專利名稱：用于水稻細(xì)菌性谷枯病菌檢測的引物對及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)，具體地說涉及水稻細(xì)菌性谷枯病菌檢測用引物和檢測方法。
背景技術(shù)：
水稻細(xì)菌性谷枯病(Bacterial grain rot of rice)是由穎殼伯克氏菌(Burkholderia glumae)引起，是近年來一種危害嚴(yán)重的水稻種傳病害，它不但侵害谷粒，而且還引起水稻秧苗腐爛，造成水稻的嚴(yán)重減產(chǎn)和損失。種子帶菌是該病菌遠(yuǎn)距離傳播的主要途徑，播種帶菌病谷粒，遇有適宜的發(fā)病條件，如高溫多日照，降雨量少易發(fā)病。病菌可通過氣孔和傷口侵入，病菌在植株體內(nèi)繁殖，在細(xì)胞間擴(kuò)散，引起葉鞘薄壁組織的分解。
1970年代后期由于推行機(jī)械化生產(chǎn)而進(jìn)行大面積的工廠化育秧，導(dǎo)致B. glumae引起的水稻苗腐病大流行，目前該病已成為日本水稻最嚴(yán)重的病害之一，并造成傳播流行。目前水稻細(xì)菌性谷枯病已經(jīng)蔓延到印度尼西亞、泰國、越南、韓國、斯里蘭卡、馬來西亞、菲律賓等東南亞國家及南美洲的哥倫比亞等國。非洲的坦桑尼亞及美國的路易安那洲相繼報(bào)告有該病發(fā)生。Shahjahan等報(bào)道該病在美國可導(dǎo)致15 80X的產(chǎn)量損失。我國臺灣地區(qū)1983年也有水稻細(xì)菌性谷枯病的發(fā)生報(bào)道并在病原及品種抗性方面做過一些研究。也曾有報(bào)道我國貴州省有細(xì)菌性谷枯病的發(fā)生，但未得到進(jìn)一步的證實(shí)。
近年來，隨著我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的多樣化和引種種植及加工貿(mào)易的發(fā)展，我國農(nóng)業(yè)種子出入境貿(mào)易在品種和規(guī)模上都逐年增長。目前我國有幾十萬噸水稻種子出口到國外，也有水稻、玉米等多種種質(zhì)資源進(jìn)口 ，經(jīng)濟(jì)一體化和引種種植等，我國對外的種子貿(mào)易逐年加大。水稻細(xì)菌性谷枯病隨種子和相關(guān)材料從境外傳入我國的風(fēng)險(xiǎn)加大。據(jù)報(bào)道，在具有枯萎癥狀的胡椒、番茄、馬鈴薯、茄子、紫蘇、芝麻和向日葵中都分離到了B. glumae菌，說明其傳入的潛在風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步加大。我國雜交水稻種子出口到多個(gè)國家，印尼等一些國家對我國的雜交水稻種子提出了細(xì)菌性谷枯病的檢測要求，從檢疫上也制約了我國水稻種子的進(jìn)入。為了嚴(yán)格控制水稻細(xì)菌性谷枯病傳入我國，嚴(yán)重危害我國的水稻種植和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全，我國必須加強(qiáng)對多種植物種子和材料的水稻細(xì)菌性谷枯病的檢疫和控制。目前我國尚無水稻細(xì)菌性谷枯病的檢測方法和相關(guān)的病理材料，極不適應(yīng)我國檢驗(yàn)檢疫部門在種子出入境檢疫中對該病的檢測和控制。 日本、韓國、美國、越南等國已有多起細(xì)菌性谷枯病分離和危害的報(bào)道。日本和韓國由于Burkholderia glumae.對水稻的危害嚴(yán)重，在病原和危害發(fā)生等方面進(jìn)行了較多的研究。1986年Tushima， S. ， S. Wakimoto，等研究了檢測Burkhol deria glumae的檢測性培養(yǎng)基；2000年，Mitsuo K， Kiyotsugu. 0等研究用于分離Burkholderia glumae的選擇性培養(yǎng)基；1987年Wakimoto S.等對Burkholderia glumae特異性的血清學(xué)方面行了研究。