專利名稱：人Bcl-2和人VEGF₁₆₅雙基因共表達(dá)重組載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種雙基因共表達(dá)重組載體及其構(gòu)建方法，特別是涉及一種人Bcl-2和人VEGF165雙基因共表達(dá)重組載體及其構(gòu)建方法。屬于生物基因治療領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
心肌梗死(Myocardium infarction , MI)是在冠狀動(dòng)脈病變基礎(chǔ)上發(fā)生冠狀動(dòng)脈血供急劇減少或中斷，造成相應(yīng)的心肌嚴(yán)重而持久地缺血導(dǎo)致心肌壞死。心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，心肌損傷后不能通過(guò)細(xì)胞再生而修復(fù)，而是形成纖維化瘢痕。目前臨床上對(duì)MI的治療方法主要是藥物治療、冠狀動(dòng)脈介入治療和冠狀動(dòng)脈旁路手術(shù)，這三大方法雖然能使部分病人閉塞的血管再通并恢復(fù)血流灌注， 一定程度上挽救瀕死的心肌，減緩心肌重構(gòu)和心衰進(jìn)程，減輕患者癥狀，降低病死率。但由于這些療法無(wú)法使梗死的心肌再生，使得遠(yuǎn)期預(yù)后仍不理想。心臟移植則由于存在供體缺乏、免疫排斥和費(fèi)用昂貴等缺陷使其在臨床上難以推廣。因此，臨床上需要一種新的治療該疾病的有效手段。
基因治療或?qū)Ω杉?xì)胞基因修飾后移植治療是當(dāng)今研究心肌梗死治療方法的熱點(diǎn)，已進(jìn)入臨床研究的是抗凋亡基因或促血管生成基因等單基因的治療方法。中國(guó)發(fā)明專利CN200810302770.6中涉及一種重組雙基因腺病毒載體，其特點(diǎn)是在一個(gè)載體上重組了兩種不同的基因，雖然其在療效方面效果要比用單基因治療效果好，但是這兩種基因分別是bFGF蛋白的基因和PDGF-B蛋白的基因，同屬于促進(jìn)血管生成的因子，其效果只能是在促進(jìn)血管生成上增加，而且此專利是采用兩個(gè)啟動(dòng)因子，容易產(chǎn)生兩個(gè)啟動(dòng)子間相互抑制導(dǎo)致一條基因表達(dá)抑制另一條基因表達(dá)的弊端。
研究中發(fā)現(xiàn)，Bcl-2基因家族是目前已知的最重要的調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族。Bcl-2基因及其編碼的蛋白質(zhì)能在不影響細(xì)胞周期和分化的情況下抑制細(xì)胞凋亡、延長(zhǎng)細(xì)胞壽命。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)是目前發(fā)現(xiàn)的促血管生成作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子。有研究表明，單獨(dú)應(yīng)用Bcl-2基因或VEGF基因?qū)π募」Ｋ烙忻黠@的治療效果，但仍不理想，有進(jìn)一步提升的空間。在多數(shù)細(xì)胞中Bcl-2基因和VEGF基因之間存在著互相上調(diào)的級(jí)聯(lián)關(guān)系，在生物學(xué)功能上能夠形成協(xié)同作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一，是為了構(gòu)建一種人Bc1-2和人VEGFi65雙基因共表達(dá)重組載體，為聯(lián)合基因治療心肌梗死的研究奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明的目的之二，是為了提供一種上述重組載體的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的目的之一，主要通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
人Bcl-2和人VEGFt65雙基因共表達(dá)重組載體，其特征是所述重組載體包括人Bcl-2基因(hBcl-2)和人VEGF啦基因(hVEGF165);
其中，hBcl-2基因序列如序列表SEQ IDN2: 1所述；hVEGF啦基因序列如序列表SEQ IDNs: 2所述；利用IRES片段連接hBcl-2、 hVEGF股基因，以AdEasy系統(tǒng)為基礎(chǔ)利用細(xì)菌內(nèi)同源重組機(jī)制重組構(gòu)建本發(fā)明hBcl-2和hVEGF^雙基因共表達(dá)重組載體。
本發(fā)明所用載體是腺病毒載體，腺病毒載體宿主范圍廣、轉(zhuǎn)染效率和基因表達(dá)水平高、安全性較好，是基因治療的優(yōu)良載體，是心肌梗死基因治療較為理想的載體。也可以使用其他腺相關(guān)病毒、慢病毒和質(zhì)粒等其他載體。
本發(fā)明的目的之二，主要通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
人Bcl-2和人VEGF啦雙基因共表達(dá)重組載體的構(gòu)建方法，其特征是主要包括以
下幾個(gè)步驟
1)獲得hBcl-2、 hVEGF!65基因；(2)構(gòu)建重組腺病毒穿梭載體pAd-Track-CMV-hBcl-2-IRES-hVEGF165; (3)重組構(gòu)建攜帶hBcl-2基因、IRES片段和hVEGF!65的腺病毒載體質(zhì)粒pAd-Easy -CMV-hBcl-2-IRES-hVEGF165; (4)脂質(zhì)體
轉(zhuǎn)染法介導(dǎo)重組腺病毒載體質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中的包裝。
本發(fā)明的目的之二，還可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明的目的之二的一種實(shí)施方案是步驟l)可以通過(guò)RT-PCR獲得hBcl-2、hVEGF!65基因；根據(jù)Genebank中基因序列設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增hBcl-2和hVEGF^5的PCR引物；
其中擴(kuò)增hBcl-2的PCR弓1物序列是
正向5 ， GAAGATCTATGGCGCACGCTGGGAGAA弓I入BglII位點(diǎn)，反向5 ， ACGCGTCGACTC ACTTGTGGCTBC AGATAGGCACC弓|入SalI位點(diǎn)；擴(kuò)增hVEGF!65的PCR引物序列是
正向5，GCTCTAGAATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGC引入XbaI位點(diǎn)，反向 5 ， CCGGATATCGCTCACCGCCTCGGCTTGTCAC AT弓|入EcoRV位點(diǎn)。
本發(fā)明的目的之二的一種實(shí)施方案是步驟(2)主要包括將人Bcl-2基因、IRES 片段和人VEGFi65依次定向裝載入腺病毒穿梭載體質(zhì)粒。
本發(fā)明的目的之二的一種實(shí)施方案是步驟(3)是以AdEasy系統(tǒng)為基礎(chǔ)，將 線性化去磷酸化的重組穿梭載體質(zhì)粒pAd-Track-CMV-hBd-2-IRES-hVEGF165與骨架 質(zhì)粒pAd-Easy-l利用細(xì)菌內(nèi)同源重組機(jī)制重組。
本發(fā)明具有的有益效果如下
