專利名稱：微小RNA-181a前體的類似物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微小RNA及其應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及微小RNA-181(microRNA-181a)前體的類似物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
microRNAs (miRNA)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類長約22個核苷酸具有 調(diào)控功能的非編碼RNA，與siRNA不同，miRNA是內(nèi)源性的，成熟的miRNA 是從70 100 nt的發(fā)夾形前體miRNA (pre-miRNA)由RNase III Dicer酶切而 來。研究表明miRNA和相應(yīng)的靶mRNA的3'端非翻譯區(qū)(3'-untranslated region,3，UTR)互補(bǔ)，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。近年來發(fā)現(xiàn)，miRNA在基 因調(diào)控表達(dá)領(lǐng)域中起超乎想象的重要作用，研究人員推測miRNA調(diào)節(jié)著人類 三分之一的基因[Maziere P, Enright AJ: Prediction of microRNA targets. Drug Discovery Today.2007, 12(11-12):452-458; Shi L, Cheng Z， Zhang J, Li R, Zhao P， Fu Z， You Y. hsa-mir-181a and hsa-mir-181b flmction as tumor suppressors in human glioma cells. Brain Res, 2008 Oct 21;1236:185-93.]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA與 腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切關(guān)系。當(dāng)某些miRNA在腫瘤中表達(dá)升高時(shí)，可能扮演 著癌基因的角色。相反，某些miRNA在腫瘤中表達(dá)降低，可能作為抑癌基因而 發(fā)揮作用。miRNA-181a在一些腫瘤中具有類似于抑癌基因的功能，可調(diào)節(jié)腦 腫瘤細(xì)胞生長[Chien Y， White MA: RAL GTPases are linchpin modulators of human tumour-cell proliferation and survival. EMBO Rep. 2003, 4(8):800畫806.]， 但在白血病中的還不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
申請人在前期研究中通過生物信息學(xué)軟件與生物芯片的方法預(yù)測出 miR-181a (Lui WO, Pourmand N， Patterson BK， Fire A. Patterns of kno， and novel small RNAs in human cervical cancer. Cancer Res, 67:6031-6043(2007).)的 候選靶基因RalA。 RalA是小G蛋白Ral家族中的一員，涉及腫瘤發(fā)生、侵襲、 和轉(zhuǎn)移，尤其在腫瘤發(fā)生過程中起重要作用[Lim KH, O'Hayer K， Adam SJ,Kendall SD, Campbell PM, Der CJ， Counter CM: Divergent roles for RalA and RalB in malignant growth of human pancreatic carcinoma cells. Curr Biol. 2006, 16(24):2385-2394; Lim KH, Baines AT, Fiordaiisi JJ, Shipitsin M， Feig LA， Cox AD， Der CJ, Counter CM: Activation of RalA is critical for Ras-induced tumorigenesis of human cells. Cancer Cell,2005， 7(6):533-545; Bodemann BO, White MA: Ral GTPases and cancer: linchpin support of the tumorigenic platform. Nat Rev Cancer. 2008， 8(2): 133-140; Chien Y， White MA: RAL GTPases are linchpin modulators of human tumour-cell proliferation and survival. EMBO Rep. 2003,4(8):800國806.]。
本發(fā)明的目的首先是提供一種針對靶基因RalA的miRNA-181a前體的類 似物，通過該類似物來研究miRNA-181a的耙基因和用于白血病治療和預(yù)防的 能力。本發(fā)明證明該類似物能有效的抑制RalA基因的表達(dá)，并能直接或間接 地抑制白血病腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和生長。
為達(dá)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是首先提供了一種miRNA-181a前體 的類似物，其具有如下的序列
正義鏈(SEQIDNo.l) : 5'-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3';