Won, So-Yo皿，Lim， Jae-Yoon等對Burkholderia glumae全基因序歹腿行了分析；Jeong，Yeonwa， Kim， Jinwoo等確證了從多種萎蔫癥植物中分離到Burkholderia glumae并提出其毒黃菌素與其產(chǎn)生腐根和爛種病理癥狀相關(guān)；日本學(xué)者Yukiiko Maeda等用MAMA-PCR方法檢測Burkholderia glumae中的抗oxolinic acid基因。Schaad. N. W等在PLANTPATHOGENIC BACTERIA (Third Edition 2001)中就伯克氏菌的檢測進(jìn)行了論述。在檢測方法方面，一些學(xué)者已建立了 Burkholderia glumae分離培養(yǎng)及細(xì)菌學(xué)鑒定方法，也有關(guān)于Burkholderia glumae的分子生物學(xué)檢測的研究和報(bào)道，Ronald J. Sayler等曾設(shè)計(jì)了檢測水稻細(xì)菌性谷枯病菌的引物及探針，并采用常規(guī)PCR方法和實(shí)時(shí)熒光PCR方法對水稻細(xì)菌性谷枯病菌進(jìn)行了檢測，Toru Takeuchi等也曾設(shè)計(jì)了一對檢測水稻細(xì)菌性谷枯病菌的引物。 水稻細(xì)菌性谷枯病在我國還屬于一種新病害(除臺灣外)，被國家質(zhì)檢總局納入了《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》。我國對于Burkholderia glumae的研究很少，病原材料和研究資料也相當(dāng)缺乏。浙江大學(xué)謝關(guān)林等人在進(jìn)行水稻谷枯病的風(fēng)險(xiǎn)分析研究。目前我國缺乏水稻細(xì)菌谷枯病的檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供用于水稻細(xì)菌性谷枯病菌雙重PCR-DHPLC檢測的引物和方法。 本發(fā)明通過已報(bào)道的水稻細(xì)菌性谷枯病菌ITS區(qū)域序列(genebank D87080)和gyrB基因(genebank AB207074)序列，設(shè)計(jì)了用于本發(fā)明的引物對，所述的兩對由正向和反向引物組成的引物對，其核苷酸序列分別為
SEQ ID NO. 1 :5' -ACACGGAACACCTGGGTA-3'
SEQ ID NO. 2 :5' -TCGCTCTCCCGAAGAGAT-3，
SEQ ID NO. 3 :5' -GCAGCGGCAAGGAAGACG-3'
SEQ ID NO. 4 :5， -GTCGTCGCCCGACGTCTC—3，。 本發(fā)明還給出了應(yīng)用上述引物的雙重PCR-DHPLC方法，其以細(xì)菌DNA為模板，進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行DHPLC分析。 其反應(yīng)體系為10XTaq buffer 2. 5 ii L， dNTPs (lOmmol/L) 0. 5 ii L，MgCl2(25,l/L)2iiL，10iimol/L弓l物各l.OiiL， Taq DNA polymerase (2U/ii L) 1. 0 ii L，lng/ ii L 10ng/ ii L DNA模板5 y L，以滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25 y L。 其中，上述反應(yīng)條件可以是96。C預(yù)變性5min ;96。C變性30s， 55。C退火30s， 72°C延伸30s，循環(huán)反應(yīng)30次；72。C延伸5min。 DHPLC分析條件設(shè)定為進(jìn)樣量5iiL，柱溫50。C，起始A液(0. lmol *L—'三乙胺乙酰鹽)濃度為44. 8%， B液(0. lmol L—1三乙胺乙酰鹽和25%乙腈)濃度為55. 2%，起始時(shí)間為0. 5min，結(jié)束A液濃度為35. 8% ，B液濃度為64. 2% ，結(jié)束時(shí)間為5min，流速0. 9mL/miru 本發(fā)明還建立了進(jìn)一步對雙重PCR-DHPLC分析得到結(jié)果陽性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定的DHPLC分子鑒定體系和分子標(biāo)本。即以引物SEQ ID NO. 3和4擴(kuò)增水稻細(xì)菌性谷枯病菌菌株DNA的PCR產(chǎn)物作為PCR-DHPLC鑒定方法的標(biāo)記物。未知擴(kuò)增產(chǎn)物通過與該標(biāo)記物進(jìn)行半變性DHPLC分析可以對未知菌進(jìn)行水稻細(xì)菌性谷枯病菌的鑒定。DHPLC檢測條件為設(shè)定片段大小為317bp，每次進(jìn)樣5 ii L，檢測溫度Tm = 64°C ，以流速0. 9mL min—1進(jìn)行分析。
