專利名稱：：一種利用基因轉(zhuǎn)化改善水稻產(chǎn)量性狀的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于遺傳工程領(lǐng)域，具體涉及一種利用lrkl基因轉(zhuǎn)化提高水稻產(chǎn)量和改善產(chǎn)量性狀的方法。
背景技術(shù)：
：目前國(guó)內(nèi)外利用轉(zhuǎn)基因改良作物經(jīng)濟(jì)性狀的技術(shù)與方法主要是根據(jù)已知的功能基因與表型性狀的關(guān)系，采用組成型表達(dá)載體或組織專一性表達(dá)載體將目的基因?qū)肽繕?biāo)植物，以期獲得作物特定經(jīng)濟(jì)性狀或抗逆性性狀的改良.在農(nóng)作物特別是谷類作物中，產(chǎn)量性狀通常是由多基因或稱數(shù)量基因控制的。分離與克隆這類產(chǎn)量性狀基因的方法一般采用定位克隆技術(shù)，然后通過轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證其功能。以栽培水稻與江西東鄉(xiāng)野生稻雜交與回交構(gòu)建的基因系為材料，通過染色體定位與基因組序列分析分離克隆了來自東鄉(xiāng)野生稻基因組的一組編碼跨膜受體蛋白LRK的基因，共有8個(gè)首尾相連簇集排列的家族成員，分別命名為lrkl，lrk2，lrk3，lrk4，lrk5，lrk6，lrk7和lrk8。在有些秈稻品種中只含有7個(gè)lrk基因，它們?nèi)鄙賚rkl基因。粳稻中，lrk2，lrk3和lrk5基因不表達(dá)。秈稻中，缺少lrkl基因，lrk3和lrk5基因不表達(dá)(GuangmingHe，XiaojinLuo，F(xiàn)engTian，KeguiLi，ZuofengZhu，WeiSu，XiaoyinQian，Xiangk皿Wang，ChuangqingS皿andJinshuiYang氺H即lotypeVariationinStructureandExpressionofaGeneClusterthatisAssociatedwithaQuantitativeTraitLocusforImprovedYieldinRice，GenomeResearch,2006，16:618-626)。這個(gè)基因簇位于水稻2號(hào)染色體的端部，其DNA序列已經(jīng)登錄在國(guó)際基因組數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI，克隆編號(hào)為AY756174和DQ195081。經(jīng)水稻苗期分子檢測(cè)證實(shí)，在粳稻日本晴的8個(gè)lrk基因中，有5個(gè)基因表達(dá)，分別為lrkl，lrk4，lrk6，lrk7和lrk8。在秈稻9311(超級(jí)雜交稻親本之一)中，也有5個(gè)lrk基因表達(dá)，分別為lrk2，lrk4，lrk6，lrk7和lrk8。但是，尚未有利用這組lrk基因提高水稻產(chǎn)量或者明顯改善產(chǎn)量性狀的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種利用基因轉(zhuǎn)化提高水稻產(chǎn)量的方法。本發(fā)明提供了一種提高水稻產(chǎn)量的方法，即用水稻lrkl基因轉(zhuǎn)化水稻，所述的lrkl基因的蛋白氨基酸序列如SEQIDNO2所示。本發(fā)明中，水稻lrkl基因是指氨基酸序列如SEQIDNO2的蛋白。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與水稻lrkl蛋白相同功能的、SEQIDN0.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括水稻lrkl蛋白的活性片段和活性衍生物。本發(fā)明中，所述的lrkl基因的核苷酸序列如SEQIDNO1所示。本發(fā)明中，水稻lrkl基因的核苷酸序列包括編碼具有水稻lrkl蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.l中32-3181位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQIDNO.l序列的編碼框32-3181位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQIDNO.l中32-3181位核苷酸序列同源性低至約70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQIDNO.2所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQIDNO.1中從核苷酸32-3181位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術(shù)語(yǔ)還包括與SEQIDNO.1中從核苷酸32-3181位的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%的核苷酸序列。