反義鏈(SEQIDNo.2) : 5'-UCACCGACAGCGUUGAAUGUUGU-3'。
本發(fā)明的miRNA-181a前體的類似物可以經(jīng)過本領(lǐng)域任何已知的保護(hù)性 修飾。
本發(fā)明選擇miRNA-181a的序列信息為切入點(diǎn)，通過生物信息學(xué)軟件與生 物芯片的方法預(yù)測出miR-181a的候選靶基因RalA。通過設(shè)計(jì)miRNA-181a前 體的類似物，研究其對腫瘤細(xì)胞生長和凋亡的影響。結(jié)果表明本發(fā)明的 miRNA-181a前體的類似物明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長。并可能是通過抑制癌基 因RalA的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。由于上述的前體類似物是在體內(nèi)降解成成熟態(tài)的 miRNA-181a起作用的，故具有其成熟態(tài)序列的miRNA-181a (SEQIDNo.3) 以及不影響其主要功能該成熟態(tài)miRNA-181a的修飾物均具有直接或間接抑 制白血病腫瘤的發(fā)生生長的作用，可用于制備預(yù)防或治療白血病的藥物。
上述藥物的形式可以是現(xiàn)有技術(shù)中的各種劑型，只要其活性成分包括本發(fā) 明的miRNA-181a前體的類似物、其成熟態(tài)miRNA-181a或不影響它們主要功 能的修飾物。上述藥物可以包含一種組合物，該組合物包括本發(fā)明的miRNA-181a前體 的類似物、其成熟態(tài)或不影響它們主要功能的修飾物。當(dāng)然還可以包括可藥用 的載體，輔劑等其它組分。
上述藥物可以和一種或幾種醫(yī)學(xué)上已知的治療藥物組合使用，例如，與其 他化療藥物/劑組合使用。
本發(fā)明相對現(xiàn)有技術(shù)的有益效果
申請人確認(rèn)了 miRNA-181a的靶基因?yàn)樵谀[瘤發(fā)生過程中起重要作用的 RalA，由此設(shè)計(jì)了miRNA-181a前體的類似物，并證明其抑制白血病細(xì)胞發(fā)生 和生長的作用，由此提示成熟的miRNA-181a、不影響其主要功能的修飾物或 者本發(fā)明提供的miRNA-181a前體的類似物具有制備預(yù)防或抗白血病的藥物 的潛力。


圖1是miR-181 a前體的類似物抑制k562細(xì)胞活力的量效關(guān)系。
圖2是miR-181a前體的類似物對k562細(xì)胞的生長抑制率。
圖3是miR-181a前體的類似物抑制k562細(xì)胞生長的時(shí)效關(guān)系(100nmol/L)。
圖4是SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR檢測候選耙基因RALA mRNA相對表達(dá)水平。
具體實(shí)施例方式
為更好的說明本發(fā)明的實(shí)施方式，但是具體實(shí)施方式
并不在任何意義上構(gòu) 成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。 1、材料和方法 1.1 miRNAs的設(shè)計(jì)與合成-
通過在線的Sanger miRNA registry數(shù)據(jù)庫(http:〃microrna.sanger.ac.uk)獲取 人miR-181a成熟序列信息，設(shè)計(jì)雙鏈的miRNA前體類似物，其序列信息(23 bp) ， sense: 5'垂AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3'; antisense:5'-UCACCGACAGCGUU GAAUGUUGU-3'。用隨機(jī)序列的RNA雙鏈 作隨機(jī)(scramble, SCR)對照，miRNA和隨機(jī)雙鏈RNA由廣州市銳博生物科技有 限公司合成，-2(TC保存。 1.2細(xì)胞培養(yǎng)
將K562細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10。/。新生牛血清、無抗生素的DMEM/Fu
5培養(yǎng)基中，置于37、體積分?jǐn)?shù)為5%的(302培養(yǎng)箱，飽和濕度下培養(yǎng)。每2-3天 換液傳代。實(shí)驗(yàn)選用對數(shù)生長期、0.2%臺盼藍(lán)拒染率>95%的細(xì)胞。 1.3 MTT法測細(xì)胞增殖抑制率
實(shí)驗(yàn)分miR-181a組、隨機(jī)對照組和空白對照組，每個組設(shè)4個復(fù)孔。 miR-181a組和隨機(jī)對照組的核酸終濃度為25、 50、 75、 100、 125nmol/L。取對 數(shù)生長期細(xì)胞，各組細(xì)胞以lxl()S/ml的密度接種于96孔板，每孔50ul，轉(zhuǎn)染體積 100ul (轉(zhuǎn)染方法參照Invitrogen公司LipofectamineTM2000說明書)，空白對照 組加入與藥物等體積的DMEM/F,2培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染6h后，加入100ul含20。/。血清培 養(yǎng)基，使終體積200ul。 48小時(shí)后每孔加入MTT液20ul，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí) 后，1000rpm/min離心10min，棄上清，每孔加入150ul二甲基亞砜(DMSO)。
震蕩使結(jié)晶充分溶解，在多功能酶標(biāo)儀上測定吸光度^7。nm,以A^間接反映存 活細(xì)胞量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，計(jì)算增殖抑制率。增殖抑制率-[l- (A^ffl/A,
組)]xl00%。
1.4臺盼藍(lán)拒染法檢測不同段時(shí)間細(xì)胞的生長狀況
