專(zhuān)利名稱(chēng)：一種人染色體p16基因探針的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人染色體P16基因探針的制備方法，還涉及利用人染色體P16基 因探針制備一種人染色體P16基因檢測(cè)試劑盒，應(yīng)用本發(fā)明的人染色體P16基因探針及相 應(yīng)的試劑盒可以對(duì)人染色體P16基因異常進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
P16 基因又叫 MTS(multiple tumor suppressor 1)基因，定位于人染色體 9p21， 直接參與細(xì)胞周期的調(diào)控，負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分裂，在人類(lèi)50%腫瘤細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)有純合 子缺失、突變，認(rèn)為P16是比P53更重要的一種新型抗癌基因。P16基因已經(jīng)在肺癌、乳 腺癌、腦腫瘤、骨腫瘤、皮膚癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌、淋巴瘤和黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)純合子缺 ^zUR^XAsXR^m^^ [Kaye FJ. RB and cyclin dependent kinase pathways defining a distinction between RB and pl61oss in lung cancer[J]. Oncogene,2002, 21(45) :6908-6914. ][Bazan V,Zanna I,Migliavacca M,et al. Prognostic significance of pl6INK4a alterations and 9p211oss of heterozygosity in locally advanced laryngeal squamous cell carcinoma [J]. J Cell Physiol，2002，192 (3) :286_293.] [Yoshida S,Todoroki T，Ichikawa Y, et al. Mutations of pl6Ink4/CDKN2 and pl5Ink4B/ MTS2genes in biliary tract cancers [J]. Cancer Res,1995,55 (13) :2756_2760.] [Calero Moreno TM, Gustafsson G, Garwicz S,et al. Deletion of the Ink4_locus(the pl6ink4a, pl4ARF and pl5ink4b genes)predicts relapse in children with ALL treated according to the Nordic protocols N0PH0 86 and N0PH0 92 [J]. Leukemia, 2002,16(10) =2037 2045.]，表明P16基因以缺失，突變方式廣泛參與腫瘤形成，檢測(cè)P16基 因有無(wú)改變對(duì)判斷患者腫瘤的易感性以及預(yù)測(cè)腫瘤的預(yù)后，具有十分重要的臨床意義。目前常用的染色體組型分析可以進(jìn)行染色體異常的分析，但這需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng) 和制備高質(zhì)量的中期染色體片，而這對(duì)于腫瘤細(xì)胞來(lái)說(shuō)是極其困難和耗時(shí)的。為了解決這 個(gè)技術(shù)難題，其中一個(gè)思路是篩選并制備相應(yīng)的區(qū)段分析基因探針，但目前染色體區(qū)段分 析基因探針制備缺乏一個(gè)系統(tǒng)和成熟的方法。本發(fā)明人在長(zhǎng)期研究的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)及篩選人染色體P16基因探針，并利用熒光原 位雜交技術(shù)檢測(cè)中期或間期細(xì)胞中的人染色體P16基因。它應(yīng)用熒光物質(zhì)標(biāo)記的雙鏈DNA 核酸探針與染色體DNA互補(bǔ)序列雜交，在核中或染色體上顯示DNA序列的位置。