專利名稱：：沉默巨噬細(xì)胞游走抑制因子表達(dá)的小干擾rna序列的制作方法沉默巨噬細(xì)胞游走抑制因子表達(dá)的小干擾RNA序列
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種沉默巨噬細(xì)胞游走抑制因子表達(dá)的小干擾RNA序列。
背景技術(shù)：
：目前惡性腫瘤治療常采用手術(shù)、化療、放療、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑治療相結(jié)合的綜合治療，但總體療效仍不令人滿意。因此，人們?cè)诓粩鄬ふ倚碌闹委煼椒?。隨著新理論的確立和新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，為惡性腫瘤新療法的出現(xiàn)打下基礎(chǔ)。巨噬細(xì)胞游走抑制因子(Macrophagemigrationinhibitoryfactor,以下簡(jiǎn)稱MIF)在包括胃癌、月市癌、月干癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、卵巢癌等多種腫瘤中都高表達(dá)，MIF能促進(jìn)惡性腫瘤增殖和血管生成、抑制惡性腫瘤凋亡，因而對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起重要作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種沉默巨噬細(xì)胞游走抑制因子(MIF)表達(dá)的小干擾RNA序列。本發(fā)明由兩對(duì)沉默巨噬細(xì)胞游走抑制因子(MIF)表達(dá)的小干擾RNA序列所組成。兩對(duì)沉默MIF表達(dá)的小干擾RNA(siRNA)(將它們分別命名為MIFsi-l和MIFsi-2)的序列分別為MIFsi-1:正義5，-ACAUCAACUAUUACGACAUGAACGCGGdTdT-3'，反義5，-CCGCGUUCAUGUCGUAAUAGUUGAUGUdTdT墨3，。MIFsi-2:正義5，-CAUCAUGCCGAUGUUCAUCGUAAACACdTdT陽3，，反義5，-GUGUUUACGAUGAACAUCGGCAUGAUGdTdT-3'。本發(fā)明具有沉默MIF表達(dá)效率高，對(duì)惡性腫瘤有抑制作用，因而對(duì)多種惡性腫瘤有潛在治療作用。沉默MIF表達(dá)的siRNA對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用研究1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染1.1細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)箱設(shè)置為37°C，5%C02，飽和濕度條件下，人胃癌AGS細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中傳代養(yǎng)。1.2MIFsiRNA的設(shè)計(jì)針對(duì)人類MIF基因mRNA序列，設(shè)計(jì)MIFsiRNA和陰性對(duì)照(NC)siRNA如下(siRNA寡核苷酸序列均由27堿基構(gòu)成)。MIFsi-1:正義5，-ACAUCAACUAUUACGACAUGAACGCGGdTdT-3，，反義5，-CCGCGUUCAUGUCGUAAUAGUUGAUGUdTdT-3，。MIFsi-2:正義5，-CAUCAUGCCGAUGUUCAUCGUAAACACdTdT-3，，反義5,-GUGUUUACGAUGAACAUCGGCAUGAUGdTdT-3，。:正義5，-GUUGCGCCCGCGAAUGAUAUUUAUAAUdTdT-3'，反義5，-AUUAUAAAUAUCAUUCGCGGGCGCAACdTdT-3，。1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染1.3.1轉(zhuǎn)染前一天，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的1.5X1(^個(gè)AGS細(xì)胞接種在6孔板上，1.5ml含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，24h細(xì)胞密度達(dá)到30-50%。1.3.2200pmolMIFsi-l用無血清Opti-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋成終體積185ul，輕輕混勻。1.3.3在24ul的無血清Opti-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基中加入脂質(zhì)體Oligofectamine6ul，輕輕混勻室溫下放置5min。1.3.4將稀釋好的MIFsi-l和Oligofectamine試劑混合，輕輕混勻室溫放置20min，以便形成復(fù)合物。1.3.5將215ul的復(fù)合物加入800ul無血清Opti-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基的6孔板中，總體積為1015ul，siRNA的終濃度為100pmol/ml，37°C,5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4-6h。1.3.64-6h后吸凈6孔板內(nèi)舊培養(yǎng)液，加入2ml含10%FBS的RPMI-1640新鮮培養(yǎng)基，37°C，5%(302的培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24h、48h、72h提RNA或蛋白。1.3.7MIFsi-2和陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染NC操作同上，終濃度為100pmol/ml;空白對(duì)照組Mock組加1ml無血清Opti-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基(含6ulOligofectamine),4-6h后換成2ml10%FBS的RPMI-1640新鮮培養(yǎng)基。