專利名稱：固定化沙雷氏菌脂肪酶、制備方法及其催化拆分地爾硫卓手性前體的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，涉及固定化沙雷氏菌脂肪酶、粘質(zhì)沙雷氏菌胞外脂肪酶 的固定化，以及固定化脂肪酶在醫(yī)藥前體生產(chǎn)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
地爾硫卓(Diltiazem)是上世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)并合成的苯并噻平類韓離子通道阻滯劑， 它作用于冠脈血管及末梢血管的血管平滑肌及房室結(jié)，對鈣通道有阻滯作用，能抑制鈣 離子向細(xì)胞內(nèi)流入，降低血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的濃度而使血管平滑肌松弛；并 能有效地擴(kuò)張小動脈血管，增加冠脈血流量，降低冠狀靜脈氧差，有降低心率和血壓作 用?？捎糜谑疑闲孕穆墒С?，典型心絞痛，變異型心絞痛，老年性高血壓等病癥的治療。 由于該藥療效確切，毒副作用小，是心血管疾病治療的重要藥物。
對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯，簡稱MPGM，其左旋異構(gòu)體[(2及,35)-(-)-MPGM]是心 血管藥物地爾硫卓合成的重要中間體，目前有不少單位在進(jìn)行(-)-MPGM的開發(fā)制備。 粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶是催化(土)-MPGM水解拆分，制備光學(xué)純(-)-MPGM的優(yōu)良生物催 化劑[中國專利ZL200410067046.1]。由于游離脂肪酶的穩(wěn)定性相對較低，難以重復(fù)使用， 而且酶液中的復(fù)雜組分給產(chǎn)品的純化處理帶來較多麻煩，因此有必要對脂肪酶進(jìn)行固定 化。
日本的田邊公司[丄Feiwewt 5i^wg.， 1994, 78: 59-63]使用中空纖維膜對沙雷氏菌脂 肪酶進(jìn)行截留固定化，并使用固定化了脂肪酶的中空纖維膜反應(yīng)器進(jìn)行(土)-MPGM的 水解拆分。固定化脂肪酶能重復(fù)使用5批次，當(dāng)上載的酶失活時，可以將其洗脫之后上 載新酶。盡管如此，由于膜傳質(zhì)阻力的存在，導(dǎo)致反應(yīng)速率較慢，第一輪反應(yīng)需要23h 才能達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)。在先前研究中，我們發(fā)現(xiàn)環(huán)氧樹脂(如EupergitC)和硅藻土是比較好 的沙雷氏菌脂肪酶固定化載體[催化學(xué)報，2007， 28: 175-179]，固定化脂肪酶可以重復(fù) 使用5~10批。盡管如此，使用環(huán)氧樹脂共價偶聯(lián)法進(jìn)行酶的固定化，載體價格比較昂貴，固定化酶成本高；而使用硅藻土吸附法進(jìn)行固定化，雖然固定化方法非常簡單，酶 上載容量也較大，但是固定化酶的穩(wěn)定性仍不夠高，反應(yīng)和分離操作也不太方便，這些 問題限制了這兩種固定化方法的工業(yè)化應(yīng)用。殼聚糖是一種天然高分子化合物，表面擁有大量羥基和氨基，生物相容性好，將其 用于酶的固定化具有許多顯著的優(yōu)點(diǎn)廉價、無毒、擁有很好的親水性、高孔隙度以及 大的表面積；可操作性強(qiáng)，能通過多種方式與酶結(jié)合；制備的固定化酶的空間阻礙低， 傳質(zhì)阻力小。另外，殼聚糖是一種可生物降解材料，在其固定化的酶完成催化劑的使用 壽命周期后容易進(jìn)行處理，且對環(huán)境友好。在本發(fā)明中，發(fā)明人使用殼聚糖作為沙雷氏菌脂肪酶的固定化載體，載體價格低， 酶的上載容量以及酶活回收率較高，使用固定化脂肪酶催化(土)-MPGM的水解拆分，反 應(yīng)速率快，對映選擇性好，產(chǎn)品光學(xué)純度高，固定化酶可以多次重復(fù)使用，應(yīng)用成本低。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種固定化沙雷氏菌脂肪酶。本發(fā)明目的還提供一種上述固定化沙雷氏菌脂肪酶的制備方法。