專利名稱：用豬成纖維細胞生成誘導的多能性干細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及干細胞領域，特別涉及用豬成纖維細胞生成誘導的多能性干細 月包的方法。
背景技術：
干細胞(stem cells)是人體及其各種組織細胞的初始來源，其最顯著的生物學 特征是既有自我更新和不斷增殖的能力，又有多向分化的潛能。干細胞根據(jù)不同 的來源分為成體干纟田月包(somatic stem cells)和胚月臺干細月包(embryonic stem cells, ES細胞)。成體干細胞包括骨髓間充質干細胞、胰腺干細胞、神經干細胞等成 體組織中存在的。
1981年，ES細胞的分離和培養(yǎng)首先在小鼠中獲得成功，是至今研究最廣泛、 最成熟的干細胞體系。隨后，牛、羊等大動物的ES細胞分離和培養(yǎng)也相繼獲得 成功。
人類胚胎干細胞(hES細胞)研究的應用前景主要是移植治療，在組織工程 學領域中以hES細胞作為種子細胞，可為臨床上細胞、組織或器官的移植治療提 供大量的材料。通過控制hES細胞分化培養(yǎng)環(huán)境、轉染能夠促進ES細胞定向 分化的關鍵分子基因等體外誘導分化策略，可獲得特異性的組織細胞類型。這類 細胞用于移植治療，將給糖尿病、帕金森氏病、脊髓損傷、白血病、心肌損傷、 腎衰竭、肝硬化等疾病的治療帶來新的希望。
一直以來，hES細胞研究面臨著許多難題和爭議，主要包括以下幾個方面(1) 供體卵母細胞的來源困難，hES細胞建系效率低。此外，體細胞核移植術(SCNT 技術)的不成熟必將需要進一步耗費更多的人類卵母細胞，故而其來源難以得到 保證。(2)免疫排斥反應，除非采用SCNT技術，否則患者對hES細胞分化而來的各種細胞和組織仍然存在免疫排斥反應。(3)hES細胞具有成瘤性，移植到受體 的體內后有發(fā)展為腫瘤的可能性，即使采用SCNT技術、給移植細胞設置自殺基 因等應對措施，也不一定能夠很好地解決這個問題。(4)體外維持hES風險。
為避開hES細胞和治療性克隆研究的倫理學爭論，需要找到一種替代途徑， 以便將人類的體細胞直接轉化為多潛能干細胞，為患者提供"個性化"的自體干 細胞。2003年，Gurdon研究小組發(fā)現(xiàn)，將已完全分化的小鼠胸腺細胞或成人外 周血淋巴細胞的細胞核注入爪蟾卵母細胞后，哺乳動物細胞核的分化標志物喪失: 而哺乳動物干細胞中最具特征性的標志物Oct4則呈高表達，提示哺乳動物細胞 核可直接被兩棲動物卵母細胞核泡所重構從而表達O ct4 。
2006年，日本京都大學Yamanaka研究小組采用體外基因轉染技術，從24 個因子中篩選出Oct4、 Sox2、 c-Myc、 Klf4等4個轉錄因子，通過逆轉錄病毒將 上述4個轉錄因子導入胚胎小鼠成纖維細胞或成年小鼠尾部皮膚成纖維細胞， 在小鼠ES細胞的培養(yǎng)條件下獲得了 Fbxl5+的多潛能干細胞系，該細胞系在細 胞形態(tài)、生長特性、表面標志物、形成畸胎瘤等方面與小鼠ES細胞非常相似，而 在基因表達譜、DNA曱基化方式及形成嵌合體動物方面卻不同于小鼠ES細胞， 故將其命名為誘導的多能性干細胞(iPS細胞)。
2007年，Yamanaka研究小組進一步用Nanog代替Fbxl5進行篩選，得到了 Nanog+的iPS細胞系，該iPS細胞不僅在細胞形態(tài)、生長特性、標志物表達、 移植到小鼠皮下可形成包含3個胚層組織細胞結構的畸胎瘤等方面與小鼠ES 細胞非常相似，而且在DNA曱基化方式、基因表達譜、染色質狀態(tài)、形成嵌合 體動物等方面也與小鼠ES細胞幾乎完全相同。此外，研究還發(fā)現(xiàn)重新激活原癌 基因c-Myc是嵌合體動物出現(xiàn)腫瘤形成的原因；而轉染的上述4個基因在iPS細 胞中并沒有表達，表明這些基因只在誘導過程中起作用，iPS細胞保持多潛能性 狀態(tài)的原因是內源性轉錄因子Nanog基因的表達。同時獨立發(fā)表的另 一篇來自 美國科學家的研究論文同樣證實了上述4個轉錄因子足以使小鼠成纖維細胞在 體外誘導重構成為類似小鼠ES細胞的iPS細胞。