2.細(xì)胞的RNA抽提采用Trizol試劑一歩法提取胃癌細(xì)胞RNA。3.RT-PCR檢測(cè)MIF基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)步驟3.1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)3丄1取薄壁離心管(RNasefree)加入如下反應(yīng)體系，7(TC變性5分鐘(min)，立即4。C冷卻。模板RNA(totalRNA)2ugOligo(dT)(0.1ug/ul)0.5ugdNTPmix(各2.5mM)0.5ul加H20(DEPC處理)至總體積5ul3丄2按反應(yīng)體系下面順序依次加入各試劑，37'C反應(yīng)5min5Xbuffer2ulRTase0.5ulRibonucleaseinhibitor0.25ul加H20(DEPC處理)至總體積10ul3.1.3在PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，42。C溫育60min，70°C15min終止反應(yīng)，《C冷卻。逆轉(zhuǎn)錄的cDNA于-2(TC貯存?zhèn)溆谩?.2PCR擴(kuò)增反應(yīng)3.2.1根據(jù)Genbank人類的MIF的cDNA序列(GeneID:4282)，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primers設(shè)計(jì)引物，并由Invitrogen公司合成。由于OligoDNA呈很輕的膜狀附在管壁上，在使用前先瞬時(shí)離心，再輕輕打開管蓋，用去離子水溶解為10pmol/ul后，貯存-2(TC備用。各引物序列如下表2:PCR各引物序列及片段大小基因序列長(zhǎng)度(bp)GAPDHsense5'-TTTGGTATCGTGGAAGGAC-3'Antisense5'-AAAGGTGGAGGAGTGGGT-3'410MIFsense5，-CAGTGGTGTCCGAGAAGTCAG-3'440antisense5'-TAGGCGAAGGTGGAGTTGTT陽3'3.2.2取出已擴(kuò)增的cDNA在冰上溶解，因?yàn)閮?nèi)參GAPDH和目的條帶MIF的長(zhǎng)度相近，所以要分別進(jìn)行PCR反應(yīng)。3.2.3PCR反應(yīng)體系如下TemplatecDNA1ulPremixTaq酶12.5ulPrimerMIF/GAPDH(sense+antisense)_1ul加H20(DEPC處理)至總體積25ul3.2.4PCR擴(kuò)增程序94°C5min熱啟動(dòng)，94°C30sec,57°C35sec,72°C45sec，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。72。C延伸7min，后-2(TC存儲(chǔ)。3.2.5DNA電泳取10ulPCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入含EB的1.5%瓊脂糖凝膠中，以100v/cm電壓電泳約30min，在紫外線照射下可見相應(yīng)長(zhǎng)度的人MIF擴(kuò)增條帶，用凝膠電泳成像分析系統(tǒng)掃描分析電泳圖像。4.細(xì)胞樣品的蛋白提取將細(xì)胞培養(yǎng)基棄去后，用PBS液清洗三次后，每1-5乂105個(gè)細(xì)胞重懸于50ul裂解液中，吹打均勻，冰浴下用細(xì)胞刮，刮后將細(xì)胞液移至EP管中，冰上靜置30min，于4。C離心，20000gX30min，收集上清，經(jīng)Bradford法測(cè)定蛋白含量，貯存-8(TC備用。5.蛋白質(zhì)含量測(cè)定(Bradford法)75.1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別取濃度為1ug/ul的小牛血清蛋白(BSA)0,5ul,10ul，15ul,20ul和25ul置試管中，分別加水100ul,95ul,90ul,85ul,80ul,75ul，再于每只試管分別加入Bradford工作液lml，混勻后放置2min，以含BSAOug/ul的溶液為空白對(duì)照，lh內(nèi)測(cè)定各管在595nm處吸收值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。5.2樣本蛋白質(zhì)含量測(cè)定取1ul蛋白樣本溶液，加99ulddH20和1mlBradfordl工作液混勻，放置2min，以含BSAOug/ul的溶液為空白對(duì)照，測(cè)定595nm處吸收值。將吸收值帶入步驟6.1所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本蛋白質(zhì)含量。5.3蛋白樣品的變性按h1比例混合樣品和5XSDS-PAGE樣品緩沖液，煮沸5min，室溫冷卻5min。6.免疫印跡(Westernblot)檢測(cè)MIF的表達(dá)6.1SDS-PAGE電泳6丄1分離膠/濃縮膠的灌制按照表1配制丙烯酰胺分離膠溶液，將所配溶液灌入玻璃板后，覆蓋水壓平液面，室溫聚合，棄去覆蓋液。表312%聚丙烯酰胺分離膠配方分離膠(12%)mlddH201.651.25Acr/Bis(30%)210%SDS0.0510%APS0.05TEMED0.003Total5按照表4配制丙烯酰胺濃縮膠液，將所配溶液立即加在聚合好的分離膠上，插入梳子，室溫聚合。表45%聚丙烯酰胺濃縮膠配方濃縮膠(5%)mlddH201.021.5mol/LTris-HCL(pH6.8)0.1875Acr/Bis(30%)0.2510%SDS0.01510%APS0.015TEMED0.003Total1.56.1.2SDS-PAG蛋白質(zhì)電泳蛋白質(zhì)樣品上樣:調(diào)整樣品蛋白質(zhì)濃度，使每個(gè)泳道上樣的蛋白質(zhì)為20ug。