本發(fā)明另外一目的是提供一種上述固定化沙雷氏菌脂肪酶的在醫(yī)藥前體生產(chǎn)中的 應(yīng)用，用固定化脂肪酶催化(土)-MPGM的水解拆分，制備光學(xué)純的(2及,3S)-(-)-MPGM， 作為合成心血管藥物地爾硫卓的手性中間體。本發(fā)明的采用的沙雷氏菌脂肪酶是由粘質(zhì)沙雷氏菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的胞外脂肪酶。本發(fā)明的固定化沙雷氏菌脂肪酶該固定化酶以天然高分子化合物殼聚糖為載體骨 架，酶通過戊二醛的交聯(lián)作用共價結(jié)合固定在殼聚糖載體表面。本發(fā)明的固定化沙雷氏菌脂肪酶的制備方法如下1、沙雷氏菌脂肪酶固定化載體的制備由于殼聚糖干粉結(jié)構(gòu)緊密，相對表面積較小，直接使用殼聚糖粉進(jìn)行脂肪酶的固定 化，酶的上載量低，因此需要對殼聚糖進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，提高酶的上載能力。殼聚糖 具有可溶于稀酸溶液(包括甲酸、乙酸等有機(jī)酸和鹽酸、硫酸等無機(jī)酸)，不溶于堿性溶 液的性質(zhì)，因此先將殼聚糖溶解于一定濃度的酸溶液中，所用的酸可以是甲酸、乙酸等有機(jī)酸，也可以是鹽酸、硫酸等無機(jī)酸，殼聚糖溶液的濃度為0.5 5Y。重量/體積(w/v)， 酸的濃度為0.5~5%( ")。然后用堿中和殼聚糖溶液中的酸，獲得固化成型的殼聚糖載 體。這里選擇二種方法制備殼聚糖固定化載體，分別為在攪拌狀態(tài)下，在含有0.5%~5%重量殼聚糖、0.5~5%重量酸的水溶液中，緩慢加入 濃度為0.5~10%重量的堿水溶液，生成殼聚糖凝膠沉淀；或者將含有2%~5%重量殼聚糖、 2~5%重量酸的水溶液逐滴滴入濃度為10~50%重量的堿水溶液中，生成殼聚糖小球；所 述的酸是甲酸或乙酸短鏈有機(jī)酸、或鹽酸或硫酸無機(jī)酸；所述的強(qiáng)堿是一價金屬的氫氧 化合物。2、沙雷氏菌脂肪酶的固定化選擇戊二醛作為交聯(lián)劑使沙雷氏菌脂肪酶共價偶聯(lián)到上述制備殼聚糖凝膠沉淀或 殼聚糖小球的殼聚糖載體上，將制備的殼聚糖凝膠沉淀或殼聚糖小球的殼聚糖載體、粘 質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶液和戊二醛在0 4(fC反應(yīng)1 24 h，所述的殼聚糖載體、粘質(zhì)沙雷氏 菌脂肪酶液的重量比為l: 5~1: 20，殼聚糖載體和戊二醛的重量比為100: 1~10: 1。 進(jìn)一步的描述可以如下1) 將所述的殼聚糖凝膠沉淀或殼聚糖小球的殼聚糖載體直接投入粘質(zhì)沙雷氏菌脂 肪酶液中，在攪拌狀態(tài)下加入戊二醛進(jìn)行偶聯(lián)固定化至戊二醛的終濃度為0.2%~2%重 量/體積，抽濾、洗滌，洗去未結(jié)合的戊二醛和蛋白質(zhì)，儲存于4。C備用。2) 將殼聚糖載體投入濃度為1~10%重量的戊二醛溶液中反應(yīng)，使載體表面接上戊 二醛臂，抽濾、洗滌，洗去過量的戊二醛；將預(yù)處理后的殼聚糖載體按10~30%重量的 濕重投入沙雷氏菌脂肪酶液中，攪拌反應(yīng)l 10h，抽濾、洗滌，洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)， 儲存于^C備用。固定化沙雷氏菌脂肪酶活力的測定方法為稱取一定質(zhì)量的固定化脂肪酶，置于IO ml磷酸鉀緩沖液(IOO mM， pH 7.0)中，30°C預(yù)熱3 min后，加入60 pi 100 mM的對硝基 苯酚丁酸酯(溶于二甲基亞砜)，攪拌反應(yīng)3min后，取0.5ml反應(yīng)液，加入等體積丙酮 終止反應(yīng)，離心后測定405 nm的吸光度，以不加酶的樣品作為空白對照。酶活力單位 的定義為在上述條件下，每分鐘催化1.0pmol對硝基苯酚丁酸酯水解所需的酶量定義 為一個活力單位(U)。本發(fā)明的固定化脂肪酶可以用于催化拆分(士)-MPGM:酶促反應(yīng)在水-有機(jī)兩相體系中進(jìn)行，有機(jī)相選擇甲苯、異丙醚、甲基叔丁基醚等水 不溶性溶劑，有機(jī)相占反應(yīng)體系總體積的5~95%，有機(jī)相中底物(土)對甲氧苯基縮水甘 油酸甲酯(士)-MPGM的濃度為0.05-1.5 mol/L。固定化脂肪酶的用量為1000-10,000 U/L，反應(yīng)溫度為20~40°C，優(yōu)選為30。C;反應(yīng)pH為7.0~9.0，優(yōu)選為8.0-8.5。每批反 應(yīng)至剩余底物的對映體過量值(")高于99%時終止，回收固定化脂肪酶，重新開始下一 批次反應(yīng)。每批反應(yīng)完畢后，反應(yīng)液靜置分層，取上清有機(jī)相，用一定濃度的亞硫酸氫鈉溶液 洗滌，隨后干燥、濃縮、精制，即可獲得光學(xué)純的地爾硫卓手性中間體(2及,3S)-(-)-MPGM。采用本發(fā)明所公開的固定化沙雷氏菌脂肪酶催化拆分制備(-)-MPGM，固定化酶易 于制備，反應(yīng)條件溫和，具有很好的工業(yè)應(yīng)用開發(fā)前景。


