專(zhuān)利名稱(chēng)：：水稻細(xì)菌性谷枯病菌檢測(cè)用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)，具體地說(shuō)涉及水稻細(xì)菌性谷枯病菌檢測(cè)用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：水稻細(xì)菌性谷枯病(Bacterialgrainrotofrice)是由穎殼伯克氏菌(Burkholderiaglumae)引起，是近年來(lái)一種危害嚴(yán)重的水稻種傳病害，它不但侵害谷粒，而且還引起水稻秧苗腐爛，造成水稻的嚴(yán)重減產(chǎn)和損失。種子帶菌是該病菌遠(yuǎn)距離傳播的主要途徑，播種帶菌病谷粒，遇有適宜的發(fā)病條件，如高溫多日照，降雨量少易發(fā)病。病菌可通過(guò)氣孔和傷口侵入，病菌在植株體內(nèi)繁殖，在細(xì)胞間擴(kuò)散，引起葉鞘薄壁組織的分解。1970年代后期由于推行機(jī)械化生產(chǎn)而進(jìn)行大面積的工廠化育秧，導(dǎo)致B.glumae引起的水稻苗腐病大流行，目前該病已成為日本水稻最嚴(yán)重的病害之一，并造成傳播流行。目前水稻細(xì)菌性谷枯病已經(jīng)蔓延到印度尼西亞、泰國(guó)、越南、韓國(guó)、斯里蘭卡、馬來(lái)西亞、菲律賓等東南亞國(guó)家及南美洲的哥倫比亞等國(guó)。非洲的坦桑尼亞及美國(guó)的路易安那洲相繼報(bào)告有該病發(fā)生。Shahjahan等報(bào)道該病在美國(guó)可導(dǎo)致1580X的產(chǎn)量損失。我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)1983年也有水稻細(xì)菌性谷枯病的發(fā)生報(bào)道并在病原及品種抗性方面做過(guò)一些研究。也曾有報(bào)道我國(guó)貴州省有細(xì)菌性谷枯病的發(fā)生，但未得到進(jìn)一步的證實(shí)。日本、韓國(guó)、美國(guó)、越南等國(guó)已有多起細(xì)菌性谷枯病分離和危害的報(bào)道。日本和韓國(guó)由于Burkholderiaglumae對(duì)水稻的危害嚴(yán)重，在病原和危害發(fā)生等方面進(jìn)行了較多的石開(kāi)究。1986年TushimaS.，S.Wakimoto，等在SelectivemediumfordetectingPseudomonasglumaeKuritaetTabei，thecausalbacteriumofgrainrotofrice一文中報(bào)道研究了檢測(cè)Burkholderiaglumae的S-PG選擇性培養(yǎng)基；2000年，MitsuoK，Kiyotsugu.O等在NewSelectiveMediumforIsolationofBurkholderiaglumaefromRiceSeeds—文中報(bào)道了研究用于分離Burkholderiaglumae的CCNT選擇性培養(yǎng)基；2004年xianglongyuan等在Indentificationofbacterialpathogenscausingpanicleblightofriceinlouisiana—書(shū)中應(yīng)用KBA培養(yǎng)基對(duì)水稻細(xì)菌性谷枯病菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，并采用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)、傳統(tǒng)生化試驗(yàn)、致病性測(cè)定對(duì)谷枯病菌進(jìn)行鑒定，羅金燕等在水稻細(xì)菌性谷枯病病原菌分離鑒定一文中采用脂肪酸測(cè)定、Biolog微生物鑒定系統(tǒng)以及RAPD-PCR等方法對(duì)水稻細(xì)菌性谷枯病菌進(jìn)行了鑒定，劉友勛等在水稻細(xì)菌性條斑病菌致病型鑒別品種的篩選一文中采用PSA培養(yǎng)基對(duì)植物病原菌進(jìn)行了培養(yǎng)。