專利名稱：一種豬流感病毒實(shí)時(shí)熒光rt-pcr分型試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬流感病毒分型試劑盒，特別是涉及以一步法實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn) 錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)進(jìn)行豬流感病毒分型的試劑盒。本試劑盒具有很高的靈 敏度和特異性，通過(guò)本發(fā)明的試劑盒對(duì)呼吸道樣本、血清、肺組織等樣品中的豬流感病毒進(jìn) 行分型，從而實(shí)現(xiàn)豬流感病毒的早期快速診斷，監(jiān)控其流行趨勢(shì)。
背景技術(shù)：
豬流感(Si)是一種因豬流感病毒引起的豬呼吸系統(tǒng)疾病，此病在世界各地都有 發(fā)生，危害嚴(yán)重，經(jīng)濟(jì)損失巨大，并對(duì)人類的健康構(gòu)成威脅。豬流感病毒(SIV)屬于正粘病 毒科(Orthomyxoviridae)，甲型流感病毒屬(Influenza virus Α)。典型病毒顆粒呈球狀， 直徑為SOnm 120nm，有囊膜。囊膜上有許多放射狀排列的突起糖蛋白，分別是血凝素HA、 神經(jīng)氨酸酶NA和M2蛋白。病毒顆粒內(nèi)為核衣殼，呈螺旋狀對(duì)稱，直徑為lOnm，它含核蛋白 (neucleoprotein,NP), 3禾中多聚酶蛋白(polymerase protein Ι,ΡΒΙ ；polymerase protein 2，PB2 ；polymerase protein A)和病毒單鏈RNA。豬流感病毒為單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組 約為13. 6kb，由大小不等的8個(gè)獨(dú)立片段組成。豬流感病毒能夠在多種動(dòng)物的細(xì)胞和雞胚 增殖。病毒具有血凝活性，但不同毒株的抗原性無(wú)明顯的區(qū)分。由于病毒受到抗體的壓力 很大，因此病毒的變異頻繁。盡管不同亞型之間可以組成很多種流感病毒血清型，但從豬身 上分離到四種主要的亞型Hmi、HlN2、H3N2和H3W，其中有三種亞型造成人感染，分別為 HlNU H1N2 和 H3N2。豬流感病毒在豬群中全年可以傳播，但多數(shù)暴發(fā)于秋季術(shù)期和冬季，具有高發(fā)病 率(幾乎100% )和低病死率(病死率< )的特點(diǎn)。豬流感病毒感染可使患病豬生產(chǎn)性 能下降，推遲上市；還可引起呼吸道細(xì)菌和病毒繼發(fā)或混合感染，使疫情更為嚴(yán)重，造成豬 只死亡。豬是人源、禽源和豬源流感病毒的惟一共同易感宿主，因此豬在禽-豬-人的流感 種間傳播過(guò)程中，起著中間宿主及多重宿主的作用，它能將豬流感病毒傳播給人或鳥類。美 國(guó)曾于1976年在新澤西州迪克斯堡的士兵中出現(xiàn)豬流感爆發(fā)，引起200多例病例，其中至 少4名士兵進(jìn)展成肺炎，1人死亡，該病毒與當(dāng)時(shí)從豬體內(nèi)分離的病毒相同，首次證實(shí)了在 自然條件下，豬流感病毒可從豬傳播給人。1988年，美國(guó)出現(xiàn)了豬流感人際間傳播的跡象， 接觸過(guò)一例豬流感病例的醫(yī)護(hù)人員中出現(xiàn)了輕微的流感樣疾病，并在血清中檢測(cè)出豬流感 抗體。2005年12月至2009年2月期間，美國(guó)共報(bào)道了 12例人感染豬流感病例，但均未出 現(xiàn)死亡。1999年10月，香港1名10月齡女嬰感染了豬流感病毒H3N2，現(xiàn)已完全康復(fù)。這 些年來(lái)，世界各地都有人感染豬流感病毒不同病毒株的報(bào)道，但并沒(méi)有大規(guī)模流行。2009年 3月，墨西哥及美國(guó)等部分地區(qū)暴發(fā)了人感染豬流感疫情，即甲型Hmi流感病毒感染，可以 人傳染人，可能出現(xiàn)全球性爆發(fā)流行的潛在危險(xiǎn)。人感染豬流感的潛伏期尚不明確，參照流感的潛伏期一般為1-3天。臨床癥狀與 流感相似，包括發(fā)熱、咳嗽、咽痛、軀體疼痛、頭痛、畏寒和疲勞等。有些人還會(huì)出現(xiàn)腹瀉和嘔 吐，甚至引起嚴(yán)重疾病(肺炎和呼吸衰竭)和死亡。人感染豬流感病毒后，現(xiàn)有資料表明，傳染期為發(fā)病前1天至發(fā)病后7天。若病例發(fā)病7天后仍有發(fā)熱癥狀，表示仍具有傳染性。 兒童，尤其是幼兒，傳染期可能長(zhǎng)于7天。豬作為流感病毒的“混合器”，在流感病毒跨種屬障礙而感染新宿主的過(guò)程中起著 重要的作用。由于豬上皮細(xì)胞具有唾液酸2，6-半乳糖苷和唾液酸2，3-半乳糖苷，人流感 病毒可與前者結(jié)合，而禽流感病毒與后者結(jié)合，因此，豬上皮細(xì)胞就能夠被人流感病毒和禽 流感病毒感染，而成為毒株間基因重組的活載體。1998年從美國(guó)北卡羅來(lái)納州分離到一株 H3N2亞型SIV，其HA，NA和PBl基因?yàn)槿诵土鞲胁《净?，M，NP和NS基因?yàn)樨i型流感病毒 基因，PB2、PA基因?yàn)榍菪土鞲胁《净颉?978年，日本暴發(fā)的H1N2 SIV是由Hmi和H3N2 基因重組而產(chǎn)生的新亞型。國(guó)內(nèi)從山東豬分離出H9N2流感病毒，分析可能是由雞和鴨流感 病毒重組的結(jié)果。繼H9N2亞型流感病毒1998年首次從豬群中分離到，研究表明，通過(guò)進(jìn)行 部分序列分析發(fā)現(xiàn)，豬源H9N2亞型與國(guó)內(nèi)分離的禽流感病毒高度同源。SI和人流感之間也 可以發(fā)生交叉感染和傳播。1978年，從臺(tái)灣的一個(gè)豬群中分離到了 H3N2亞型SIV，通過(guò)測(cè) 序發(fā)現(xiàn)，此病毒發(fā)生了人流感病毒和SI病毒基因片段的重組。2009年墨西哥和美國(guó)出現(xiàn)的 甲型Hmi流感病毒，被認(rèn)為該毒株包含有豬流感、禽流感和人流感三種流感病毒的基因片 斷。因此研究SIV在不同時(shí)間和地域的型別變化，開(kāi)展相應(yīng)的流行病學(xué)調(diào)查，可以預(yù) 測(cè)人流感的發(fā)展趨勢(shì)，具有深遠(yuǎn)的公共衛(wèi)生學(xué)意義。由于本病的流行和危害日益嚴(yán)重，因此 對(duì)SIV分型研究已成為國(guó)內(nèi)外獸醫(yī)界、醫(yī)學(xué)界和微生物學(xué)界的熱點(diǎn)之一。目前常用的豬流感病毒分型檢測(cè)方法包括1)血清學(xué)方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、熒光免疫法、血凝抑制試驗(yàn)等， 這些血清學(xué)的方法需要對(duì)樣本預(yù)先進(jìn)行雞胚或組織培養(yǎng)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)快速診斷，且需要相當(dāng) 完整的靶抗原和型特異性的免疫血清，操作步驟繁瑣。