專利名稱：采用轉(zhuǎn)喜樹aoc基因提高喜樹愈傷組織中喜樹堿含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種提高喜樹愈傷組織中喜樹堿含量的方法，特別 是一種采用轉(zhuǎn)化丙二稀氧化物環(huán)化酶基因(allene oxide cyclase, aoc)提高喜樹愈傷組 織中喜樹堿含量的方法。
背景技術(shù)：
喜樹(Camptotheca acuminata Decaisne)，藍(lán)果樹科(Nyssaceae)喜樹屬多年生 亞熱帶落葉闊葉樹，別名有旱蓮木、干丈樹等，此屬僅喜樹1種植物，是我國(guó)特有樹種(中國(guó) 科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，1983)。自20世紀(jì)90年代來(lái)，美國(guó)、日本、加拿大和英國(guó)等 國(guó)家積極投入大量人力物力進(jìn)行喜樹引種和栽培等的研究和喜樹堿開發(fā)，喜樹成為紅豆杉 (Taxus sp。)之后第2個(gè)重要的木本抗癌藥用植物(Wallis, Wang et al. 1997)。至此，已 從喜樹中分離出20多種化學(xué)成分，其中喜樹堿及其類似物有8種，它們的共同點(diǎn)是結(jié)構(gòu)中 都擁有5個(gè)環(huán)。其中，10-羥基喜樹堿(hydroxy-camptothecin，HCPT)是喜樹堿分子的第 10位碳原子的氫被羥基取代后的喜樹堿的天然衍生物，來(lái)源于喜樹的果實(shí)、葉，也可由喜樹 堿人工化學(xué)轉(zhuǎn)化而來(lái)，為黃色柱狀結(jié)晶、不溶于水，微溶于有機(jī)溶劑、溶液，具有藍(lán)色熒光， 其鈉鹽溶于水。該化合物具有顯著的抗癌活性，較喜樹堿劑量小、毒性輕、抗瘤廣譜。從目前 的研究情況和研究趨勢(shì)來(lái)看，喜樹堿及類似物主要從喜樹中分離獲得(SriranuYogeeswari et al. 2005)。而喜樹堿作為喜樹中的一種天然次生代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)量受到喜樹生長(zhǎng)發(fā)育和 環(huán)境因素的影響，而過(guò)去人們一直著力于提取工藝和產(chǎn)品的開發(fā)，隨著喜樹堿市場(chǎng)的擴(kuò)大， 生產(chǎn)喜樹堿及其類似物所需的原料將成為這一產(chǎn)業(yè)的瓶頸。據(jù)報(bào)道，中國(guó)國(guó)內(nèi)每年新發(fā)現(xiàn) 癌癥患者160萬(wàn)人，并有130萬(wàn)人死于癌癥，全世界的癌癥患者將會(huì)更多。但現(xiàn)今全世界的 喜樹堿的生產(chǎn)能力僅為600kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需要，而且喜樹堿仍不能化學(xué)全合成， 所以喜樹資源仍是喜樹堿及其類似物的唯一來(lái)源。喜樹愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)則為生產(chǎn) 喜樹堿帶來(lái)了新的希望。喜樹堿(camptothecin，簡(jiǎn)稱CPT)是一種具有抗腫瘤活性的萜類吲哚生物堿。 經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家嘗試了采用各種方法，包括優(yōu)化培養(yǎng)條件 (Helmut Wiedenfeld, et al. Camptothecin and 10-hydroxycamptothecin in callus and plantlets of Camptotheca acuminata. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 1997,49 :213-218. Xue-Wu Pan，et al.Improvement of growth and camptothecin yield by altering nitrogen source supply in cell suspension cultures of Camptotheca acuminata. Biotechnology Letters，2004，26 :1745—1748)、力口入前體物質(zhì) (Andrea Silvestrini，et al. Effects of alkaloid precursor feeding on Camptotheca acuminata. Physiology and Biochemistry, 2002,40 749-753) R^itRM (Lorence A， et al. Camptothecin and 10-hydroxy-camptothecin from Camptotheca acuminatahairy roots. Plmt Cell Reports, 2004, 22 437-441)來(lái)提高喜樹組織培養(yǎng)物中喜樹堿的含量。