以蛋白Marker作為分子量對(duì)照。電泳在Bio-Rad電泳槽中進(jìn)行，樣品在濃縮膠中運(yùn)行電壓為60v，到達(dá)分離膠界面時(shí)，電壓調(diào)升至80v，繼續(xù)電泳直至溴酚蘭到分離膠底部。6.2電轉(zhuǎn)移6.2.1切除棄去濃縮膠。在分離膠右下切角作標(biāo)記，在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15min。剪取與分離膠大小相同并做好標(biāo)記的PVDF膜和兩塊3mm濾紙。PVDF膜先在甲醇中浸透約15sec，然后轉(zhuǎn)入ddH20中平衡5min，取出后浸入轉(zhuǎn)移緩沖液5-10min。濾紙亦在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸5-10min。自下而上依次疊放濾紙、膜、凝膠、另外一張濾紙，疊放時(shí)每一歩都要注意趕除氣泡。6.2.2放置在Bio-Rad半干電轉(zhuǎn)儀陽極板上，蓋上帶陰極板的上蓋。設(shè)置恒電壓10v，45min-lh。6.2.3轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將PVDF膜浸入甲醇10sec，后轉(zhuǎn)入ddH20中平衡5min。6.3免疫檢測(cè)及EC.L化學(xué)發(fā)光6.3.1用封閉液(5%脫脂奶粉和0.5%Tween的TBST)室溫下封閉轉(zhuǎn)移后的PVDF膜lh。6.3.2根據(jù)蛋白Marker指示的MIF，a-Tubulin的位置將PVDF膜剪開，然后分別放入用塑料薄膜手套自制的雜交袋中，分別加入用封閉液1:200稀釋的兔抗人MIF多克隆抗體，1:1000稀釋的小鼠抗人a扁Tubulin單克隆抗體，趕除氣泡后封袋口，4。C搖床過夜。6.3.3TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。6.3.4分別加入相應(yīng)的用封閉液1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗鼠和山羊抗兔抗體，室溫反應(yīng)lh。6.3.5TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。6.3.6ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)等量混合ECL中的A液和B液(按照0.1ml反應(yīng)膠/cm2PVDF的量配置)平鋪于封口膜上，然后將PVDF膜的蛋白印跡面向下蓋于其上，輕輕趕走氣泡，室溫孵育反應(yīng)3-5min。6.3.7瀝干PVDF膜上多余的ECL試劑，將PVDF膜置于兩層保鮮膜間，小心趕去氣泡，膜的蛋白印跡面向上放入暗盒。于暗室內(nèi)壓X底片曝光，顯影、定影，水洗膠片晾千后保存。7.噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖7.1實(shí)驗(yàn)步驟7丄1接種細(xì)胞用含10%胎小牛血清得RPMI-1640培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔3.5乂103個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100ul，每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)復(fù)孔。7丄2培養(yǎng)細(xì)胞及轉(zhuǎn)染次日細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別取100nmol/L濃度MIFsi畫l，MIFsi-2，NC轉(zhuǎn)染胃癌AGS細(xì)胞。7丄3呈色轉(zhuǎn)染培養(yǎng)于24h,48h,72h后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS，pH值7.4)20ul。在37。CC02培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加100ulDMSO，振蕩5min，使結(jié)晶物充分融解。7丄4比色:選擇492nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值(A)，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。8.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)步驟8.1首先進(jìn)行6孔板細(xì)胞轉(zhuǎn)染，具體操作同方法1.3，于轉(zhuǎn)染48h后終止培養(yǎng)，PBS洗兩次，加適量的0.25%胰蛋白酶消化液消化1-2min，注入1.5ml左右的培養(yǎng)液中止消化，吸管吹打至呈單細(xì)胞狀態(tài)。8.2用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，按500個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，補(bǔ)足2ml培養(yǎng)液，置37"C,5y。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8.3培養(yǎng)13天后棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加甲醇3ml左右固定15min，棄去固定液，姬姆薩染色40min，ddH20緩慢洗去染色液，空氣干燥，將6孔板倒置并輕微劃上網(wǎng)格線，普通光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)。9.