本發(fā)明中，所述的方法具體包括以下步驟(1)將lrkl基因編碼序列插入植物表達(dá)載體構(gòu)建重組表達(dá)載體；(2)誘導(dǎo)處理水稻愈傷組織；(3)用(1)所得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織；(4)恢復(fù)培養(yǎng)(3)所得的水稻愈傷組織。本發(fā)明中，所述的植物表達(dá)載體可以是常規(guī)的水稻表達(dá)載體。構(gòu)建重組序列的方法參考《分子克隆》的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如，將lrkl基因編碼序列克隆到植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)。本發(fā)明中，所述的植物表達(dá)載體可以是已經(jīng)市售或者文獻(xiàn)報(bào)道過的植物表達(dá)載體，例如pCAMBIA1304等。本發(fā)明中，步驟(3)中用基因槍微彈轟擊法實(shí)現(xiàn)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織。除此以外，還可以參用其他常規(guī)的基因轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明中，恢復(fù)培養(yǎng)水稻愈傷組織是先在不含篩選劑的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，然后再在含有篩選劑的培養(yǎng)基上篩選，并將篩選后的愈傷組織光照培養(yǎng)。本發(fā)明中，所述的篩選劑是潮霉素。在進(jìn)行篩選時(shí)，可以采用篩選劑濃度逐步提高的方法，也可以配合光照條件進(jìn)行。例如在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，采用下述含有30mg/和50mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基、同時(shí)配合暗培養(yǎng)約兩周進(jìn)行篩選。篩選完成后，所得即含有l(wèi)rkl基因的愈傷組織，可以將篩選后存活的愈傷于分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，待分化出小植株后，再轉(zhuǎn)入生根壯苗培養(yǎng)基，長(zhǎng)大后移入溫室。本發(fā)明提供了一種利用lrkl基因轉(zhuǎn)化提高水稻產(chǎn)量及產(chǎn)量性狀的方法。本發(fā)明利用基因槍微彈轟擊法，將水稻lrkl基因轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，經(jīng)過恢復(fù)培養(yǎng)獲得表達(dá)lrkl基因的水稻植株。結(jié)果顯示，成功轉(zhuǎn)化的水稻，其種子發(fā)芽勢(shì)快于對(duì)照，苗期分蘗勢(shì)好于對(duì)照，苗期生長(zhǎng)勢(shì)、苗期生長(zhǎng)勢(shì)和植株成熟穗子指標(biāo)總體優(yōu)于對(duì)照。本發(fā)明為水稻提高產(chǎn)量提供了一種低成本、高效益的新方法。圖1是含lrkl基因的表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖。lrkl基因插入表達(dá)載體的位置有箭頭標(biāo)4不。圖2是轉(zhuǎn)lrkl基因的種子發(fā)芽勢(shì)快于對(duì)照9311的結(jié)果圖1。圖3是轉(zhuǎn)lrkl基因的種子發(fā)芽勢(shì)快于對(duì)照9311結(jié)果圖2。具體方法為浸種兩天，催芽?jī)商?，催?天。圖4是lrkl轉(zhuǎn)基因苗期分蘗勢(shì)好于對(duì)照9311結(jié)果圖1。圖5是lrkl轉(zhuǎn)基因苗期生長(zhǎng)勢(shì)圖。左，9311對(duì)照；右轉(zhuǎn)lrkl基因9311。圖6是lrkl轉(zhuǎn)基因9311成熟單株圖。左，9311對(duì)照，株高110厘米，分蘗數(shù)為9;右，lrkl轉(zhuǎn)基因9311單株，株高105厘米，分蘗數(shù)為12。圖7是lrkl轉(zhuǎn)基因9311植株成熟穗子圖。