如Wiedenfeld等對(duì)喜樹組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基條件進(jìn)行了研究，比較了不同的激素配比和培 養(yǎng)基類型，選擇了 MS培養(yǎng)基和1. Omg/La-萘乙酸、1. Omg/L激動(dòng)素和60mg/L蔗糖作為最 優(yōu)培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的所有組織和器官中都含有喜樹堿和10-羥基喜樹堿，喜樹愈 傷中喜樹堿含量變化范圍從2. 36mg/g到1. 49mg/g干重。而Lorence等建立了利用發(fā)根農(nóng) 桿菌ATCC15834和A4遺傳轉(zhuǎn)化喜樹的體系，獲得了毛狀根，其中喜樹堿最高含量為1. Omg/ g干重 雖然嘗試了多種辦法來(lái)提高喜樹愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)物中的喜樹堿含量，但到目 前為止，通過(guò)愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生喜樹堿，其含量依然太低不具商業(yè)前景。代謝 工程為改變植物細(xì)胞或愈傷組織的組成成份和增加植物細(xì)胞或愈傷組織喜樹堿產(chǎn)量提供 了一條誘人的方法。為了更有效地生產(chǎn)喜樹堿，應(yīng)用一條新的途徑進(jìn)行植物次生代謝基因 工程，開展茉莉酸合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)及調(diào)控研究，以及開展喜樹堿代謝工程研究 相結(jié)合將是提高喜樹堿含量并最終解決喜樹堿產(chǎn)品稀缺的有效方法。0RCA3 (octadecanoic-responsive Catharanthus AP2_domain protein 3)是一 個(gè)受甲基茉莉酸誘導(dǎo)的植物基礎(chǔ)和次級(jí)代謝的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可增強(qiáng)萜類吲哚生物堿 (Terpenoid Indole Alkaloids,TIAs)代謝途徑上多個(gè)基因(dxs、as、tdc、str)的表達(dá)，從 而使代謝流向TIAs合成方向流動(dòng)，利于TIAs的積累。在茉莉酸合成途徑中，丙二烯氧化物 環(huán)化酶(allene oxide cyclase, A0C, EC 5.3.99.6)是調(diào)控茉莉酸合成途徑中最優(yōu)先考慮 的靶點(diǎn)。它催化一種不穩(wěn)定的丙二烯氧化物環(huán)化生成茉莉酸最終前體12-氧植物二烯酸。 采用基因工程手段，將丙二烯氧化物環(huán)化酶編碼基因aoc轉(zhuǎn)化喜樹，對(duì)喜樹堿合成途徑上 多個(gè)基因進(jìn)行調(diào)控，獲得喜樹堿高產(chǎn)的喜樹愈傷組織。目前尚未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化aoc基因提高喜 樹愈傷組織中喜樹堿含量的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種提高喜樹愈傷組織中喜樹堿 含量的方法，特別是一種采用轉(zhuǎn)化丙二稀氧化物環(huán)化酶基因(allene oxide cyclase,aoc) 提高喜樹愈傷組織中喜樹堿含量的方法。本發(fā)明涉及的關(guān)鍵酶基因克隆、載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化、分子檢測(cè)、生物堿提取及含 量測(cè)定、半定量RT-PCR分析用于本發(fā)明，建立了提高喜樹愈傷組織生物堿含量的方法，為 喜樹愈傷組織大規(guī)模工廠化生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明從喜樹中克隆aoc基因，構(gòu)建含aoc基因的植物表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介 導(dǎo)，將aoc基因?qū)胂矘浼?xì)胞并再生出愈傷組織；PCR和半定量RT-PCR檢測(cè)外源目的基因 aoc的整合和表達(dá)情況，高效液相色譜(HPLC)測(cè)定喜樹愈傷組織中喜樹堿含量，篩選喜樹 堿含量提高的轉(zhuǎn)基因喜樹愈傷組織。本發(fā)明包括如下具體步驟(1)采用基因克隆方法獲得喜樹關(guān)鍵酶基因aoc ；(2)把a(bǔ)oc基因可操作性地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成含aoc基因的植物表達(dá)載體；(3)將含aoc基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化喜樹的含aoc基 因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株；