但對(duì)于用于添加至培養(yǎng)基中增快培養(yǎng)速度和增加檢出率的增效因子并無(wú)相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供用于水稻細(xì)菌性谷枯病菌培養(yǎng)基中添加水稻葉汁(以下用D表示)和胡蘿卜汁(以下用C表示)中的至少一種，達(dá)到水稻細(xì)菌性谷枯病菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度加快和增加檢出率。本發(fā)明提供的水稻細(xì)菌性谷枯病菌檢測(cè)用培養(yǎng)基，在水稻細(xì)菌性谷枯病菌生長(zhǎng)或選擇性分離培養(yǎng)基中添加水稻葉汁和胡蘿卜汁中的至少一種。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，通過(guò)加入水稻葉汁和胡蘿卜汁中的至少一種，能增快水稻細(xì)菌性谷枯病菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度，提高檢出率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，同時(shí)加入水稻葉汁和胡蘿卜汁時(shí)，有增敏效果。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例優(yōu)選的添加的水稻葉汁或/和胡蘿卜汁的濃度是1-5%。添加的水稻葉汁或/和胡蘿卜汁的終濃度大于上述濃度，并沒(méi)有不利影響，同樣具有增敏的作用，只是從實(shí)用的角度看，不需要更大的濃度。其中，上述濃度中又以2.5%為最佳。水稻葉汁和胡蘿卜汁的制備方法非常簡(jiǎn)單，即通過(guò)打碎水稻葉或胡蘿卜后，經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌后，即可得到水稻葉汁或胡蘿卜汁。選擇在4t:冷藏備用。當(dāng)然，可以根據(jù)本發(fā)明的增效因子組裝成培養(yǎng)基試劑盒，以方便使用。本發(fā)明采用的用于水稻細(xì)菌性谷枯病菌培養(yǎng)基，顯著地提高了水稻細(xì)菌性谷枯病菌的檢出率和檢出速度，為菌種的復(fù)活培養(yǎng)和水稻材料的生物安全檢疫提供了保證。具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1增效因子的提取和培養(yǎng)基制備。水稻葉汁的制備取新鮮水稻葉剪碎后按照質(zhì)量比1:2添加蒸餾水后榨汁機(jī)榨汁，O.45iim濾膜過(guò)濾除菌后4t:冷藏備用。以下簡(jiǎn)稱(chēng)D。胡蘿卜汁的制備直接將新鮮胡蘿卜榨汁機(jī)榨汁后，0.45ym濾膜過(guò)濾除菌后4t:冷藏備用。以下簡(jiǎn)稱(chēng)C。PS液體培養(yǎng)基配方(生長(zhǎng)培養(yǎng)基的一種)酵母粉lg牛肉浸膏3g蛋白胨5g蔗糖15g蒸餾水1L以上成份充分混合后調(diào)節(jié)ra至7.2，分裝50mL每瓶，115"滅菌15min后備用。向滅菌后的PS液體培養(yǎng)基(生長(zhǎng)培養(yǎng)基)中添加D、C以及兩者的混合物D+C(體積比為2:l)，制備成液體培養(yǎng)基。向滅菌后溫度為53t:左右的PSA平板中添加過(guò)濾除菌的D、C以及兩者的混合物(體積比2:1)，傾注平板，表面晾干備用，PSA培養(yǎng)基在PS液體培養(yǎng)基中添加18g細(xì)菌瓊脂粉即可。向滅菌后溫度為53t:左右的S-PG選擇性瓊脂和CCNT選擇性瓊脂中添加過(guò)濾除菌的D、C以及兩者的混合物(體積比2:l)，傾注平板，表面晾干備用。水稻細(xì)菌性谷枯病菌鑒定方法采用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)方法進(jìn)行水稻細(xì)菌性谷枯病菌的鑒定。本方法所使用的Biolog微生物鑒定儀型號(hào)為BIOLOGELX808BLG，微生物鑒定板為biologGN2鑒定板。將水稻細(xì)菌性谷枯病菌疑似菌落接種至Biolog鑒定系統(tǒng)專(zhuān)用BUG平板培養(yǎng)基上進(jìn)行富集培養(yǎng)，28°C±1°C培養(yǎng)24小時(shí)后，并挑取BUG上的單個(gè)菌落再次轉(zhuǎn)接BUG培養(yǎng)基，使其性狀充分表達(dá)以適合Biolog鑒定。