2)核酸檢測(cè)方法；包括RT-PCR方法，由于PCR技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異性 強(qiáng)等特點(diǎn)，可用于豬流感病毒分型檢測(cè)和分子流行病學(xué)調(diào)查等，是實(shí)現(xiàn)豬流感病毒快速分 型檢測(cè)的推薦方法?；蛐酒椒?，該方法具有快速、靈敏和通量高等優(yōu)點(diǎn)，但價(jià)格昂貴，不 利于大規(guī)模推廣。測(cè)序分型和全基因組測(cè)序的方法，具有準(zhǔn)確度高，獲取的信息量大的特 點(diǎn)，可進(jìn)行病毒的進(jìn)化分析，但其對(duì)儀器的要求高，檢測(cè)時(shí)間較RT-PCR和基因芯片長(zhǎng)。實(shí)時(shí)熒光(Real-time)RT-PCR技術(shù)是在RT-PCR技術(shù)上發(fā)展起來(lái)的。實(shí)時(shí)熒光 PCR技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種核酸檢測(cè)技術(shù)，使用一種帶有核電偶聯(lián)裝置(CCD)的PCR 擴(kuò)增儀，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)反映PCR的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增水平。CCD能夠按 照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，收集檢測(cè)熒光信號(hào)，并通過(guò)軟件分析匯總 到工作站得到擴(kuò)增曲線。一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)是實(shí)時(shí)熒光PCR的一種(Martell， Μ.，J. Gomez, J. Esteban，S. Sauleda，J. Quer, B. Cabot, R. Esteban，and J. Guardia. 1999. High-throughput real-time reverse transcription-PCR quantitation of hepatitis Cvirus RNA. J. Clin. Microbiol. 37:327-332 ;Lee CW, Suarez DL 2004. Application of real-time RT-PCR for the quantitation and competitive replication study of H5 and H7 subtype avian influenza virus. J Virol Methods. 119 (2) :151_8。)，它是一禾中 直接快速檢測(cè)RNA的方法，與檢測(cè)DNA的實(shí)時(shí)熒光PCR相比，不同之處在于前者在反應(yīng)體系 中增加了逆轉(zhuǎn)錄酶，同時(shí)多了一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)步驟；相同之處 于兩者在反應(yīng)體系中均有一條兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針，探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出 熒光的能量轉(zhuǎn)移給淬滅基團(tuán)，呈現(xiàn)淬滅效應(yīng)。如果擴(kuò)增過(guò)程中有靶序列的存在，擴(kuò)增的過(guò)程 中探針?lè)肿又饾u被水解切斷，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互解離，阻斷了二者間熒光共振 能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光信號(hào)。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號(hào)隨著目的片段的擴(kuò) 增而呈現(xiàn)線性增強(qiáng)。傳統(tǒng)的RT-PCR由兩個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)程序或步驟完成，第一步是通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶作用， 將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ；第二步是在Taq酶作用下，以第一步中形成的cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。與傳統(tǒng)的RT-PCR相比較，一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)1、將逆轉(zhuǎn)錄和 PCR擴(kuò)增兩個(gè)在不同反應(yīng)管中分開(kāi)進(jìn)行的二個(gè)反應(yīng)程序合并成一個(gè)反應(yīng)程序，在一個(gè)PCR 反應(yīng)管中完全閉管完成檢測(cè)過(guò)程，大大節(jié)省了反應(yīng)時(shí)間；2、通過(guò)對(duì)擴(kuò)增曲線以及對(duì)數(shù)增長(zhǎng) 期的循環(huán)閾值(Ct)的分析，摒棄普通PCR方法受多種因素干擾的終點(diǎn)分析方法，能夠?qū)z 測(cè)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析，從而有效監(jiān)測(cè)藥物治療的效果；3、將RNA逆轉(zhuǎn)錄、DNA擴(kuò)增與檢 測(cè)三過(guò)程融合為一體，可以實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)RNA擴(kuò)增的全過(guò)程，省掉了 PCR產(chǎn)物后處理過(guò)程， 大大縮短了結(jié)果分析時(shí)間，使得該方法更加快捷、方便；4、由于采取一種封閉的檢測(cè)模式， 從而減少了氣溶膠污染和由此造成的假陽(yáng)性；5、由于在普通RT-PCR基礎(chǔ)上增加了一條可 與模板互補(bǔ)配對(duì)的熒光探針，進(jìn)一步提高了檢測(cè)靶多核苷酸的特異性。因此，該技術(shù)在RNA 樣品的檢測(cè)和分析中，已逐漸取代傳統(tǒng)的RT-PCR方法，得到十分廣泛的應(yīng)用。我國(guó)食品與藥品管理局(SFDA)已經(jīng)批準(zhǔn)了諸如HIV-1、HCV等病原體的一步法實(shí) 時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒的生產(chǎn)與臨床應(yīng)用。因此，通過(guò)一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法開(kāi) 發(fā)一種豬流感病毒分型試劑盒在技術(shù)上是可行的，再加之其方法學(xué)上具有簡(jiǎn)便快速、靈敏 度和特異性高的特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)早期快速分型檢測(cè)。