1、 本發(fā)明將具有抗凋亡能力的Bcl-2基因和目前促血管生成作用最強(qiáng)的細(xì)胞因 子VEGF!65基因重組在同一載體上共表達(dá)，在解決了移植細(xì)胞在低氧、炎癥的條件 下生存率低的問(wèn)題的同時(shí)發(fā)揮VEGF165的促血管生成作用，并利用Bcl-2和VEGF165 的相互上調(diào)作用，使單一作用效應(yīng)放大，兩者在生物學(xué)功能上形成協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)而 促進(jìn)心梗后心臟的血管再生、心肌細(xì)胞修復(fù)，加快心功能的恢復(fù)。本發(fā)明將在心肌 梗死的基因治療和細(xì)胞移植研究領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。
2、 本發(fā)明是在同一載體上搭載抗調(diào)亡基因Bcl-2和促血管生成基因VEGF165， 通過(guò)IRES片段的連接來(lái)實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因的共表達(dá)。本發(fā)明利用IRES片段連接hBd-2、 hVEGF165基因?qū)崿F(xiàn)雙基因共表達(dá)，避免了應(yīng)用雙啟動(dòng)子存在啟動(dòng)子間相互抑制的現(xiàn) 象可能導(dǎo)致的基因表達(dá)抑制的弊端。 '


圖l為腺病毒載體構(gòu)建示意圖。 圖2為腺病毒穿梭載體質(zhì)粒圖譜。
圖3為hBcl-2和hVEGF!65的PCR產(chǎn)物電泳圖。圖中，M: DL2000; 1: 734bp的hBcl-2 片段；2: 595bp的hVEGFw5片段。
圖4為pMD19T-hBcl-2質(zhì)粒酶切鑒定圖。圖中，M: DL2000; 1: pMD19T-hBcl-2質(zhì) 粒BglII、 SaJI雙酶切產(chǎn)物。
圖5為pMD19T-hBcl-2質(zhì)粒基因測(cè)序圖。
圖6為pMD19T-hVEGF!65質(zhì)粒酶切鑒定圖。圖中，M: DL2000; 1: pMD19T- hVEGF165 質(zhì)ftXbal、 EcoRV雙酶切產(chǎn)物。
圖7為pMD19T-hVEGFw5質(zhì)?；驕y(cè)序圖。
圖8為穿梭載體質(zhì)粒pAd-Track-CMV-hBcl-2-IRES-hVEGFw5酶切鑒定圖。圖中， M: DL15000 marker h BglIIXSalI雙酶切得到722bp的片段；2- Xbal疋coRV雙酶切得到584bp的 片段；3: XhoIVXbal雙酶切641bp的片段；4: BgimEcoRV雙酶切得到2Kb左右的片段。圖9為重組腺病毒載體質(zhì)粒的酶切鑒定圖。圖中，M: lkb ladder Marker; h重組 腺病毒載體質(zhì)粒PacI單酶切產(chǎn)物。
圖10為重組腺病毒DNA的PCR鑒定。圖中，M: DL2000; 1: 584bp的hVEGF^片段; 2 : 734bp的hBcl-2片段。
圖ll腺病毒包裝擴(kuò)增過(guò)程中HEK293細(xì)胞形態(tài)變化和同視野GFP的表達(dá)。圖中， A:轉(zhuǎn)染后2小時(shí)的HEK293 (x100)B:轉(zhuǎn)染后2小時(shí)GFP的表達(dá)(x100)
C:轉(zhuǎn)染后第3天的HEK293細(xì)胞(x100)D:轉(zhuǎn)染后第3天GFP的表達(dá)(x100)
E:第二輪擴(kuò)增第7天的HEK293細(xì)胞(xl00)F:第二輪擴(kuò)增第7天GFP的表達(dá)(x100)
G:第二輪擴(kuò)增第10天的HEK293細(xì)胞(x200) H:第二輪擴(kuò)增第10天GFP的表達(dá)(x200)
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明，應(yīng)該指出的是，所列舉的實(shí)施例不應(yīng)理解為對(duì) 本發(fā)明的限制。
具體實(shí)施例l
圖1 11構(gòu)成本發(fā)明的具體實(shí)施例1。
人Bcl-2和人VEGFi65雙基因共表達(dá)重組載體，包括人Bcl-2基因和人VEGFi65基因； 其中，人Bcl-2基因序列如序列表SEQ IDNs: 1所述；人VEGFw5基因序列如序列表 SEQ IDN2: 2所述；所述載體是腺病毒載體，也可以使用其他腺相關(guān)病毒、慢病毒 和質(zhì)粒等其他載體。
所述人Bcl-2和人VEGF^雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體的構(gòu)建過(guò)程如圖1所示，
其構(gòu)建方法具體如下
1、主要實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備
生化試劑DNAMarker(日本Takara),胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉(日本 Oxoid)，瓊脂糖(西班牙Biowest)，卡那霉素、氨節(jié)青霉素(美國(guó)Amresco) Trizol 試劑(美國(guó)Invitrogen)。
工具酶和試劑盒逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒、Lipofectamine2000 (美國(guó)Invitrogen)、 質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒(德國(guó)Qiagen)，去內(nèi)毒素中量質(zhì)粒提取試劑盒(德 國(guó)MN) ， PCR引物、LATaq酶試劑盒、pMD19T載體試劑盒(日本Takara) ， T4連 接酶、堿性磷酸酶及限制性內(nèi)切酶BglII、 Sall、 Xbal、 EcoRV、 Xhol、 Xbal、 Pacl、 Pmel (美國(guó)NEB) ， DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、Opti-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清(美國(guó) GIBCO),腺病毒沉淀法純化試劑盒(美國(guó)GENMED)。
質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞株A549肺癌細(xì)胞株、pIRES質(zhì)粒、AdEasy系統(tǒng) (pAd-Track-CMV質(zhì)粒、含pAd-Easy-l質(zhì)粒的大腸桿菌BJ5183、 HEK293細(xì)胞)、大腸 桿菌DH5d(廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中心保存)。
主要儀器與設(shè)備FORMA3111水套C02培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo)、實(shí)時(shí)熒光定 量PCR儀(美國(guó)Bio-md)、超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)、倒置式熒光生物顯微鏡(德國(guó)Leica)、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad)、核酸蛋白定量?jī)x(美國(guó)NanoDrop)、 振蕩培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo)、多功能細(xì)胞電穿孔儀(德國(guó)Eppendorf)。
2、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