(4)利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化喜樹細(xì)胞，獲得經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因愈傷 組織；(5)半定量RT-PCR測(cè)定喜樹愈傷組織中aoc基因的表達(dá)；(6)對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因愈傷組織中喜樹堿含量進(jìn)行HPLC測(cè)定，篩選喜樹堿含量顯著 提高的轉(zhuǎn)基因喜樹愈傷組織。本發(fā)明中，所述的經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因愈傷組織是指，分別設(shè)計(jì)合成aoc基因的檢 測(cè)引物，進(jìn)行DNA擴(kuò)增，紫外線下觀察到目的條帶的陽(yáng)性組織即為轉(zhuǎn)基因喜樹愈傷組織。所述的對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因愈傷組織中喜樹堿含量進(jìn)行HPLC測(cè)定，方法為色譜柱為 Diamonsil C-18柱，流動(dòng)相為乙腈水，乙腈水的體積比為4 6，柱溫25°C，流速0. 8mL/ min，進(jìn)樣量10yL。喜樹堿含量根據(jù)峰面積由標(biāo)準(zhǔn)品曲線換算。所述的半定量RT-PCR測(cè)定喜樹愈傷組織中aoc基因的表達(dá)，方法為設(shè)計(jì)合成 aoc基因和看家基因18S rRNA的引物，進(jìn)行半定量RT-PCR擴(kuò)增，用相對(duì)定量法分析基因相 對(duì)表達(dá)量。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的采用轉(zhuǎn)aoc基因提高喜樹愈傷組織喜樹堿含量的方 法采用基因工程方法，將茉莉酸合成途徑關(guān)鍵酶基因aoc導(dǎo)入喜樹愈傷組織中，獲得了喜 樹堿含量顯著提高的喜樹愈傷組織，且轉(zhuǎn)基因喜樹愈傷中喜樹堿含量均高于非轉(zhuǎn)基因喜樹 愈傷。其中，轉(zhuǎn)基因喜樹愈傷中喜樹堿含量最高達(dá)3. 9310mg/g干重，而非轉(zhuǎn)基因喜樹愈傷 中幾乎檢測(cè)不到喜樹堿含量。這對(duì)解決喜樹堿藥源匱乏、滿足醫(yī)藥工業(yè)大規(guī)模工廠化生產(chǎn) 需要具有重要意義。所述的根癌農(nóng)桿菌的公開方式為市場(chǎng)有公開出售的生物材料，可以從多家公司 如澳大利亞 CAMBIA 公司(CAMBIA，GP0 Box 3200,Canberra,ACT 2601，Australia。商品名 稱根癌農(nóng)桿菌菌株如EHA105，商品編號(hào)Gambar 1)購(gòu)得。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述 的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1喜樹aoc基因的克隆1.組織分離將喜樹種子用75 % (V/V)酒精浸泡1分鐘，再用0. 1 % (V/V) HgCl2浸泡5分鐘，無(wú) 菌水沖洗3-4次，用無(wú)菌吸水紙吸干表面水分，接種于無(wú)激素的MS(Murashige and Skoog, 1962)固體培養(yǎng)基中，25°C、12h/12h光照培養(yǎng)，即可獲得喜樹無(wú)菌苗，待苗長(zhǎng)至5cm左右后， 切取葉片和莖段用于RNA提取。2. RNA 的分離稱取0.5g所述的喜樹無(wú)菌試管苗，用液氮速凍后，迅速用研缽研碎，加入盛有 lmL CTAB 緩沖液[3% CTAB (W/V) ,3% PVP (ff/V) (Mw 40000), 25mM EDTA, 2. 0M NaCl, lOOmMTris-HCl(pH 8. 0) ,0. 5g/L spermidine 和 0. 1 % DEPC(V/V)]的 1. 5mL Eppendorf 管中， 充分振蕩后，于室溫下放置5min，加200 u L氯仿，用力振蕩15sec，室溫放置2-3min后，于 41、12，00(^離心15111土11 ；將上清液(約600ii L)吸入干凈的1. 5mL Eppendorf管中，加入等 體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫下放置lOmin后，于4°C、12，000g離心lOmi n ；棄上清，加lmL 75%乙醇清洗，振蕩后，于4°C、7，500g離心5min ；室溫干燥15-20min后溶于適量(50 y L) RNAase-free水中；用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含 量。