專利名稱：：Rna和dna雙外參實時定量熒光pcr檢測方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物信息學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR檢測方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：自從1970年克里克提出分子生物學(xué)的中心法則以來，人們對于基因的轉(zhuǎn)錄表達和及其調(diào)控的機制進行了大量的研究。Northern雜交方法是最早被用來測定基因轉(zhuǎn)錄量的方法。后來，結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生的RT-PCR(reversetranscription-PCR，即逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))提供了一種靈敏而又簡便的半定量測定方法。近年來，實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(簡稱為qPCR)方法由于其靈敏、準(zhǔn)確和重復(fù)性好，因此逐步成為基因表達的定量測定的主要方法。所有上述方法的檢測原理是將待測基因的轉(zhuǎn)錄水平表示為與一個參考(內(nèi)參或外參)基因的相對表達量。因此為了減少由于RNA不穩(wěn)定和逆轉(zhuǎn)錄的效率問題產(chǎn)生的誤差，通常采用內(nèi)參或者用相同量的總RNA來對數(shù)據(jù)進行歸一化。內(nèi)參通常選用一些看家基因，如e-actin、GAPDH以及rRNA等。然而，眾所周知，由于對不同組織而言，細胞的總RNA含量和/或內(nèi)參的量并不相同，即便同一組織在不同條件下它們也不一定相同，而且這種以總RNA中的含量和/或相對于一個內(nèi)參的比例的表示方法顯示不出一個基因的轉(zhuǎn)錄水平。由于上述原因，待測基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測數(shù)據(jù)往往不準(zhǔn)確。因此，如何檢測出真實可靠的基因轉(zhuǎn)錄水平是目前亟待解決的技術(shù)問題。此外，還有利用外源的RNA在實時定量PCR中進行跟蹤標(biāo)定(spike-inqPCR)的方法，此方法結(jié)合絕對標(biāo)準(zhǔn)曲線可以產(chǎn)生更加可靠的結(jié)果?，F(xiàn)有技術(shù)中雖然已經(jīng)有人使用了跟蹤標(biāo)定策略，但沒有能夠?qū)⒁粋€基因的轉(zhuǎn)錄水平與它的基因的拷貝數(shù)聯(lián)系起來。
發(fā)明內(nèi)容為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR檢測方法。所述檢測方法通過同時測定待測基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的拷貝數(shù)和待測基因的拷貝數(shù)以及參考基因(包括外參mRNA和外參DNA)的拷貝數(shù)來檢測待測基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測方法。通過檢測待測基因在某個時刻，某個細胞狀態(tài)下的mRNA和DNA的比值，即mRNA/DNA的值來確定待測基因在某細胞狀態(tài)下的表觀表達水平。本發(fā)明的第一個目的是提供一種RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR檢測方法，包括如下步驟1)配制外參基因的mRNA與外參基因的DNA的預(yù)混合液；2)將待測樣品與步驟l)中制備的預(yù)混合液混合，分別抽提并且收集總mRNA部分和總DNA部分；3)總mRNA部分進行逆轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈后與總DNA部分分別進行實時定量熒光PCR，然后計算擴增后待測基因的mRNA和DNA以及外參基因的mRNA和DNA的擴增產(chǎn)物的拷貝數(shù)。上述步驟l)中的外參基因為被測樣品中不存在的序列，同時該外參基因的mRNA與外參基因的DNA中均不含有待測基因的mRNA和DNA序列。常用外參基因的選擇現(xiàn)在己經(jīng)有多種生物的全基因組已經(jīng)測序完成，在已經(jīng)測出的序列中，可以選擇被測樣品中不存在的序列做外參。通常遺傳進化上相差遠的生物之間(例如植物與動物之間，原核與真核之間)比較容易找到這種序列?？梢赃x擇天然存在并且滿足上述要求的序列作為外參基因，或者人工合成一個滿足上述要求的人為設(shè)定的序列作為外參。優(yōu)選的，所述外參基因的DNA為攜帶外參基因DNA序列的重組載體；所述外參基因的mRNA是以上述線性化的攜帶外參基因DNA序列的重組載體為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄制得的mRNA。上述載體為質(zhì)?；驐U狀病毒DNA(bacmid)。優(yōu)選的，所述步驟1)中的外參基因的mRNA的序列長度與待測基因的mRNA的序列長度相近，外參基因的DNA的序列長度與待測基因的DNA的序列長度相近。上述步驟2)中RNA與DNA的預(yù)混合液中，mRNA拷貝數(shù)與DNA拷貝數(shù)的比值的范圍應(yīng)當(dāng)不受限制，根據(jù)實施例中對家蠶基因轉(zhuǎn)錄的測定，中等水平表達在50~5000:1。因此，預(yù)混合液中，mRNA拷貝數(shù)與DNA拷貝數(shù)的比值優(yōu)選為100:1。