但目前國(guó)內(nèi)外均尚未開(kāi)發(fā)出檢測(cè)豬流 感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR分型試劑盒，因此開(kāi)發(fā)該試劑盒成為當(dāng)務(wù)之急，它的應(yīng)用將極大滿 足豬流感病毒快速分型檢測(cè)與監(jiān)測(cè)工作的需要。在使用已知的一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)檢測(cè)和定量分析樣品中某特定靶核酸 的實(shí)踐中，為了減少和避免檢測(cè)結(jié)果的假陰性或假陽(yáng)性，提高定量分析的準(zhǔn)確性，一個(gè)關(guān)鍵 性的基本技術(shù)環(huán)節(jié)是如何基于已知的靶多核苷酸序列設(shè)計(jì)、篩選及制備適當(dāng)?shù)囊锖凸押?苷酸探針。本發(fā)明人在此基礎(chǔ)上利用一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)發(fā)明了一種進(jìn)行豬流感 病毒分型的試劑盒，應(yīng)用于豬流感病毒分型檢測(cè)及流行狀況監(jiān)測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種豬流感病毒分型試劑盒，特別是涉及以一步法實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn) 錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)進(jìn)行豬流感病毒分型的試劑盒。本試劑盒可以對(duì)呼吸道 樣本、血清、肺組織等樣品中的豬流感病毒進(jìn)行分型。本發(fā)明的目的是提供一種使用一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)進(jìn)行豬流感病毒分型 的試劑盒，特別是涉及豬流感病毒的早期感染在實(shí)驗(yàn)室診斷中的應(yīng)用及其流行狀況監(jiān)測(cè)。 其基本原理是利用一對(duì)寡核苷酸的特異性引物和一條寡聚核苷酸的特異性探針，在逆轉(zhuǎn)錄 酶(RT酶)、熱啟動(dòng)Taq酶、RNA酶抑制劑(RNasin)、高質(zhì)量的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs) 以及Mg2+等RT-PCR反應(yīng)緩沖液中，通過(guò)DA7600、ABI7500等市售的熒光PCR擴(kuò)增儀實(shí)現(xiàn)靶 多核苷酸的循環(huán)擴(kuò)增，從而達(dá)到快速、實(shí)時(shí)、定量檢測(cè)靶多核苷酸的目的。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，我們采用了以下技術(shù)方案1)使用適當(dāng)?shù)暮怂岱治鲕浖謩e對(duì)已知的豬流感病毒Hl型、H3型HA基因和m 型、N2型NA基因的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，在找出同源區(qū)段的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步使用適 當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件(例如Primer Express 2)選擇并設(shè)計(jì)寡核苷酸引物和探針。由于所設(shè) 計(jì)的引物和探針均具有互補(bǔ)于豬流感病毒相應(yīng)型別的序列，而且與其他病原體的核苷酸序 列沒(méi)有同源性，不同型別的豬流感病毒之間不存在交叉反應(yīng)的情況，也不包括任何常見(jiàn)的 核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，所以提高了豬流感病毒分型檢測(cè)的可靠性和準(zhǔn)確度。2)使用DNA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物，用分子篩和快速蛋白質(zhì)液相層析 法(FPLC)純化后進(jìn)行氨解處理。同樣合成所需的探針序列，氨解處理后分別在其5’端標(biāo)記 作為熒光發(fā)生基團(tuán)(報(bào)告基團(tuán))&6-FAM amidite，并在其3’端標(biāo)記借助活性連接臂偶聯(lián) 上作為熒光淬滅或抑制基團(tuán)的TAMRA。以FPLC層析法純化熒光標(biāo)記的探針。然后，使用變 性條件下的聚丙烯酰胺凝膠(20% )電泳法和分光光度法物理鑒定所合成的引物和探針。3)適宜于一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系。反應(yīng)體系包括逆轉(zhuǎn)錄酶、熱啟 動(dòng)Taq酶、2’ _脫氧核苷三磷酸、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物、能 夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物、能夠與靶多聚核苷酸結(jié)合并且兩末端 分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針、含有鎂離子的緩沖液。由于要 分別確認(rèn)H抗原和N抗原的型別，兩者結(jié)合起來(lái)才能判斷豬流感病毒的具體亞型，因此本試 劑盒試劑的反應(yīng)體系將包括四種分別是Hl亞型反應(yīng)體系、H3亞型反應(yīng)體系、m亞型反應(yīng) 體系和N2亞型反應(yīng)體系。4)從待測(cè)樣本中提取RNA，分別加入前述的反應(yīng)體系中，直接經(jīng)一步法RT-PCR擴(kuò) 增，從熒光擴(kuò)增曲線判斷豬流感病毒的型別。本發(fā)明所提供的樣品中豬流感病毒進(jìn)行分型的試劑盒包括(1)分別裝有RNA提 取液(即TRIZOL核酸抽提試劑)、H1亞型反應(yīng)體系、H3亞型反應(yīng)體系、m亞型反應(yīng)體系和 N2亞型反應(yīng)體系、陰性質(zhì)控品、Hl亞型陽(yáng)性質(zhì)控品、H3亞型陽(yáng)性質(zhì)控品、Nl亞型陽(yáng)性質(zhì)控 品和N2亞型陽(yáng)性質(zhì)控品并加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶 或管的包裝盒。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中Hl亞型反應(yīng)體系包括Hl亞型引物探 針混合液、RT-PCR反應(yīng)液、RT-PCR酶系；H3亞型反應(yīng)體系包括H3亞型引物探針混合液、 RT-PCR反應(yīng)液、RT-PCR酶系；附亞型反應(yīng)體系包括附亞型引物探針混合液、RT-PCR反應(yīng) 液、RT-PCR酶系；N2亞型反應(yīng)體系包括N2亞型引物探針混合液、RT-PCR反應(yīng)液、RT-PCR酶 系。