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，兩因素間的差異比較及相關(guān)性分析采用\2檢驗(yàn)；尸<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染MIFsi-l、MIFsi-2和NC比較，24h、48h、72h的MIFmRNA抑制率分別為為MIFsi-l62.83%、67.28%和76.91%，MIFsi陽256.65%、65.78%和73.86%;MIF蛋白抑制率為MIFsi-l71.00%、72.73%和76.51%，MIFsi-262.94%、66.21%和73.55%。用RNA干擾沉默MIF基因后，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MIFsi-l和MIFsi-2在轉(zhuǎn)染4天后細(xì)胞數(shù)分別為原來2.55±0.13倍和2.62±0.15倍，倍增時(shí)間分別為2.58±0.14天和2.42±0.17天，而NC組和Mock組細(xì)胞數(shù)則為原來的4.21±0.32倍和4.33±0.48倍，倍增時(shí)間為1.25±0.06天和1.08士0.14天。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)MIFsi-l和MIFsi-2沉默MIF基因IO天后，AGS細(xì)胞集落形成數(shù)為33.15士4.12個(gè)和43.25士2.63個(gè)，顯著低于陰性對(duì)照組的103.27土2.80個(gè)和未轉(zhuǎn)染組(Mock組)的112.50士2.10個(gè)(均尸O.OOl)。同時(shí)，MIF沉默后，PCNA表達(dá)下調(diào)。表明沉默MIF表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖有抑制作用。沉默MIF表達(dá)的siRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲力的抑制作用研究方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)革巴向敲除MIF基因，以RT-PCR和Westernblot檢測(cè)MIF在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，通過體外遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)和噻唑藍(lán)比色法(MTT)分析MIF對(duì)HO-8910和OVCAR-3細(xì)胞遷移、侵襲和增殖能力的影響。結(jié)果顯示與陰性對(duì)照組細(xì)胞比較，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MIFsiRNA的HO-8910和OVCAR-3細(xì)胞中MIF基因表達(dá)水平明顯降低。MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染MIFsiRNA的兩株卵巢癌細(xì)胞增殖率顯著低于陰性對(duì)照組(尸<0.05)。轉(zhuǎn)染MIFsiRNA的HO-8910細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)(MIFsi-l:48.0±7.3,MIFsi-2:38.0±3.6)與陰性對(duì)照組(78.0土8.5)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義CP0.05)，其穿過鋪了Matrigel膜的細(xì)胞數(shù)(MIF-sil:35.0±5.0，MIF-si2:30.0±5.6)也顯著少于陰性對(duì)照組(尸<0.05)。同樣，轉(zhuǎn)染了MIFsiRNA的OVCAR-3細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)(MIFsi-l:40.0±4.5，MIFsi-2:42.0±3.0)與陰性對(duì)照組(65±2.1)比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸<0.05)，其穿過鋪了Matrigel膜的細(xì)胞數(shù)(MIFsi-l:25.0±3.0,MIFsi-2:27.0±3.4)也明顯低于陰性對(duì)照組(尸<0.05)。表明沉默MIF表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲力有抑制作用。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)沉默MIF表達(dá)效率高，對(duì)惡性腫瘤有抑制作用，因而對(duì)多種惡性腫瘤有潛在治療作用。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)描述一、實(shí)驗(yàn)材料1細(xì)胞系及培養(yǎng)條件人胃癌AGS細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生物細(xì)胞研究所，在37°C、5%C02、飽和濕度條件下，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，0.25%胰蛋白酶(含0.02。/。EDTA)消化傳代。2主要試劑Trizol為美國Invitrogen公司產(chǎn)品。M-MulV逆轉(zhuǎn)錄酶、01igo(dT)(0.5ug/ul)、10mmol/LdNTP、RNA酶抑制劑(Ribonucleaseinhibitor)、10XPCRbufferwith(NH4)2S04、25mmol/LMgCl2、TaqDNA聚合酶(1U/ul)、6Xloadingbuffer均為MBIFermentas公司產(chǎn)品。瓊脂糖為加拿大BBI公司產(chǎn)品；5XTAE為上海捷瑞生物工程有限公司產(chǎn)品。十二烷基磺酸鈉(SDS)、過硫酸按溶液(APS)、甘氨酸、Trisbase、EDTA、MTT、DMSO、DEPC、TritonX等均為Ameresco公司產(chǎn)品。