2.1hBcl-2、 hVEGF貼基因的獲得
2丄1復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代A549細(xì)胞
取出液氮中保存的A549細(xì)胞，迅速放入37。C的恒溫水浴中，并劇烈搖晃，使其 盡快融化，超凈工作臺(tái)內(nèi)將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，1000rpm離心5min，用含 10。/。FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸浮，并轉(zhuǎn)移至T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充培養(yǎng)液至5 mL， 置37。C、 5。/。C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況。 待細(xì)胞長(zhǎng)至豐度約80%時(shí)棄去舊培液，加入l mL37。C預(yù)熱的胰蛋白酶消化液(0.25X) 消化細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待大部分細(xì)胞變圓、細(xì)胞之間不再連接成 片時(shí)倒去消化液，加入新鮮的培養(yǎng)液，用滴管將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，按1:3比例 接種傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。
2.1.2提取A549細(xì)胞的總RNA
將實(shí)驗(yàn)用的玻璃器皿、EP管、槍頭經(jīng)0.in/。DEPC浸泡過(guò)夜滅活RNA酶，并高 壓滅菌。挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好，豐度約80%的細(xì)胞，按Trizol試劑說(shuō)明書進(jìn)行首先 棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入lmLTrizol試劑鋪蓋細(xì)胞，反復(fù)搖動(dòng)至細(xì)胞脫落后，移至1.5 mL的EP管中，室溫溫育5min。加入0.2mL氯仿，振蕩15 s，靜置2min。 4°C離 心，12000 gxl5min，取上清，將無(wú)色水相輕輕吸出轉(zhuǎn)移至另一 EP管中。力卩入0.5 mL 異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。 4。C離心，12000 gx10 min，可見(jiàn) 少許絮狀沉淀，棄上清。加入lmL75。/。乙醇，顛搖混勻，輕輕洗滌沉淀。4。C離心， 7500gx5min，棄上清。晾干，加入25 pl的DEPC水溶解。取5pl瓊脂糖凝膠電泳 鑒定RNA完整性。核酸蛋白定量?jī)x定量。其余即刻保存于-80。C冰箱。
2.1.3逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA
按M-MLV逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，20 pl反應(yīng)體系
將以下4種試劑加入去RNA酶的PCR管中
。ligo(dT)(500叱/mL) 1 pl
總RNA 2 pl
10mMdNTPMix 1^1
8將混合物65°C加熱5 min，然后快速移至冰上，將PCR管簡(jiǎn)單離心
往PCR管中加3種試劑
5 x First-strand Buffer 4 pi
0.1 M DTT 2^1
40 U/pl Rnase inhibitor 1 pi
輕輕搖勻離心管后37°C放置2 min，往管中加入M-MLV RT 1 pi (200 U),輕輕 搖勻，置PCR儀上37°C孵育50 min， 70°C、 15 min，所得到的cDNA置-20°C保 存作為下一步PCR的模板。
2.1.4 PCR獲得hBcl-2和hVEGF165基因
根據(jù)Genebank中基因序列設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增hBcl-2和hVEGF!65的PCR引物，序列分 別為hBcl隱2:正向5 ， GAAGATCTATGGCGC ACGCTGGGAGAA弓|入BglII位點(diǎn)， 反向5'ACGCGTCGACTCACTTGTGGCTBCAGATAGGCACC弓i入Sail位點(diǎn)； hVEGF165:正向5'GCTCTAGAATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGC弓|入XbaI位 點(diǎn)，反向5，CCGGATATCGCTCACCGCCTCGGCTTGTCACAT弓I入EcoRV位點(diǎn)。
按下列組份配制PCR反應(yīng)液，50^1反應(yīng)體系 TaKaRaLATaq (5，) 1 OxLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus ) dNTP Mixture (各2.5mM) 模板cDNA 上游引物 (20 pM) 下游引物(20 nM) 滅菌蒸餾水
反應(yīng)條件
94。C 3 min
94°C 30 s
58°C (hBcl-2)， 55°C (hVEGF165) 30 s 35個(gè)循環(huán)
72。C 1 min
72°C 10 min
Store at 4°C
0.5 jxl 5^1 8 pi 0.5 pi 1 pi 1 nl 34 pi取10^1PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳(含溴化乙啶的2%瓊脂糖)檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果 如圖3所示，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)734bp的hBcl-2片段和595bp的hVEGF!65片段。
2.1.5從PCR產(chǎn)物中回收純化DNA片段
應(yīng)用QIAquick Gel Extraction Kit凝膠回收純化PCR產(chǎn)物將40 pi PCR產(chǎn)物 全部進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(2%瓊脂糖)，紫外分析儀下用干凈鋒利的手術(shù)刀片切下 含待回收DNA條帶的凝膠，置1.5mL無(wú)色EP管中，稱重。加入Buffer QG (按每 100 mg凝膠加Buffer QG 300 pi)，置50°C水浴10 min;檢査所加Buffer與溶解物 顏色，黃色即完全溶解；將柱子放在2mL收集管上，將上述溶液加于柱上。4°C離 心13000 gxl min;棄去收集管中液體，將吸附柱重新放入收集管中。加入500 pi Buffer QG于柱上，4°C離心13000 gxl min，棄去收集管中液體。加入750 Buffer PE于 柱上，4。C離心13000gxl min，棄去收集管中液體。4°C離心13000gxl min,棄去 收集管。將柱放于一新1.5mLEP管中，加50^1 buffer EB于柱上。放置1 min， 4°C 離心13000 gxl min，此EP管中液體即為回收的DNA片段。取5 pi回收的DNA電 泳檢測(cè)，核酸蛋白定量?jī)x定量。
2.1.6氯化鈣法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5a