新近報道了小鼠肝細胞和胃上皮細胞同樣也可被重構成為iPS纟田胞，遺傳學細胞譜系示蹤分析顯示，iPS細胞源自i普系定型的體細胞的直接重構，而未發(fā)現(xiàn) 逆轉錄病毒整合到特定的基因位點與細胞核重構相關。
還有研究者利用相同的技術，將上述同樣的4個轉錄因子導入到人類皮膚 成纖維細胞中，也成功獲得了 iPS細胞。原代人類成纖維細胞樣滑膜細胞和源自 新生兒成纖維細胞的細胞系同樣也可被重構成為iPS細胞。這類iPS細胞在細胞 形態(tài)、增殖能力、表面抗原標志、基因表達譜、多潛能干細胞特異性基因的表 觀遺傳學狀態(tài)、端粒酶活性等方面與hES細胞相似，并且在體外培養(yǎng)時和在小鼠 體內畸胎瘤形成中均可分化為3個胚層的不同細胞類型。與此同時，威斯康辛大 學Thomson研究小組也報道了成功誘導胎兒成纖維細胞轉化為具有hES細胞 基本特征的人類iPS細胞，所不同的是他們使用慢病毒作為載體，并在14個候選 基因中選擇了 Oct4、 Sox2、 Nanog、 Lin28等4個基因進行轉導。
Park IH等人利用來自胎兒、新生兒及成人的皮膚或肺部的原代成纖維細胞， 其中包括來自l名健康男性皮膚活檢得到的成纖維細胞，采用Yamanaka研究小 組的策略也獲得了相同的結果。他們還發(fā)現(xiàn)Oct4和Sox2在誘導重構為iPS細 胞過程中是必需的，正是這兩個轉錄因子維持了人類iPS細胞的多潛能性，而 Kif4和c-Myc的作用是改變染色質的結構，從而有利于Oct4和Sox2的結合， 以提高誘導的效率。此外，這項研究的重要意義在于將取自皮膚活檢的成纖維細 胞誘導為iPS細胞。上述研究表明，從活檢人類皮膚組織中提取體細胞后進行誘 導以制備患者特異性的干細胞是可行的，因而有望克服細胞移植治療中存在的 免疫排斥反應。鑒于導入c-Myc基因可使嵌合體小鼠的腫瘤發(fā)生率高達20%，可 能會阻礙其未來的臨床應用。因此,Yamanaka研究小組新近報道，小鼠和人類皮 膚成纖維細胞轉染c-Myc以外的其余3個基因，在調整培養(yǎng)條件后也可得到iPS 細胞。去除c-Myc基因盡管可使未來臨床應用的安全性顯著提高，但形成iPS細 胞的效率卻明顯降低。雖然嵌合體小鼠在100天內沒有腫瘤發(fā)生，但逆轉錄病毒 的再激活仍有導致腫瘤發(fā)生的潛在風險。同樣，慢病毒轉染技術可能也存在類似 的風險。
盡管科學家們在人類ES細胞方面做出了顯著的成績，但從ES細胞，或者說iPS細胞到可以移植的組織和器官，路途仍然艱辛而遙遠。從另一個角度來講， 部分科學家已經開始尋找可以直接移植的器官。但由于人體器官來源的局限性， 其它物種的器官開始進入研究者的視野中，而豬就是其中一個典型的例子。由 于豬在器官體積及生理方面與人的相似性，在過去的幾十年中，對于豬的科學 研究已經取得了可喜進步。由于ES細胞可作為良好的研究模型，許多科學家曾 嘗試分離豬的ES細胞，但都以失敗而告終。因此，目前對于豬細胞的遺傳操作 都基于核移植技術。但由于核移植對于細胞核的重編程不徹底，因此即使產生 后代，其也多有畸形，且核移植操作繁瑣，周期長，因此效率低、費時費力。 此外，將人類iPS細胞應用到臨床之前，安全問題，即成瘤性問題需要被嚴格檢 測。由于小鼠的壽命較短，而猴的飼養(yǎng)又較為困難。因此，豬作為另一個可候 選的生物模型來檢測iPS安全性，極具應用前景。

發(fā)明內容
為克服上述技術缺陷，本發(fā)明的目的是提供用豬成纖維細胞生成誘導的多 能' 性干細胞的方法。
為實現(xiàn)該目的，采用如下技術方案
本發(fā)明的用豬成纖維細胞生成誘導的多能性干細胞的方法包括如下步驟
(1) 用包含多能性干細胞因子的cDNA導入豬成纖維細胞；
(2) 培養(yǎng)步驟(1)得到的豬成纖維細胞；
(3) 鑒定多能性干細胞克隆。
所述多能性干細胞因子為對于干細胞多能性維持關4建的因子。 所述多能性干細胞因子包括Oct4、 Sox2、 Soxl、 C-myc、 L-Myc、 N-Myc、 Klf4、 Klf5和Klf2中的一種或多種。