蛋白質(zhì)預(yù)染Marker為美國MBIFermentas公司產(chǎn)品?？捡R斯亮藍(lán)、硫脲為美國Sigma公司產(chǎn)品，CHAPS、DTT、Pharmlyte試劑為美國AmershamBioSciences公司產(chǎn)品。兔抗人MIF多克隆抗體為美國SantaCruz公司產(chǎn)品。RT-PCR試劑購自大連TaKaRa公司。RPMI-1640為美國Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清為美國Hyclone公司產(chǎn)品；胰蛋白酶為美國Difco公司產(chǎn)品。丙烯酰胺(Aerylamide，Acr)、N，N，甲叉雙丙烯酰胺(Bis)為美國Sigma公司產(chǎn)品。PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)為美國Piecee公司產(chǎn)品。ECL化學(xué)發(fā)光試劑(SupersignalwestPicoluminol/Enhancersolution,supersignalwestPicostablePeroxidesolution)為美國Piecee生物技術(shù)公司產(chǎn)品。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑由美國DAKO公司提供?？逻_(dá)(Kodak)醫(yī)用X射線膠片為科達(dá)(中國)股份有限公司產(chǎn)品。沉默MIF基因的siRNA和陰性對(duì)照siRNA均為大連TaKaRa公司合成，其中陰性對(duì)照siRNA為一對(duì)無任何靶基因的雙鏈RNA。轉(zhuǎn)染試劑Oligofectamine為美國Invitrogen公司產(chǎn)品。姬姆薩粉、RNaseA、碘化丙啶(propidineiodide,PI)為Sigma公司產(chǎn)品。鼠抗人PCNA單克隆抗體為武漢博士德公司產(chǎn)品。3%多聚甲醛為廣州威家科技公司。3主要設(shè)備超速低溫離心機(jī)德國西門子公司。恒溫離心機(jī)美國Eppendorf公司。Ultrospec3000紫外分光光度度計(jì)英國Pharmacia生物技術(shù)公司。多通道PCR儀(MJPT-220):美國Bio-Rad公司。酶標(biāo)儀Multisranspectrum:美國Thermo公司。凝膠電泳成像分析系統(tǒng)美國Bio-Rad公司，GelDoc-2000型。穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀及水平電泳槽美國Bio-Rad公司。垂直電泳槽、電泳儀、Trans-BlotSD半干電轉(zhuǎn)儀美國Bio-Rad。大型多功能分光光度計(jì)美國MBIFermentas公15司。OLYMPUS光學(xué)顯微鏡日本Olympus公司。酸度計(jì)意大利Hanna公司，PHZn型。Imagescanner掃描儀美國AmershamBiosciences公司。TS-1型脫色搖床江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠。C02細(xì)胞培養(yǎng)箱美國MBIFermentas公司。超凈工作臺(tái)上海匯龍電子儀表有限公司。恒溫水浴箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DK-522型。倒置相差熒光顯微鏡德國Leica公司，ZeissAxiovert200型。各型移液槍、槍頭、細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶德國ComingCostar公司廣口no二、實(shí)驗(yàn)方法i細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染i.i細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)箱設(shè)置為37°C，5%C02，飽和濕度條件下，人胃癌AGS細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中傳代養(yǎng)。1.2MIFsiRNA的設(shè)計(jì)針對(duì)人類MIF基因mRNA序列，設(shè)計(jì)MIFsiRNA和陰性對(duì)照(NC)siRNA如下(siRNA寡核苷酸序列均由27堿基構(gòu)成)。MIFsi-1:正義5，匿ACAUCAACUAUUACGACAUGAACGCGGdTdT-3，，反義5，-CCGCGUUCAUGUCGUAAUAGUUGAUGUdTdT墨3，。MIFsi-2:正義5，-CAUCAUGCCGAUGUUCAUCGUAAACACdTdT墨3，，反義5，-GUGUUUACGAUGAACAUCGGCAUGAUGdTdT-3，。:正義5，-GUUGCGCCCGCGAAUGAUAUUUAUAAUdTdT-3'，反義5，-AUUAUAAAUAUCAUUCGCGGGCGCAACdTdT陽3，。1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染1.3.1轉(zhuǎn)染前一天，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的1.5Xl(f個(gè)AGS細(xì)胞接種在6孔板上，1.5ml含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，24h細(xì)胞密度達(dá)到30-50%。1.3.2200pmolMIFsi-l用無血清Opti-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋成終體積185ul，輕輕混勻。1.3.3在24ul的無血清Opti-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基中加入脂質(zhì)體01igofectamineTM6ul，輕輕混勻室溫下放置5min。