙烯酰胺)由于絮凝活性高、成本低而被廣泛的應(yīng)用。盡管這些合成絮凝劑 被廣泛應(yīng)用，但研究發(fā)現(xiàn)鋁鹽會(huì)導(dǎo)致老年癡呆癥、聚丙烯酰胺單體對(duì)人類具有致癌和強(qiáng)烈 的神經(jīng)毒性，并在自然環(huán)境中不能生物降解。相反，微生物絮凝劑是由微生物在生長(zhǎng)過程中 產(chǎn)生的安全無毒可生物降解的聚合物，其主要成分有糖蛋白、胞外多糖、蛋白質(zhì)、纖維素和 核酸等。由于微生物種類繁多，絮凝劑特性各異，具有很好的開發(fā)前景。但是目前國內(nèi)外對(duì)微生物絮凝劑的研究大多處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，還未達(dá)到實(shí)際 應(yīng)用和工業(yè)化生產(chǎn)階段，制約其發(fā)展的關(guān)鍵在于微生物絮凝劑絮凝能力低、用量大且生產(chǎn) 成本高。因此，篩選絮凝能力強(qiáng)，又能利用低廉原料作為替代培養(yǎng)基的微生物絮凝劑產(chǎn)生 菌，并研究其生產(chǎn)工藝條件是微生物絮凝劑工業(yè)化生產(chǎn)過程中急需解決的關(guān)鍵問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于利用一株高效絮凝劑產(chǎn)生菌，選擇高濃度淀粉廢水作為替代培 養(yǎng)基，同時(shí)研究其最佳的產(chǎn)絮凝劑工藝以解決微生物絮凝劑的工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)問題。本發(fā)明的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一株利用高濃度淀粉廢水產(chǎn)生生產(chǎn)微生物絮凝劑的生產(chǎn)菌為地衣芽胞桿菌 (Bacillus licheniformis X14,CCTCC AB 208260)。利用高濃度淀粉廢水生產(chǎn)絮凝劑的生 產(chǎn)方法包括種子液的培養(yǎng)，產(chǎn)絮凝劑培養(yǎng)條件優(yōu)化及絮凝劑的提取。(1)種子液的培養(yǎng)經(jīng)斜面培養(yǎng)的地衣芽胞桿菌接種至經(jīng)滅菌的種子培養(yǎng)液中， 在37°C、160r/min的條件下培養(yǎng)18-24小時(shí)，至細(xì)菌濃度約為0. 5-1 X 107CFU/ml ；(2)產(chǎn)絮凝劑微生物的培養(yǎng)條件優(yōu)化采用PH為7. 5，CODcr濃度為8000mg/L的 淀粉廢水，外加緩沖鹽為3g/L的K2HPO4和lg/L的KH2PO4,在115°C高溫滅菌30min后，按體 積比接種的種子液，在溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速采用140-160r/min的變速控制的條件下發(fā) 酵培養(yǎng)48小時(shí)；(3)微生物絮凝劑ZS-7的提取發(fā)酵液在lOOOOr/min離心30分鐘，收集上清液， 在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮為原來體積的0. 2倍并在4°C去離子水中透析過夜，加入三倍體積的 無水預(yù)冷的乙醇，獲得的沉淀重新溶解在去離子水中，再加入10%的氯代十六烷基吡啶，數(shù) 小時(shí)后收集沉淀并將之溶解在0. 5mol/L的NaCl溶液中，再加入三倍體積的無水乙醇收集沉淀，并用75%的乙醇沖洗三次，將沉淀溶解于去離子水(0. 1% )上柱(S印hacryl S-500 column 1.6 X 100cm)，以蒸餾水作為流動(dòng)相(流速為2ml/min)收集活性峰，冷凍干燥得到 絮凝劑純品ZS-7。下面結(jié)合附圖詳述本發(fā)明。


圖1菌株X14的顯微照片(600 X)；圖2X14基于16S rDNA的核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹圖3接種量對(duì)絮凝率的影響圖4pH值對(duì)絮凝率的影響圖5溫度對(duì)絮凝率的影響1、絮凝劑產(chǎn)生菌的分離及特征絮凝菌X14是采用常規(guī)方法從中山大學(xué)校園土壤中篩選到的一種絮凝劑高產(chǎn)菌，其產(chǎn)生的胞外高聚物具有極好的脫水除濁能力。該菌株在牛肉膏蛋白胨的培養(yǎng)基菌落乳 白色，橢圓形，粘稠，大小為(1. 6-3) μ mX (0. 6-0. 8) μ m(圖1)。革蘭氏染色呈陽性，有芽 胞，好氧或兼性厭氧，能利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，接觸酶陽性，水解淀粉。利用通用引物27F 和1522R對(duì)提取到的X14菌株的DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的16S rDNA的測(cè)序結(jié)果提 交到GenBank，登錄號(hào)為EU717842。Blastn同源性檢測(cè)結(jié)果表明，該菌株的16S rDNA與 Bacilluslicheniformis DSM 13T的相似性最大，達(dá)到99% (圖2)。