在此基礎(chǔ) 上本發(fā)明人還開(kāi)發(fā)人染色體P16基因檢測(cè)試劑盒，該試劑盒具有快速、無(wú)創(chuàng)性、敏感度高和 特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，無(wú)需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，就能夠在中期和間期細(xì)胞中檢測(cè)人染色體P16基因 的異常。由于本發(fā)明提供了這種人染色體P16基因探針的制備方法，并在此基礎(chǔ)上自主研 制開(kāi)發(fā)人染色體P16基因檢測(cè)試劑盒，對(duì)擺脫對(duì)進(jìn)口試劑的依賴(lài)，填補(bǔ)國(guó)內(nèi)該檢測(cè)領(lǐng)域的 空白具有十分重大的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種人染色體P16基因探針的制備方法。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案人染色體P16基因探針的制備步驟包括(1)克隆篩選P16基因位于人染色體9p21區(qū)段，挑選包含有該基因的克隆。(2)克隆培養(yǎng)和鑒定購(gòu)買(mǎi)克隆，取適量克隆菌液添加到500ml的TB培養(yǎng)液(氯 霉素抗性)中，37°C搖床中搖菌培養(yǎng)24 48小時(shí)；使用STS引物對(duì)進(jìn)行克隆鑒定。(3)P16基因探針制備對(duì)鑒定陽(yáng)性的菌液，進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取；通過(guò)適當(dāng)稀釋質(zhì) 粒DNA，對(duì)質(zhì)粒DNA定量；然后，通過(guò)缺口平移方法對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記；對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn) 行乙醇沉淀和濃縮；獲得P16探針，避光、-20°C儲(chǔ)存。(4)P16基因探針驗(yàn)證使用人類(lèi)正常分裂中期淋巴細(xì)胞滴片進(jìn)行探針驗(yàn)證。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，克隆篩選步驟中挑選的克隆號(hào)為 RP11-14912 (Invitrogen RPCI11.C)。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，克隆培養(yǎng)和鑒定步驟中使用的STS引物序列分 別為上游引物 5’ -ATCCAACATGCCATAGCTCC-3，和下游引物 5’ -TTTGTCCCATGTCACTGGAA-3，， PCR 擴(kuò)增條件為95°C 5 分鐘；(94°C 30 秒，56°C 30 秒，72°C 45 秒)X40 循環(huán)；72°C 10 分鐘。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，P16基因探針制備步驟中克隆質(zhì)粒DNA提取可 使用市售的質(zhì)粒提取試劑盒，優(yōu)選Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，P16基因探針制備步驟中克隆質(zhì)粒DNA的定量 是將質(zhì)粒DNA稀釋后分別測(cè)定260nm和280nm下的吸光度，計(jì)算產(chǎn)物濃度。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，P16基因探針制備步驟中質(zhì)粒DNA進(jìn)行熒光標(biāo) 記可以使用市售的缺口平移標(biāo)記試劑盒，優(yōu)選abbott公司的Nick Translation Kit。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，P16基因探針標(biāo)記的熒光素為熒光素標(biāo)記的 dUTP，并優(yōu)選 Spectrum dUTP。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，P16基因探針濃縮方法為乙醇沉淀濃縮，最后使 用 5ulHuman Cot-IDNA(lug/ul)溶解沉淀。本發(fā)明的另一個(gè)目的是利用P16基因探針制備一種P16基因探針檢測(cè)試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，我們采用了以下技術(shù)方案(1)樣本處理和制片按照原位雜交方法對(duì)各類(lèi)型樣本進(jìn)行處理。