1.3.4將稀釋好的MIFsi-l和Oligofectamine試劑混合，輕輕混勻室溫放置20min，以便形成復(fù)合物。1.3.5將215ul的復(fù)合物加入800ul無血清Opti-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基的6孔板中，總體積為1015ul,siRNA的終濃度為100pmol/ml，37°C,5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4-6h。1.3.64-6h后吸凈6孔板內(nèi)舊培養(yǎng)液，加入2ml含10%FBS的RPMI-1640新鮮培養(yǎng)基，37°C，5%(302的培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24h、48h、72h提RNA或蛋白。1.3.7MIFsi-2和陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染NC操作同上，終濃度為100pmol/ml;空白對(duì)照組Mock組加lml無血清Opti-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基(含6ulOligofectamine),4-6h后換成2ml10%FBS的RPMI-1640新鮮培養(yǎng)基。2.細(xì)胞的RNA抽提采用Trizol試劑一步法提取胃癌細(xì)胞RNA。3.RT-PCR檢測(cè)MIF基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)步驟3.1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)3丄1取薄壁離心管(RNasefree)加入如下反應(yīng)體系，7(TC變性5min，立即4。C冷卻。模板RNA(totalRNA)2ugOligo(dT)(0.1ug/ul)0.5ugdNTPmix(各2.5mM)0.5ul加H20(DEPC處理)至總體積5ul3丄2按反應(yīng)體系下面順序依次加入各試劑，37。C反應(yīng)5min5Xbuffer2ulRTase0.5ulRibonucleaseinhibitor0.25ul加H20(DEPC處理)至總體積10ul3.1.3在PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，42。C溫育60min，70°C15min終止反應(yīng)，4'C冷卻。逆轉(zhuǎn)錄的cDNA于-2(TC貯存?zhèn)溆谩?.2PCR擴(kuò)增反應(yīng)3.2.1根據(jù)Genbank人類的MIF的cDNA序列(GeneID:4282)，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primers設(shè)計(jì)引物，并由Invitrogen公司合成。由于OligoDNA呈很輕的膜狀附在管壁上，在使用前先瞬時(shí)離心，再輕輕打開管蓋，用去離子水溶解為10pmol/ul后，貯存-2(TC備用。各引物序列如下表2:PCR各引物序列及片段大小基因序列長(zhǎng)度(bp)GAPDHsense5'-TTTGGTATCGTGGAAGGAC-3'410Antisense5'陽AAAGGTGGAGGAGTGGGT-3'MIFsense5，-CAGTGGTGTCCGAGAAGTCAG-3'440antisense5'墨TAGGCGAAGGTGGAGTTGTT-33.2.2取出已擴(kuò)增的cDNA在冰上溶解，因?yàn)閮?nèi)參GAPDH和目的條帶MIF的長(zhǎng)度相近，所以要分別進(jìn)行PCR反應(yīng)。3.2.3PCR反應(yīng)體系如下TemplatecDNA1ulPremixTaq酶12.5ulPrimerMIF/GAPDH(sense+antisense)_1ul加H20(DEPC處理)至總體積25ul3.2.4PCR擴(kuò)增程序94°C5min熱啟動(dòng)，94。C30sec,57°C35sec,72°C45sec，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。72。C延伸7min，后-2(TC存儲(chǔ)。3.2.5DNA電泳取10ulPCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入含EB的1.5%瓊脂糖凝膠中，以100v/cm電壓電泳約30min，在紫外線照射下可見相應(yīng)長(zhǎng)度的人MIF擴(kuò)增條帶，用凝膠電泳成像分析系統(tǒng)掃描分析電泳圖像。4.細(xì)胞樣品的蛋白提取將細(xì)胞培養(yǎng)基棄去后，用PBS液清洗三次后，每1-5乂105個(gè)細(xì)胞重懸于50ul裂解液中，吹打均勻，冰浴下用細(xì)胞刮，刮后將細(xì)胞液移至EP管中，冰上靜置30min，于4。C離心，20000gX30min，收集上清，經(jīng)Bradford法測(cè)定蛋白含量，貯存-8(TC備用。5屋白質(zhì)含量測(cè)定(Bradford法)5.1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別取濃度為1ug/ul的小牛血清蛋白(BSA)0，5ul,10ul，15ul,20ul和25ul置試管中，分別加水100ul,95ul,90ul,85ul,80ul,75ul，再于每只試管分別加入Bradford工作液lml，混勻后放置2min，以含BSAOug/ul的溶液為空白對(duì)照，lh內(nèi)測(cè)定各管在595nm處吸收值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。5.2樣本蛋白質(zhì)含量測(cè)定取lul蛋白樣本溶液，加99ulddH20和1mlBradford工作液混勻，放置2min，以含BSAOug/ul的溶液為空白對(duì)照，測(cè)定595nm處吸收值。