3.基因克隆將所獲的喜樹總RNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶XL (AMV)反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA，根據(jù)所述喜 樹aoc基因的編碼序列(序列表中的序列1)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼框的上下游引物，并在上 游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載 體。以所述的第一鏈cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序。DNA序列測(cè)定由上海英駿生物 技術(shù)服務(wù)有限公司采用3730自動(dòng)測(cè)序儀完成。測(cè)序結(jié)果表明，所克隆的序列與GenBank中 所報(bào)道的喜樹aoc基因的編碼序列(序列表中的序列1) 一致。本實(shí)施例采用基因克隆方法從喜樹中獲得序列正確的喜樹茉莉酸生物合成關(guān)鍵 酶基因aoc，為通過(guò)轉(zhuǎn)aoc基因提高喜樹愈傷組織中喜樹堿含量提供了一個(gè)重要關(guān)鍵酶基 因。實(shí)施例2構(gòu)建含aoc基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1304: :p35S-aoc_nos以pCAMBIA1304為表達(dá)載體，用實(shí)施例1中aoc基因替換其上的gfp+gus基因。具 體地，Spe I/BstE II 雙酶切 pMDT-simple+aoc 和 pCAMBIA1304，回收 aoc 和 pCAMBIA1304 大片段，連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，提取質(zhì)粒做PCR檢測(cè)和酶切驗(yàn)證。結(jié)果表明，aoc基因 已被成功構(gòu)建到植物表達(dá)載體PCAMBIA1304中，從而獲得含aoc基因的植物表達(dá)載體 pCAMBIA1304::p35S-aoc-nos。本實(shí)施例將喜樹茉莉酸生物合成途徑關(guān)鍵酶基因aoc可操作性地連于表達(dá)調(diào)控 序列，形成含aoc基因的植物表達(dá)載體，該表達(dá)載體可用于通過(guò)代謝工程策略來(lái)提高喜樹 愈傷組織中喜樹堿的含量。實(shí)施例3獲得含aoc基因植物表達(dá)載體根癌農(nóng)桿菌工程菌將實(shí)施例2中含aoc基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(如EHA105，為市場(chǎng) 有公開出售的生物材料，可以從澳大利亞CAMBIA公司購(gòu)得，菌株編號(hào)為Gambar 1)，并進(jìn) 行PCR驗(yàn)證。具體地，首先制備感受態(tài)根癌農(nóng)桿菌(如EHA105):培養(yǎng)根癌農(nóng)桿菌至菌 液0. D600 = 0 . 5，將菌液冰浴30min后，取菌于1. 5ml Eppendorf管中，于4°C 5000rpm離 心5min，去上清；用抽濾滅菌的0. 1M CaCl2 (預(yù)冷)400 yl懸浮菌體(用移液槍輕輕打 勻)后于冰上放置30min，5000rpm離心5min，去上清，用100 yl預(yù)冷的0. lMCaCl2懸 浮菌體后于4°C保存10h備用。然后，采用以下方法獲得含aoc基因的植物表達(dá)載體 (PCAMBIA1304: :p35S-aoc-nos)的根癌農(nóng)桿菌工程菌株取一管100 yl的感受態(tài)，加 10 u 1質(zhì)粒DNA(pCAMBIA1304: :p35S-aoc-nos)，輕輕混勻后，于冰上放置5min和液氮中放 置8min后，放入37°C水浴中熱激5min ；加入800 u 1無(wú)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基，輕輕混 勻；振蕩培養(yǎng)活化(28°C，200rpm)4h后，于室溫離心(4000rpm) lOmin，去上清，余下200 yl 菌液重懸菌體混勻；將混勻的200 yl重懸活化菌液均勻涂布到加相應(yīng)抗生素[卡那霉素(Kan) 100 u g/ml+ 鏈霉素(Str) 25 u g/ml+ 利福平(Rif) 40 u g/ml]的 YEB 固體培養(yǎng)基平板 上，于28°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2天后，挑選抗性單菌落在含相應(yīng)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中 培養(yǎng)。