上述步驟3)中的cDNA的制備過程為將外參基因的mRNA裝入T7體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，4再用T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄制得，其他常用于體外轉(zhuǎn)錄的酶還有SP6和T3RNA聚合酶。上述步驟3)中對同一基因的mRNA與DNA使用相同的引物分別進行實時定量熒光PCR擴增。上述步驟3)中實時定量熒光PCR中的引物按照實時定量熒光PCR的常規(guī)要求進行設(shè)計并合成，具體要求為要求引物退火溫度盡量相同，擴增產(chǎn)物的長度盡量接近，擴增產(chǎn)物的GC含量盡量接近，且每對引物應(yīng)當(dāng)是位于同一個外顯子中。同時由于本發(fā)明中需要同時對mRNA與DNA進行擴增，同一基因的mRNA與DNA使用相同的引物進行實時定量熒光PCR擴增可以消除由于引物不同和擴增片段不同帶來的誤差。可以根據(jù)上述規(guī)則使用引物設(shè)計軟件(例如clonemanager)進行設(shè)計。上述步驟3)中的實時定量熒光PCR擴增產(chǎn)物的長度范圍一般為100bp~300bp，同一批測定要求長度盡量接近，這里在由軟件設(shè)計時擴增產(chǎn)物的長度規(guī)定為140bp160bp。優(yōu)選的，所述RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR檢測方法還包括根據(jù)如下公式計算待測基因的表觀表達水平-.待測基因mRNA的拷貝數(shù)外參基因mRNA的拷貝數(shù)外參基因mRNA的初始含量待測基因的表觀表達水平=-待測基因DNA的拷貝數(shù)'外參基因DNA的拷貝數(shù)外參基因DNA的初始含量本發(fā)明的檢測方法通過引入外參基因的mRNA和外參基因的DNA分別對待測樣品中待測基因的mRNA(轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)和DNA(基因)進行標(biāo)定，通過外參基因的mRNA的初始拷貝數(shù)與外參基因的DNA的初始拷貝數(shù)之間的比值最終測出在該樣品中待測基因的mRNA的初始拷貝數(shù)與待測基因的DNA的初始拷貝數(shù)之間的比值，并且使用該比值來表征這個基因的表達水平。考慮到各基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的壽命是不一樣的，有些基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物半衰期很短，在檢測過程中可能有些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物己經(jīng)水解消亡，因此將使用本發(fā)明的方法測得的基因轉(zhuǎn)錄水平稱為"表觀轉(zhuǎn)錄水平"。本發(fā)明的方法使用了mRNA和DNA雙外參來分別對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和基因進行跟蹤標(biāo)定，是一種雙跟蹤標(biāo)定技術(shù)(daul-spike-intechnique)。本發(fā)明的第二個目的是提供所述的RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR檢測方法在芯片(包括cDNA芯片和寡核苷酸芯片)檢測基因表達和基因拷貝數(shù)變異中的應(yīng)用，包括如下步驟1)選定外參基因，在基因芯片上設(shè)計針對該外參基因的探針；2)配制外參基因的mRNA與DNA的預(yù)混合液；3)在抽提樣品中加入步驟2)中制得的預(yù)混合液，分別收集樣品中的總mRNA和DNA部分；4)mRNA和DNA分別進行表達譜芯片檢測流程和拷貝數(shù)變異芯片(tilingarrayplatform)檢測流程，得到各基因的mRNA和DNA以及外參基因的mRNA和DNA的拷貝數(shù)變化情況；5)根據(jù)如下原理進行數(shù)據(jù)處理和歸一化，最終計算待測基因的轉(zhuǎn)錄水平行、，甚^|的表^宇丄+水平-待測基因mRNA的拷貝數(shù)外參基因mRNA的拷貝數(shù)外參基因mRNA的初始含量待測基因DNA的拷貝數(shù)t外參基因DNA的拷貝數(shù)X外參基因DNA的初始含量所述步驟l)中的外參基因可以為l個或多個。目前，正在廣泛使用的芯片技術(shù)實際上與實時定量PCR采用同樣的方法來進行數(shù)據(jù)的歸一化的。從用看家基因歸一化和總RNA歸一化，再到跟蹤標(biāo)定。因此本發(fā)明的方法可以擴展到高通量測定的平臺，即用RNA外參跟蹤標(biāo)定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，用DNA外參跟蹤標(biāo)定基因拷貝數(shù)，這樣可以將mRNA水平與基因拷貝數(shù)聯(lián)系起來。基因芯片有二類cDNA芯片和寡核苷酸芯片。最近更有用寡核苷酸探針如屋頂上蓋瓦片一樣交叉重疊起來組成了一種嵌合芯片(tilingarrayplatform)技術(shù)，這種嵌合芯片既能分析基因表達譜又能夠分析基因拷貝數(shù)的變化，是一種很好的工具。在用上述二類基因芯片技術(shù)分析基因表達譜時使用木發(fā)明的方法同樣可以將mRNA水平與基因拷貝數(shù)聯(lián)系起來。當(dāng)mRNA水平與基因拷貝數(shù)聯(lián)系起來后，同一基因的表達水平在不同組織之間可以進行比較，在同一組織不同條件下可以進行比較；不同基因之間也可以進行比較；同一批的實驗可以進行比較，不同批的實驗也可以進行比較。因此，本發(fā)明的方法可以為基因表達數(shù)據(jù)和基因拷貝數(shù)據(jù)的整合提供新的概念和框架。木發(fā)明極大地改進了對基因轉(zhuǎn)錄水平檢測的實驗設(shè)計，使得人們可以得到某個基因的真實的轉(zhuǎn)錄水平而不是一個相對水平。