實(shí)驗(yàn)分組及轉(zhuǎn)染處理同前，miR-181a組和隨機(jī)對照組的核酸終濃度為 100nmol/L。于24、 48、 72小時(shí)將每組細(xì)胞充分混勻后用臺盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)每 組活細(xì)胞數(shù)，重復(fù)3次，取均值。
1.5 SYBR-Green real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染miR-181a前體的類似物后K562細(xì)胞 中候選耙基因RalAmRNA相對表達(dá)水平。
實(shí)驗(yàn)分組同前，各組細(xì)胞以1.5xl()S/ml的密度接種于24孔板，每孑L400ul， 轉(zhuǎn)染終體積500ul。 6小時(shí)后加入500ul 20%的血清培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 miR-181a組和隨機(jī)對照組的核酸終濃度為100nmol/L。于48小時(shí)收集細(xì)胞，總 RNA抽提按Trizol試劑(Invitrogen公司)說明書進(jìn)行，提取的總RNA用紫外分光 光度儀(UVPupland, USA)測A26(/A28Q進(jìn)行RNA純度及濃度計(jì)算，利用SYBR Green I染料檢測白血病K562細(xì)胞中候選耙基因RalA的mRNA表達(dá)水平，以 GAPDH為內(nèi)參。逆轉(zhuǎn)錄條件37。C持續(xù)lh, 95"C持續(xù)5min。 Real-time PCR條件 ①94。C持續(xù)5min，②94。C持續(xù)30s，③RalA56。C; GAPDH57.5。C持續(xù)30s， 72°C 持續(xù)30s，⑤plate read,⑥Go to step 2， 39 more times,⑦M(jìn)let-curve analysis, 60。C to 95°C, 0.3°C/read 1 sec hold。 PCR所用引物自行設(shè)計(jì)，由上海生工技術(shù)有限公 司合成，RalA上游引物(SEQ ID No.4 ): 5'-ATCGGAAGAAGGTAGTGC-3'，下游引物(SEQ ID No.5 ): 5'-AAATCTGCTCCCTGAAGT-3'; GAPDH上游引物(SEQIDNo.6): 5'-CAACGGATTTGGTCGTATT-3'，下游引物(SEQIDNo.7): 5'-CACAGTCTTCTGGGTGGC-3'。 RalA和GAPDH的擴(kuò)增片段長度分別為182 bp和541 bp。 RalAmRNA的相對表達(dá)水平用ACr和rA"T計(jì)算。 1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(xb)表示，采用完全隨機(jī)設(shè) 計(jì)的單因素方差分析法(one-way ANOVA)分析各組數(shù)據(jù)間差異的顯著性。 以尸O.05為有顯著性差異。 2、實(shí)施效果
2.1 MTT法檢測miR-181a前體類似物對細(xì)胞的生長抑制作用的量效效應(yīng)及抑 制率
miR-181前體的類似物在48h可有效抑制K562細(xì)胞增殖活力，終濃度 lOOnmol/L時(shí)作用最佳，且細(xì)胞毒性小，隨著濃度的增大，抑制效應(yīng)增強(qiáng)，但 毒性增加，與隨機(jī)對照組和空白對照組相比有顯著差異(P0.05)(圖1， 2)。 2.2臺盼蘭拒染法檢測miR-181a前體的類似物對細(xì)胞的生長抑制作用的時(shí)間 效應(yīng)
終濃度100nmol/L的miR-181a前體的類似物作用于k562細(xì)胞后48小時(shí) 開始表現(xiàn)出生長抑制效應(yīng)，持續(xù)至72小時(shí)，與隨機(jī)對照組和空白對照組相比 有顯著差異(PO.05)(圖3)。
2.3 SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR檢測miR-181a前體的類似物作用于K562細(xì)胞 后候選靶基因RalA mRNA相對表達(dá)水平
如圖4所示，SYBR Greenl實(shí)時(shí)定量PCR顯示終濃度100nmol/L的 miR-181a前體的類似物作用于k562細(xì)胞后48小時(shí)，RalA mRNA的相對表達(dá)水 平顯著降低，GAPDH作為內(nèi)參，與隨機(jī)對照組和空白對照組相比有顯著差異 (P<0.05)。
在不表達(dá)或低表達(dá)miR-181a的白血病K562細(xì)胞中，本實(shí)驗(yàn)將化學(xué)合成 的外源性miR-181a前體的類似物導(dǎo)入細(xì)胞，模擬miR-181a在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)， 通過MTT和臺盼藍(lán)的方法檢測K562細(xì)胞生長，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-181a前體的類 似物明顯抑制細(xì)胞生長。使用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證候選靶基因RalAmRNA相對表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)添加了 miR-181a前體的類似物的組RalA的表達(dá)水平與對照組 相比明顯降低(P0.05)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miRNA-181a前體的類似物對白血 病k562細(xì)胞具有生長抑制作用，并可能是通過抑制癌基因RalA的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的， 對腫瘤基因治療具有潛在價(jià)值。由于miR-181a前體的類似物是在細(xì)胞內(nèi)被降 解成miR-181a的成熟態(tài)起作用的，我們因而能夠證明miR-181a (包括其具有 相同或類似功能的修飾物)及其前體具有同樣的藥用價(jià)值。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí) 施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、 替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCE LISTING