其中Hl亞型反應(yīng)體系、H3亞型反應(yīng)體系、附亞型反應(yīng)體系、N2亞型反應(yīng)體系中RT-PCR 反應(yīng)液、RT-PCR酶系的組分均相同。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中Hl亞型引物探針混合液由(a)與雙鏈靶 多核苷酸的第一條鏈結(jié)合的Hl亞型正向引物，(b)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈結(jié)合 的Hl亞型反向引物，(c)和能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光報(bào)告基團(tuán)和 熒光淬滅基團(tuán)的Hl亞型寡核苷酸探針組成，以上引物探針濃度均為5 15pmol/反應(yīng)，優(yōu) 選引物濃度為5pmol/反應(yīng)、探針濃度為5pmol/反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中Hl亞型引物探針混合液中Hl亞型正向 引物的序列為:5，-TGGCACCAAGATATGCTTTTG-3，(SEQ ID NO 1), Hl亞型反向引物的序列為5，-CAAGTCGCATTGCAGTCATG-3’ (SEQ ID NO :2)，正、反向引物可向 5，和 3，端方向各延 伸10個(gè)堿基。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中Hl亞型引物探針混合液中Hl亞型寡核 苷酸探針的序列為5’ -CGGGTATCATAACATCGGATGCACCA-3’ (SEQ ID NO :3)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中H3亞型引物探針混合液由(a)與雙鏈靶 多核苷酸的第一條鏈結(jié)合的H3亞型正向引物，(b)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈結(jié)合 的H3亞型反向引物，(c)和能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光報(bào)告基團(tuán)和 熒光淬滅基團(tuán)的H3亞型寡核苷酸探針組成，以上引物探針濃度均為5 15pmol/反應(yīng)，優(yōu) 選引物濃度為5pmol/反應(yīng)、探針濃度為5pmol/反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中H3亞型引物探針混合液中H3亞型正向 引物的序列為5，-CGTCGTGAAAGCGTGAACAG-3，(SEQ ID NO :4)，H3亞型反向引物的序列為 5，-CGGCATGGTCACGTTCAG-3，(SEQ ID NO :5)，正、反向引物可向 5，和 3，端方向各延伸 10
個(gè)堿基。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中H3亞型引物探針混合液中H3亞型寡核 苷酸探針的序列為5，-CCGTCTGAACTGGCTGCATAACCTGG-3，(SEQ ID NO :6)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中m亞型引物探針混合液由(a)與雙鏈靶 多核苷酸的第一條鏈結(jié)合的W亞型正向引物，(b)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈結(jié)合 的m亞型反向引物，(c)和能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光報(bào)告基團(tuán)和 熒光淬滅基團(tuán)的m亞型寡核苷酸探針組成，以上引物探針濃度均為5 15pmol/反應(yīng)，優(yōu) 選引物濃度為5pmol/反應(yīng)、探針濃度為5pmol/反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中m亞型引物探針混合液中m亞型正向 引物的序列為5，-GACCTTGCTTTTGGGTTGAACT-3’ (SEQ ID NO 7), Nl亞型反向引物的序列 為5，-AAGGATATGCTGCTCCCACTAGTC-3，(SEQ ID NO :8)，正、反向引物引物可向 5，和 3，端 方向各延伸10個(gè)堿基。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中m亞型引物探針混合液中m亞型寡核 苷酸探針的序列為5，-CAGAGGGCGACCCAAAGAGAACACAATC-3，(SEQ ID NO :9)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中N2亞型引物探針混合液由(a)與雙鏈靶 多核苷酸的第一條鏈結(jié)合的N2亞型正向引物，(b)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈結(jié)合 的N2亞型反向引物，(c)和能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩術(shù)端分別結(jié)合有熒光報(bào)告基團(tuán)和 熒光淬滅基團(tuán)的N2亞型寡核苷酸探針組成，以上引物探針濃度均為5 15pmol/反應(yīng)，優(yōu) 選引物濃度為5pmol/反應(yīng)、探針濃度為5pmol/反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中N2亞型引物探針混合液中N2亞型正向 引物的序列為5，-GGGCACCACCCTGAACAA-3’ (SEQ ID NO: 10)，N2亞型反向引物的序列為 5，-CGTTCATCAGCAGGGTACGA-3，(SEQ ID NO :11)，正、反向引物引物可向 5，和 3，端方向各 延伸10個(gè)堿基。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中N2亞型引物探針混合液中N2亞型寡核 苷酸探針的序列為5’ -CCATAGCAACGATACCGTGCATGATCG-3，(SEQ ID N0:12)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，RT-PCR反應(yīng)液包括一步法RT-PCR反應(yīng)緩沖 液和 DEPC 水，其中一步法 RT-PCR 反應(yīng)緩沖液包含 10mmol/L Tris-HCl (pH8. 0)、150mmol/LKCl,2. Ommol/L MgCl20根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，RT-PCR酶系由逆轉(zhuǎn)錄酶(RT酶)、熱啟動(dòng)Taq 酶、RNasin, dNTPs、酶系稀釋液組成，其中RT酶用量為1. 