其中，所述多能性因子為對于干細胞多能性維持關鍵的因子，優(yōu)選地，所 述的多能性因子包括Oct4、 Sox2 (任選地，Soxl)、 C-myc (任選地L-Myc或 N-Myc),以及Klf4(任選地，Klf5或Klf2 )。最優(yōu)選地，所述多能性因子包括 Oct4、 Sox2、 C-myc以及Klf4。上述多能性因子可以是任何來源的，優(yōu)選為小鼠和人的多能性因子以及其變體，如Sox2, NCBI登錄號為NM_011443.3 (小 鼠)和NM—003106.2 (人)；Oct4, NCBI登錄號為NM—013633.2 (小鼠)和 NM—002701.4(人)；Klf4， NCBI登錄號為NM—010637.2(小鼠)和NM—004235.4 (人)；c-Myc， NCBI登錄號為NM—010849.4 (小鼠)和NM—002467.3 (人)； Soxl， NCBI登錄號為NM_009233,3,(小鼠)和NM—005986.2 (人)；KIG, NCBI登錄號為NM_008452.2 (小鼠)和NM—016270.2 (人)；Klf5, NCBI登錄 號為NM—009769.4 (小鼠)和NM—001730.3 (人)。C-Myc還可以被換為其突變 體L-myc (登錄號為NM_008506.2 (小鼠)和NM_001033081.1 (人))；或者 N-Myc (登錄號為NM—008709.3 (小鼠)和NM—005378.4 (人))。
本發(fā)明所述的"誘導的多能性干細胞(iPS細胞)"是這樣的細胞，其在ES 細胞培養(yǎng)條件下，與ES細胞在細胞形態(tài)、生長特性、表面標志物表達、移植到 皮下可形成包含3個胚層組織細胞結構的畸胎瘤等方面與人ES細胞非常相似。 本文所述的術語"誘導重編程"是指將體細胞去分化為多能性干細胞的過程。 優(yōu)選地，通過將維持干細胞多能性所需的多能性因子cDNA導入體細胞可以誘 導體細胞去分化成為多能性干細胞。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果
與現(xiàn)有技術公開的其它可以被誘導為iPS的細胞不同，本發(fā)明中由豬成纖維 細胞誘導形成的iPS細胞，為該物種的進一步研究提供了良好的細胞模型。鑒于 目前仍然沒有分離得到豬ES細胞，豬iPS細胞為遺傳操作提供了便利，可以進 一步開展分化研究及疾病模型的建立。此外，還可以以豬為模型檢測iPS細胞的 安全性問題，為優(yōu)化iPS誘導策略，加速人類iPS細胞的臨床應用提供科學數(shù)據(jù)。 本發(fā)明利用外源基因高表達的方式，將豬成纖維細胞誘導為干細胞樣細胞(iPS )， 并證明了其具有分化多能性，為該物種的進一步科學研究提供了良好的細胞模 型。同時，本發(fā)明基于iPS技術，成功誘導了ES樣細胞，具有體外分化潛能， 易于基因操作，為科學研究提供了良好的平臺。


圖l是豬成纖維細胞iPS誘導過程的示意圖； 圖2是豬iPS細胞系的形態(tài)示意圖和外源基因整合分析； 圖3是豬iPS細胞系的多能性標記鑒定圖； 圖4是豬iPS細胞系畸胎瘤分化鑒定和核型分析。
具體實施例方式
為使本發(fā)明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應 理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
除非另外指明，本發(fā)明的實踐將使用分子生物學、微生物學、細胞生物學、
免疫學和重組DNA的傳統(tǒng)技術，其屬于本領域技術范圍。參見例如，Sambrook, Fritsch和Maniatis ，分子克隆實驗指南，第3版(2002); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel等人編著(1987));叢書METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR2: A PRACTICAL APPROACH (M丄MacPherson, B.D. Hames和G.R. Taylor編著，(1995))， Harlow和Lane編 著，(1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL and ANIMAL CELL CULTURE (R.I.Freshney編著，(1987)); W. French Anderson等人，HANDBOOK 。FSTEMCEIXS,巻2。