a. 用接種環(huán)直接取凍存的大腸桿菌DH5cc，在LB培養(yǎng)基平板表面劃線，于37°C
培養(yǎng)16 h;
b. 挑取一個(gè)單菌落，接種到5mL無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基中，于37°C、 200 rpm 振蕩培養(yǎng)5 h;
c. 培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)到100 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h-3 h，到OD6W=0.3 0.4;
d. 將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，在冰上放置15—30min;
e. 4。C離心，4000 rpmx5 min，棄上清；
f. 加入0.8 mL預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2溶液懸浮沉淀，冰上預(yù)冷10 min;
g. 4。C離心，4000 rpmx5 min，棄上清；
h. 加入0.2 mL預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2溶液懸浮沉淀，加入預(yù)冷的甘油使總體 積為15%，分裝100 pl/管置于一70。C長(zhǎng)期保存。
2.1.7 pMD19T-hBcl-2質(zhì)粒、pMD19T- hVEGF16S質(zhì)粒的獲得
按Takara pMD19T simple vector試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行在微量離心管中配制下列 DNA溶液，全量為5 j^l: 10pMD19-T Simple Vector DNA ( hBcl國(guó)2或hVEGF!6s) 滅菌雙蒸水
1 pi
0.1 pmol up to 5 pi
加入5 pi的SolutionI液，16。C反應(yīng)30min，全量(IO pl)加入至感受態(tài)E. coliDH5a (使用前中在冰中解凍)中，冰中放置30min， 42。C孵育45 s后，再在冰中放置l min, 加入890plLB培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)60 min,取100pl涂布在含有氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基平板，37。C倒置培養(yǎng)16h，形成白色的單菌落。挑選8個(gè)白色菌落分別接種于 2mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37°C、 200 rpm振蕩培養(yǎng)12h，可見(jiàn)液體變渾濁。
2.1.8 pMD19T- hBcl-2質(zhì)粒、pMD19T- hVEGFi65質(zhì)粒的菌落PCR鑒定和測(cè)序鑒定
取50pl菌液1000rpm離心l min，棄上清，加入30 pl雙蒸水，煮沸10min， 1000 rpm離心lmin，取2 pl上清為模板行PCR，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同前。將菌落PCR鑒 定陽(yáng)性的菌液送大連寶生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序引物為M13。
用BglII、 SalI雙酶切pMD19T-hBcl-2質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳見(jiàn)722bp和2.6Kb 的特定酶切產(chǎn)物(如圖4)，基因測(cè)序結(jié)果(如圖5)通過(guò)BLAST比對(duì)與Genebank 中的hBcl-2序列g(shù)ill61277340l完全相同。pMD19T-hVEGF165質(zhì)粒經(jīng)Xbal、 EcoRV 雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳見(jiàn)584bp和2.6Kb的特定酶切產(chǎn)物(如圖6)，基因測(cè)序結(jié) 果(如圖7)通過(guò)BLAST比對(duì)與Genebank中的hVEGF!65序列別19909064|完全相 同。
2.2重組腺病毒穿梭載體質(zhì)粒pAd-Track-CMV-hBcl-2-IRES-hVEGF165的構(gòu)建 2.2.1 pMD19T-hBcl-2、 pMD19T隱hVEGF165、 pAd-Track誦CMV三種質(zhì)粒的提取 按QIAprep Spin Miniprep Kit說(shuō)明書進(jìn)行
a. 取5 nl甘油保存的測(cè)序正確的pMD19T-hBcl-2質(zhì)粒、pMD19T- hVEGF165 質(zhì)粒菌液按l: IOOO體積比例接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基；AdEasy系 統(tǒng)(pAd-Track-CMV)質(zhì)粒接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 過(guò)夜；
b. 室溫下將菌液10000 rpmx3 min離心，吸掉LB培養(yǎng)基；
c. 加入250^1 PI液重懸浮，吹打至不能見(jiàn)有細(xì)菌團(tuán)塊，然后轉(zhuǎn)移入EP管；
d. 加入250 nlP2液，倒置搖晃4-6次(不可震蕩)，至完全混合，為藍(lán)色；
e. 加入350 ^1N3液，馬上倒置搖晃4-6次，至為白色；
11f. 13000 rpmxlO min離心，將上清吸至柱子，13000 rpmx 60 s離心，棄廢液；g. 加入500 plPB液，然后13000 rpmx 60s離心；h. 加入750 nl PE液，13000卬mx 60s離心，棄廢液，再離心一次去除剩余洗液；i. 置一干凈的EP管于柱子下面，加入50plEB液至柱子中間，靜置lmin，離 心lmin，分別得到三種質(zhì)粒，并用核酸蛋白定量?jī)x定量。2.2.2重組pAd-Track-CMV-hBcl-2質(zhì)粒分別將pAd-Track-CMV、 pMD19T-hBcl-2用BglII、 Sail雙酶切，50 pl酶切體系pAd-Tmck-CMV 2嗎 或pMD19T-hBcl-2BglII 1 plSail 1 pl10xNEB緩沖液3 5 nl100xBSA 0.5 pl滅菌雙蒸水 至50 pl37。C酶切過(guò)夜，取5pl酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳凝膠鑒定，確定酶切正確后用 QIAquick Gel Extraction Kit回收9205bp的切開(kāi)的pAd-Tmck-CMV質(zhì)粒片段和 726bp的hBcl-2基因片段，并用核酸蛋白定量?jī)x定量。按pAd-Track-CMV和hBcl-2的摩爾數(shù)比為1: 10的比例建立20 ^連接體系， 使用T4DNA連接酶16°C連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物全量加入感受態(tài)E. coliDH5a (使用前 中在冰中解凍)中，冰中放置30min， 42。C加熱45s后，再在冰中放置1 min，加 入890 pi LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)60 min。取100 pl涂布在卡那霉素LB培養(yǎng)基平 板，37。