5 3. 5U/反應(yīng)、熱啟動(dòng)Taq酶用 量為3 7U/反應(yīng)、RNasin用量為15 25U/反應(yīng)、dNTPs濃度為0. 20mmol/L,酶系稀釋液 為一般市售的酶系稀釋液。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中陰性質(zhì)控品為去離子水，Hl亞型陽(yáng)性質(zhì)控 品為含有Hl亞型HA基因序列的重組質(zhì)粒，質(zhì)粒由上下游引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過(guò)市售的 載體克隆構(gòu)建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID NO :1和SEQ ID N0:2，H3亞型陽(yáng)性質(zhì) 控品為含有H3亞型HA基因序列的重組質(zhì)粒，質(zhì)粒由上下游引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過(guò)市售 的載體克隆構(gòu)建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5，附亞型陽(yáng) 性質(zhì)控品為含有m亞型NA基因序列的重組質(zhì)粒，質(zhì)粒由上下游引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過(guò) 市售的載體克隆構(gòu)建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8，N2亞 型陽(yáng)性質(zhì)控品為含有N2亞型NA基因序列的重組質(zhì)粒，質(zhì)粒由上下游引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物 通過(guò)市售的載體克隆構(gòu)建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID N0:10和SEQ ID NO=Il, 以上陽(yáng)性質(zhì)控品濃度均為IX IO6拷貝/ml。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)溫度和時(shí)間 為50°C逆轉(zhuǎn)錄 15min，l 個(gè)循環(huán)；94°C 15min，1 個(gè)循環(huán)；最后 95°C 15s，55 60°C 45s，45 個(gè)循環(huán)(收集熒光信號(hào))。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中試劑盒的待檢樣品是呼吸道樣本、血清、肺 組織等樣品。本發(fā)明提供的一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒可以檢測(cè)出豬流感病毒不同亞型的 最低濃度為1.0X102COpieS/ml，說(shuō)明本試劑盒具有非常好的靈敏度。本發(fā)明分別針對(duì)豬流感病毒Hl亞型、H3亞型HA基因和附亞型、N2亞型NA基因 設(shè)計(jì)特異性引物和探針，可分別檢測(cè)出豬流感病毒相應(yīng)亞型，但不能檢測(cè)出豬繁殖與呼吸 綜合征病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株、偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán) 病毒2型、口蹄疫病毒陽(yáng)性樣本，說(shuō)明本試劑盒具有很好的特異性。本發(fā)明提供的一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒可以檢測(cè)呼吸道樣本、血清、肺 組織等樣品中的豬流感病毒不同亞型；可為靈敏、快速早期診斷豬流感病毒感染，監(jiān)控其流 行狀況提供可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。


圖1顯示Hl亞型陽(yáng)性質(zhì)控品、H3亞型陽(yáng)性質(zhì)控品、附亞型陽(yáng)性質(zhì)控品、N2亞型陽(yáng) 性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果。Hl亞型陽(yáng)性質(zhì)控品、H3亞型陽(yáng)性質(zhì)控品、m亞型陽(yáng)性 質(zhì)控品、N2亞型陽(yáng)性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，成S型，可明確判定為陽(yáng)性。陰性 質(zhì)控品擴(kuò)增曲線平直或斜向下且與基線無(wú)交叉，沒(méi)有Ct值，可明確判定為陰性。圖2顯示特異性參考品的檢測(cè)結(jié)果。9份特異性參考品的擴(kuò)增曲線平直或斜向下 且與基線無(wú)交叉，沒(méi)有Ct值，可明確判定為陰性。9份特異性參考品分別為禽流感病毒H5/ H7/H9各亞型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株、偽狂 犬病毒、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、口蹄疫病毒。
圖3顯示Hmi型豬流感病毒樣本檢測(cè)結(jié)果。Hl亞型、Nl亞型的擴(kuò)增曲線有明顯 指數(shù)增長(zhǎng)期成S型，可明確判定為陽(yáng)性，其余亞型的擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線平直或斜向下且與 基線無(wú)交叉，沒(méi)有Ct值，可明確判定為陰性，因此可明確判定為Hmi型豬流感病毒。圖4顯示H3N2型豬流感病毒樣本檢測(cè)結(jié)果。H3亞型、N2亞型的擴(kuò)增曲線有明顯 指數(shù)增長(zhǎng)期成S型，可明確判定為陽(yáng)性，其余亞型的擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線平直或斜向下且與 基線無(wú)交叉，沒(méi)有Ct值，可明確判定為陰性，因此可明確判定為H3N2型豬流感病毒。圖5顯示H1N2型豬流感病毒樣本檢測(cè)結(jié)果。Hl亞型、N2亞型的擴(kuò)增曲線有明顯 指數(shù)增長(zhǎng)期成S型，可明確判定為陽(yáng)性，其余亞型的擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線平直或斜向下且與 基線無(wú)交叉，沒(méi)有Ct值，可明確判定為陰性，因此可明確判定為H1N2型豬流感病毒。圖6顯示靈敏度參考品的檢測(cè)結(jié)果。16份靈敏度參考品中除了濃度為 1. 0 X lO^opies/ml的4份質(zhì)粒樣本擴(kuò)增曲線平直或斜向下且與基線無(wú)交叉，沒(méi)有Ct值，可 明確判定為陰性。