此策略對于芯片分析以及芯片數(shù)據(jù)的整合同樣適用。本發(fā)明采用RNA和DNA雙外參分別跟蹤標(biāo)定樣品中的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和基因的拷貝數(shù)，使基因的轉(zhuǎn)錄水平能夠與每個基因聯(lián)系起來。本發(fā)明的方法是不依賴樣品，可以廣泛使用，并且能夠得到更具有生物學(xué)意義的數(shù)據(jù)的技術(shù)。根據(jù)實施例中的實驗結(jié)果，那些看家基因，如GAPDH和A3實際上在各組織中是差異表達的，然而它們以前卻經(jīng)常被用作內(nèi)參，因此使用看家基因作內(nèi)參的數(shù)據(jù)也許是不準(zhǔn)確的，可能需要重新進行檢測。圖l質(zhì)粒pPigT.7的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2質(zhì)粒FFa2A3IFP2的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3bacmidAcA3IFP2的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4IFP2DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5Cyp6AB4在家蠶各組織中的表觀轉(zhuǎn)錄水平圖。具體實施例方式下面結(jié)合實施例進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆試驗手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件或者制造商建議的條件進行或配置。實施例11.實驗蠶的處理實驗蠶54A的卵由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蠶業(yè)研究所提供，催青、孵化后用人工飼料在25'C飼養(yǎng)。幼蟲長到5齡第3天解剖，取中部絲腺、后部絲腺、脂肪體、馬氏管和中腸，重蒸水洗3次后-70'C保存。2.RNA和DNA外參的選擇p/ggy^"c轉(zhuǎn)座子在鱗翅目細胞系TN-368中發(fā)現(xiàn)的，它由2個轉(zhuǎn)座臂和一個轉(zhuǎn)座酶IFP2的編碼序列組成。由于IFP2不存在于家蠶中，因此選擇IFP2作為本實施例的外參。3.檢測RNA和DNA外參的比值質(zhì)粒pPigT.7是將T7-IFP2表達框插入載體pUC19中制得，質(zhì)粒pPigT.7(4983bp)的結(jié)構(gòu)圖見圖1。使用限制性內(nèi)切酶HindIII將質(zhì)粒pPigT.7線性化，然后進行瓊脂糖凝膠電泳純化后，用ThermoNanoDropl000Spectrophotometer(GeneCompanyLtd)儀器通過紫外吸收定量。以上述線性化的pPigT7為模板，使用T7RNA聚合酶通過體外轉(zhuǎn)錄制備外參RNA，即IFP2mRNA。其具體制備過程如下總反應(yīng)體積為20pl。反應(yīng)體系中含有2pi50mM的DTT(Dithiothreitol，二硫蘇糖醇)，pPigT7模板1.2嗎，4種NTP各2.5mM，10x反應(yīng)緩沖液2pl，20單位RNA酶抑制劑和50單位T7RNA聚合酶，37'C下保溫1小時。產(chǎn)物經(jīng)DNaseI處理后用CsCl(氯化銫)超離心純化，用ThermoNanoDrop1000Spectrophotometer(GeneCompanyLtd)儀器通過紫外吸收定量。最后用DEPC—H20將制備好的IFP2mRNA稀釋成濃度為lng/pl(即7.605xl08拷貝4tl)的溶液?？紤]到細胞DNA抽提液中的DNA片段的長度通常比質(zhì)粒DNA大許多，為避免DNA抽提液中DNA中其他片段的干擾所產(chǎn)生的不必要的誤差，因為外參基因的mRNA和DNA分別對待測基因的mRNA和DNA進行跟蹤標(biāo)定，因此要求與被跟蹤的mRNA和DNA在各種處理過程(酒精沉淀，RNA的反轉(zhuǎn)錄，用于芯片測定時的DNA隨機引物延伸等)中的行為一致。因此本實施例選用含IFP2的bacmidAcA3IFP2(~134kb)(結(jié)構(gòu)參見圖2)來作為外參DNA。含IFP2的bacmidAcA3IFP2的制備方法為將質(zhì)粒FFa2A3IFP2(是將A3-IFP2表達框插入載體pFFa2中制得，其結(jié)構(gòu)圖見圖2)轉(zhuǎn)入bacmidAcAEGT得到bacmidAcA3IFP2(結(jié)構(gòu)如圖3所示)。通過實時定量PCR方法，以HindIII線性化的pPigT7為標(biāo)準(zhǔn)，檢測AcA3IFP2的濃度，具體檢測方法如下實時定量PCR用SYBRPremixExTaqkit(TakaRaBiotechnology(Dalian)Co.Ltd.)在95t:下變性1min,然后在95°C5sec,55°C10sec,72°C10sec循環(huán)50次，然后收集熒光信號。熒光數(shù)據(jù)收集的溫度77"C。檢測結(jié)果如圖4所示，經(jīng)過計算可知AcA3IFP2DNA外參的濃度為9.341xl06拷貝/pl。將等體積的外參IFP2mRNA和AcA3IFP2混合，2pl混合液中含DNA外參9.341xl06拷貝，RNA外參7.605xl()S拷貝，二者之比為1:81.4。將它們加到lOOmg家蠶組織勻漿液中，與細胞基因組DNA的拷貝數(shù)(~108)大致是相匹配的。4.