本發(fā)明的用豬成纖維細胞生成誘導的多能性干細胞的方法的優(yōu)選實施例的 過程如下，圖l為從體外轉染到獲得iPS克隆的豬iPS細胞系IPS誘導過程概覽。使 用5天大的西藏小型豬，與我們實驗使用的品系類似，如圖左所示。獲得使用GFP 對照逆轉錄病毒和SKOM感染后6天的豬胚胎成纖維細胞，在特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 使用熒光顯微鏡觀察到GFP有100。/。的感染率。早期的典型形態(tài)改變(與人和鼠 的iPS誘導類似，細胞變得圓而緊密)只出現(xiàn)在SKOM感染的細胞克隆中。具體 過程如下
細胞培養(yǎng)
分離豬胚胎成纖維細胞，37天的胚胎在HEPES緩沖液培養(yǎng)基中攪碎，39 °C 膠原酶消化4小時。用吸液管多次吹打混合，用PEF培養(yǎng)基1: l稀釋(DMEM-高葡萄糖，青霉素/鏈霉素雙抗，以及10。/。Hyclone胎牛血清)。樣品在700rpm轉 速下離心10分鐘，在PEF培養(yǎng)中集中吹打重懸。只有早期的幾代細胞用于iPS誘 導。用絲裂霉素C處理過的鼠胚胎成纖維細胞作為滋養(yǎng)層細胞。HEK293T細胞用 作逆轉錄病毒的包裝細胞系。以上3種細胞型均在與豬胚胎成纖維細胞相同的細 胞中培養(yǎng)。所有細胞一直在39t:培養(yǎng)(逆轉錄病毒包裝及感染除外)。 逆轉錄病毒感染
使用含有Sox2、 Klf4、 Oct4、 c-Myc的pMX質粒和EGFP的質粒以及人因子 的質粒(購自Adgene )。 HEK293T細胞使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉染。 2輪(一次24小時)，停止轉染后收集上清液，過濾(0.45m微孔直徑)，加入到提前 一天分離的豬胚胎成纖維細胞中；加入聚凝胺(8g/ml， Sigma)以提高轉染效率。 iPS細胞培養(yǎng)基成份為DMEM-高糖，抗生素，谷氨酰胺(2mM, Gibco)，丙酮酸鹽 (2mM,Gibco)，非必須氨基酸(1%, Gibco)， beta巰基乙醇(0.1 mM, Sigma), bFGF(4ng/ml， Invitrogen)， Lif (1000U/ml，Millipore)以及15%提純胎牛血清(dFBS， Hyclone)。 iPS克隆先使用巴氏吸管傳代，然后使用中性蛋白酶(lmg/ml,Invitrogen) 傳代，iPS誘導和維持的培養(yǎng)基每日更新。
相關結果見圖2-4，圖2中，圖2A為豬iPS細胞形態(tài)圖，由圖可見，第16天出現(xiàn) 與胚胎干細胞(ESC)類似的克隆，并觀察到多種非ESC形態(tài)的其他類型細胞。 圖2B為挑取單克隆的圖片，在多次傳代后，豬iPS克隆仍然保持最初的形態(tài)，并 且呈現(xiàn)AP染色陽性。圖2C是半定量RT-PCR的凝膠電泳圖，顯示外源的鼠或者人 因子成功整合進了豬iPS的基因組DNA中，包括了陽性對照(C+，病毒感染6天的 MEF)對照和陰性對照(未被感染的PEF)。DNA抽提使用Wizard 基因組DNA純 化試劑盒(Promega)。檢測鼠外源因子整合進基因組的引物和衡量基因沉默的引 物相同(如下)。用于人因子的引物如下
pMX載體
上游引物5，-GCCGACACCAGACTAAGAACCTAGAACCTC-3,， human Sox2上游引物5，-CTTGGCTCCATGGGTTCG-3，， human Oct4上游引物5，-GAGAACCGAGTGAGAGGCAAC-3，，human Klf4上游引物5 ，-TCTCTTCGTGCACCCACTTG-3 ，，
human c-Myc上游引物5，-AGAGTCTGGATCACCTTCTGCTG -3,。
圖2D是TERT基因的實時定量RT-PCR結果，與未感染的PEF比較，顯示在才兆 選的豬ips克隆中得到高表達。熒光定量PCR使用SYBR Green (Takara)和ABI 7300儀器，數(shù)值使用18S標準化。引物如下