將吸收值帶入步驟6.1所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本蛋白質(zhì)含量。5.3蛋白樣品的變性按1:1比例混合樣品和5XSDS-PAGE樣品緩沖液，煮沸5min，室溫冷卻5min。6.免疫印跡(Westernblot)檢測(cè)MIF的表達(dá)6.1SDS-PAGE電泳6丄1分離膠/濃縮膠的灌制按照表1配制丙烯酰胺分離膠溶液，將所配溶液灌入玻璃板后，覆蓋水壓平液面，室溫聚合，棄去覆蓋液。表312%聚丙烯酰胺分離膠配方分離膠(12%)mlddH201.651.5mol/LTris-HCL(pH8.8)1.25Acr/Bis(30%)210%SDS0.0510%APS0.05TEMED0.003Total5按照表4配制丙烯酰胺濃縮膠液，將所配溶液立即加在聚合好的分離膠上，插入梳子，室溫聚合。表45%聚丙烯酰胺濃縮膠配方濃縮膠(5%)mlddH201.021.5mol/LTris-HCL(pH6.8)0.1875Acr/Bis(30%)0.2510%SDS0.01510%APS0.015TEMED0.003Total1.56.1.2SDS-PAG蛋白質(zhì)電泳蛋白質(zhì)樣品上樣調(diào)整樣品蛋白質(zhì)濃度，使每個(gè)泳道上樣的蛋白質(zhì)為20ug。以蛋白Marker作為分子量對(duì)照。電泳在Bio-Rad電泳槽中進(jìn)行，樣品在濃縮膠中運(yùn)行電壓為60v，到達(dá)分離膠界面時(shí)，電壓調(diào)升至80v，繼續(xù)電泳直至溴酚蘭到分離膠底部。6.2電轉(zhuǎn)移6.2.1切除棄去濃縮膠。在分離膠右下切角作標(biāo)記，在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15min。剪取與分離膠大小相同并做好標(biāo)記的PVDF膜和兩塊3mm濾紙。PVDF膜先在甲醇中浸透約15sec，然后轉(zhuǎn)入ddH;zO中平衡5min，取出后浸入轉(zhuǎn)移緩沖液5-10min。濾紙亦在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸5-10min。。自下而上依次疊放濾紙、膜、凝膠、另外一張濾紙，疊放時(shí)每一步都要注意趕除氣泡。6.2.2放置在BioRad半干電轉(zhuǎn)儀陽極板上，蓋上帶陰極板的上蓋。設(shè)置恒電壓10v，45min陽lh。6.2.3轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將PVDF膜浸入甲醇10sec，后轉(zhuǎn)入ddH20中平衡5min。6.3免疫檢測(cè)及ECL化學(xué)發(fā)光6.3.1用封閉液(5%脫脂奶粉和0.5%Tween的TBST)室溫下封閉轉(zhuǎn)移后的PVDF膜1h。6.3.2根據(jù)蛋白Marker指示的MIF,a-Tubulin的位置將PVDF膜剪開，然后分別放入用塑料薄膜手套自制的雜交袋中，分別加入用封閉液1:200稀釋的兔抗人MIF多克隆抗體，1:1000稀釋的小鼠抗人a-Tubulin單克隆抗體，趕除氣泡后封袋口，4"C搖床過夜。6.3.3TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。6.3.4分別加入相應(yīng)的用封閉液1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗鼠和山羊抗兔抗體，室溫反應(yīng)lh。6.3.5TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。6.3.6ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)等量混合ECL中的A液和B液(按照0.1ml反應(yīng)膠/cm2PVDF的量配置)平鋪于封口膜上，然后將PVDF膜的蛋白印跡面向下蓋于其上，輕輕趕走氣泡，室溫孵育反應(yīng)3-5min。6.3.7瀝干PVDF膜上多余的ECL試劑，將PVDF膜置于兩層保鮮膜間，小心趕去氣泡，膜的蛋白印跡面向上放入暗盒。于暗室內(nèi)壓X底片曝光，顯影、定影，水洗膠片晾千后保存。7.噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖7.1實(shí)驗(yàn)步驟7丄1接種細(xì)胞用含10%胎小牛血清得RPMI-1640培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔3.5X1()S個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100ul，每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)復(fù)孔。7丄2培養(yǎng)細(xì)胞及轉(zhuǎn)染次日細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別取10Onmol/L濃度MIFsi-l，MIFsi-2，NC轉(zhuǎn)染胃癌AGS細(xì)胞。7丄3呈色:轉(zhuǎn)染培養(yǎng)于24h,48h，72h后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS，pH值7.4)20ul。在37。CC02培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加100ulDMSO，振蕩5min，使結(jié)晶物充分融解。7丄4比色選擇492nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值(A)，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。8.