4
本發(fā)明還提供含有所述弓I物的試劑盒。 進(jìn)一步，本發(fā)明提供的試劑盒中還有引物SEQ ID N0.3和4擴(kuò)增的陽性片段。
本發(fā)明設(shè)計(jì)用于檢查水稻細(xì)菌性谷枯病菌的引物特異性好，檢測靈敏度高，本發(fā)明的檢測方法準(zhǔn)確性高、靈敏度高，其能夠快速簡單地判斷樣品是否有水稻細(xì)菌性谷枯病菌，為進(jìn)出口安全提供了保證。


圖1雙重PCR-DHPLC檢測水稻細(xì)菌性谷枯病菌DNA結(jié)果；
圖2本發(fā)明方法靈敏度檢測結(jié)果； 圖3引物BGF3-BGR3擴(kuò)增水稻細(xì)菌性谷枯病菌DNA片段DHPLC半變性檢測。
具體實(shí)施例方式
下面實(shí)施例用于對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例1 引物的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)報(bào)道的水稻細(xì)菌性谷枯病菌ITS區(qū)域序列(genebank D87080)，設(shè)計(jì)了引物序列為 SEQ ID NO. l(正向):5， -ACACGGAACACCTGGGTA—3，;
SEQ ID NO. 2(反向)5， -TCGCTCTCCCGAAGAGAT—3，。 根據(jù)報(bào)道的水稻細(xì)菌性谷枯病菌gryB基因(genebank AB207074)，設(shè)計(jì)了引物和探針，引物序列為 SEQ ID NO. 3(正向):5， —GCAGCGGCAAGGAAGACG—3，;
SEQ ID NO. 4(反向):5， -GTCGTCGCCCGACGTCTC—3，。
實(shí)施例2 雜交稻種中水稻細(xì)菌性谷枯病菌的分離 選用文獻(xiàn)報(bào)道的水稻細(xì)菌性谷枯病菌半選擇性分離培養(yǎng)基S-PG瓊脂培養(yǎng)基對水稻材料中的病菌進(jìn)行分離培養(yǎng)。細(xì)菌性谷枯病菌在S-PG上呈現(xiàn)兩種生長形態(tài)，一種菌落為紅褐色、圓形、光滑、隆起；另一種菌落為淡紫色、圓形、光滑、隆起。
樣品處理方法 大量種子樣品先用蒸餾水沖洗后，稱取10g或400粒種子放入90mL 0. 001 %吐溫_磷酸鹽緩沖液(pH7. 0)中低溫(5°C 15°C )浸泡4 6h，用均質(zhì)器打碎，制備樣品提取液。如果是檢測少量的種子樣品，取20粒種子加入10mL滅菌的0. 001%吐溫-磷酸鹽緩沖液(pH7. 0)，用滅菌槌和研缽或是攪拌器將種子充分碾磨，制成提取液。
將樣品提取液置于22°C 25t:環(huán)境中4 6h后，旋渦混勻懸浮液5min，懸浮液進(jìn)行十倍梯度稀釋，稀釋后的IOX，和100X以及1000X三個(gè)稀釋度的懸浮液取1. OmL，分別放入到5個(gè)S-PG平皿中(每個(gè)平皿加0. 2mL)。用L-型玻璃棒將液體均勻涂布在瓊脂的表面。 接種后的平皿28°C 士rC培養(yǎng)2d 3d后觀察生長菌落形態(tài)。
實(shí)施例3
細(xì)菌DNA的提取 1)直接挑取S-PG平板上生長的典型或疑似菌落至少5個(gè)至1. 5mL離心管中，加入lmL滅菌水充分振蕩，12000g離心3min，棄上清，再向管中加入lmL滅菌水，重復(fù)三次，取沉淀進(jìn)行DNA提取； 2)在沉淀中加入TE緩沖液600 ii L， 10% SDS溶液30 y L， 20mg/mL蛋白酶K15 y L，
混勻，37t:水浴孵育lh。 3)加入等體積的三氯甲烷-異戊醇(24 : l)，混勻。10000g離心5min，將上清液