反相端粒酶逆轉錄酶(TERT, NCBI NO:AY785158):
上游引物5'-TGCTCGCCAACGTTTACA-3，；
下游引物5 ，-CAAGCCGGAGGAAAAATG-3 ，；
18S(NR_002170):
上游引物5，-ACCCACGGAATCGAGAAA-3，； 下游引物5 ，-GCCTGCGGCTTAATTTGA-3 ，。
豬iPS細胞使用的是豬iPS克隆的第9代(mouse SKOM)和15代(human SK。M)。
圖3A為免疫熒光顯微觀察。iPS細胞系在有滋養(yǎng)層細胞包被的載玻片中生長 2-3天，然后使用4%多聚曱醛固定。玻片使用Triton X100通透，然后使用封閉試 劑(含5。/。FBS的PBS溶液)孵育30分鐘?？筍SEA4的抗體以及二抗(山羊抗鼠 TRITC)分別購于Invitrogen以及中山金橋生物技術有限公司，抗Nanog和Rexl的抗 體購自Abcam。室溫一抗一個小時以上，二抗一小時或少于一小時。DAPI購自 Sigma，蓋玻片用甘油和指曱油封片至于載玻片上，使用常規(guī)的熒光顯微鏡觀察。 結果顯示iPS克隆表達ES細胞多能性標記SSEA4， Nanog和Rexl。
圖3B為半定量RT-PCR鑒定多能性標記。使用Trizol(MRC)提取RNA。反 轉錄的半定量PCR使用降落PCR技術和LA Taq聚合酶(Takara)。豬序列的引物 如下
外源的Sox2 (NCBI accession number畫_001123197) 上游引物5'-GGTTACCTCTTCTTCCCACTCCA-3，； 下游引物5 ，-CAAAAATAGTCCCCCCAAAAGAAG-3 ，； Nanog(顧—001129971):上游引物5，-CTTATTCAGGACAGCCCTGATTCTTC-3，； 下游引物5，- AAGACGGCCTCCAAATCACTG誦3,; Lin28(NMJ)01123133):
上游引物5，-TCAACGTGCGCATGGGGTTCGGCTTCCTGT-3，； 下游引物5, - GTGGACGTCTTTGTGCACCAGAGTAAGCTG誦3 ，； beta actin (AY550069):
上游引物5，-CCGTGAGAAGATGACCCAGATCATGT-3，；
下游引物5 ，-CGTGATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3 ，；
Sox2、 Lin2S和Nanog擴增子克隆進pMD18-T (TAKARA)并測序。證明與 預測序列100%吻合，此外在NCBI和Sanger豬基因組數(shù)據(jù)庫中沒有其他可吻合序 列。用5-azad處理含有人因子C13和C17iPS克隆沒有進一步增加ESC marker的表 達(如圖右所示)。使用豬iPS克隆的第9代(鼠SKOM)和第15代(人SKOM)。
圖3C為外源轉基因沉默程度檢測，其引物為
pMX載體上游引物 5，-GCCGACACCAGACTAAGAACCTAGAACCTC-3，，
mouse Sox2下游引物5 ，-GCTTCAGCTCCGTCTCCATCATGTTATACAT-3 ，, mouse Oct4下游引物5 ，-AGTATGCCATCCCTCCGCAGAACTCGTATG-3 ，，
mouse Klf4下游引物5，- AGGATAAAGTCTAGGTCCAGGAGGTCGTTG-3'，
mouse c-Myc下游引物5，-AGTCGTAGTCGAGGTCATAGTTCCTGTTGG-
3，，
human Sox2下游引物5，-TGACCACCGAACCCATGGAGCCAAGAG-3，， humanOct4下游引物5，-GTTGCTCTCCACCCCGACTCCTGCTTC-3，， human Klf4下游引物5 ，-GGAGGATGGGTCAGCGAATTGGAGAGA-3 ，， human c-Myc下游引物5 ，-AGGACGGAGAGAAGGCGCTGGAGTCTTG-3，。