(2)雜交配制雜交液，主要包括標(biāo)記探針和雜交緩沖液。合適溫度下進(jìn)行8 16 小時(shí)的雜交，然后以合適的洗液洗去未結(jié)合上的和非特異結(jié)合的探針；DAPI復(fù)染劑復(fù)染。(3)通過(guò)熒光顯微鏡相應(yīng)濾塊觀察熒光信號(hào)，觀察P16基因是否缺失或擴(kuò)增。基于以上技術(shù)方案發(fā)明的試劑盒包括1)雜交液、DAPI復(fù)染劑，和2)分隔并集中 包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，由雜交緩沖液、熒光標(biāo)記的P16基因探針和H20 配制成雜交液，其中每人份雜交液中使用P16基因探針的量為1. 5ul 3ul，雜交緩沖液為 7111，用 H20 補(bǔ)至 10ulo根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，雜交緩沖液的組分包括去離子甲酰胺，SSC，硫 酸葡聚糖，其中去離子甲酰胺濃度為50% 70%，硫酸葡聚糖濃度為0. lg/ml。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中DAPI復(fù)染劑配制方法為50 250ng DAPI 溶于1ml抗褪色液(10mg/ml對(duì)苯二胺/PBS，甘油混合液)。利用本發(fā)明的試劑盒，依照常規(guī)的熒光原位雜交方法對(duì)人的中期和間期細(xì)胞進(jìn)行 P16基因檢測(cè)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有下列優(yōu)點(diǎn)(1)可以對(duì)人P16基因進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)、且結(jié)果重復(fù)性好；(2)無(wú)需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和制備高質(zhì)量的中期染色體片，可用于中期或間期細(xì)胞 P16基因計(jì)數(shù)，操作相對(duì)簡(jiǎn)單；(3)通過(guò)制備成試劑盒，可以實(shí)現(xiàn)在腫瘤生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、產(chǎn)前診斷等領(lǐng)域的 應(yīng)用，了解P16基因與腫瘤發(fā)生等的聯(lián)系。


圖1顯示克隆鑒定的電泳結(jié)果。目的產(chǎn)物184bp。圖2顯示人類(lèi)正常分裂中期淋巴細(xì)胞P16基因檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在舉例說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1 人P16基因探針的制備方法(1)引物設(shè)計(jì)克隆篩選P16基因位于人染色體9p21區(qū)段，挑選包含有該基因的克 隆:RPll-149I2o(2)克隆培養(yǎng)和鑒定購(gòu)買(mǎi)相應(yīng)克隆Invitrogen RPCI11. C，取50ul添加到500ml 的TB培養(yǎng)液(氯霉素抗性)中，37°C搖床中搖菌培養(yǎng)24 48小時(shí)；菌液使用STS引 物對(duì)進(jìn)行克隆鑒定。STS引物對(duì)上游引物5 ’ -ATCCAACATGCCATAGCTCC-3，和下游引物 5，-TTTGTCCCATGTCACTGGAA-3，，PCR 擴(kuò)增條件為95 V 5 分鐘；(94 °C 30 秒，56°C 30 秒， 72V 45秒)X40循環(huán)；72°C 10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳驗(yàn)證，結(jié)果184bp左右具有明亮的 條帶(參見(jiàn)附圖1)。(3)P16基因探針制備鑒定陽(yáng)性的菌液，使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit, 按照說(shuō)明書(shū)要求的操作方法進(jìn)行超低拷貝質(zhì)粒DNA提取，通過(guò)測(cè)定260nm和280nm處的吸 光度對(duì)質(zhì)粒DNA定量；按照公式雙鏈DNA濃度(ng/ul) = 0D260 X 50 (ng/ul)計(jì)算質(zhì)粒DNA 濃度。采用高壓滅菌的超純水稀釋為lOOng/ul，采用1. 5ml的離心管分裝，_20°C密封保存。通過(guò)缺口平移方法對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記，探針標(biāo)記的熒光素為Spectrum dUTP。采用abbott的Nick Translation Kit，按如下方案，嚴(yán)格避光條件下在冰上配制PCR