移至一個(gè)新離心管中。4)加入等體積酚-三氯甲烷-異戊醇(25 : 24 : 1)，混勻，10000g離心5min，將
上清液移至一新離心管。 5)加入O. 6倍體積的異丙醇，輕輕混勻，-2(TC沉淀lh， 10000g離心5min，棄上清。
6)加入lmL70X乙醇洗滌沉淀，8000g離心，棄上清，晾干。
7)加入50 ii LTE緩沖液溶解DNA沉淀，-2(TC長期保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例4 雙重PCR-DHPLC檢測方法的建立 本方法選擇了 8株購買自NCPPB的不同國家地區(qū)發(fā)生的水稻細(xì)菌性谷枯病菌菌株作為陽性對照，同時(shí)采用了水稻種子中分離的部分微生物、幾種常見并與水稻細(xì)菌性谷枯病菌近緣的植物病原菌及部分其它植物病原菌做為參試菌株進(jìn)行比較分析。供試菌株具體情況如表l。 表1供試菌及其來源
菌株菌種名稱來源菌株編 號菌種名稱來源
Al水稻細(xì)菌性谷枯病菌NCPPB2391CK6洋蔥伯克霍爾德氏菌CGMCC 1. 1813
A2水稻細(xì)菌性谷枯病菌NCPPB2891CK7燕麥假單胞菌CGMCC 1. 1726
A3水稻細(xì)菌性谷枯病菌NCPPB3591CK8丁香假單胞菌黍致病變種NCPPB 1835
A4水稻細(xì)菌性谷枯病菌NCPPB3673CK9成團(tuán)泛菌NCPPB 2274
A5水稻細(xì)菌性谷枯病菌NCPPB3674CK10胡蘿卜軟腐歐文氏胡蘿 卜軟腐變種CGMCC 1. 1000
A6水稻細(xì)菌性谷枯病菌NCPPB3708CK11水稻白葉枯病菌NCPPB 2446
A7水稻細(xì)菌性谷^t病菌NCPPB3923CK12水稻細(xì)菌性條斑病菌NCPPB 1632
A8水稻細(xì)菌性谷枯病菌NCPPB3924CK13西瓜細(xì)菌性果斑病菌NCPPB 4207
CK1唐菖蒲伯克霍爾德菌自然種子分離CK14玉米細(xì)菌性^ 萎病菌ATCC 29227
CK2黃單胞菌屬菌自然種子分離CK15草生歐文氏菌NCPPB 1269
CK3假單胞菌屬菌自然種子分離CK16梨火疫病菌ATCC 15580
CK4泛菌屬自然種子分離CK17蘭花褐斑病菌ATCC 10200
CK5洋蔥軟腐病菌ATCC 11662CK18番茄潰瘍病菌ATCC 14456 對上述菌株進(jìn)行DNA提取后，應(yīng)用下述反應(yīng)體系和條件進(jìn)行雙重PCR檢測研究。所使用PCR儀器為Biometra公司產(chǎn)品。 反應(yīng)體系10 X Taq buffer 2. 5 ii L， dNTPs (lOmmol/L) 0. 5 ii L， MgCl2 (25,1/ L) 2 ii L， 10 ii mol/L弓|物各1. 0 ii L， Taq DNA polymerase (2U/ ii L) 1. 0 ii L， lng/ ii L 10ng/ ii LDNA模板5 ii L，以滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25 y L。 反應(yīng)條件96。C預(yù)變性5min ;96。C變性30s，55。C退火30s，72。C延伸30s，循環(huán)反 應(yīng)30次；72。C延伸5min。 將PCR產(chǎn)物放入DHPLC進(jìn)樣室，洗脫液由緩沖液A(O. lmol *L—'三乙胺乙酰鹽)和 緩沖液B(O. lmol *L—工三乙胺乙酰鹽和25%乙腈)組成，在檢測起始為時(shí)間0. 5min，洗脫液 A液起始濃度為44. 8% ，緩沖液B液起始濃度55. 2% ，檢測結(jié)束時(shí)間為5min，洗脫液A液終 止?jié)舛葹?5. 8% ，緩沖液B液終止?jié)舛?4. 2% ，柱溫50°C ，系統(tǒng)自動(dòng)按照線性遞增的方式， 以流速0. 9mL min—1的流速將DNAS印柱上的DNA分子洗脫下來，波長260nm處讀取吸光 值，經(jīng)系統(tǒng)自動(dòng)處理后，形成DHPLC峰型圖譜，供分析鑒定。
特異性檢測 采用提取得到的水稻細(xì)菌性谷枯病菌陽性菌株DNA和其它參試菌株DNA進(jìn)行檢