C倒置培養(yǎng)16 h，形成白色的單菌落，挑選8個(gè)白色菌落分別接種于2 mL 含卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37°C 、 200 rpm搖菌12 h，可見(jiàn)LB變渾濁，行hBcl-2 的菌落PCR鑒定(方法同前)。將PCR陽(yáng)性的用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，用BglII、 Sall雙酶切鑒定，并用核酸蛋白定量?jī)x定量。2.2.3重組pAd-Track-CMV-hBcl-2-hVEGF脇質(zhì)粒分別將pAd-Track-CMV-hBcl-2、 pMD19T- hVEGF165質(zhì)粒用Xbal、 EcoRV雙酶 切，50pl酶切體系pAd國(guó)Track國(guó)CMV-hBcl-2 2 ug(或pMD19T隱跳GFi65)Xbal 1 piEcoRV 1 pl10xNEB緩沖液2 5^1100xBSA 0.5 pl滅菌雙蒸水 至50 ^37°C酶切過(guò)夜，取5 ^酶切產(chǎn)物瓊脂糖電泳凝膠鑒定，確定酶切正確后用QIAquickTM Gel Extraction Kit回收9925bp的切開(kāi)pAd-Track-CMV-hBcl-2質(zhì)粒片段和584bp的 hVEGFw基因片段，并用核酸蛋白定量?jī)x定量。按pAd-Track-CMV-hBcl-2和hVEGF165的摩爾數(shù)比為1:10的比例建立20 pi連 接體系，使用T4DNA連接酶16°C連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物全量轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coliDH5a，涂布在卡那霉素LB培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)后挑選8個(gè)白色菌落，接種于含卡 那霉素的LB培養(yǎng)基，行hVEGFw菌落PCR鑒定(方法同前)。將PCR陽(yáng)性的用 質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，Xbal、 EcoRV雙酶切鑒定，并用核酸蛋白定量?jī)x定量。2.2.4重組pAd-Track-CMV-hBcl-2-IRES-hVEGF貼質(zhì)粒分別將pAd-Track-CMV-hBcl-2-hVEGF165 、 pIRES質(zhì)粒用Xhol、 Xbal雙酶切，酶切體系pAd隱Track-CMV- hBcl-2-hVEGF165 2嗎 (或pIRES)Xhol 1 nlXbal 1 nl10xNEB緩沖液2 5 pi腦xBSA 0.5 pi滅菌雙蒸水 至50 fil37°C酶切過(guò)夜，取5 ^酶切產(chǎn)物瓊脂糖電泳凝膠鑒定，確定酶切正確后用 QIAquick Gel Extraction Kit回收10507bp的切開(kāi)pAd-Track-CMV-hBcl-2-hVEGF165 質(zhì)粒片段和641bp的IRES片段，用核酸蛋白定量?jī)x定量。按PAd-Track-CMV-hBcl-2-hVEGF165和IRES的摩爾數(shù)比為1:10的比例建立20 ^連接體系，使用T4 DNA連接酶16°C連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物全量轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coliDH5a，涂布在卡那霉素LB培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)后挑選8個(gè)白色菌落，接種于含卡 那霉素的LB培養(yǎng)基，行菌落PCR鑒定(引物為hBcl-2上游和hVEGF!65下游)。13將PCR陽(yáng)性的用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，Xhol、 Xbal雙酶切鑒定，并用核酸蛋白 定量?jī)x定量。2.2.5重組穿梭載體質(zhì)粒pAd-Track-CMV-hBcl-2-IRES-hVEGF16S的酶切鑒定重組穿梭載體質(zhì)粒pAd-Track-CMV-hBcl-2-IRES-hVEGF165經(jīng)BglII\SalI 、 XbaI\EcoRV、 XhoI\XbaI、 BglII\EcoRV四種組合的雙酶切鑒定分析。結(jié)果如圖8所 示，瓊脂糖凝膠電泳見(jiàn)與質(zhì)粒圖譜相符的條帶。2.3重組腺病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定2.3.1含有骨架質(zhì)粒pAd-Easy-1的BJ5183電穿孔感受態(tài)細(xì)菌的制備在含氨芐青霉素LB平板上劃線培養(yǎng)BJ5183 (含有pAd-Easy-1質(zhì)粒)。挑取單 個(gè)菌落接種3mLLB液體培養(yǎng)基，37°C、 200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日，將過(guò)夜培養(yǎng) 物按2%體積接種100 mL LB液體培養(yǎng)基，37°C， 200 rpm振蕩培養(yǎng)，至OD600=0.4 0.6。將培養(yǎng)物冰浴30min， 4000 rpm離心10 min收獲菌體。棄去所有上清，用等體 積、冰浴冷的WB溶液(WB^O。/。甘油，90%雙蒸水，高壓滅菌)重懸細(xì)菌，4°C、 4000 卬m，離心30min。重復(fù)上一步驟2次。棄去大部分WB，使剩余體積為原始培養(yǎng)物 的0.5%)，重懸，即制備得到含pAd-Easy-l的BJ5183電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。每管分裝 50pl， -80。C凍存?zhèn)溆谩?.3.2線性化去磷酸化重組穿梭載體質(zhì)粒將重組穿梭載體質(zhì)粒用Pmd單酶切線性化，50 pl酶切體系 pAd-Track-CMV-hBcl-2-IRES-hVEGF1652昭 10xNEB緩沖液4 訓(xùn)xBSA Pmel滅菌雙蒸水37°C酶切過(guò)夜，將酶切產(chǎn)物用CIAP酶去磷酸化， 酶切產(chǎn)物 10xCIAP buffer C1AP5^1 0.5 pi 1 pl至50 nl50 Hl反應(yīng)體系:43 pl 2^150。C反應(yīng)30min,苯酚/氯仿/異戊醇(25: 24: 1)抽取兩次，氯仿/異戊醇(24: 1) 抽取一次，添加5pl的3M的NaOAC，添加125 pl (2.5倍)的冷乙醇，在-20。C下保 冷lh，離心分離回收沉淀，用200^70%的冷乙醇洗凈，干燥后用20nl的滅菌蒸餾水溶解。用相同方法制備線性化的不帶治療基因的穿梭載體質(zhì)pAd-Track-CMV-GFP。2.3.3穿梭載體質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒的細(xì)菌內(nèi)同源重組取出一管儲(chǔ)于-80。C的電穿孔感受態(tài)BJ5183在冰上融化。取0.4pg線性化去磷酸 化的穿梭載體質(zhì)粒在1700V、 5ms條件下電穿孔轉(zhuǎn)化，加入卯Opl不含抗生素的LB 培養(yǎng)基，37。C搖菌lh后接種含50mg/L卡那霉素的LB平板，放置于37。C孵育24 h。挑 選體積最小的十個(gè)白色菌落，接種于5mL含卡那霉素LB培養(yǎng)基，37。C搖菌過(guò)夜。菌 落PCR初篩(方法同前)。