綜合以上形態(tài)學(xué)、生理 生化特征和16S rDNA序列同源性分析鑒定結(jié)果可以認(rèn)為菌株X14為地衣芽胞桿菌，將其命 名為Bacillus licheniformis X14。該菌株已經(jīng)提交到中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號(hào)為 CCTCC AB 208260。2、絮凝劑的生產(chǎn)方法(1)種子液培養(yǎng)基及種子液培養(yǎng)種子培養(yǎng)基為葡萄糖20g/L，KH2PO4 2g/L，K2HPO4 5g/L，(NH4)2SO4 0. 2g/L, NaCl 0. lg/L，尿素 0. 5g/L，酵母膏 0. 5g/L，MgSO4 0. 2g/L，蒸餾水 lL，pH7. 5-8. 0，115°C滅菌 30 分 鐘。于新鮮的X14培養(yǎng)斜面上挑取少許菌落，接種于種子培養(yǎng)基中，于溫度37°C、160r/min 的條件下培養(yǎng)18-24小時(shí)，至細(xì)菌濃度約為0. 5-lX107CFU/mlo將此培養(yǎng)液作為X14產(chǎn)絮 凝劑接種時(shí)的種子液。(2)替代培養(yǎng)基(淀粉廢水)的制備淀粉廢水是食品行業(yè)中一種最常見的一種廢水，含有大量細(xì)小的懸浮米糠顆粒和 幾乎所有的玉米蛋白，回收的固體物質(zhì)通常被用作動(dòng)物飼料，但是大部分都是直接排放，沒 有被充分的利用，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。利用淀粉廢水作為替代培養(yǎng)基生產(chǎn)微生物絮凝 齊U，既解決了微生物絮凝劑生產(chǎn)的成本問題，又減少了企業(yè)的排污量和處理費(fèi)用，實(shí)現(xiàn)了廢 水資源化的可行性和高效性。具有廣泛的市場(chǎng)潛力和應(yīng)用前景。Bacillus licheniformis X14合成絮凝劑所用的淀粉廢水為生產(chǎn)淀粉過程中所 產(chǎn)生的廢水，為乳白色液體，有惡臭。其CODcr為11200mg/L，B0D5為4580mg/L，SS為825mg/ L，氨氮為3542mg/L，pH為5. 1。廢水預(yù)處理將原廢水加熱至80°C，沉淀、過濾去渣，備用。 考慮到X14產(chǎn)絮凝劑過程中會(huì)產(chǎn)生大量的酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基嚴(yán)重酸化，影響絮凝劑的合成，所以將培養(yǎng)基的初始PH值調(diào)制堿性，并投加3g/L的K2HPO4和lg/L的KH2PO4作為緩沖鹽。(3)最佳培養(yǎng)條件的確定通過比較微生物絮凝劑生產(chǎn)過程中的影響因素如廢水的濃度、接種量(圖3)、PH(圖4)、溫度(圖5)、搖床轉(zhuǎn)速等，得到微生物絮凝劑生產(chǎn)的最佳條件如下淀粉廢水的 濃度采用CODcr為8000mg/L，培養(yǎng)基的初始pH設(shè)為7. 5，按體積比接種量為1 %，培養(yǎng)溫度 為37°C，搖床轉(zhuǎn)速采用140-160r/min的變速控制的條件下發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)。3、絮凝劑的提取發(fā)酵液在lOOOOr/min離心30分鐘，收集上清液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮為原來體 積的0. 2倍并在4°C去離子水中透析過夜，加入三倍體積的無水預(yù)冷的乙醇，獲得的沉淀重 新溶解在去離子水中，再加入10%的氯代十六烷基吡啶，數(shù)小時(shí)后收集沉淀并將之溶解在 0. 5mol/L的NaCl溶液中，再加入三倍體積的無水乙醇收集沉淀，并用75%的乙醇沖洗三 次，將沉淀溶解于去離子水(0. 1% )上柱(Sephacryl S_500column 1. 6 X 100cm)，以蒸餾 水作為流動(dòng)相(流速為2ml/min)收集活性峰，冷凍干燥得到絮凝劑純品ZS-7。該絮凝劑經(jīng) 鑒定為糖蛋白類物質(zhì)，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，能耐酸耐堿耐高溫，具有極好的絮凝活性。當(dāng)投加 量為2mg/L時(shí)，對(duì)0. 4%的高嶺土懸濁液絮凝率達(dá)到96%以上，對(duì)印染廢水、造紙廢水、碳素 墨水等具有很好的脫色除濁效果。用本發(fā)明篩選出的用高濃度淀粉廢水作為廉價(jià)的替代培養(yǎng)基生產(chǎn)微生物絮凝劑， 不僅解決了微生物絮凝劑生產(chǎn)的成本問題，實(shí)現(xiàn)了微生物絮凝劑的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；而 且還減少了企業(yè)的排污量和處理費(fèi)用，實(shí)現(xiàn)了廢水資源化的可行性和高效性。