菌液達(dá)到一定濃度后做目的基因aoc的PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，含aoc基因植物表達(dá) 載體已成功構(gòu)建到根癌農(nóng)桿菌菌株中。實(shí)施例41.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)aoc基因轉(zhuǎn)化喜樹1. 1.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)挑取含所述aoc基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌單菌落于培養(yǎng)基[YEB液 體培養(yǎng)基+鏈霉素(Str) 25 u g/ml+卡那霉素(Kan) 100 u g/ml+利福平(Rif) 40 u g/ml]中 在28°C搖床上180rpm振蕩過(guò)夜，第二天當(dāng)菌液濃度達(dá)到0D_ = 0. 5時(shí)，5000rpm離心10 分鐘后倒掉上層培養(yǎng)液，重懸沉淀在底部的農(nóng)桿菌，加入100 u M乙酰丁香酮，在28°C搖床 (180rpm)上活化2小時(shí)后用于轉(zhuǎn)化喜樹外植體。1.2.農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)將喜樹種子用75 % (V/V)酒精消毒1分鐘，再用0. 1 % (V/V)HgCl2浸泡消毒5 分鐘，無(wú)菌水沖洗3-4次后，用剪刀把種胚剪出傷口，放進(jìn)上述菌液中浸泡5分鐘，把菌 液倒掉，用無(wú)菌吸水紙吸干胚上多余的菌液，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+5mg/LNAA+0. 5mg/L 6-BA+O. 3mg/L 2，4_D+30g/L蔗糖+3g/L植物凝膠)上于25°C暗培養(yǎng)3天，使農(nóng)桿菌充分侵 染喜樹幼胚。以浸泡在不帶有根癌農(nóng)桿菌的幼胚外植體為對(duì)照。1. 3.愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)共培養(yǎng)后，把胚外植體轉(zhuǎn)接到恢復(fù)培養(yǎng)基(MS+5mg/L NAA+0. 5mg/L6_BA+0. 3mg/ L 2，4-D+30g/L蔗糖+3g/L植物凝膠+250mg/L羧芐霉素)上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和脫菌 培養(yǎng)，于25°C暗培養(yǎng)4周后轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基(MS+5mg/LNAA+0. 5mg/L 6-BA+O. 3mg/L 2， 4-D+30g/L蔗糖+3g/L植物凝膠+250mg/L羧芐霉素+25mg/L潮霉素)上進(jìn)行抗性愈傷 組織的篩選培養(yǎng)，將起源于不同細(xì)胞的每個(gè)愈傷組織作為一個(gè)無(wú)性系，接種于繼代培養(yǎng)基 (MS+5mg/L NAA+0. 5mg/L6-BA+0. 3mg/L 2，4_D+30g/L 蔗糖+3g/L 植物凝膠+25mg/L 潮霉素) 上繼代篩選，每四周繼代培養(yǎng)一次。2.轉(zhuǎn)基因喜樹愈傷組織的PCR檢測(cè)首先采用常規(guī)CTAB(Cetyltrimethyl Ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化 胺)方法提取轉(zhuǎn)基因喜樹潮霉素抗性愈傷組織的DNA，然后，根據(jù)目的基因所在表達(dá)盒 PCAMBIA1304 p35S-aoc_nos序列p35s和aoc分別設(shè)計(jì)正向引物T35SF和反向引物TA0CR， 用PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因喜樹抗性愈傷組織中的目的基因aoc進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件為94°C 變性 5min — 30 個(gè)循環(huán)(94°C 50sec — 58°C 50sec — 72°C lmin) — 72°C 6min。結(jié)果表 明，利用所設(shè)計(jì)的PCR特異引物擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因喜樹愈傷組織DNA，能擴(kuò)增出與預(yù)期結(jié)果一致的 特異目的片段(0.5kb)，而以非轉(zhuǎn)化喜樹基因組DNA為模板時(shí)，沒有擴(kuò)增出任何片段。說(shuō)明 aoc基因已經(jīng)整合到喜樹基因組中。本實(shí)施例將所述的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化喜樹的含aoc基 因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株，利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化喜樹細(xì)胞，獲得經(jīng) PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因愈傷組織。轉(zhuǎn)基因喜樹愈傷組織的獲得為篩選獲得喜樹堿含量提高的喜 樹愈傷組織提供了直接素材。