上，9311對(duì)照，穗長(zhǎng)29.5厘米，第一枝梗為12，第二枝梗為54，總穎花數(shù)為244，千粒重為28克，生育期5/1播種，始穗8/7，采收9/5;下，lrkl轉(zhuǎn)基因9311，穗長(zhǎng)29.0厘米，第一枝梗為13，第二枝梗為73，總穎花數(shù)為293，千粒重為26克，生育期5/1播種，始穗8/2，采收9/5。具體實(shí)施例方式實(shí)施例llrkl基因的功能驗(yàn)證1)lrkl基因表達(dá)載體的構(gòu)建采用pCAMBIA1304為表達(dá)載體，將東鄉(xiāng)野生稻lrkl基因插入到pCAMBIA1304載體35S組型啟動(dòng)子下游。含lrkl基因的表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖如下2)lrkl基因轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)與結(jié)果采用目前國(guó)內(nèi)超級(jí)雜交稻的主要親本之一9311為轉(zhuǎn)基因受體。將9311成熟種子去殼消毒后接種在脫分化植物組織培育基上誘導(dǎo)愈傷組織。在愈傷組織誘導(dǎo)2-3周后，采用基因槍微彈轟擊法，將含lrkl基因的純化的pCAMBIA1304質(zhì)粒DNA導(dǎo)入9311愈傷組織細(xì)胞。在添加30ppm潮霉素的MS培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)3-4周篩選抗性細(xì)胞系，然后將篩選的細(xì)胞系轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)長(zhǎng)芽和生根。3)轉(zhuǎn)化處理試管苗移載及轉(zhuǎn)化植株后代的分子檢測(cè)將lrkl基因轉(zhuǎn)化處理的9311試管苗移載田間，并在分蘗期取葉片提取DNA采用PCR擴(kuò)放技術(shù)進(jìn)行分子檢測(cè)，于2005年秋獲得陽(yáng)性TO代。2005年冬，在海南島加代繁殖，獲得轉(zhuǎn)基因Tl代，共計(jì)7個(gè)株系。4)lrkl轉(zhuǎn)基因T2代群體產(chǎn)量性狀的調(diào)查與統(tǒng)計(jì)將lrkl基因轉(zhuǎn)基因T2代于2006年春播種，四葉期將轉(zhuǎn)化的7個(gè)lrkl轉(zhuǎn)基因T2代株系種植在復(fù)旦大學(xué)試驗(yàn)田。7個(gè)株系每個(gè)株系各種植49株，行株距為6寸X6寸，重復(fù)三次，同時(shí)設(shè)立9311親本對(duì)照。在分蘗盛期調(diào)查統(tǒng)計(jì)分蘗數(shù)，成熟期統(tǒng)計(jì)有效穗數(shù)，單株總粒數(shù)和千粒重，結(jié)果如下株系號(hào)碼平均株高(cm)主穗平均有效穗平均最長(zhǎng)劍葉平均最長(zhǎng)穗長(zhǎng)平均每株總粒數(shù)平均每穗粒數(shù)千粒重株系195.966.6531.1222.421392210265<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>根據(jù)上述田間調(diào)查及考種數(shù)據(jù)，與對(duì)照相比，lrkl轉(zhuǎn)基因9311的產(chǎn)量性狀優(yōu)于對(duì)有效穗增加27.8%;每株總粒數(shù)增加38.9%;平均每穗穗粒數(shù)增加8.9%。千粒重減少7%。水稻lrkl轉(zhuǎn)基因增加產(chǎn)量的主要原因是增加分蘗力和有效穗以及穗粒數(shù).轉(zhuǎn)基因9311植株的平均穗長(zhǎng)與對(duì)照基本一致，但穗粒數(shù)增加，主要是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因株系的稻穗二次枝梗數(shù)增加，從而增加了每穗總粒數(shù)。實(shí)施例2水稻lrkl基因轉(zhuǎn)化秈稻9311的方法1)選擇lrkl全長(zhǎng)0RF區(qū)段(見序列表)，采用PCR方法從東鄉(xiāng)野生稻中將其擴(kuò)增，并合成插入接頭克隆到植物表達(dá)載體pCAMBIA1304，獲得lrkl表達(dá)載體pCAMBIA1304/lrkl.2)誘導(dǎo)水稻愈傷組織培養(yǎng)基1.誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)基MS+2mg/L2，4_D.2.高滲培養(yǎng)基MS+2mg/L2，4_D+46.67g/L山梨醇+46.67g/L甘露醇.3.第一輪篩選培養(yǎng)基MS+2mg/L2，4_D+30mg/L潮霉素.4.第二輪篩選培養(yǎng)基MS+2mg/L2，4_D+50mg/L潮霉素.5.