其余樣本均可明確判定為陽(yáng)性。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在舉例說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1 豬流感病毒分型檢測(cè)試劑的研制1、引物和探針的設(shè)計(jì)通過(guò)對(duì)已報(bào)導(dǎo)豬流感病毒的核酸序列進(jìn)行序列比對(duì)分析， 分別以豬流感病毒Hl型、H3型HA基因和m型、N2型NA基因?yàn)閿U(kuò)增靶位點(diǎn)，選擇無(wú)二級(jí)結(jié) 構(gòu)且高度保守的區(qū)段，根據(jù)引物探針設(shè)計(jì)的基本原則，利用軟件和人工設(shè)計(jì)多對(duì)引物和探 針。2、臨床樣本的選擇根據(jù)國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道表明，可以使用呼吸道樣本、血清、 肺組織等樣品。3、反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化樣品的準(zhǔn)備以構(gòu)建的含有各目的擴(kuò)增片斷的質(zhì)粒作為陽(yáng)性質(zhì)控品，以禽流感病 毒H5/H7/H9各亞型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異 株、偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、口蹄疫病毒陽(yáng)性樣本作為陰性參考品；以去 離子水作為陰性質(zhì)控品，分別用TRIZOL提取上述陽(yáng)性質(zhì)控品與特異性參考品的RNA，陰性 質(zhì)控品待用。引物探針的篩選以上述1中設(shè)計(jì)的多組引物探針?lè)謩e檢測(cè)上述的陽(yáng)性質(zhì)控品與 陰性參考品的RNA，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，篩選出特異性、靈敏度和重復(fù)性好的最佳引物探針組合。 (如序列表中 SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 12)。引物探針濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從2pmol/ 反應(yīng)至15pmol/反應(yīng)梯度的引物和從2pmol/反應(yīng)至15pmol/反應(yīng)濃度梯度的探針進(jìn)行PCR 反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)引物和探針濃度在5 15pmol/反應(yīng)之間均可，其中最佳的引物 濃度為5pmol/反應(yīng)、探針濃度為5pmol/反應(yīng)。鎂離子濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從lmmol/L 至2. 5mmol/L濃度梯度的鎂離子進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳的鎂離子濃 度為 2. Ommol/Lο熱啟動(dòng)Taq酶用量的優(yōu)化在25 μ L反應(yīng)體系中 他組分不變的情況下，分別使用從IU (酶單位)至8U濃度梯度的酶用量/反應(yīng)進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定 最佳的熱啟動(dòng)Taq酶用量為3 7U/反應(yīng)。RT酶用量的優(yōu)化在25μ L反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從 IU (酶單位)至8U濃度梯度的酶用量/反應(yīng)進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳 的RT酶用量為1. 5 3. 5U/反應(yīng)。RNasin用量的優(yōu)化在25 μ L反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從 5U(酶單位)至40U濃度梯度的酶用量/反應(yīng)進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最 佳的RNasin用量為15 25U/反應(yīng)。dNTPs濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從0. lmmol/L 至0. 25mmol/L濃度梯度的dNTPs進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳的dNTPs 濃度為 0. 20mmol/Lo反應(yīng)溫度的優(yōu)化根據(jù)酶的活性和靶多核苷酸的長(zhǎng)度，主要對(duì)退火溫度和延伸時(shí) 間進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳的反應(yīng)溫度和時(shí)間為50°C逆轉(zhuǎn)錄15min， 1個(gè)循環(huán)；94°C 15min, 1個(gè)循環(huán)；最后95°C 15s, 55 60°C 45s, 45個(gè)循環(huán)(收集熒光信 號(hào))。實(shí)施例2 豬流感病毒分型檢測(cè)試劑盒及其使用1、制備包括下列組成成分的試劑盒RNA提取液(50ml/管)1管、Hl亞型引物探針 混合液(50 μ 1/管)1管、Η3亞型引物探針混合液(50 μ 1/管)1管、、m亞型引物探針混合 液(50 μ 1/管)1管、Ν2亞型引物探針混合液(50 μ 1/管)1管、RT-PCR反應(yīng)液(1440 μ 1/ 管)1管、RT-PCR酶系(300 μ 1/管)1管，陰性質(zhì)控品(200 μ 1/管)1管、Hl亞型陽(yáng)性質(zhì)控 品(100 μ 1/管)1管、Η3亞型陽(yáng)性質(zhì)控品(100 μ 1/管)1管、Nl亞型陽(yáng)性質(zhì)控品(100 μ 1/ 管)1管、Ν2亞型陽(yáng)性質(zhì)控品(100 μ 1/管)1管。2、標(biāo)本采集、運(yùn)送和保存根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行標(biāo)本采集，可檢測(cè)的標(biāo)本包括呼吸道樣本、血清、肺組織等樣 品。采集方法如下①呼吸道樣本拭子擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將拭子浸入4-5ml采 樣液中，密封送檢；②血清無(wú)菌采集靜脈血約1ml，分別于室溫和4°C靜置2小時(shí)和1小時(shí) 后，離心(8，000rpm，5分鐘)分離并收集血清標(biāo)本；③肺組織利用支氣管鏡對(duì)肺部可疑病 灶進(jìn)行活組織取樣，并用組織勻漿器對(duì)組織樣本進(jìn)行勻漿待用。標(biāo)本可立即用于測(cè)試，也可以保存于-70°C待測(cè)，保存期為6個(gè)月。標(biāo)本運(yùn)送采用 0°C冰壺3、檢測(cè)步驟(I)RNA 提取取上述類型的樣本各100 μ 1 (樣品不足100 μ 1時(shí)請(qǐng)補(bǔ)加適量生理鹽水重懸)，放 置于1. 5ml滅菌離心管，加入200 μ 1 Trizol試劑及100 μ 1氯仿，用振蕩器強(qiáng)力振蕩20秒