實(shí)施例5半定量RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因喜樹愈傷組織中aoc基因的表達(dá)1.引物的設(shè)計(jì)和合成設(shè)計(jì)合成aoc基因和看家基因18S rRNA的引物，進(jìn)行半定量RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn) 物凝膠電泳后與對(duì)照愈傷組織對(duì)比其表達(dá)量。2.RNA 的提取參照實(shí)施例1中所述方法，從喜樹愈傷組織中提取RNA，用DNasel除去RNA中基因 組DNA，用反轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)進(jìn)行第一鏈cDNA的合成，再以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行半定量 RT-PCR。3.半定量RT-PCR檢測(cè)看家基因18S rRNA基因的表達(dá)為調(diào)整各樣品間在RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中反應(yīng)效率的差異，檢測(cè)目的基因表達(dá) 量的同時(shí)需檢測(cè)看家基因18S rRNA基因的表達(dá)。4.半定量RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因喜樹愈傷組織中aoc基因的表達(dá)用非轉(zhuǎn)化普通愈傷作對(duì)照，用半定量RT-PCR測(cè)定aoc基因的表達(dá) 量。半定量RT-PCR反應(yīng)條件為50 °C 30min — 94 °C 2min — 22個(gè)循環(huán)(94 °C 30sec — 60°C 30sec — 72°C 60sec)。結(jié)果表明，在相同的總RNA量和18s rRNA基因表達(dá) 水平下，相比未轉(zhuǎn)化的愈傷組織，轉(zhuǎn)基因愈傷組織中的aoc基因轉(zhuǎn)錄水平有明顯升高，表明 目的基因aoc的轉(zhuǎn)入顯著提高了喜樹愈傷中的aoc的表達(dá)量。實(shí)施例6利用HPLC測(cè)定轉(zhuǎn)基因喜樹愈傷組織中喜樹堿含量1. HPLC條件及系統(tǒng)適用性以及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制HPLC 采用高效液相色譜儀(日本島津HPLC-4A)，積分儀3395，監(jiān)測(cè)器SPD-10A。 喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品(SIGMA)。乙腈為HPLC級(jí)；水為超純水。色譜柱為Diamonsil C18柱(5 y m， 200X4. 5mm)。流動(dòng)相為乙腈水，乙腈水的體積比為4 6，柱溫25°C，流速0. 8mL/min, 進(jìn)樣量10 ii L，壓力7. 8Mpa，靈敏度(AUFS = 1.0)。精密稱取喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)用甲醇溶解并稀釋至濃度為0. 4ng/uL, 0. 8ng/ u L，4ng/ u L，8ng/ u L，保存于 _20°C備用。2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液在相應(yīng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄圖譜及色譜參數(shù)，分別以峰面積 (Y)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X，ng/L)進(jìn)行回歸分析。喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品的log-log線性回歸方程分別 為Y = 0. 0153X+0. 0935R2 = 0. 99453.樣品的制備和喜樹堿含量的測(cè)定將愈傷組織置于烘箱中60°C干燥至恒重。每次稱取研碎的愈傷組織0. 2g進(jìn)行定 量分析。