圖1用殼聚糖固定化沙雷氏菌脂肪酶重復(fù)拆分(士)-MPGM;圖2殼聚糖固定化酶催化拆分(i)-MPGM的反應(yīng)進(jìn)程 ( )第一批；(■)第二批；(fe)第三批；(X)第四批；(*)第五批；(*)第六批；(+)第 七批。具體的實(shí)施方式下述實(shí)施例將有助于進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不能限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1殼聚糖固定化沙雷氏菌脂肪酶分別取0.5g殼聚糖，制備殼聚糖凝膠和殼聚糖小球，具體制備方法如下殼聚糖凝膠將0.5g殼聚糖，溶于50mlP/。的醋酸溶液中，磁力攪拌狀態(tài)下緩慢 加入l。/。的NaOH溶液至溶液呈堿性，抽濾收集析出的殼聚糖絮凝體，水洗至中性，備 用。殼聚糖小球?qū)?.58殼聚糖，溶于20ml2.5y。的醋酸溶液中，用注射器逐滴滴到 20。/。NaOH溶液中，抽濾收集獲得的小球，水洗至中性，備用。將獲得的殼聚糖載體投入到50ml 1%的戊二醛水溶液中，30。C振搖12h，抽濾，比酶活(U/g) 23.6 酶活回收率(％) 31.0 蛋白上載量1.2(mg/g)10.0 6.50.5說明書第5/6頁洗滌。投入50ml沙雷氏菌脂肪酶發(fā)酵液(5000U/L)中，4。C攪拌固定化2h，抽濾、洗 滌。酶固定化的結(jié)果如表1所示。表l殼聚糖固定化沙雷氏菌脂肪酶殼聚糖小殼聚糖絮凝體球?qū)嵤├?殼聚糖固定化沙雷氏菌脂肪酶在10L熱水中，加入100g殼聚糖以及100ml醋酸，攪拌使殼聚糖溶解，緩慢滴 加lmol/L的NaOH至溶液呈弱堿性。抽濾，洗滌析出的殼聚糖凝膠，將獲得的凝膠加 到10 L沙雷氏菌發(fā)酵液中(脂肪酶活力約5000 U/L)，加入50 ml戊二醛(50%)，室溫攪 拌反應(yīng)2h，抽濾、洗滌，洗去未反應(yīng)的戊二醛和蛋白質(zhì)，獲得固定化酶濕重約1.5kg， 活力為21 U/g。實(shí)施例3殼聚糖固定化沙雷氏菌脂肪酶在異丙醚-水兩相體系中催化拆分(士)-MPGM取10g殼聚糖絮凝體固定化沙雷氏菌脂肪酶，總活力為230U，加到250ml三口燒 瓶中，加入50ml含有1.04g(土)-MPGM的異丙醚以及50ml水，30°C， 200 rpm攪拌 反應(yīng)，滴加氨水控制反應(yīng)液pH恒定為8.5。間歇取樣，分析剩余底物濃度以及ee值。 每批反應(yīng)剩余底物的ee值達(dá)到99.9%以上時終止反應(yīng)，抽濾收集固定化沙雷氏菌脂肪 酶，用水洗滌后，重新開始下一批反應(yīng)。固定化沙雷氏菌脂肪酶重復(fù)使用30批，仍然 保留了較高的活力(圖1)。 、實(shí)施例4殼聚糖固定化酶在甲苯-水兩相體系中催化拆分(士)-MPMG 取1 kg固定化沙雷氏菌脂肪脂肪酶(21 U/g)投入10 L三口燒瓶中，加入624 g(士)-MPGM (3.0 mol)，加3 L甲苯以及3 L自來水，30°C, 200 rpm攪拌反應(yīng)，流加氨 水控制反應(yīng)pH恒定為8.5。間歇取樣，待剩余底物的"值高于99%時終止反應(yīng)，抽濾 回收固定化脂肪酶，洗滌后，補(bǔ)加15g新鮮固定化沙雷氏菌脂肪酶后重新進(jìn)行下一批反 應(yīng)。連續(xù)反應(yīng)7批，反應(yīng)進(jìn)程結(jié)果如圖2所示，反應(yīng)總產(chǎn)率為1.3 kg (-)-MPGM/kg固定 化酶。
權(quán)利要求
1、一種用殼聚糖載體固定化粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶，其特征為該固定化酶以天然高分子化合物殼聚糖為載體骨架，酶通過戊二醛的交聯(lián)作用共價結(jié)合固定在殼聚糖載體表面。