質(zhì)粒小提試劑盒提取PCR陽(yáng)性菌液的質(zhì)粒，測(cè)濃度。將候 選的陽(yáng)性質(zhì)粒用PacI初步酶切鑒定，20 nl酶切體系質(zhì)粒 1嗎10xNEB緩沖液4 2 ^100xBSA 0.2 piPacl 0.5 (al滅菌雙蒸水 至20 ^將全量酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳觀察。將陽(yáng)性質(zhì)粒用氯化鈣法轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coUDH5a 擴(kuò)增(方法同前)。用去內(nèi)毒素中量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行a. 取白色菌落，接種于5mL的氨芐抗性LB培養(yǎng)基，37°C、 300 rpm振蕩培養(yǎng)8 h;b. 取2mL菌液按h 100比例接種于200mL的氨芐抗性LB培養(yǎng)基，37。C、 300rpm 振蕩培養(yǎng)16h;c. 紫外分光光度計(jì)測(cè)菌液OD值，通過(guò)V[mlh800/OD60()計(jì)算最適體積；d. 4。C、 6000gxl5min離心，棄上清；e. 6 mL RES-EF buffer重懸浮，用移液器吹勻；f. 加入16mLLYS-EF，輕柔搖晃5次，室溫放置5 min;g. 取出樹脂過(guò)濾柱，15mLEQU-EFbuffer濕潤(rùn)柱子；h. 加入16mLNEU-EF buffer,立即輕柔顛倒10次，搖勻，冰上放置5 min;i. 混合液倒進(jìn)過(guò)濾柱，液體隨重力流盡，5mLFIL-EFbuffer清洗柱子，流盡后 向過(guò)濾柱添加35 mL ENDO-EF buffer清洗，流盡后添加15 mL WASH-EF buffer;j.流盡后添加5 mL ELU-EF buffer溶解質(zhì)粒DNA，用15 mL的離心管收集；15k.加入3.5 mL的異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA，充分混合后放置2 min， 4。C離心6000 gx30 min;1.加入2mL的70"/。乙醇清洗沉淀，室溫下離心6000 gx5 min,移液器小心吸盡上 清，室溫干燥15min;m. 100nl去內(nèi)毒素水重溶沉淀，進(jìn)一步PacI酶切鑒定；經(jīng)PacI酶切后瓊脂糖凝膠電泳，可觀察到一條約30Kb的大片段和一條約4.5Kb的 小片段(如圖9)，提示穿梭載體質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒pAd-Easy-l在右臂與左臂區(qū)發(fā)生重 組，重組腺病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。得到重組腺病毒載體質(zhì)粒(pAd-Easy-hBcl-2-IRES-hVEGF165質(zhì)粒)，利用核酸 蛋白定量?jī)x定量。用相同方法制備不攜帶治療基因的對(duì)照腺病毒載體質(zhì)粒 pAd-Easy-GFP。2.4重組腺病毒載體質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中的包裝2.4.1轉(zhuǎn)染前pAd-Easy-hBcl-2-IRES-hVEGF貼質(zhì)粒的準(zhǔn)備Pacl酶切質(zhì)粒，50nl酶切體系pAd-Easy-hBcl-2-IRES-hVEGF165 3嗎10xNEB緩沖液4 5 nl100xBSA 0.5 plPacl 2 nl滅菌雙蒸水 至50 pi37。C酶切過(guò)夜，取lnl稀釋5倍后瓊脂糖凝膠電泳確定酶切是否完全，乙醇沉 淀法純化線性化的質(zhì)粒(方法同前)，重溶于20pl滅菌雙蒸水。2.4.2包裝細(xì)胞HEK293細(xì)胞的準(zhǔn)備取出液氮中保存的HEK293細(xì)胞，迅速放入37。C的恒溫水浴中，并劇烈搖晃， 使其盡快融化，超凈工作臺(tái)內(nèi)將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，1000 rpm離心5 min， 細(xì)胞培養(yǎng)液重懸浮，并轉(zhuǎn)移至T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充培養(yǎng)液至5mL，置37°C、 5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況。待細(xì)胞長(zhǎng) 至豐度約80%時(shí)棄去舊培液，加入0.5 mL 37°C預(yù)熱的胰蛋白酶消化液(0.25%)消化 細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待大部分細(xì)胞變圓、細(xì)胞之間不再連接成片時(shí) 倒去消化液，加入新鮮的培養(yǎng)液，用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，按l: 3比例接種傳代，培養(yǎng)至有數(shù)瓶細(xì)胞，挑選狀態(tài)好、融合度為50%-70%的細(xì)胞準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。
轉(zhuǎn)染3天后在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)未有明顯變化，熒光顯微鏡觀察到散在的 GFP表達(dá)，此后可見(jiàn)GFP有擴(kuò)散趨勢(shì)；第二輪擴(kuò)增的第7天可見(jiàn)大部分細(xì)胞變圓、 飄起、透光度增加等典型的CPE改變；第IO天幾乎全部細(xì)胞飄起、葡萄串樣的CPE 改變(如圖11)。
2.4.3脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，觀察熒光的表達(dá)和細(xì)胞狀況 按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染
a. 將3嗎線性化的質(zhì)粒和15^1脂質(zhì)體混合于500 )al的Opti-MEMI培養(yǎng)基， 混合物室溫下放置30min;
b. 等待的時(shí)候在超凈工作臺(tái)內(nèi)棄去HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)液，加入4 mL的無(wú)血 清DMEM培養(yǎng)液洗凈殘余的血清，吸去DMEM，添加2.5 mL Opti-MEMI 培養(yǎng)液，37°C、 5%<:02培養(yǎng)箱中放置10min;
c. 將混合物加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37°C、 5%(302培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
d. 6h后添加8mL的無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液。