用8ml 95%乙醇50°C超聲30分鐘后，冷卻至室溫，吸取提取液，12500轉(zhuǎn)/分鐘 離心10分鐘，吸取上清液，12500轉(zhuǎn)/分鐘再離心10分鐘，吸取上清液，取10 ill上樣，用 HPLC法測(cè)量喜樹堿的含量。分別吸取所述對(duì)照品溶液和供試樣品溶液各10 U L，注入高效液相色譜儀，記錄各 組分峰面積，代入線性回歸方程，計(jì)算即得樣品中喜樹堿含量。在本發(fā)明中轉(zhuǎn)aoc基因顯著提高喜樹愈傷組織中喜樹堿含量。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因愈傷組織中喜樹堿含量比對(duì)照均有較大增加，其中非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼鷤M織中幾乎檢測(cè)不到喜 樹堿(痕量)，是由于對(duì)照愈傷中喜樹堿含量太低，達(dá)不到最低檢測(cè)范圍；而轉(zhuǎn)aoc基因的 轉(zhuǎn)基因愈傷組織中喜樹堿含量最高為3. 9310mg/g干重，最低為1. 0028mg/g干重。
本實(shí)施例采用HPLC法測(cè)定了轉(zhuǎn)基因喜樹愈傷組織中喜樹堿含量。采用轉(zhuǎn)aoc基 因的代謝工程策略獲得了喜樹堿含量提高的喜樹愈傷組織，為規(guī)模化生產(chǎn)喜樹堿并最終解 決生物堿匱乏提供了一種方法。本發(fā)明涉及的序列表
<110>復(fù)旦大學(xué)
<120>轉(zhuǎn)aoc基因提高喜樹愈傷組織中喜樹堿含量的方法
<160>1
<170>PatentIn version 3. 4
<210>1
<211>2622
<212>DNA
<213> (Camptotheca acuminata Decaisne)
<400>1
1GATTCACCCATTACATCCATCCTCACCAAACTTTTTACTTTTTCTCCTCAGACTTCAGAG
61CACTTCCAATAATGGCTGCTTCATCAACTTCTTCTCTCAGAACCATCTCTTCCTCTGTAA
121AGCTACCAACTGCCACCGCCATCACTTCACCTGCCCAGAAACTCACACACTTCAAGCTCT
181CCAACCCCTTCGTCTCCCAAAACCTCAGACTCACCACCACAGCTGCCCCTTCCAGAATAT
241CATTCACATGCAAGTGCCAAAGCAGCACATCAGATTCTTCAAGACCCAGTAAAGTTCAAG
301AACTGCACGTCTATGAGATCAACGAACGAGACCGTGGAAGCCCAGCTTATCTCAGGCTCA
361GCCAGAAATCTGTCAATTCCCTCGGCGATCTTGTCCCTTTCAGCAACAAAATCTATAGCG
421GATGTCTGAAGAAGCGATTGGGAGTAACGGCCGGAATATGCGTTCTGATCCGGAACGTGC
481CGGAGAAGAAAGGTGACGTGTACGAGGCGATCTACAGCTTCTACTTCGGAGACTACGGTC
541ACATAGCGGTGCAGGGAGCGTATTTGACCCACCAGGACACGTATCTAGCTGTGACTGGTG
601GATCGGGCATCTTCGAGGGGGTGTACGGTTCCGTGAAGCTGCACCAGATTGTGTTCCCCT
661TCAAGTTACTGTACACTTTTTACTTGAAGGGTATACCGGATCTGCCGGAGGAGTTGCTAG
721ATACACCGGTCCATCCGTCGCCCACGGTGGAGCCGTCGCCCGAGGCCAAGGCGTGTGAAC
781CTGGCGCCACTCTTCCTAACTTCACTGACTGAGGATGCTCGAGAATGATGATGGTCAAAA
841AACTGCACTTTAATTATGACACTTCTGTAATATTGTGGCTGCGTTTTCTTTTCTTTTCTC
901TTTTTTTATGGTGGCGCCGGCGGAGTGGTGGAGGAGGTTTTTTTTTGGGTTGGAGTCGTT
961CAATTTGGAGGCAATTTTTAGTGCATTGAG AGGCCCACTTCACCACTTGATAGMTGAGC
1021TGTCGAAACTATATACATATGTATGTAAAATGGCATATTTTTCAGGGCATTACATTTGGA
1081TTTCAAGTTATTGCATATTATTATGTTTGG ACTAMAAAA AAAAMAAAAGTACTAGTCG
1141ACGCGTGGCC
9
權(quán)利要求