具有廣泛的 市場(chǎng)潛力和應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式從菌株X14的保藏斜面上挑取少許菌落，接種于裝有IOOml種子培養(yǎng)基的250ml 三角瓶中，在37°C、160r/min的條件下培養(yǎng)24小時(shí)，至細(xì)菌濃度約為lX107CFU/ml。將此 培養(yǎng)液作為X14產(chǎn)絮凝劑接種時(shí)的種子液。調(diào)節(jié)淀粉廢水的CODcr濃度為8000mg/L，在高溫高壓下(0. IMPa, 115°C )滅菌 30mino將滅菌后的淀粉廢水的pH值調(diào)為7. 5，按體積比接種量為1%，培養(yǎng)溫度為37°C， 搖床轉(zhuǎn)速采用140-160r/min的變速控制的條件下發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)。發(fā)酵液在lOOOOr/min離心30分鐘，收集上清液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮為原來體 積的0. 2倍并在4°C去離子水中透析過夜，加入三倍體積的無水預(yù)冷的乙醇，獲得的沉淀重 新溶解在去離子水中，再加入10%的氯代十六烷基吡啶，數(shù)小時(shí)后收集沉淀并將之溶解在 0. 5mol/L的NaCl溶液中，再加入三倍體積的無水乙醇收集沉淀，并用75%的乙醇沖洗三 次，將沉淀溶解于去離子水(0.1%)上柱(Sephacryl S-500 column 1.6 X 100cm)，以蒸餾 水作為流動(dòng)相(流速為2ml/min)收集活性峰，冷凍干燥得到絮凝劑純品ZS-7。
權(quán)利要求
一株微生物絮凝劑產(chǎn)生菌為地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis X14CCTCC AB 208260)。
2.一種如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)微生物絮凝劑的生產(chǎn)方法，包括菌種的篩選和鑒定、 培養(yǎng)條件的優(yōu)化以及絮凝劑的提取，本發(fā)明的特征在于(1)種子液的培養(yǎng)經(jīng)斜面培養(yǎng)的地衣芽胞桿菌接種至經(jīng)滅菌的種子培養(yǎng)液中，在 37°C、160r/min的條件下培養(yǎng)18-24小時(shí)，至細(xì)菌濃度至0. 5-1 X 107CFU/ml ；(2)產(chǎn)絮凝劑微生物的培養(yǎng)條件優(yōu)化采用pH為7.5，CODcr濃度為8000mg/L的淀粉 廢水，外加緩沖鹽為3g/L的K2HPO4和lg/L的KH2PO4,在115°C高溫滅菌30min后，按體積比 接種的種子液，在溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速采用140-160r/min的變速控制的條件下發(fā)酵培 養(yǎng)48小時(shí)；(3)微生物絮凝劑ZS-7的提取發(fā)酵液在lOOOOr/min離心30分鐘，收集上清液，在 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮為原來體積的0. 2倍并在4°C去離子水中透析過夜，加入三倍體積的無 水預(yù)冷的乙醇，獲得的沉淀重新溶解在去離子水中，再加入10%的氯代十六烷基吡啶，數(shù) 小時(shí)后收集沉淀并將之溶解在0. 5mol/L的NaCl溶液中，再加入三倍體積的無水乙醇收集 沉淀，并用75%的乙醇沖洗三次，將沉淀溶解于去離子水(0. 1% )上柱(S印hacryl S-500 column 1.6 X 100cm)，以蒸餾水作為流動(dòng)相(流速為2ml/min)收集活性峰，冷凍干燥得到 絮凝劑純品ZS-7。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物絮凝劑ZS-7。本發(fā)明利用分離出一株高效絮凝劑產(chǎn)生菌X14(Bacillus licheniformis，CCTCC AB 208260)；該菌株以高濃度淀粉廢水作為替代培養(yǎng)基合成絮凝劑，經(jīng)培養(yǎng)條件優(yōu)化，培養(yǎng)工藝如下COD濃度為8g/l的淀粉廢水，外加緩沖鹽為3g/L的K2HPO4和1g/L的KH2PO4，培養(yǎng)基初始的pH值為7.5，培養(yǎng)基在115℃滅菌30min后，接種量采用1％，溫度采用37℃，搖床轉(zhuǎn)速采用變速控制(140-160r/min)培養(yǎng)48h后的發(fā)酵液經(jīng)過高速離心、濃縮、乙醇沉淀、透析、CPC沉淀和凝膠色譜得到純化的微生物絮凝劑ZS-7。利用淀粉廢水生產(chǎn)微生物絮凝劑，既解決了微生物絮凝劑生產(chǎn)的成本問題，又減少了企業(yè)的排污量和處理費(fèi)用，實(shí)現(xiàn)了廢水資源化的可行性和高效性。
文檔編號(hào)C12R1/10GK101805707SQ20091003806
公開日2010年8月18日 申請(qǐng)日期2009年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月23日
發(fā)明者雷恒毅, 黎忠 申請(qǐng)人:中山大學(xué);廣州珠江環(huán)?？萍及l(fā)展有限公司