用滅菌棉簽挑取取BUG上二次培養(yǎng)的菌落接種至GN/GP-IF接種液，并調(diào)節(jié)菌懸液濃度至目標(biāo)濁度為52%±2，并靜止放置5分鐘。接種調(diào)節(jié)好菌濃度的接種液至GN2微生物鑒定板中，每孔接種菌液150L。將接種完成的微孔板放置于28°C±1°C中保濕培養(yǎng)24小時(shí)后使用Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定分析。實(shí)施例2增效因子在PSA搖瓶培養(yǎng)基中的增效作用。用3mm接種環(huán)挑取將4t:保存4周的水稻細(xì)菌性谷枯病菌，在裝有1ml滅菌PBS的試管中涂抹均勻，取50L接種至添加有終濃度為2.5%(v/v)的實(shí)例1中不同植物提取物的50mlPS液體培養(yǎng)基中，并接種未添加植物提取物的PS液體培養(yǎng)基做陽(yáng)性對(duì)照(CK)，同時(shí)以未接種水稻細(xì)菌性谷枯病菌的PS液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，28t:±rC180rpm振蕩培養(yǎng)，4小時(shí)后開(kāi)始每1小時(shí)無(wú)菌條件下取菌液涂布5個(gè)PSA瓊脂平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，至菌液生長(zhǎng)24小時(shí)，取平均值并記錄試驗(yàn)結(jié)果。取培養(yǎng)12小時(shí)后的菌液20mL至滅菌同規(guī)格50mL離心管中，lOOOOrpm離心20min后，去上清，觀察菌體生長(zhǎng)情況并照相。計(jì)算5個(gè)平行試驗(yàn)的平均值(P>0.05)后得出以下試驗(yàn)結(jié)果陰性對(duì)照均未生長(zhǎng)出菌落，添加了D+C混合物和單一添加D的搖瓶培養(yǎng)基中水稻細(xì)菌性谷枯病菌的生長(zhǎng)速度明顯增快，在培養(yǎng)10小時(shí)前其菌落數(shù)量也較未添加提取汁的培養(yǎng)基上有明顯地增加，而同一時(shí)間內(nèi)添加D+C混合因子的培養(yǎng)基較單一添加D的培養(yǎng)基中水稻細(xì)菌性谷枯病菌菌落生長(zhǎng)顯著性地增加(P<0.05)。(表1)表1水稻細(xì)菌性谷枯病菌在添加不同成分PSA液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況\添CFU/mL\力口32.lx1018.5><1。22.OxlO12.3〉<10241.5xl027.8〉<1033.lxl026.7〉<1036.4x1025.1〉<1048.6xl023.7><10465.5xl038.1〉<1056.4xl032.5><105了7.0xl037.7><1069.6xl034.9><10685.4xl048.5><1077.4x1045.6><10796.6xl068.9><1097.7xl063.5>"09104.1xl089.6x10107.7xl085.4x1010培養(yǎng)12小時(shí)，添加D+C混合物和添加D的培養(yǎng)基中菌液離心得到的沉淀較未添加和單一添加C的培養(yǎng)基中得到的沉淀有明顯增加。稱(chēng)重后菌體重量分別為CK(1.2g);添加D(2.lg);添加D+C(2.3g);添加C(l.3g)。稱(chēng)重結(jié)果表明添加D和添加D+C至PS液體培養(yǎng)基中時(shí)，菌體生長(zhǎng)較旺盛。實(shí)施例3增效因子在PSA培養(yǎng)基上的增效作用。將fC保存4周的水稻細(xì)菌性谷枯病菌用滅菌生理鹽水洗下菌苔，制備成均勻的菌懸液，十倍稀釋法將菌液稀釋至一定濃度，取O.lmL涂布添加濃度為1%、2.5%和5%(v/v)的D、C和D+C的PSA平板，同時(shí)涂布未添加植物提取物的瓊脂平板作為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)以未接種水稻細(xì)菌性谷枯病菌的平板作為陰性對(duì)照，進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，2『c士rc培養(yǎng)，IO小時(shí)后觀察菌落生長(zhǎng)情況，之后每小時(shí)觀察一次，并記錄菌落生長(zhǎng)數(shù)量。