分化培養(yǎng)基MS+3mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+50mg/L潮霉素.6.生根壯苗培養(yǎng)基l/2MS+0.lmg/LNAA注1.以上培養(yǎng)基均含30g/L蔗糖+2.5g/Lagar，pH5.82.愈傷誘導(dǎo)、繼代、篩選培養(yǎng)條件為26-2『C暗培養(yǎng)，分化、生根壯苗為26-2『C及16小時(shí)光周期3)愈傷組織誘導(dǎo)與處理1.取授粉后12-15天的未成熟種子，在無菌條件下，先用70%乙醇浸洗10min，轉(zhuǎn)入0.1%升汞浸泡20min，無菌水清洗3次。2.在無菌條件下剝離幼胚，接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，26-28t:暗培養(yǎng)約20天后切芽，繼代一次。3.在繼代培養(yǎng)基中挑選生長(zhǎng)旺盛、淡黃色的愈傷約30-50塊(每塊3mm左右)，置于高滲培養(yǎng)基上中央，排成直徑約2.5cm的圓圈內(nèi)，培養(yǎng)約4-5h后用于轉(zhuǎn)化。4)基因槍轉(zhuǎn)化1.基因槍從寧波新芝科技有限公司購(gòu)置的高壓氣體基因槍，型號(hào)GJ-IOOO.2.微粒子彈制備3.稱取60mg鴇粉(直徑約lum)，加入到1.5ml滅菌離心管中，再加入lml無水乙醇，振蕩lmin，于10000rpm離心10s，棄上清，重復(fù)洗一次后，將金粉懸浮于lml無菌水中現(xiàn)用或-2(TC保存。4.吸取50ul鴇粉懸浮液于1.5ml離心管，依次加入5ugDNA、50u12.5MCaCl2、20ul0.1M亞精胺，振蕩5分鐘，10000rpm離心20s，棄上清，以140ul無水乙醇漂洗兩次，加入60ul無水乙醇，懸浮待用。5)轟擊受體材料1.將基因槍放于超凈工作臺(tái)上，用70%酒精擦凈真空室，并將可裂膜、載粒膜、金屬擋網(wǎng)(均由寧波新芝科技有限公司供貨)于70%酒精中消毒30分鐘，然后用無菌濾紙吸干或吹凈殘余酒精.2.打開電源開關(guān)，真空泵及氦氣瓶閥。3.將可裂膜裝入固定、旋緊。4.取10ul包被DNA的鎢粉無水乙醇懸浮液，均勻涂布于載粒膜中心，放在超凈臺(tái)上吹干。5.將載有微彈的載粒膜及擋網(wǎng)裝入微彈發(fā)射裝置，使有顆粒的一面朝下。6.將培養(yǎng)皿放在托盤上，使愈傷集中于培養(yǎng)皿中央。7.打開氣瓶，調(diào)節(jié)壓力1100Psi。8.抽真空，當(dāng)真空度達(dá)到需要值時(shí)，將VAC鍵轉(zhuǎn)到Hold位置。9.轟擊，每皿轟擊2次(第一次轟擊后將培養(yǎng)皿旋轉(zhuǎn)90度后進(jìn)行第二次轟擊)，按放氣鍵使真空表讀數(shù)回零，取出樣品，轟擊后于高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)12-16h。6)轉(zhuǎn)化愈傷組織篩選1.將打槍后高滲培養(yǎng)基上的愈傷轉(zhuǎn)入不含篩選劑的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上恢復(fù)生長(zhǎng)5-7天。2.將愈傷轉(zhuǎn)到含30mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，均勻擺放，暗培養(yǎng)14-17天進(jìn)行第一次抗性篩選。3.將抗性愈傷轉(zhuǎn)入含50mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)8_12天進(jìn)行第二次抗性篩選。7)水稻rFCA基因RRM2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)化植株篩選與檢測(cè)1.轉(zhuǎn)化試管苗分子檢測(cè)A，將篩選后存活的愈傷于分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)30天。B，待分化出小植株后，將小植株轉(zhuǎn)入生根壯苗培養(yǎng)基，長(zhǎng)大后移入溫室。2.轉(zhuǎn)化植株的分子檢測(cè)分別采用PCR擴(kuò)增和基因組Southern雜交雜法檢測(cè)后選的轉(zhuǎn)化植株，共獲得兩株含有轉(zhuǎn)化的rFCA-RRM片段的陽(yáng)性植株序列表〈210>1〈211>3240〈212>DNA〈213>0ryzasativa〈220〉〈221>CDS〈222>(32).