〈110〉 暨南大學(xué)
<120>微小RNA-181a前體的類似物及其應(yīng)用
〈130〉 090429
<160> 7
<170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211> 23
<212> RNA <213〉人工序列
〈220〉
〈221> misc_RNA
〈222〉 (l),.咖
<223> miRNA-181a前體的類似物的正義鏈
〈400> 1
aacauucaac gcugucggug agu 23
<210〉 2<211> 23 〈212〉 RNA 〈213>人工序列
<220〉
<221〉 misc—腿
〈222〉 (1).. (23)
<223〉 miRNA-181a前體的類似物的反義鏈
<400> 2
ucaccgacag cguugaaugu ugu 23
〈210> 3
<211> 23
<212> ■
<213〉 Homo sapiens
〈220>
<221〉 misc—腿
<222> (l)..咖
〈223〉 人miR-181a成熟態(tài)序列
〈400> 3
aacauucaac gcugucggug agu 23〈210〉 4
〈211〉 18
<212> 腿 <213〉人工序列
<220>
〈221〉 misc—feature
<223〉 RalA上游引物
<400> 4
atcggaagaa ggtagtgc
<210> 5
〈211〉 18
〈212〉 DNA <213>人工序列
<220>
〈221〉 misc—feature
<223〉 RalA下游引物
<400〉 5
aaatctgctc cctgaagt
說明書第9/10頁
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18〈211〉 19
<212〉 DNA <213>人工序列
<220>
〈221〉 misc一feature
<223〉 GAPDH上游引物
〈400〉 6
caacggattt ggtcgtatt
<210〉 7
〈211〉 18
〈212> DNA 〈213>人工序列
<220〉
<221> misc—feature
<223〉 GAPDH下游引物
<400> 7
cacagtcttc tgggtggc
說明書第10/10頁
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18
權(quán)利要求
1、一種微小RNA-181a前體的類似物，其特征在于是一種雙鏈RNA，具有如下的序列正義鏈5′-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3′；反義鏈5′-UCACCGACAGCGUUGAAUGUUGU-3′。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述微小RNA-181a前體的類似物在制備預(yù)防或治療白 血病的藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述藥物的活性成分包括所述的微小 RNA-181a前體的類似物。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述微小RNA-181a前體的類似物在制備預(yù)防或治療白 血病的藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述藥物的活性成分包括所述微小 RNA-181a前體的類似物的成熟態(tài)微小RNA-181a，具有如下的序列5'-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3'。
4、 一種組合物，其特征在于包括權(quán)利要求l所述的微小RNA-181a前體 的類似物。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于還包括能夠藥用的載體。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述組合物在制備預(yù)防或治療白血病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及微小RNA，具體涉及一種微小RNA-181a前體的類似物及其在制藥中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種微小RNA-181a前體的類似物，序列如SEQ No.1和2所示。將其在白血病細(xì)胞中表達(dá)后，細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞凋亡明顯增加，基因RalA的表達(dá)大幅下降。該微小RNA-181a前體類似物及其成熟態(tài)的微小RNA-181a均可用于制備預(yù)防或治療白血病的藥物。
文檔編號C12N15/11GK101550415SQ20091003923
公開日2009年10月7日 申請日期2009年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月5日
發(fā)明者姚君琳, 李育敏, 林春燕, 嘉 費(fèi) 申請人:暨南大學(xué)