測，用水作為對照進(jìn)行擴(kuò)增。 試驗(yàn)結(jié)果 8株水稻細(xì)菌性谷枯病菌均擴(kuò)增出明顯的陽性峰，見圖1。其它參試菌株DNA均無 陽性信號。 靈敏度檢測 接種水稻細(xì)菌性谷枯病菌于100ml PSA液體培養(yǎng)基中，28。C震蕩培養(yǎng)24h，用平板 計(jì)數(shù)法對菌濃度進(jìn)行測定，并將培養(yǎng)液用生理鹽水制成105、 104、 103、 102、 101 (CFU/mL) 5個(gè)稀 釋梯度。提取DNA，進(jìn)行雙重PCR-DHPLC靈敏度檢測。 試驗(yàn)結(jié)果如圖2，利用本方法能有效地從含有4X 102CFU/mL的水稻細(xì)菌性谷枯病 菌的菌液中檢測出該病原菌。 實(shí)施例5PCR-DHPLC分子標(biāo)準(zhǔn)體系的建立 通過鑒定8株水稻細(xì)菌性谷枯病菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物序列的同源性是否一致，以期建 立統(tǒng)一的分子標(biāo)本和分子標(biāo)準(zhǔn)體系。 采用DHPLC對同一對引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物間進(jìn)行了序列半變性檢測將每兩 種同數(shù)量級濃度的PCR產(chǎn)物相互間按照1 : 1的比例混合，將混合產(chǎn)物及單一 PCR產(chǎn)物在 PCR儀上進(jìn)行以下變性_復(fù)性過程95t:起始變性5min，94. 5"C變性20s，以后每20s —個(gè) 循環(huán)降低0. 5t:，緩慢降溫到25°C，以形成同源或異源雙鏈DNA分子混合物。將降溫處理后 的PCR產(chǎn)物放入DHPLC進(jìn)樣室，輸入被檢測片段序列，設(shè)定每次進(jìn)樣5ii L。檢測溫度以該序 列片段的解鏈溫度(Tm = 63. 9°C )為參照，分別選擇柱溫為64。C，設(shè)定片段大小317bp，以 流速0. 9mL min—、進(jìn)行DHPLC分析。 通過變性并緩慢復(fù)性處理的PCR混合產(chǎn)物，進(jìn)行半變性DHPLC分析結(jié)果為引物 SEQID NO. 1和2擴(kuò)增8株陽性菌株DNA得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DHPLC半變性比較分析時(shí)， 部分陽性菌株出現(xiàn)非特異性的多峰，可能在擴(kuò)增片段區(qū)間內(nèi)存在部分位點(diǎn)的差異而影響 DHPLC分析結(jié)果；引物SEQ ID NO. 3和4擴(kuò)增水稻細(xì)菌性谷枯病菌A1-A8DNA的PCR產(chǎn)物在 4. 27min(圖3)左右均只出現(xiàn)一個(gè)明顯的吸收峰，結(jié)果與相同處理后的單一 PCR產(chǎn)物結(jié)果一致。試驗(yàn)證明通過引物SEQ ID NO. 3和4進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，各水稻細(xì)菌性谷枯病菌DNA 的PCR產(chǎn)物片段序列一致，同源性高，無突變位點(diǎn)。 因引物SEQ ID NO. 3和4擴(kuò)增8株菌株的PCR產(chǎn)物序列均一致，可以建立起以引 物SEQ ID NO. 3和4擴(kuò)增A1-A8中任意一株菌株DNA的PCR產(chǎn)物作為PCR-DHPLC鑒定方法 的標(biāo)記物。將未知的片段大小一致或相近的PCR產(chǎn)物與分子標(biāo)本進(jìn)行變性并緩慢復(fù)性處理 后，進(jìn)行DHPLC半變性分析。DHPLC鑒定條件為設(shè)定片段大小為317bp，每次進(jìn)樣5 y L。檢 測溫度Tm = 64°C ，以流速0. 9mL *min—、進(jìn)行DHPLC分析。結(jié)果出現(xiàn)單一的峰型且其它峰 型正常情況下，可判斷為水稻細(xì)菌性谷枯病菌。序列表〈110〉湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心〈120〉用于水稻細(xì)菌性谷枯病菌檢測的引物對及檢測方法〈130>PLH09659〈140>200910043810. 