2、 一種如權(quán)利要求1所述的殼聚糖載體固定化粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶的制備方法， 其特征是通過下述步驟1)在攪拌狀態(tài)下，在含有0.5%~5%重量殼聚糖、0.5~5%重量酸的水溶液中， 緩慢加入濃度為0.5~10%重量的堿水溶液，生成殼聚糖凝膠沉淀；或者將含有2%~5% 重量殼聚糖、2~5%重量酸的水溶液逐滴滴入濃度為10~50%重量的強(qiáng)堿水溶液中， 生成殼聚糖小球；所述的酸是甲酸或乙酸短鏈有機(jī)酸、或鹽酸或硫酸無機(jī)酸；所述 的堿是一價金屬的氫氧化合物；2)將l)制備的殼聚糖凝膠沉淀或殼聚糖小球的殼聚糖載體、粘質(zhì)沙雷氏菌脂 肪酶液和戊二醛在(K40。C反應(yīng)1 24 h，所述的殼聚糖載體、粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶液 的重量比為l: 5~1: 20，殼聚糖載體和戊二醛的重量比為100: 1~10: 1。
3、 如權(quán)利要求2所述的殼聚糖載體固定化粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶的制備方法，其特征 是步驟(2)的反應(yīng)是將所述的殼聚糖凝膠沉淀或殼聚糖小球的殼聚糖載體直接投入粘 質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶液中，在攪拌狀態(tài)下加入戊二醛進(jìn)行偶聯(lián)固定化，戊二醛的終濃度為 0.2%~2%重量/體積；或者將制備的1~30%濕重殼聚糖載體投入到戊二醛溶液中反應(yīng)， 再將預(yù)處理后的殼聚糖載體投入粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶液中偶聯(lián)固定化。
4、 如權(quán)利要求l所述的殼聚糖載體固定化粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶的用途，其特征是用 于催化拆分(土)對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯制備左旋對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯。
5、 如權(quán)利要求3所述的殼聚糖載體固定化粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶的用途，其特征是所 述的制備在20 4(rc， (士)對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯和固定化脂肪酶反應(yīng)l 24h;反應(yīng) 在水-有機(jī)兩相體系中進(jìn)行，所述的的(土)對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯溶解在有機(jī)相中， 濃度為0.05~1.5摩爾/升；水相溶液的pH為7.0 9.0;固定化脂肪酶的用量為IOO(MO,OOO U/L;有機(jī)相體積占反應(yīng)體系總體積的5~95%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固定化沙雷氏菌脂肪酶、制備方法及其催化拆分地爾硫卓手性前體的用途，該固定化酶可以催化拆分地爾硫卓手性前體--外消旋對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯[(±)-MPGM]。本發(fā)明使用殼聚糖作為沙雷氏菌脂肪酶的固定化載體，用戊二醛作為交聯(lián)劑，使沙雷氏菌脂肪酶共價結(jié)合到固定化載體上。將固定化酶應(yīng)用到(±)-MPGM的酶促水解拆分反應(yīng)中，固定化酶可以重復(fù)使用多次，顯示了良好的操作穩(wěn)定性和實(shí)際應(yīng)用可行性。
文檔編號C12P7/62GK101532007SQ20091004789
公開日2009年9月16日 申請日期2009年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月20日
發(fā)明者江 潘, 許建和, 趙麗麗, 陸雅臣 申請人:華東理工大學(xué);江蘇華榮生物科技有限公司