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)步驟8.1首先進(jìn)行6孔板細(xì)胞轉(zhuǎn)染，具體操作同方法1.3，于轉(zhuǎn)染48h后終止培養(yǎng)，PBS洗兩次，加適量的0.25%胰蛋白酶消化液消化1-2min，注入1.5ml左右的培養(yǎng)液中止消化，吸管吹打至呈單細(xì)胞狀態(tài)。8.2用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，按500個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，補(bǔ)足2ml培養(yǎng)液，置37"C，5y。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8.3培養(yǎng)13天后棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加甲醇3ml左右固定15min，棄去固定液，姬姆薩染色40min，ddH20緩慢洗去染色液，空氣干燥，將6孔板倒置并輕微劃上網(wǎng)格線，普通光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)。9.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，兩因素間的差異比較及相關(guān)性分析采用^2檢驗(yàn)；尸<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、結(jié)果顯示AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染MIFsi-l、MIFsi-2和NC比較，24h、48h、72h的MIFmRNA抑制率分別為為MIFsi-l62.83%、67.28%和76.91%，MIFsi-256.65%、65.78%和73.86%;MIF蛋白抑制率為MIFsi隱l71.00%、72.73%和76.51%,MIFsi-262.94%、66.21%和73.55%。用RNA干擾沉默MIF基因后，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MIFsi-l和MIFsi-2在轉(zhuǎn)染4天后細(xì)胞數(shù)分別為原來2.55±0.13倍和2.62±0.15倍，倍增時(shí)間分別為2.58±0.14天和2.42±0.17天，而NC組和Mock組細(xì)胞數(shù)則為原來的4.21±0.32倍和4.33±0.48倍，倍增時(shí)間為1.25±0.06天和1.08±0.14天。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)MIFsi-1和MIFsi-2沉默MIF基因IO天后，AGS細(xì)胞集落形成數(shù)為33.15士4.12個(gè)和43.25土2.63個(gè)，顯著低于陰性對(duì)照組的103.27土2.80個(gè)和未轉(zhuǎn)染組(Mock組)的112.50士2.10個(gè)(均尸O駕)。同時(shí)，MIF沉默后，PCNA表達(dá)下調(diào)。上述結(jié)果表明用siRNA沉默MIF表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖有抑制作用。<110〉中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院朱，森林<120〉沉默巨噬細(xì)胞游走抑制因子表達(dá)的小干擾RNA序列<130><160>2<170〉Patentlnversion3.4<210>1〈211〉58<212>RNA<213〉人工序列<400〉1acaucaacuauuacgacaugaacgcggddccgcguucaugucguaauaguugaugudd58<210〉2<211〉58<212>RNA〈213>人工序列〈400〉2caucaugccgauguucaucgimaacacddguguuuacgaugaacaucggcaugaugdd58權(quán)利要求1、一種沉默巨噬細(xì)胞游走抑制因子表達(dá)的小干擾RNA序列，其有兩對(duì)，將它們分別命名為巨噬細(xì)胞游走抑制因子(Macrophagemigrationinhibitoryfactor，MIF)si-1和巨噬細(xì)胞游走抑制因子(Macrophagemigrationinhibitoryfactor，MIF)si-2，其特征在于它們的序列分別為MIFsi-1正義5’-ACAUCAACUAUUACGACAUGAACGCGGdTdT-3’，反義5’-CCGCGUUCAUGUCGUAAUAGUUGAUGUdTdT-3’；MIFsi-2正義5’-CAUCAUGCCGAUGUUCAUCGUAAACACdTdT-3’，反義5’-GUGUUUACGAUGAACAUCGGCAUGAUGdTdT-3’。全文摘要本發(fā)明涉及一種沉默巨噬細(xì)胞游走抑制因子(Macrophagemigrationinhibitoryfactor，MIF)表達(dá)的小干擾RNA，將它們分別命名為MIFsi-1和MIFsi-2。它們的序列分別為MIFsi-1正義5’-ACAUCAACUAUUACGACAUGAACGCGGdTdT-3’，反義5’-CCGCGUUCAUGUCGUAAUAGUUGAUGUdTdT-3’。MIFsi-2正義5’-CAUCAUGCCGAUGUUCAUCGUAAACACdTdT-3’，反義5’-GUGUUUACGAUGAACAUCGGCAUGAUGdTdT-3’。本發(fā)明具有沉默巨噬細(xì)胞游走抑制因子表達(dá)效率高，對(duì)多種惡性腫瘤有潛在治療作用。文檔編號(hào)C12N15/11GK101591656SQ20091004045公開日2009年12月2日申請(qǐng)日期2009年6月23日優(yōu)先權(quán)日2009年6月23日公開號(hào)200910040454.0發(fā)明者孔祥復(fù),朱森林,胡品津,丹謝,賀龍君申請(qǐng)人:中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院;朱森林