一種采用轉(zhuǎn)喜樹aoc基因提高喜樹愈傷組織中喜樹堿含量的方法，其特征在于，從喜樹中克隆丙二烯氧化物環(huán)化酶AOC基因，構(gòu)建含aoc基因的植物表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將aoc基因?qū)胂矘溆着卟⒄T導(dǎo)出愈傷組織，PCR和半定量RT-PCR檢測(cè)外源目的基因aoc的整合和表達(dá)情況，利用高效液相色譜法測(cè)定喜樹愈傷組織中喜樹堿的含量，篩選喜樹堿含量提高的轉(zhuǎn)基因喜樹愈傷組織。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用轉(zhuǎn)aoc基因提高喜樹愈傷組織中喜樹堿含量的方法，其 特征是，包括如下具體步驟(1)采用基因克隆方法獲得喜樹關(guān)鍵酶基因aoc；(2)把a(bǔ)oc基因可操作性地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成含aoc基因的植物表達(dá)載體；(3)將含aoc基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化喜樹的含aoc基因植 物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株；(4)利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化喜樹幼胚，獲得經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因愈傷組織；(5)半定量RT-PCR測(cè)定喜樹愈傷組織中aoc基因的表達(dá)；(6)對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因愈傷組織中生物堿含量進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)儀測(cè)定，篩選喜樹 堿含量提高的轉(zhuǎn)基因喜樹愈傷組織。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，所述的經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因愈傷組織，其中 設(shè)計(jì)合成aoc基因的引物，進(jìn)行DNA擴(kuò)增，紫外線下觀察到目的條帶的陽(yáng)性愈傷組織即為轉(zhuǎn) 基因喜樹愈傷組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，所述的對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因愈傷組織中生物堿 含量進(jìn)行高效液相色譜法檢測(cè)器測(cè)定，其中色譜柱為Diamonsil C18柱，流動(dòng)相為乙腈 水，乙腈水的體積比為4 6，柱溫25°C，流速0. 8mL/min，進(jìn)樣量10yL，壓力7. 8Mpa，喜 樹堿含量根據(jù)峰面積由標(biāo)準(zhǔn)品曲線換算。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，所述的半定量RT-PCR測(cè)定喜樹愈傷組織中 aoc基因的表達(dá)，通過(guò)下述步驟設(shè)計(jì)合成aoc基因和看家基因18S rRNA的引物，進(jìn)行半定 量RT-PCR擴(kuò)增，用相對(duì)定量法分析基因相對(duì)表達(dá)量。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種采用轉(zhuǎn)aoc基因提高喜樹愈傷組織中喜樹堿含量的方法。本發(fā)明從喜樹中克隆aoc基因，構(gòu)建含aoc基因的植物表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將aoc基因?qū)胂矘浼?xì)胞并再生出愈傷組織；PCR和半定量RT-PCR檢測(cè)外源目的基因aoc的整合和表達(dá)情況，高效液相色譜檢測(cè)器測(cè)定喜樹愈傷組織中喜樹堿含量，篩選喜樹堿含量提高的轉(zhuǎn)基因喜樹愈傷組織。本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因喜樹愈傷組織中喜樹堿的含量顯著提高，本發(fā)明提供了一種提高喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物中喜樹堿含量的方法，對(duì)解決喜樹堿藥源匱乏、滿足醫(yī)藥工業(yè)大規(guī)模工廠化生產(chǎn)需要具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101831456SQ20091004761
公開日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2009年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月13日
發(fā)明者唐克軒, 孫小芬, 皮妍, 蔣科技 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)