轉(zhuǎn)染后每天觀察細(xì)胞變化，10d-20d后用無(wú)菌細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至15mL 離心管，4。C離心500 gx10 min，留下2mL上清，移液器吹打重懸浮細(xì)胞，-80°C 放置30 min， 37°C迅速融解，反復(fù)凍融四次裂解細(xì)胞以釋放病毒，4°C離心500 gx10 min去除細(xì)胞碎片，將上清-20。C保存。取一半體積的腺病毒接種于長(zhǎng)至90%融合度 的HEK293細(xì)胞，用含2%血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每日觀察GFP和細(xì)胞病 變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE):即細(xì)胞變圓、透亮度增加、飄起、呈葡萄串狀等。 如培養(yǎng)7 d后未出現(xiàn)CPE則按上述辦法收獲病毒繼續(xù)接種于HEK293細(xì)胞。如仍未 出現(xiàn)CPE，則重新進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
2.4.4獲取重組腺病毒載體
繼續(xù)接種病毒原液于HEK293細(xì)胞直至3 d內(nèi)能出現(xiàn)明顯CPE，收獲細(xì)胞，取 10%混合液反復(fù)凍融用于繼續(xù)接種擴(kuò)增病毒，其余則保存于-80。C作為原代重組腺病 毒載體備用。以相同方法制備對(duì)照腺病毒Ad-GFP。
2.4.5重組腺病毒載體DNA的PCR鑒定
分別取重組腺病毒載體Ad-hBcl-2-hVEGF165上清50 jxl于EP管中，加入20 mg/mL蛋白酶K 2 pl ，置于56°C反應(yīng)1 h ，沸水浴10 min，離心13000 rpmx10 min
17后，取2 pl為DNA模板行hBcl-2和hVEGF165的PCR反應(yīng)(引物、反應(yīng)體系和反應(yīng) 條件同前)，以Ad-GFP病毒上清為陰性對(duì)照。
成功提取重組腺病毒的DNA，以其為模板的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn) 734bp的hBcl-2片段和595bp的hVEGF^片段(圖11)，證明重組腺病毒的DNA 中帶有hBcl-2序列和hVEGF165序列。
2.5重組腺病毒載體的擴(kuò)增和純化
按照GENMED小量腺病毒沉淀法純化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行
a. 將HEK293細(xì)胞接種于5個(gè)T-75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，直至達(dá)到90%的細(xì)胞融 合時(shí)倒去培養(yǎng)液，并用無(wú)血清的DMEM洗去殘存的血清；
b. 取一管保存的病毒原液分5份加入5瓶HEK293細(xì)胞，十字形緩慢搖晃培養(yǎng) 瓶使病毒原液分布均勻，37°C、 5MC02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，每個(gè)培養(yǎng)瓶再加 入15 mL含2%血清的DMEM培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)；
c. 感染后72 h或直至出現(xiàn)CPE和50%的細(xì)胞脫落時(shí)用無(wú)菌細(xì)胞刮子刮下所有 培養(yǎng)瓶的細(xì)胞，連同培養(yǎng)液合并轉(zhuǎn)移至50mL離心管，4°C離心500 gx10 miii， 小心棄去上清；
d. 加入1 mL GENMED裂解液，渦旋振蕩30 s，室溫下放置5 min;
e. 加入100 ^ GENMED沉淀液，渦旋振蕩60 s，移取500 nl混合液到GENMED 過(guò)濾柱；
f. 4°C離心500 gx2 min，棄去過(guò)濾柱；
g. 繼續(xù)移取剩余的500 pi混合液到新的過(guò)濾柱，4°C離心500 gx2 min，棄去過(guò) 濾柱；
h. 分別加入100 ^ GENMED保存液，混勻，-80°<:冰箱保存。
2.5重組腺病毒載體的滴度測(cè)定
將HEK293細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)至細(xì)胞融 合度為80%;將待測(cè)腺病毒原液用維持液(含2。/。FBS的DMEM)作1: IO倍比稀 釋；棄去96孔板中的培養(yǎng)液，接種稀釋好的病毒液，每個(gè)稀釋度接種6個(gè)孔，100^1/ 孔；置于37。C、 5。/。C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h;在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)孔中的熒光數(shù)， 一個(gè)發(fā)光的細(xì)胞為一個(gè)表達(dá)單位，按下列公式計(jì)算病毒滴度病毒滴度(pfWmL) =GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)x病毒稀釋倍數(shù)/0.1 mL。
經(jīng)四輪擴(kuò)增和最終純化后重組腺病毒載體滴度為5xl09pfWmL。< 110〉廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院
<120〉人Bcl-2和人VEGFI65雙基因共表達(dá)重組載體及其構(gòu)建方法
<160〉1
〈210〉1
<211〉720
〈212〉薩
〈213〉人工序列
<220〉 ，
<223〉人Bcl-2基因，利用該基因和人VEGF^基因共表達(dá)構(gòu)建重組腺病毒載體，應(yīng)
用在心肌梗死的基因治療和細(xì)胞移植研究領(lǐng)域。
<400〉1
atggcgcacg ctgggagaac ggggtacgat aaccgggaga tagtgatgaa gtacatccat 60 tataagctgt cgcagagggg ctacgagtgg gatgcgggag atgtgggcgc cgcgcccccg 120 ggggccgccc ccgcaccggg catcttctcc tcccagcccg ggcacacgcc ccatccagcc 180 gcatcccggg acccggtcgc caggacctcg ccgctgcaga ccccggctgc ccccggcgcc 240 gccgcggggc ctgcgctcag cccggtgcca cctgtggtcc acctgaccct ccgccaggcc 300 ggcgacgact tctcccgccg ctaccgccgc gacttcgccg agatgtccag ccagctgcac 360 ctgacgccct tcaccgcgcg gggacgcttt gccacggtgg tggaggagct cttcagggac 420 ggggtgaact gggggaggat tgtggccttc tttgagttcg gtggggtcat gtgtgtggag 480 agcgtcaacc gggagatgtc gcccctggtg gacaacatcg ccctgtggat gactgagtac 540 ctgaaccggc acctgcacac ctggatccag gataacggag gctgggatgc ctttgtggaa 600 ctgtacggcc ccagcatgcg gcctctgttt gatttctcct ggctgtctct gaagactctg 660
19ctcagtttgg ccctggtggg agcttgcatc accctgggtg cctatctgag ccacaagtga 720
〈210〉2
〈211〉576
〈212〉DNA
<213〉人工序列
<220〉
〈223〉人VEGF，65基因，利用該基因和人Bcl-2基因共表達(dá)構(gòu)建重組腺病毒載體，應(yīng) 用在心肌梗死的基因治療和細(xì)胞移植研究領(lǐng)域。
〈400〉2 ' .