4〈141>2009-07-01〈160>4〈170>PatentIn version 3. 1〈210>1〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>13C3cgg朋ca cctgggte〈210>2〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2tcgctctccc gaagagat〈210>3〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3gcagcggc朋gg朋gacg〈210>4〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4
gtcgtcgccc gacgtctc 18
權(quán)利要求
用于水稻細(xì)菌性谷枯病菌檢測的引物對，其核苷酸序列為SEQ ID NO.15’-ACACGGAACACCTGGGTA-3’；SEQ ID NO.25’-TCGCTCTCCCGAAGAGAT-3’。SEQ ID NO.35’-GCAGCGGCAAGGAAGACG-3’；SEQ ID NO.45’-GTCGTCGCCCGACGTCTC-3’。
2. —種利用引物SEQ ID N0.3和4所擴(kuò)增的陽性片段。
3. —種檢測水稻細(xì)菌性谷枯病菌的方法，該方法以水稻細(xì)菌性谷枯病菌的DNA為模 版，利用權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)用DHPLC進(jìn)行結(jié)果分析和 判定。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，雙重PCR的反應(yīng)過程中的退火溫度為55°C。
5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，DHPLC檢測過程中，檢測片段設(shè)定大小為 317bp。
6. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，DHPLC判定過程中，應(yīng)用權(quán)利要求2中的 陽性片段作為分子標(biāo)本并建立分子標(biāo)準(zhǔn)體系進(jìn)行水稻細(xì)菌性谷枯病菌的判定，判定柱溫為 64°C。
7. 含有權(quán)利要求1所述引物的試劑盒。
8. 如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其還包括權(quán)利要求2所述的陽性片段。
全文摘要
本發(fā)明提供了兩對水稻細(xì)菌性谷枯病菌檢測用的引物，所述引物的核苷酸序列為SEQID NO.15’-ACACGGAACACCTGGGTA-3’；SEQ ID NO.25’-TCGCTCTCCCGAAGAGAT-3’和SEQ ID NO.35’-GCAGCGGCAAGGAAGACG-3’；SEQ ID NO.45’-GTCGTCGCCCGACGTCTC-3’。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了檢測水稻細(xì)菌性谷枯病菌的方法，該方法對樣品中水稻細(xì)菌性谷枯病菌進(jìn)行分離，以細(xì)菌DNA為模板，利用上述引物進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DHPLC分析，得到的陽性結(jié)果，利用引物BGF3和BGR3擴(kuò)增得到陽性片段作為的分子標(biāo)本進(jìn)行鑒定。本發(fā)明引物特異性好，檢測方法準(zhǔn)確性高，靈敏度高，為進(jìn)出口安全提供了保證。
文檔編號C12Q1/68GK101712982SQ200910043810
公開日2010年5月26日 申請日期2009年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月1日
發(fā)明者朱金國, 莫瑾 申請人:湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心