待測樣品處理依產(chǎn)品說明書用TRNzol-A+TotalRNA試劑(TiangenBiotechCo.,LTDBeijing,China)分別抽提家蠶各組織的總mRNA和DNA，具體步驟如下將待檢測組織研磨后將1ml抽提液加到100mg組織樣品中，同時加2|xlIFP2snRNA和AcA3IFP2的預(yù)混合液，使之充分混合，裂解細胞并且溶解細胞內(nèi)含物。在12,000rpm的轉(zhuǎn)速下離心15min，分別收集RNA和DNA部分。總RNA部分用DNaseI處理后進行逆轉(zhuǎn)錄，合成第一條cDNA鏈。具體反應(yīng)為在20^總反應(yīng)體系中含有4pi5x反應(yīng)緩沖液，1|_ig總RNA,4種dNTP各0.5mM，25單位8RNasin(核酸酶抑制劑)，150nM(dN)6，2pi10nMoligo(dT15)及200單位M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/pi;TaKaRa)。5.實時定量PCR引物檢測為減少由不同引物和擴增片段帶來的實驗系統(tǒng)誤差，本實施例中對同一基因測定其mRNA和DNA的拷貝數(shù)時采ffl相同的引物對，并設(shè)計在問一外顯子屮。擴增產(chǎn)物的長度在144bp到152bp之間。針對FibH、FibL、Ser-l、Cyp6AB4、A3、GAPDH、28SrRNA和IFP2的引物見表1。表l實時定量PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實時定量PCR的條件如下實時定量PCR用SYBRPremixExTaqkit(TakaRaBiotechnology(Dalian)Co.Ltd.)在95。C下變性1min,然后在95°C5sec,55°C10sec,72°C10sec循環(huán)50次，然后收集熒光信號。熒光數(shù)據(jù)收集的溫度依據(jù)擴增產(chǎn)物而定(具體溫度參見表l)。6、實時定量PCR效率分析對于每一個基因的'a'值通過實時定量PCR的DNA模板和RNA模板的稀釋曲線來測定。取W值趨向于1的最大值得到直線方程C(T)=axlg(c叩y)+b,這里斜率'a'給出每一個基因的PCR的效率。結(jié)果表明不同基因的PCR擴增效率稍有不同(見表2)。這些'a'值可以用于RNA與DNA比值的計算。表2每個基因的qPCR效率<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>7、實吋定量PCR檢測的數(shù)據(jù)處理和歸一化通過檢測某個基因在某個細胞狀態(tài)下的raRNA和DNA的比值，即mRNA/DNA的值來確定在某細胞狀態(tài)下每個拷貝的基因的表觀轉(zhuǎn)錄量。本實施例中通過檢測組織或者樣品中待測基因的mRNA的拷貝數(shù)與待測基因DNA的拷貝數(shù)之比來判斷待測基因在該組織或者樣品中在特定時間范圍內(nèi)的表達水平，即上述的"表觀表達水平"。本實施例的檢測過程如下在用實時定量PCR測定了每個基因的mRNA和DNA水平后，計算這個基因的mRNA與DNA之比，并用實時定量PCR測定的外參基因的mRNA與DNA之比進行歸一化，再乘以預(yù)混合液中外參基因的mRNA與DNA之比(81.4)進行歸一化。其中，第一步歸一化的目的是用于去除諸如酒精沉淀、逆轉(zhuǎn)錄效率和PCR等技術(shù)上的問題；第二步歸一化的目的是用于去除RNA和DNA樣品處理過程帶來的差別。通過上述兩步歸一化，可以準(zhǔn)確地計算出某組織中的待測基因在某個條件下，每個拷貝的表達水平。計算公式如下PCR擴增時樣品中初始拷貝數(shù)越高，則熒光信號強度超過閾值(T)時的擴增圈數(shù)C(T)就越?。籆(T)值與初始拷貝數(shù)的對數(shù)成線性關(guān)系C(T)=axlg(copy)+b,a和b分別是直線方程的斜率和截距。根據(jù)數(shù)學(xué)運算lg(c叩yl/copy2)^C(T)！-C(T)2)+a.C(T)=axlg(copy)+b，C(T)產(chǎn)axlg(copy!)+b........................................................................(1)C(T)2=axlg(COpy2)+b........................................................................(2)(1)式一(2)式可得C(T)廠C(T)2=ax(lgcopy「lgcopy2)所以可得lg(c叩y,/c叩y2)=[QTh-C(T)2]+a即第一步歸一待測翻的表觀表達水，待測基因m腿附頻數(shù)+外參基因mR輔拷貝數(shù);待測基因DNA的拷貝數(shù)夕卜參基因DNA的拷貝數(shù)第二步歸一行測某H的-恕ff表伏水平—待測基因mRNA的拷貝數(shù)外參基因mRNA的拷貝數(shù)外參基因mRNA的初始含量付"巷Utf、J衣人衣込JM—待測基因DNA的拷貝數(shù)7外參基因DNA的拷貝數(shù)X外參基因DNA的初始含量'由于IFP2基因的mRNA與IFP2基因的DNA的初始含量之比為81.4，因此經(jīng)過兩步歸一步驟后可知，^甘m^主加主i'+i亞—A3基因mRNA的拷貝數(shù).IFP2基因mRNA的拷貝數(shù)A堪因的表觀表達水干-A3基剛幽勺拷貝數(shù)-!FP堪剛NA附考貝數(shù)x81.4同時因為:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>可得1n[(C(T)(A3/mRNA)_C(T)(A3/DNA))+aA3]八3基因的表觀表達水平=~^-^~Tx81.41ol_(C(T)(IFP2/mRNA)—C(T)(IFP2/DNA)卜a肝2jA3基因在后部絲腺測定結(jié)果計算步驟如下三次mRNA測定的C(T)值的平均為24.092，三次DNA測定的C(T)值的平均為32.947，A3基因PCR擴增反應(yīng)的a值是-3.1H7，lg(