atgaactttctgctgtcttgggtgcattggagccttgccttgctgctctacctccaccat60
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aatccctgtgggccttgctc卿gcggagaaagcatttgtttgtaLcaagatccgcagacg480
tgta犯tgttcctgcaa犯acacagactcgcgttgc犯ggcgaggcagcttgagttaaac540
gaacgtacttgc卿tgtgacaagccgaggcggtga 57權(quán)利要求
1、人Bcl-2和人VEGF165雙基因共表達(dá)重組載體，其特征是所述重組載體包括人Bcl-2基因和人VEGF165基因，其中Bcl-2基因序列如序列表SEQ ID№1所述；VEGF165基因序列如序列表SEQ ID№2所述。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的重組人Bc卜2和人VEGF165雙基因共表達(dá)重組載體，其特征是所述重組載體利用IRES片段連接人Bcl-2、人VEGFw5基因。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的重組人Bcl-2和人VEGF165雙基因共表達(dá)重組載體，其特征是所述載體是腺病毒載體。
4、 人Bcl-2和人VEGFw5雙基因共表達(dá)重組載體的構(gòu)建方法，其特征是包括以下幾個(gè)歩驟1) 獲得人Bcl-2、人VEGFw5基因；2) 構(gòu)建重組腺病毒穿梭載體pAd-Track-CMV-hBcl-2-IRES-hVEGFw5;3) 構(gòu)建攜帶人Bcl-2基因、IRES片段和人VEGF165的重組腺病毒載體質(zhì)粒pAd-Easy-hBc1-2-IRES-hVEGF165;4) 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法介導(dǎo)重組腺病毒載體質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中的包裝。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的人Bcl-2和人VEGFi65雙基因共表達(dá)重組載體的構(gòu)建方法，其特征是通過(guò)RT-PCR獲得人Bcl-2、人VEGFw5基因。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的人Bcl-2和人VEGFw5雙基因共表達(dá)重組載體的構(gòu)建方法，其特征是根據(jù)Genebank中基因序列設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增hBcl-2和hVEGFw5的PCR引物；其中擴(kuò)增hBcl-2的PCR弓l物序列是正向5，GAAGATCTATGGCGCACGCTGGGAGAA弓|入BglII位點(diǎn)，反向5 ， ACGCGTCGACTC ACTTGTGGCTBCAGATAGGCACC弓|入SalI位點(diǎn)；擴(kuò)增hVEGF船的PCR引物序列是正向5 ， GCTCTAGAATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGC弓|入XbaI位點(diǎn)，反向5'CCGGATATCGCTCACCGCCTCGGCTTGTCACAT弓I入EcoRV位點(diǎn)。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的人Bcl-2和人VEGF^雙基因共表達(dá)重組載體的構(gòu)建方法，其特征是步驟(2)主要包括將人Bcl-2基因、IRES片段和人VEGF^依次定向裝載入腺病毒穿梭載體質(zhì)粒。
8、根據(jù)權(quán)利要求5所述的人Bcl-2和人VEGFi65雙基因共表達(dá)重組載體的構(gòu) 建方法，其特征是步驟(3)是以AdEasy系統(tǒng)為基礎(chǔ)，將重組腺病毒穿梭載 體質(zhì)粒pAd-Track-CMV-hBcl-2-IRES-hVEGF165與骨架質(zhì)粒pAd-Easy-l利用細(xì)菌內(nèi)同源重組機(jī)制重組構(gòu)建。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人Bcl-2和人VEGF₁₆₅雙基因共表達(dá)重組載體及其構(gòu)建方法，其特征是利用IRES片段連接hBcl-2、hVEGF₁₆₅基因，以AdEasy系統(tǒng)為基礎(chǔ)利用細(xì)菌內(nèi)同源重組機(jī)制重組構(gòu)建hBcl-2和hVEGF₁₆₅雙基因共表達(dá)重組載體。本發(fā)明將具有抗凋亡能力的Bcl-2基因和目前促血管生成作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子VEGF₁₆₅基因重組在同一載體上共表達(dá)，在解決了移植細(xì)胞在低氧、炎癥的條件下生存率低的問(wèn)題的同時(shí)發(fā)揮VEGF₁₆₅的促血管生成作用，本發(fā)明將在心肌梗死的基因治療和細(xì)胞移植研究領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/85GK101654685SQ20091004166
公開(kāi)日2010年2月24日 申請(qǐng)日期2009年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月5日
發(fā)明者何曉青, 倪曉彬, 劉世明, 羅承鋒, 陳敏生 申請(qǐng)人:廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院