后靜置3分鐘；2 8°C下12，OOOrpm離心lOmin，吸取上清至另一干凈的1. 5ml離心管；加入0. 2ml氯仿，蓋緊蓋子，手動(dòng)用力顛倒搖動(dòng)15s (不可用振蕩器)，室溫孵育 2 3min ；2 8°C下12000rpm離心15min后，取最上層的上清液至另一干凈的1. 5ml離管；加入0. 5ml預(yù)冷的異丙醇，緩慢顛倒充分混勻后，_20°C靜置15min，2 8°C， 12000rpm離心lOmin，小心棄盡上清液；加入Iml預(yù)冷的70%的冰冷乙醇，手動(dòng)顛倒數(shù)次洗滌沉淀，2 8°C，8000rpm離心 5min，小心棄盡上清液；空氣或真空干燥5 10min，WA 50 μ 1 DEPC H2O, 55 60°C下孵育lOmin，于指 輕輕彈打管底，使其充分溶解，直接用于實(shí)驗(yàn)或-70°C保存?zhèn)溆谩?2) PCR反應(yīng)與結(jié)果分析分別取Hl亞型引物探針混合液2 μ 1、RT-PCR反應(yīng)液15 μ 1、RT-PCR酶系3 μ 1配 制成Hl亞型反應(yīng)體系；取Η3亞型引物探針混合液2 μ 1、RT-PCR反應(yīng)液15 μ 1、RT-PCR酶 系3 μ 1配制成Η3亞型反應(yīng)體系；取Μ亞型引物探針混合液2 μ 1、RT-PCR反應(yīng)液15 μ 1、 RT-PCR酶系3 μ 1配制成附亞型反應(yīng)體系；取N2亞型引物探針混合液2 μ 1、RT-PCR反應(yīng) 液15 μ 1、RT-PCR酶系3 μ 1配制成Ν2亞型反應(yīng)體系。取陰性質(zhì)控品、標(biāo)本各5 μ 1，分別加入Hl亞型反應(yīng)體系、Η3亞型反應(yīng)體系、Nl亞 型反應(yīng)體系、Ν2亞型反應(yīng)體系中，另外取Hl亞型陽(yáng)性質(zhì)控品5μ 1加入Hl亞型反應(yīng)體系、 Η3亞型陽(yáng)性質(zhì)控品5 μ 1加入Η3亞型反應(yīng)體系、Nl亞型陽(yáng)性質(zhì)控品5 μ 1加入附亞型反 應(yīng)體系、Ν2亞型陽(yáng)性質(zhì)控品5 μ 1加入Ν2亞型反應(yīng)體系使用市售的熒光定量PCR儀(如 ΑΒΙ7500)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR循環(huán)條件是50°C逆轉(zhuǎn)錄15min，1個(gè)循環(huán)；94°C 15min, 1個(gè) 循環(huán)；最后95°C 15s，55 60°C 45s，45個(gè)循環(huán)(收集熒光信號(hào))。反應(yīng)結(jié)束后保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件。根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果所得到的曲線，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 如擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，則判定為相應(yīng)亞型陽(yáng)性，否則為陰性。如Hi亞型陽(yáng)性、m亞型陽(yáng)性，其余亞型為陰性，則為Hmi型豬流感病毒；如H3亞型陽(yáng)性、N2亞型陽(yáng)性，其余亞型為陰性，則為H3N2型豬流感病毒；如Hl亞型陽(yáng)性、N2亞型陽(yáng)性，其余亞型為陰性，則為H1N2型豬流感病毒；如H3亞型陽(yáng)性、附亞型陽(yáng)性，其余亞型為陰性，則為H3W型豬流感病毒。實(shí)施例3 應(yīng)用豬流感病毒分型檢測(cè)試劑盒檢測(cè)樣品以實(shí)施例1中的陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、特異性參考品作為待檢樣本，按照實(shí)施 例2的方法分別檢測(cè)這些樣本，陽(yáng)性質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，陰性質(zhì)控品和特異性參考品 檢測(cè)結(jié)果均為陰性(參見(jiàn)附圖1，2)。分別以Hmi型豬流感病毒、H3N2型豬流感病毒、H1N2型豬流感病毒樣本作為待 檢樣本，按照實(shí)施例2的方法分別檢測(cè)這些樣本，HlNl型豬流感病毒、H3N2型豬流感病毒、 H1N2型豬流感病毒均準(zhǔn)確分型(參見(jiàn)附圖3，4，5)。實(shí)施例4 豬流感病毒分型檢測(cè)試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)分別以豬流感病毒Hl亞型HA基因的質(zhì)粒、H3亞型HA基因的質(zhì)粒、Nl亞型NA基 因的質(zhì)粒、N2亞型NA基因的質(zhì)粒作為待測(cè)樣本，各質(zhì)粒濃度均稀釋為1. OX 104COpieS/ml、 1. 0X103copies/ml、l. 0X102copies/ml、l. OXlOkopies/ml 組成靈敏度參考品，按照實(shí)施 例2的方法分別檢測(cè)這16份樣本，檢測(cè)結(jié)果表明，本試劑盒的靈敏度為1. 0X102copies/ ml (見(jiàn)附圖6)。序列表
<110>中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司<120> 一種豬流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR分型試劑盒<140><141><160>12<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。<400>1tggcaccaagatatgcttttg<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。<400>2caagtcgcattgcagtcatg<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的探針。<400>3cgggtatcataacatcggatgcacca<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。<400>4cgtcgtgaaagcgtgaacag<210>5<211>18頁(yè)<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。<400>5cggcatggtcacgttcag<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的探針。<400>6ccgtctgaactggctgcataacctgg<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。<400>7gaccttgcttttgggttgaact<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。<400>8aaggatatgctgctcccactagtc<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的探針。<400>9cagagggcgacccaaagagaacacaatc<210>10