A3mRNA/A3DNA)=(24.092—32.947)+(-3.1147)=2.84297(A3mRN感3DNA)=102層=696.58外參IFP2在后部絲腺測定結(jié)果四次RNA測定的C(T)值的平均為23.337，六次DNA測定的C(T)值的平均為29.742，外參IFP2PCR擴增反應(yīng)的a值是-3.6882，lg(IFP2RNA/IFP2DNA)=(23.337—29.742)+(-3.6882)=1.73662(IFP2RNA/IFP2DNA)=10173662=54.528A3基因在后部絲腺的表觀表達水平=696.58+54.528X81.4=1039.9實施例2檢測A3,GAPDH，28SrRNA在家蠶各組織中的表達使用實施例1中的檢測方法對A3,GAPDH，28SrDNA基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和基因以及外參IFP2mRNA和DNA在家蠶中部絲腺、后部絲腺、脂肪體、馬氏管和中腸抽提物中的拷貝數(shù)進行了測定。A3，GAPDHand28SrDNA基因在這些組織中的每拷貝基因的表達量按上述方法計算出來。它們的表觀轉(zhuǎn)錄水平在不同組織間差別很大(如表3所示)。表3家蠶各組織中A3,GAPDHand28SrRNA基因的表觀轉(zhuǎn)錄水平<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>上述實驗結(jié)果表明actin-3基因(即A3基因)的表觀轉(zhuǎn)錄水平與家蠶組織的生長速度相一致，最高的是后部絲腺，接下來依次是脂肪體、馬氏管、中部絲腺和中腸。GAPDH的表觀轉(zhuǎn)錄水平反映了各組織的能量代謝的能力，而28SrDNA的表觀轉(zhuǎn)錄水平表示出各組織的蛋白質(zhì)合成能力。GAPDH的表達最高的是脂肪體，接著是后部絲腺、馬氏管、中腸和中部絲腺。28SrDNA的表達最高的也是脂肪體，接著是后部絲腺、中部絲腺、馬氏管和中腸。家蠶脂肪體的功能與高等動物的肝臟類似，在能量代謝和蛋白質(zhì)合成上起著至關(guān)重要的作用，這能解釋GAPDH和28SrDNA基因在脂肪體中的表達特別高的結(jié)果。28SrDNA基因在后部絲腺和中部絲腺也相當(dāng)高，這與絲腺的這兩部分中高蛋白合成的相符。這個結(jié)果提示這些常被用作內(nèi)參的基因在測定組織專一性表達時用來歸一化其他基因的表達是不合適的。由于本實施例中計算的是每個基因的轉(zhuǎn)錄水平，對于多拷貝基因，它的真實的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物就要多得多。例如，在脂肪體中RNA與DNA之比對A3是538.69，對GAPDH是10475，對28SrRNA是97321。由于基因組中rDNA和核糖體蛋白基因有200-300拷貝，所以28SrRNA的量比A3和GAPDH的mRNA還要多得多。實施例3家蠶中絲素基因和絲膠l基因的表達的檢測檢測方法同實施例l。測定了家蠶各組織中絲素重鏈基因(FibH)、輕鏈基因和絲膠l基因的表觀轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示FibH和FibL專一地在后部絲腺表達，Ser-l專一地在中部絲腺表達。FibL在后部絲腺的表觀轉(zhuǎn)錄水平(192029士30739)與Ser-l在中部絲腺的表觀轉(zhuǎn)錄水平(196539土12455)相近，而FibH在后部絲腺的表觀轉(zhuǎn)錄水平(106453土13667)約是FibL的一半。如果將FibH和FibL在后部絲腺的表達以及Ser-l在中部絲腺的表達如以前常做的用A3,GAPDH或28SrRNA進行歸一化，Ser-l在中部絲腺的表達比FibL在后部絲腺的表達要高得多。這是由于A3,GAPDH和28SrDNA基因在絲腺兩部分的表達不同之故。結(jié)果參見表4，表4中的結(jié)果證明一個基因的表觀轉(zhuǎn)錄水平比對看家基因的相對表達要可靠。表4表觀轉(zhuǎn)錄水平和相劉r測定的比較表達的基因和組織后部絲腺中FibH的表達后部絲腺中FibL的表達中部絲腺中Ser-l的表達表觀轉(zhuǎn)錄水平106453192029196539相對于A3的表達96,987174.951607.7相對于GAPDH的表達689.511243.818208相對于28SrRNA的表達*0.0393570.0709950.1103713*依每個基因組中有300拷貝28SrDNA計算。同樣，如上所述，F(xiàn)ibH和FibL在后部絲腺的表觀轉(zhuǎn)錄水平(106453和192029),Ser-l在中部絲腺的表觀轉(zhuǎn)錄水平(196539)都超過28SrDNA在絲腺的這二個部分中的表觀轉(zhuǎn)錄水平(后部絲腺9016.1,中部絲腺5935.5)。這與絲腺在5齡第3天大量合成絲素和絲膠相一致。考慮到基因組中rDNA有200-300拷貝，雖然FibH,FibL和Ser-l以每個基因的轉(zhuǎn)錄水平高于28SrDNA，rRNA的總量還是比比這些基因的mRNA高許多，因而保證了蛋白合成系統(tǒng)的功能。實施例4細胞色素P450(Cyp6AB4)表達的組織專一性Cyp6AB4是近年克隆的一種家蠶細胞色素P450，然而其表達的組織專一性還不清楚。檢測方法同實施例1。檢測結(jié)果如圖5中所示，Cyp6AB4在各組織的表觀轉(zhuǎn)錄水平顯示Cyp6AB4主要在馬氏管和脂肪體中表達，在中腸和絲腺中不表達。本實施例用家蠶做模式系統(tǒng)來測定不同基因在各組織中的表觀轉(zhuǎn)錄水平。家蠶的基因表達明顯地在空間與時間上受到調(diào)控，例如絲素蛋白專一地在5齡家蠶的后部絲腺表達，而絲膠蛋白則在中部絲腺表達。這對于研究基因的組織專一性表達，并發(fā)展測定方法十分有利。