(3181)〈223〉〈400>1ccaacttccatgctagtatcaccagaaaaccatgcagccacctcatttttea52MetGinProProHisPhe15tac朋gc朋age朋c3gactgcccatecctgttcttagecttgec100TyrLysThrGinSerAsnArgLeuProlieProValLeuSerLeuAla101520cttgtgctgctgetc朋cttc3CCtctccc3CCElgtteatgtgag148LeuValLeuLeuLeuAsnPheThrSerProThrSerSerCysThrGlu253035CElggag朋g朋ctecetcetc朋tttcetc3CCgggctttct朋ggat196GinGluLysAsnSerLeuLeuAsnPheLeuThrGlyLeuSerLysAsp40455055ggcetcageEltgteatgg朋ggatggcgtggattgttgcgagtgg244GlyGlyLeuSerMetSerTrpLysAspGlyValAspCysCysGluTrp606570g朋gggate3CCtgc3gagat￡igg3CCgtgactgatgttteactg292[o川]GluGlylieThr75CysArgThrAspArg80ThrValThrAspVal85SerLeuccttct￡iggageetcgaggggtacatetctCC3tctcttggc朋cctg340ProSerArgSerLeuGluGlyTyrlieSerProSerLeuGlyAsnLeu9095100actttgctgcgcetc朋cctgtectac朋cctgetatecElgtgtc388ThrGlyLeuLeuArgLeuAsnLeuSerTyrAsnLeuLeuSerSerVal105110115etaccgCElgg朋ttgctgtcttecageetcategtcateg￡lCate436LeuProGinGluLeuLeuSerSerSerLysLeulieVallieAsplie120125130135agettt朋ccgcctg朋tggtetcg￡lC朋gttgCC3tcttea3CC484SerPheAsnArgLeuAsnGlyGlyLeuAspLysLeuProSerSerThr140145150cctgcc￡lggCC3ctgCElggt￡letc朋cateteaElgt朋tttgttagCEl532ProAlaArgProLeuGinValLeuAsnlieSerSerAsnLeuLeuAla155160165CElgtttCC3tectectgggt￡lgtgEltggCEl朋tctggccgCEl580GlyGinPheProSerSerThrTrpValValMetAlaAsnLeuAlaAla170175180etc朋tgtcElgt朋c朋cagetttactgggateCC3act朋tttc628LeuAsnValSerAsnAsnSerPheThrGlyLyslieProThrAsnPhe185190195tgc3CC朋cteaCC3tecttagetgtgcttg朋etcElgttac朋cc朋676CysThrAsnSerProSerLeuAlaValLeuGluLeuSerTyrAsnGin200205210215ttcElgtgggageattccccctg朋cttgg￡iElgttgctec￡iggctg3ga724PheSerGlySerlieProProGluLeuGlySerCysSerArgLeuArg220225230gtcetc朋ggetggccat朋c朋ccttElgtgggactetccctgatg朋772ValLeuLysAlaGlyHisAsnAsnLeuSerGlyThrLeuProAspGlu235240245atettc朋tget3CCtegttagagtgcetctcttttCC3朋c朋t朋t820liePheAsnAlaThrSerLeuGluCysLeuSerPheProAsnAsnAsn250255260ttac朋cttg朋ggggCEl朋tgttgtcaaaetcggt朋gctg868LeuGinGlyThrLeuGluGlyAlaAsnValValLysLeuGlyLysLeu265270275get3CCcttg￡lCcttgag朋c朋cttcElgtggt朋cattCC3gag916AlaThrLeuAspLeuGlyGluAsnAsnPheSerGlyAsnlieProGlu280285290295tctateggtCElgetc朋c3gattggagg朋etccatttg朋c朋c朋c964SerlieGlyGinLeuAsnArgLeuGluGluLeuHisLeuAsnAsnAsn300305310aaaEltgtttgggageateCC3teaaccctgage犯ctgcacaagtctg1012LysMetPheGlySerlieProSerThrLeuSerAsnCysThrSerLeu93153203253CCateg￡lCetc朋tage朋c朋tttcagtggagagetc3tg朋t1060LysThrlieAspLeuAsnSerAsnAsnPheSerGlyGluLeuMetAsn330335340gtc朋tttctec朋tetacccElgtctecaaactttagatctteggcag1108ValAsnPheSerAsnLeuProSerLeuGinThrLeuAspLeuArgGin345350355朋catettcElgtggtaaaattCC3g朋seaatetecteatgcage朋c1156AsnliePheSerGlyLyslieProGluThrlieTyrSerCysSerAsn360365370375etaactgccctgeggetatctttg朋ta朋ttcc朋ggccagttetea1204LeuThrAlaLeuArgLeuSerLeuAsnLysPheGinGlyGinLeuSer380385390朋getaggc朋tctg朋gtecctttecttcctgteaetcggttac1252LysGlyLeuGlyAsnLeuLysSerLeuSerPheLeuSerLeuGlyTyr395400405朋c朋tetc朋cate朋tgcactecagatetteaggagetec1300AsnAsnLeuThrAsnlieThrAsnAlaLeuGinlieLeuArgSerSer410415420ageaaaetc3CC3CCcttcttattage朋c朋cttc3tg朋tg朋3gt1348SerLysLeuThrThrLeuLeulieSerAsnAsnPheMetAsnGluSer425430435ateCC3g￡lCgatgat3gaattgatggttttgagaatcttcaggttctt1396lieProAspAspAspArglieAspGlyPheGluAsnLeuGinValLeu440445450455g￡lCetaElgttgctecttttctggaa朋atecctc朋tggttetea1444AspLeuSerGlyCysSerPheSerGlyLyslieProGinTrpLeuSer460465470etctcg￡lggttggagEltgctggttttegac朋c朋tc朋cteact1492LysLeuSerArgLeuGluMetLeuValLeuAspAsnAsnGinLeuThr475■485CC3atecctg￡lCtggateageagecteaacttcetcttctatcte1540GlyProlieProAspTrplieSerSerLeuAsnPheLeuPheTyrLeu490495500gatgt￡ltea朋t朋c朋tctg3Cgggag朋attccgatggccttette1588AspValSerAsnAsnAsnLeuThrGlyGlulieProMetAlaLeuLeu505510515CElgEltgCC3Eltgeta￡lggteag￡lCagggetgcagcac朋ttggacact1636GinMetProMetLeuArgSerAspArgAlaAlaAlaGinLeuAspThr10CN10]781658A說明書9/15頁(yè)5205255305353gagCEltttg朋etacccatetatategatgcaacaetacttcaatac1684ArgAlaPheGluLeuProlieTyrlieAspAlaThrLeuLeuGinTyr540545550cgc朋ggccElgtgettttcccgtgctg朋tcteggt朋c朋tg朋1732ArgLysAlaSerAlaPheProLysValLeuAsnLeuGlyAsnAsnGlu555560565ttc3CCggtttgatecctc朋gagattggtcagttgaaagcgetcctt1780PheThrGlyLeulieProGinGlulieGlyGinLeuLysAlaLeuLeu570575580ttgctt朋tttgagettt朋caaattetatggagatateccccagteg1828LeuLeuAsnLeuSerPheAsnLysLeuTyrGlyAsplieProGinSer585590595atetgc朋cetc3gag￡lCctgetaatgctggattteteaage朋t朋t1876lieCysAsnLeuArgAspLeuLeuMetLeuAspLeuSerSerAsnAsn600605610615etaactggtateCC3gccgCElctgaacaatttaacctttcttate1924LeuThrGlyThrlieProAlaAlaLeuAsnAsnLeuThrPheLeulie620625630g朋ttc朋cgtctegtat朋tg￡lCctegaagggcctateccaactggc1972GluPheAsnValSerTyrAsnAspLeuGluGlyProlieProThrGly635640645gg￡iCElgtttElgtttc朋ttctagettttatggcaatccaaag2020GlyGinPheSerThrPheThrAsnSerSerPheTyrGlyAsnProLys650655660ctgtgtggtcctEltgcttC3Ccattgcagtteatttgatagacat2068LeuCysGlyProMetLeuThrHisHisCysSerSerPheAspArgHis665670675ttggtctea朋gc朋c朋c朋朋c朋g朋ggtcatecttgteattgtt2116LeuValSerLysGinGinGinAsnLysLysVallieLeuVallieVal680685690695ttttgtgtcctttttgccattgtcattcttttgttgttggggtat2164PheCysValLeuPheGlyAlalieVallieLeuLeuLeuLeuGlyTyr700705710etccttctgteaate￡lggggtEltgagtttc3Cg3CC3333gtaggtgc2212LeuLeuLeuSerlieArgGlyMetSerPheThrThrLysSerArgCys715720725朋c朋tgattacateg朋gCElttateaccgaacaccaatteagatcat2260AsnAsnAspTyrlieGluAlaLeuSerProAsnThrAsnSerAspHis730735740ttgttggteEltgttgCElgc朋ggc33gg朋gcag朋朋c朋getc2308LeuLeuValMetLeuGinGinGlyLysGluAlaGluAsnLysLeuThr745750755ttcactggcattgtgg朋get朋c朋tttt朋ccaggagcacate2356PheThrGlylieValGluAlaThrAsnAsnPheAsnGinGluHislie760765770775atttgtgg￡iggttatgg￡igtctacaaggcacagttecctgat2404lieGlyCysGlyGlyTyrGlyLeuValTyrLysAlaGinLeuProAsp780785790ggctctEltgattgccate朋gcttaatggtgaaatgtgtctgatg2452GlySerMetlieAlalieLysLysLeuAsnGlyGluMetCysLeuMet795■805g朋￡lgggagttcElgtgCElgaggttgaaacgetctecatggcacgacat2500GluArgGluPheSerAlaGluValGluThrLeuSerMetAlaArgHis810815820g￡lC朋tcttgtgCC3etctggggttectgtatecaggga朋ctegagg2548AspAsnLeuValProLeuTrpGlyTyrCyslieGinGlyAsnSerArg825830835etcetcatetattcttacEltggagaatggcagectggatgattggctt2596LeuLeulieTyrSerTyrMetGluAsnGlySerLeuAspAspTrpLeu840845850855cat朋c朋ggatgatgat3CCageseaattctegattggcca3gaegg2644HisAsnLysAspAspAspThrSerThrlieLeuAspTrpProArgArg860865870etcategCElaaaggggCElagecatggcctttcttecatecacaat2692LeuLyslieAlaLysGlyAlaSerHisGlyLeuSerTyrlieHisAsn875880885atetgc朋gcctcgtattgtcC3Ccgtgacateaaatctageaacate2740lieCysLysProArglieValHisArgAsplieLysSerSerAsnlie890895■cttetcg￡lCaaag朋ttcgettatattgcagattttggattetea2788LeuLeuAspLysGluPheLysAlaTyrlieAlaAspPheGlyLeuSer905910915eggttgatecttccc朋cactcatgtcccaactgaaetagttggc2836ArgLeulieLeuProAsnLysThrHisValProThrGluLeuValGly920925930935actcttggttacateCC3cctgagtacgcccaggcatgggttgetaca2884ThrLeuGlyTyrlieProProGluTyrAlaGinAlaTrpValAlaThr940945950ttgaaaggtgatgtetecagtttcggagtggtcctgcttgagcttetc2932LeuLysGlyAspValTyrSerPheGlyValValLeuLeuGluLeuLeu955960965actgggaggaggccagttccgatectgtctaccteaaaggaacttgtc2980ThrGlyArgArgProValProlieLeuSerThrSerLysGluLeuVal970975980ccatgggtecaggagatggtateaaatggaaagcagattgaggtgctg3028ProTrpValGinGluMetValSerAsnGlyLysGinlieGluValLeu985990995gattteseatttc朋ggcseagggtgtg朋gagc朋atgcte朋g3073AspLeuThrPheGinGlyThrGlyCysGluGluGinMetLeuLys100010051010gtccttgaaattgettgcaagtgtgtcaaaggtgatcctttgegg3118ValLeuGlulieAlaCysLysCysValLysGlyAspProLeuArg101510201025aggcctactatgatagaagtegtagccagtctgcacagtatagac3163ArgProThrMetlieGluValValAlaSerLeuHisSerlieAsp103010351040cctgacggcctgacctaaagatacaataatetgacaaataatcttgta3211ProAspGlyLeuThr1045ctttcagtgaactgagttgatctagtctc3240〈210>2〈211>1049〈212>PRT〈213>0ryzasativa〈400>2MetGinProProHis15lieProValLeuSer20ProThrSerSerCys35LeuThrGlyLeuSer50GlyValAspCysCys65ThrValThrAspValPheSerTyrLysThrGinSerAsnArgLeuPro1015LeuAlaLeuValLeuLeuLeuAsnPheThrSer2530ThrGluGinGluLysAsnSerLeuLeuAsnPhe4045LysAspGlyGlyLeuSerMetSerTrpLysAsp5560GluTrpGluGlylieThrCysArgThrAspArg707580SerLeuProSerArgSerLeuGluGlyTyrlie13859095SerProSerLeuGlyAsnLeuThrGlyLeuLeuArgLeuAsnLeuSer100105110TyrAsnLeuLeuSerSerValLeuProGinGluLeuLeuSerSerSer115120125LysLeulieVallieAsplieSerPheAsnArgLeuAsnGlyGlyLeu130135140AspLysLeuProSerSerThrProAlaArgProLeuGinValLeuAsn145150155160lieSerSerAsnLeuLeuAlaGlyGinPheProSerSerThrTrpVal165170175ValMetAlaAsnLeuAlaAlaLeuAsnValSerAsnAsnSerPheThr180185190GlyLyslieProThrAsnPheCysThrAsnSerProSerLeuAlaVal195200205LeuGluLeuSerTyrAsnGinPheSerGlySerlieProProGluLeu210215220GlySerCysSerArgLeuArgValLeuLysAlaGlyHisAsnAsnLeu225230235240SerGlyThrLeuProAspGluliePheAsnAlaThrSerLeuGluCys245250255LeuSerPheProAsnAsnAsnLeuGinGlyThrLeuGluGlyAlaAsn260265270ValValLysLeuGlyLysLeuAlaThrLeuAspLeuGlyGluAsnAsn275280285PheSerGlyAsnlieProGluSerlieGlyGinLeuAsnArgLeuGlu290295300GluLeuHisLeuAsnAsnAsnLysMetPheGlySerlieProSerThr305310315320LeuSerAsnCysThrSerLeuLysThrlieAspLeuAsnSerAsnAsn325330335PheSerGlyGluLeuMetAsnValAsnPheSerAsnLeuProSerLeu340345350GinThrLeuAspLeuArgGinAsnliePheSerGlyLyslieProGlu355360365ThrlieTyrSerCysSerAsnLeuThrAlaLeuArgLeuSerLeuAsn370375380LysPheGinGlyGinLeuSerLysGlyLeuGlyAsnLeuLysSerLeu3853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