反應(yīng)體系。
10XNT buffer5ul
dTTP(lmM)0. 5ul
d3TPs(lmM)lul
Spectrum-Orange dUTP0. 5ul
NT 酶lOul
DNA(100ng/ul)lOul
H2023ul總體積50ul配完后震蕩混勻，在15°C標(biāo)記12小時(shí)，再70°C孵育10分鐘滅活酶。取5ul使用 2%瓊脂糖凝膠做電泳，要求在100-500bp之間存在彌散的帶。對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行乙醇沉淀和濃縮，按如下方案在1. 5ml離心管中依次加入醋酸鈉 和無(wú)水乙醇，避光、冰上配制標(biāo)記產(chǎn)物45ulHuman Cot-IDNA5ul醋酸鈉(3mol/L)5ul無(wú)水乙醇125ul混勻后置于_70°C冰箱中至少2小時(shí)，4°C 13000rpm離心30分鐘，小心去上清，勿 攪動(dòng)沉淀，加入1ml的70%乙醇，4°C 13000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，小心去上清，勿攪動(dòng)沉淀， 避光干燥。使用5ul Human Cot-IDNA(lug/ul)溶解沉淀，獲得P16基因探針，避光、-20°C儲(chǔ)存。(4)P16基因探針驗(yàn)證使用人類(lèi)正常分裂中期淋巴細(xì)胞滴片進(jìn)行探針驗(yàn)證。包含 中期或間期染色體DNA，熒光原位雜交時(shí)，染色體DNA表現(xiàn)為形態(tài)上可識(shí)別的染色體或是細(xì)胞核。
實(shí)施例2 :P16基因檢測(cè)試劑盒制備 以10人份/盒為例。(1)雜交液配制取少量P16基因探針稀釋成50ng/ul，按下表配制雜交液 (2)DAPI復(fù)染劑配制
抗褪色液全程操作必須避光，10mg的對(duì)苯二胺溶于1ml的PBS中，加入9ml甘油， 反復(fù)震蕩混勻，調(diào)節(jié)PH為9.0，-20°C儲(chǔ)存。終溶液應(yīng)該為無(wú)色或者略帶淡黃色，假如呈現(xiàn) 黃色或者橙色則需廢棄并重新配制。用去離子水配制lmg/ml DAPI儲(chǔ)存液。取2. 5ul的DAPI溶液(lmg/ml)溶于1ml抗褪色液中，避光條件下反復(fù)震蕩混 勻，-20°C避光密閉保存。(3)成品組裝 實(shí)施例3 :P16基因檢測(cè)試劑盒的使用方法以人類(lèi)正常分裂中期淋巴細(xì)胞為例。(1)人外周血培養(yǎng)及染色體制備采血用肝素潤(rùn)濕注射針筒(0. 2ml)后，常規(guī)取靜脈血1 2ml，轉(zhuǎn)動(dòng)針筒混勻肝 素。接種(在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌操作)在每個(gè)培養(yǎng)瓶中(含20%血清的1640培養(yǎng)液5ml， pH7. 2)，加入全血0.25 0.30ml (7號(hào)針頭13 15滴)、PHA 5mg，蓋緊膠塞，輕輕搖勻。培 養(yǎng)將培養(yǎng)瓶放在37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h。終止培養(yǎng)前2 4h，加入0. 01%秋水仙素 溶液(100 u g/ml) 1 2滴(7號(hào)針頭)，使終濃度為0. 2 u g/ml培養(yǎng)液。輕輕搖勻后，放回 培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 4h。收獲將培養(yǎng)后的血細(xì)胞收集在離心管中，平衡后lOOOr/min離 心8min，棄去上清。(2)樣品處理低滲向離心管中加入37°C 0. O75mol/LKC1溶液至8ml，用吸管輕輕吹打混勻細(xì) 胞，置于37°C水浴箱溫育15min。預(yù)固定向離心管中滴加新配制的甲醇-冰醋酸固定液 1 2ml，用吸管輕輕吹打混勻后lOOOr/min離心8min，棄去上清。固定加入新配制的固 定液至8ml，室溫靜置30min。3000r/min離心8min，棄去上清?？稍僦貜?fù)固定1次。制片 根據(jù)沉淀細(xì)胞的多少，加入適量新鮮固定液(0. 5 1ml)，輕輕吹打制成細(xì)胞懸液。用滴管 吸取少量細(xì)胞懸液，滴至載玻片上，鏡檢。