試驗(yàn)結(jié)果為陰性對(duì)照均未生長(zhǎng)出菌落，在添加D和D+C混合因子的情況下，PSA瓊脂平板上菌落較其它兩種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度增快5個(gè)小時(shí)，且在同時(shí)段內(nèi)觀察菌落生長(zhǎng)也有明顯地增加。在18小時(shí)添加有D+C混合液的瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落較添加D的瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落多，到24小時(shí)時(shí)菌落數(shù)相近(P>0.05)。在PSA瓊脂培養(yǎng)基中添加終濃度2.5%(v/v)D+C能增加水稻細(xì)菌性谷枯病菌在瓊脂平板上的生長(zhǎng)速度，且生長(zhǎng)數(shù)量在同時(shí)段內(nèi)也較未添加的培養(yǎng)基上有顯著性地增加(P<0.05)，添加5%D(v/v)與添加2.5%(v/v)的D+C無(wú)明顯差別。(表2)表2水稻細(xì)菌性谷枯病菌在添加不同成分PSA瓊脂平板中生長(zhǎng)情況<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注"/"表示未出現(xiàn)典型菌落，單位cfu/Ml實(shí)施例4增效因子在S-PG和CCNT培養(yǎng)基上的增效作用。稱(chēng)取10g或400粒的4C保存4周含水稻細(xì)菌性谷枯病菌的水稻種子，放入90mL0.001X吐溫-磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中低溫(8°C±2°C)浸泡4h，用均質(zhì)器打碎，制備樣品提取液。將樣品提取液置于22°C25t:環(huán)境中4h后，旋渦混勻懸浮液5min，懸浮液進(jìn)行十倍梯度稀釋?zhuān)♂尯蟮腎OX，IOOX以及1000X三個(gè)稀釋度分別放入到已制備好的添加有終濃度為2.5%(v/v)的增效因子的S-PG和CCNT的平皿中(每個(gè)平皿加0.2mL)，用L-型玻璃棒將液體均勻涂布在瓊脂的表面。同時(shí)涂布未添加植物提取物的瓊脂平板作為陽(yáng)性對(duì)照，并以未接種水稻細(xì)菌性谷枯病菌的平板作為陰性對(duì)照，進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，28°c士rc培養(yǎng)，io小時(shí)后觀察菌落生長(zhǎng)情況，之后每小時(shí)觀察一次，并記錄菌落生長(zhǎng)數(shù)試驗(yàn)結(jié)果陰性對(duì)照均未生長(zhǎng)出菌落，添加了增效因子D+C和增效因子D的半選擇性培養(yǎng)基上水稻細(xì)菌性谷枯病菌的生長(zhǎng)速度增快約6小時(shí)，其菌落數(shù)量也較未添加提取物的培養(yǎng)基上有顯著性地增加(P<0.05)，添加D+C較添加單一D的培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)速度快且菌落數(shù)多。(表3)表3水稻細(xì)菌性谷枯病菌不同時(shí)間在添加不同成份的選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況CKD+CCD注"/"表示未出現(xiàn)典型菌落，單位cfu/mL結(jié)論本發(fā)明得到了兩種在液體培養(yǎng)基中對(duì)水稻細(xì)菌性谷枯病菌生長(zhǎng)有促進(jìn)作用的植物提取物D和植物提取物C，通過(guò)對(duì)添加該兩種提取物至瓊脂平板中的研究表明，在瓊脂平板上添加D和添加D+C時(shí)生長(zhǎng)情況較未添加和單一添加C的生長(zhǎng)情況好。而在生長(zhǎng)較快的同時(shí)段下，添加D+C的瓊脂培養(yǎng)基上水稻細(xì)菌性谷枯病菌生長(zhǎng)較單一添加D的培養(yǎng)基上生菌落生長(zhǎng)明顯且數(shù)量較多，因此可以在半選擇性瓊脂培養(yǎng)基中添加植物提取物D+C，達(dá)到改良培養(yǎng)基的目的。