半定量RT-PCRs使用上述的逆轉錄樣品。使用半定量RT-PCR檢測顯示挑 選的iPS細胞系與對照感染細胞的mRNA產物相比有低程度的沉默，水作為PCR反應的的陰性對照。
圖4是豬iPS細胞系具有多能性的分析圖。圖4A表示在免疫缺陷的小鼠中形 成的畸胎瘤分化成了3個胚層。豬iPSCs使用中性蛋白酶收獲，IOO萬個細胞皮下 注射進棵鼠的拱側翼。8-9周后，小鼠被處死，畸胎瘤嵌入石蠟中，使用 hematoxilin/eosin切片染色后進行組織結構上地分析。使用細胞系為hs SKOM C13 (第16代)和hsSKOMC17(第16代)。圖4B為iPS細胞的核型分析。細胞在 培養(yǎng)瓶(Coming,美國)中培養(yǎng)至指數(shù)生長期，加入^C水仙素(Dahui biotech)終濃 度50pg/ml，然后細胞用胰蛋白酶處理，2,000 rpm離心5min，在8ml的0.075M KC1重懸，在37。C中孵育20分鐘。加入固定液(由1份醋酸和3份曱醇)至10ml,輕 柔混合，37。C孵育10分鐘。離心，并棄上清，加入冰凍固定溶液(由1份醋酸和3 份曱醇)至10ml。細胞由高處滴落至水凍載玻片，75。C孵育3h。顯帶時用胰蛋 白酶和著色劑處理，并且用01ympusBX51顯微鏡分析分裂中期的狀態(tài)。通過核 型分析顯示出，兩個不同的人SKOMips細胞系(第18代)擁有與對照組PEF細 胞等量的染色體(19對)。
最后應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非對本發(fā) 明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領域的普 通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不 脫離本發(fā)明技術方案的實質和范圍。
權利要求
1、一種用豬成纖維細胞生成誘導的多能性干細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)用包含多能性干細胞因子的cDNA導入豬成纖維細胞；(2)培養(yǎng)步驟(1)得到的豬成纖維細胞；(3)鑒定多能性干細胞克隆。
2、 根據(jù)權利要求1所述的用豬成纖維細胞生成誘導的多能性干細胞的方法， 其特征在于，所述步驟(2)與所述步驟(3)之間可以包括如下步驟感染后第16天，選擇與hES相似的ES樣克隆擴大培養(yǎng)。
3、 根據(jù)權利要求1或2所述的用豬成纖維細胞生成誘導的多能性干細胞的 方法，其特征在于，所述多能性干細胞因子為對于干細胞多能性維持關鍵的因 子。
4、 根據(jù)權利要求3所述的用豬成纖維細胞生成誘導的多能性干細胞的方法， 其特征在于，所述多能性干細胞因子包括Oct4、 Sox2、 Soxl、 C-myc、 L-Myc、 N-Myc、 Klf4、 Klf5和Klf2中的一種或多種。
5、 用權利要求1或2所述的用豬成纖維細胞生成誘導的多能性干細胞的方 法得到的多能性干細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了用豬成纖維細胞生成誘導的多能性干細胞的方法。該方法包括如下步驟(1)用包含多能性干細胞因子的cDNA導入豬成纖維細胞；(2)培養(yǎng)步驟(1)得到的豬成纖維細胞；(3)鑒定多能性干細胞克隆。本發(fā)明成功誘導了ES樣細胞，具有體外分化潛能，易于基因操作；本發(fā)明的豬iPS細胞為遺傳操作提供了便利，可以進一步開展分化研究及疾病模型的建立；還可以以豬為模型檢測iPS細胞的安全性問題，為優(yōu)化iPS誘導策略，加速人類iPS細胞的臨床應用提供科學數(shù)據(jù)。
文檔編號C12N15/867GK101613717SQ20091003874
公開日2009年12月30日 申請日期2009年4月17日 優(yōu)先權日2009年4月17日
發(fā)明者彭梅秀, 徐建勇, 楊佳銀, 米蓋爾·埃斯特班, 裴端卿, 賴良學 申請人:中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院