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)特定核苷·g序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>10
gggcaccaccctgaacaa
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)特定核苷·I序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>11
cgttcatcagcagggtacga
<210>12
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)特定核苷1:I序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的探針。
<400>12
ccatagcaacgataccgtgcatgatcg
權(quán)利要求
一種豬流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR分型試劑盒，試劑盒包括分別裝有RNA提取液、H1亞型反應(yīng)體系、H3亞型反應(yīng)體系、N1亞型反應(yīng)體系和N2亞型反應(yīng)體系、陰性質(zhì)控品、H1亞型陽(yáng)性質(zhì)控品、H3亞型陽(yáng)性質(zhì)控品、N1亞型陽(yáng)性質(zhì)控品和N2亞型陽(yáng)性質(zhì)控品并加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其特征在于H1亞型引物探針混合液中H1亞型正向引物的序列為5’-TGGCACCAAGATATGCTTTTG-3’，H1亞型反向引物的序列為5’-CAAGTCGCATTGCAGTCATG-3’，正、反向引物可向5’和3’端方向各延伸10個(gè)堿基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于HI亞型引物探針混合液中HI亞型寡核苷 酸探針的序列為5’ -CGGGTATCATAACATCGGATGCACCA-3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于H3亞型引物探針混合液中H3亞 型正向引物的序列為5，-CGTCGTGAAAGCGTGAACAG-3，，H3亞型反向引物的序列為: 5’ -CGGCATGGTCACGTTCAG-3’，正、反向引物引物可向5’和3’端方向各延伸10個(gè)堿基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于H3亞型引物探針混合液中H3亞型寡核苷 酸探針的序列為5’ -CCGTCTGAACTGGCTGCATAACCTGG-3，。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于m亞型引物探針混合液中m亞型 正向引物的序列為5，-GACCTTGCTTTTGGGTTGAACT-3’，N1亞型反向引物的序列為: 5，-AAGGATATGCTGCTCCCACTAGTC-3，，正、反向引物引物可向5，和3，端方向各延伸10個(gè)堿 基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于m亞型引物探針混合液中m亞型寡核苷 酸探針的序列為5’ -CAGAGGGCGACCCAAAGAGAACACAATC-3，。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于N2亞型引物探針混合液中N2亞 型正向引物的序列為5’ -GGGCACCACCCTGAACAA-3’，N2亞型反向引物的序列為 5，-CGTTCATCAGCAGGGTACGA-3’，正、反向引物引物可向5，和3，端方向各延伸10個(gè)堿基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于N2亞型引物探針混合液中N2亞型寡核苷 酸探針的序列為5’ -CCATAGCAACGATACCGTGCATGATCG-3，。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于HI亞型正、反向引物，H3亞型正、反向引 物，m亞型正、反向引物，N2亞型正、反向引物的濃度均為5pmol/反應(yīng)，HI亞型寡核苷酸探 針、H3亞型寡核苷酸探針、m亞型寡核苷酸探針、N2亞型寡核苷酸探針的濃度均為5pmol/ 反應(yīng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，RT-PCR酶系由逆轉(zhuǎn)錄酶(RT酶)、熱啟動(dòng)Taq酶、RNasin、 dNTPs、酶系稀釋液組成，其特征還在于其中RT酶用量為1. 5 3. 5U/反應(yīng)、熱啟動(dòng)Taq酶 用量為3 7U/反應(yīng)、RNasin用量為15 25U/反應(yīng)、dNTPs濃度為0. 20mmol/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬流感病毒分型試劑盒，特別是涉及以一步法實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)進(jìn)行豬流感病毒分型的試劑盒。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過(guò)本發(fā)明的試劑盒對(duì)呼吸道樣本、血清、肺組織等樣品中的豬流感病毒進(jìn)行分型，從而實(shí)現(xiàn)豬流感病毒的早期快速診斷，監(jiān)控其流行趨勢(shì)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101886134SQ20091003940
公開(kāi)日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2009年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月12日
發(fā)明者何蘊(yùn)韶, 李明, 陳華云, 高秀杰 申請(qǐng)人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司