新研究的培養(yǎng)基可用于水稻細(xì)菌性谷枯病的分離檢測(cè)，在添加植物提取物D+C終濃度為2.5%(v/v)的瓊脂培養(yǎng)基中，谷枯病菌生長(zhǎng)速度可加快56小時(shí)，同時(shí)可達(dá)到修復(fù)受損細(xì)菌的目的，提高細(xì)菌性谷枯病的檢出率30%40%。添加增效因子適用于水稻細(xì)菌性谷枯病菌的生長(zhǎng)和選擇性培養(yǎng)基。CCNT24h25h26h27h28h29h30hS-PG/CCNT/S陽(yáng)PG/CCNT/S陽(yáng)PG/CCNT/S-PG////4.5X103//////2.6X103///7.1X103///6.6X103//7.6X1034.6X103//6.8X1033.4X103/8.9X1036.5X103//7.2X1034.6X103/2.3X1047.4X103//1.6X1046.5X103/6.4X1045.1X104//3.5X1042.3X104/8.9X1047.0X1043.5X103/6.7X1044.8X104/2.2X1051.3X1054.7X103/8.9X1047.5X1046.8X1032.2X1051.7X1059.4X1036.7X1031.8X1059.8X1041.8X1042.4X1051.9X1053.2X1042.1X1041.9X1051.4X1053.4X1042.4X1052.1X1055.6X1045.5X1041.9X1051.8X1054.1X1042.5X1052.1X1055.6X1045.5X1041.9X1051.8X1058.8X1042.5X1052.3X1051.9X1051.7X1052.2X1052.1X1051.7X1052.5X1052.3X1051.9X1051.8X1052.2X1052.1X1051.7X1052.5X1052.3X1051.9X1051.8X1052.2X1052.1X105333444555ooooooooohhhhhhhh234567893333333f*J權(quán)利要求水稻細(xì)菌性谷枯病菌的檢測(cè)用培養(yǎng)基，其特征在于在水稻細(xì)菌性谷枯病菌生長(zhǎng)或選擇性分離培養(yǎng)基中添加水稻葉汁和胡蘿卜汁中的至少一種。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻細(xì)菌性谷枯病菌的檢測(cè)用培養(yǎng)基，其特征在于添加的水稻葉汁或/和胡蘿卜汁的濃度是1_5%。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻細(xì)菌性谷枯病菌的檢測(cè)用培養(yǎng)基，其特征在于添加的水稻葉汁或/和胡蘿卜汁的濃度是2.5%。4.權(quán)利要求1-3之一所述的檢測(cè)用培養(yǎng)基在檢測(cè)水稻細(xì)菌性谷枯病菌中的應(yīng)用。5.試劑盒，包括水稻細(xì)菌性谷枯病菌生長(zhǎng)或/和選擇性分離培養(yǎng)基，以及水稻葉汁和胡蘿卜汁中的至少一種。全文摘要本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)，具體地說(shuō)涉及水稻細(xì)菌性谷枯病菌檢測(cè)用培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的水稻細(xì)菌性谷枯病菌檢測(cè)用培養(yǎng)基，在水稻細(xì)菌性谷枯病菌生長(zhǎng)或選擇性分離培養(yǎng)基中添加水稻葉汁和胡蘿卜汁中的至少一種。本發(fā)明采用的用于水稻細(xì)菌性谷枯病菌培養(yǎng)基，顯著地提高了水稻細(xì)菌性谷枯病菌的檢出率和檢出速度，為菌種的復(fù)活培養(yǎng)和水稻材料的生物安全檢疫提供了保證。文檔編號(hào)C12Q1/04GK101712978SQ20091004403公開(kāi)日2010年5月26日申請(qǐng)日期2009年8月5日優(yōu)先權(quán)日2009年8月5日發(fā)明者朱金國(guó),莫瑾申請(qǐng)人:湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心