(3)制片取干凈載玻片，重懸細(xì)胞后分別取3ul，10ul和30ul懸液滴加到載玻片上的不同 位置，注意不要重疊；室溫下晾干；用20X物鏡在相差顯微鏡下觀察三個(gè)區(qū)域的細(xì)胞密度， 記錄細(xì)胞沒(méi)有明顯重疊，且數(shù)量在100 200個(gè)以上所加的細(xì)胞懸液量；如果細(xì)胞密度及數(shù) 目合適，另取一張干凈的載玻片，滴加適量的細(xì)胞懸液；如果滴加30ul懸液的區(qū)域仍然細(xì) 胞數(shù)目太少，另取30ul懸液重復(fù)滴到該區(qū)域，晾干，觀察；如果滴加3ul懸液的區(qū)域仍然細(xì) 胞數(shù)目太多，用新鮮固定液稀釋細(xì)胞懸液，重復(fù)步驟滴片觀察。(4)玻片乙醇老化將熱臺(tái)加熱到95度；取出蓋玻片，擦干備用；一塊折疊為方形的4 8層紗布，浸 透無(wú)水乙醇；在載玻片的雜交區(qū)域上各滴加160ul的無(wú)水乙醇；輕輕蓋上24 X 24mm的蓋玻 片，輕壓緊；將載玻片置于95°C預(yù)熱的熱臺(tái)上，蓋上浸透了無(wú)水乙醇的紗布(完全覆蓋載玻 片)，再蓋上事先準(zhǔn)備好的方形蓋子(完全覆蓋載玻片)，計(jì)時(shí)2分鐘；從熱臺(tái)上去除蓋子、 紗布，取下載玻片，輕輕去除蓋玻片，繼續(xù)預(yù)處理步驟。(5)玻片預(yù)處理玻片放入37士 1°C的1XPBS中孵育5分鐘，胃蛋白酶溶液中消化15分鐘；1XPBS 室溫洗滌3分鐘；多聚甲醛/PBS室溫固定10分鐘；1XPBS室溫洗滌3分鐘；70%、85%、 100%梯度乙醇脫水各3分鐘；室溫晾干玻片；繼續(xù)雜交過(guò)程。(6)樣品和探針同時(shí)變性從試劑盒中取出雜交液，震蕩混勻，瞬時(shí)離心；加8ul的雜交液到雜交區(qū)域，迅速蓋上蓋玻片，輕壓使雜交液均勻分布，避免產(chǎn)生氣泡；橡皮膠水沿蓋玻片邊緣封片，完全覆 蓋蓋玻片與載玻片接觸的邊緣；78士 1°C的熱臺(tái)上變性2分鐘30秒；將玻片放入預(yù)熱的雜 交盒中，避光，37士 1°C孵育過(guò)夜(約16小時(shí))；繼續(xù)雜交后洗滌步驟。(7)雜交后洗滌及復(fù)染一般洗滌方法(推薦使用)取出孵育過(guò)夜的雜交盒，小心去除橡皮膠水和蓋玻 片；將玻片放入37 士 1 °C的50 %甲酰胺/2 X SSC洗滌15分鐘；再將其放入2 X SSC的染色缸 中，37 士 1°C洗滌15分鐘；再將其放入盛有0. 1% NP40/2XSSC的染色缸中，37 士 1°C洗滌5 分鐘；室溫70%、85%、100%梯度乙醇依次脫水各3分鐘；暗處晾干?？煜捶椒ㄈ〕龇跤^(guò)夜的雜交盒，小心去除橡皮膠水和蓋玻片；將玻片放入 73 士 1°C的0. 3 % NP40/0. 4 X SSC中，洗滌2分鐘；再將其放入0. 1 % NP40/2 X SSC中，室溫 洗滌2分鐘；室溫70%、85%、100%梯度乙醇依次脫水各3分鐘；暗處晾干。復(fù)染滴加10ul DAPI到載玻片目標(biāo)區(qū)域，蓋上蓋玻片，輕壓，避免產(chǎn)生氣泡，在暗 處存放，待觀察。(8)結(jié)果分析在Olympus BX60熒光顯微鏡下，用WU、WG濾鏡組分別觀察DAPI復(fù)染的分裂相和 雜交的熒光信號(hào)，用C⑶照相記錄。在40X物鏡下尋找，在100X物鏡下計(jì)數(shù)；調(diào)整合適的 焦距，對(duì)信號(hào)和背景有明確的概念；信號(hào)點(diǎn)因位于細(xì)胞內(nèi)；當(dāng)細(xì)胞外存在熒光信號(hào)點(diǎn)時(shí)，要 注意與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)點(diǎn)區(qū)分，最好能避開(kāi)該區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)；調(diào)整焦距，在核的不同層次找到信 號(hào)點(diǎn)；記錄觀察每個(gè)細(xì)胞中的P16基因數(shù)目。(9)結(jié)果判定按處理方法要求進(jìn)行操作，記錄P16基因數(shù)目(參見(jiàn)附圖2)。熒光原位雜交結(jié)果 顯示，中期染色體上可見(jiàn)兩個(gè)信號(hào)點(diǎn)，未見(jiàn)其它熒光信號(hào)；間期細(xì)胞核中僅見(jiàn)兩個(gè)信號(hào)點(diǎn)， 未見(jiàn)其它熒光信號(hào)。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。序列表<110>中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司<120> 一種人染色體P16基因探針的制備方法及其應(yīng)用<140><141><160>2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220> <223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>1atccaacatgccatagctcc<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。<400>2tttgtcccatgtcactggaa
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權(quán)利要求
一種人染色體P16基因探針的制備方法，其特征在于制備步驟包括(1)克隆篩選P16基因位于人染色體9p21區(qū)段，挑選包含有該基因的克??；(2)克隆培養(yǎng)和鑒定購(gòu)買(mǎi)克隆，取適量克隆菌液添加到500ml的TB培養(yǎng)液(氯霉素抗性)中，37℃搖床中搖菌培養(yǎng)24～48小時(shí)；使用STS引物對(duì)進(jìn)行克隆鑒定；(3)P16基因探針制備對(duì)鑒定陽(yáng)性的菌液，進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取；通過(guò)適當(dāng)稀釋質(zhì)粒DNA，對(duì)質(zhì)粒DNA定量；然后，通過(guò)缺口平移方法對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記；對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行乙醇沉淀和濃縮；獲得P16探針，避光、-20℃儲(chǔ)存；(4)P16基因探針驗(yàn)證使用人類(lèi)正常分裂中期淋巴細(xì)胞滴片進(jìn)行探針驗(yàn)證。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于克隆篩選步驟中挑選的克隆號(hào)為 RP11-149I2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于克隆培養(yǎng)和鑒定步驟中使用的STS引物序列 分別為上游引物 5，-ATCCAACATGCCATAGCTCC-3，和下游引物 5，-TTTGTCCCATGTCACTGGAA-3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于克隆培養(yǎng)和鑒定步驟中PCR擴(kuò)增條件均為 950C 5 分鐘；(94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C 45 秒)X 40 循環(huán)；72°C 10 分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于P16基因探針標(biāo)記的熒光素為熒光素標(biāo)記的 dUTPo
6.一種P16基因探針檢測(cè)試劑盒，包括1)雜交液、DAPI復(fù)染劑，和2)分隔并集中包 裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中雜交液由雜交緩沖液、熒光標(biāo)記的P16基因探針和H2O配 制而成，其特征在于每人份雜交液中使用P16基因探針的量為1. 5ul 3ul，雜交緩沖液為 7ul。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的試劑盒，其特征還在于雜交緩沖液中去離子甲酰胺濃度為50% 70%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人染色體P16基因探針的制備方法，還涉及利用人染色體P16基因探針制備一種人染色體P16基因檢測(cè)試劑盒，應(yīng)用本發(fā)明的人染色體P16基因探針及相應(yīng)的試劑盒可以對(duì)人染色體P16基因異常進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101886104SQ20091003941
公開(kāi)日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2009年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月12日
發(fā)明者何瑰, 李明, 陳娟 申請(qǐng)人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司