同時，本實施例測定了家蠶幼蟲絲腺的不同部位、脂肪體、馬氏管、中腸中細胞質(zhì)肌動蛋白(cytoplasmicactin，A3)、甘油醛3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)、28S核糖體RNA(28SrRNA)的表觀轉(zhuǎn)錄水平。發(fā)現(xiàn)A3，GAPDH、28SrRNA這些常被用作內(nèi)參的基因在不同組織中的表達差別非常大，說明采用本實施例的檢測方法是非常必要的。在此基礎(chǔ)上，本實施例中測定了絲素重鏈蛋白基因(fibroinheavychain,FibH)和輕鏈蛋白基因(fibroinlightchain,FibL)、絲膠蛋白1基因(sericin-1,Ser-1)和細胞色素P450Cyp6AB4基因(cytochromeP450，Cyp6AB4)轉(zhuǎn)錄的組織專一性。實施例5RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR檢測方法應(yīng)用于嵌合芯片(tilingarrayplatform)技術(shù)平臺本實施例中，將該RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR檢測方法應(yīng)用于嵌合芯片(tilingarrayplatform)技術(shù)平臺，對表達譜和基因拷貝數(shù)進行聯(lián)合檢測和整合分析。步驟如下1)選定外參基因，并且在tilingarray芯片上設(shè)計針對該外參基因的探針；2)制備外參基因的RNA與DNA，配制外參基因的RNA與DNA的預(yù)混合液；3)將預(yù)混合液混入組織樣本，分別收集總mRNA和DNA;4)tnRNA樣本用于表達譜檢測，得到樣本的基因表達情況以及外參基因的mRNA拷貝數(shù)；DNA樣本用于拷貝數(shù)變異(copynumbervariation,縮寫為CNV)檢測，得到樣本的DNA拷貝數(shù)以及外參基因的拷貝數(shù)情況；5)按照如下原理進行數(shù)據(jù)處理和歸一化，實現(xiàn)基因表達數(shù)據(jù)與基因拷貝數(shù)據(jù)的整合，最終計算待測基因的轉(zhuǎn)錄水平-MS，.,jfct-y-待測基閔m咖A的拷貝數(shù).外參基因m咖A的拷貝數(shù)外參基因mRNA的初始含量、待測基因DNA的拷貝數(shù)t外參基因DNA的拷貝數(shù)X外參基因DNA的初始含量15序列表<110>上海生物信息研究中心<120>RNA和DNA雙外參檢測方法<130>090365<160>17<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>4983<212>DNA<213>重組質(zhì)粒gagacggtca60tcagcgggtg120ctgagagtgc180atcaggcgcc240tcttcgctat300acgccagggt360txactatagg420ctgattttga480cttttaagat540acttattata600tgttctttag660ggtgaggatt720gaagaagcgt780tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccgcagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatc卿gc卿ttgtaaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtatttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattctaatacgacgcgccgcttggagctcgcgtgaggcgtgcttgtcaatgcggtaagtgtcaactatatcgaccgcgtgagtcaaaatgacgcatgattatcttttacgtgattaactcatacgataattatattgttatttcatgttctacttscgtgatatatatattttcttgttatagatatcgtgactaatatataataaaatgggaacgatgagcatatcctctctgctcttctgcaaggcgatgacgagcttgttctgacagtgaaatatcagatcacgtaagtgaagacgtccagagcgataca16ttat3gSLtgaaaaatgttsLtgccgagtctxttgtaa犯tgcatttcgtgacagtgaga犯tgtacgtctcccatagatgaacaagcc已agtgat犯atgg犯tactacgt3C犯ttggttCC3ttgtggggctccaggcctcaacg已aagtgg3C3CgCtctatggcattgccat犯tgttttBCatgELgggt￡LCertg￡L￡ltgaetcaacc3tag8ggt83gtgceLctgaaccccacttttaagataaccactctctttatcacagttacttt犯gtatggaaatgccttatg卿g兆ttacacctcaatcaaccgtgcga郞tggg認agccagct犯gagaccaaatgattgtacggac已gt已gc已已gcctgacgtcagtgtCgLgCCaggttcttcataataaacattattgtcagattgcttcaaacgagatatcatgatgaaatctatgtccacagctgtggatcgcccacacttccatcagtgcaggttU卿gataaaa&tccttgggs卿gtc犯3gcctgtcaaacaaactcgatgttttatggtatactccgcaagitggtgttctgtgatcgtttatgcacgtcaagcgtggcttctaagttggtcaacctca^agaggtattttttactg犯3cgtcgatgctttcttatgacctcttttttggatttgacggtgtcctcatgatgtggaacacagactgC3Cggt3gaaaac11actgcgagataccgttttgacggtattatcatcttatgtattatgsLCctgcagttgcctgcatttca^Lgtcggtaaccgtttcagaatcttgttc犯agtcctccgacgcgttgattgag3t3gg犯tct已tgtggtattctgtggatcgatctttgatacgatgtatttactcsctccaggggtttaggatgtgacagtggtttgtcgtaatacaag犯ccggg鄉(xiāng)tactgaccccttactttgtgatgagtaatcaaactt鄉(xiāng)a卿cgaaattc"ttttagaagctcctttagacgaacaccttgccac3cg鄉(xiāng)ggtaatgtgccgcaatttcgcaaaacaggtgctagtaatgacagtttgtcaatgtgtcttag犯cctgttagaagctcatttgatatatccc犯ccactcggtg3tt3Cgtgtg幼a犯cagtcctcgtctcatgatgcttcta犯aggcggeigaataggtggcattatatacaatgagaaaccactttgaags900960102010801140120012601320138014401500156016201680174018001860192019802040210021602220gatatttgcgcgataatatctctaatattttgccaaatgaagtgcctggtacalcagatg2280acagtactgaagagccagtaatgas犯aacgtacttactgtacttactgcccctctaa犯2340t犯ggcga犯ggcaaatgcatcgtgc犯aaaatgcs犯犯sgtteitttgtcg3g3gC￡Lt32400atattgatatgtgccaaagttgtttctgactgactaataagtatastttgtttctattat2460gtataagttaagctaattacttattttataatacaacatgactgtttttaaagtacaaaa2520taagtttatttttgtaaaagagagaatgtttaaaagttttgttactttagaagaaatttt2580gagtttttgtttttttttaataaata犯taaacataaataaattgtttgttgaatttatt2640attagtatgta3gtgt犯atatastaaaacttaatatctattcawttaat犯ataaacc2700tcg3tstac3g3ccg3as幼犯3犯saa犯a犯3犯3^a犯犯3gcttggcgt犯tcat2760ggtcatagctgtttcctgtgtga犯ttgttatccgctcacaattccacacaacatacgag2820ccggaagcataaagtgt犯agcctggggtgcctaatgagtgagct犯ctcacattaattg2880cgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa2940tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctca3000ctgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcgg3060t犯tacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaa犯ggcc3120agcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcc3180cccctgacgagcatcacaaa犯tcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggac3240tataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccc3300tgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcata3360gctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgc3420acg肪ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggt朋ctatcgtcttgagtcca3480acccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagsg3540cgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacacta3600gaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa犯gagttg366018gtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagc3720agcagattacgcgcsgaa犯a犯ggatctc犯gaagatcctttgatcttttctacggggt3780ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaa3840ggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatct已aagtat3t3900atgagt犯acttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcga3960tctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatac4020gggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccgg4080ctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcsgaagtggtcctg4140caactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagtt4200cgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgct4260cgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgat4320cccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagta4380agttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtca4440tgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaat4500agtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccac4560atagcagaactttaa犯gtgctcatcattggaa犯cgttcttcggggcgaaaactctcaa4620ggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatctt4680cagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccg4740caaaaaagggaat犯gggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaat4800attattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacstatttgaatgtattt4860agaaa犯t8aacat犯taggggttccgcgcacatttccccgaa犯gtgccacctgacgtct4920aagaaaccattattatcatgacattaacctataa<aaataggcgtstcacgaggccctttc4980gtc4983<210>2<211>19<212>DNA<213>引物<400>2cggctactcgttcactacc19<210>3<211>19<212>DNA<213>引物<400>3ccgtcgggaagttcgtaag19<210>4<211>20<212>DNA<213>引物<400>4cggtaacgagtccattgtag20<210>5<211>20<212>DNA<213>引物<400>5<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><213>引物<400>9accgtcggtggatgttac<210>10<211>21<212>DNA<213>引物<400>10cccagtgctctgaatgtcaac<210>11<211〉22<212>DNA<213>引物<400>11agatagggacagtgggaatctc<210>12<211>18<212>DNA<213>引物<400>12ctgtgcacggtagttgtc<210>13說明書第20/22頁18212222<211>20<212>DNA<213>引物<400>13tcagtacttccggtatctcg20<210>14<211>18<212>DNA<213>引物<400>14tgttgagggcttgatgac18<210>15<211>18<212>DNA<213>引物<400>15accttaccc3cagctttg18<210>16<211>20<212>DNA<213>引物<400>16cgcgtatttctatccaaggg2023<210>17<211>18<212>DNA<213>引物<400>17acatggcacgcaatttcc1g權(quán)利要求1.一種RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR檢測方法，包括如下步驟1)配制外參基因的mRNA與外參基因的DNA的預(yù)混合液；2)將待測樣品與步驟1)中制備的預(yù)混合液混合，分別抽提并且收集總mRNA和總DNA；3)總mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈后與總DNA分別進行實時定量熒光PCR，然后計算擴增后待測基因的mRNA和DNA的拷貝數(shù)以及外參基因的mRNA和DNA的擴增產(chǎn)物的拷貝數(shù)。2.如權(quán)利要求1所述的RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述步驟l)中的外參基因為被測樣品中不存在的序列，同時該外參基因的mRNA與外參基因的DNA中均不含有待測基因的mRNA和DNA序列。3.如權(quán)利要求1所述的RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述外參基因的DNA為包含外參基因的重組載體；所述外參基因的mRNA是以上述線性化的包含外參基因的重組載體為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄制得的mRNA。4.如權(quán)利要求3所述的RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述載體為質(zhì)?；驐U狀病毒。5.如權(quán)利要求1所述的RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR檢測方法，其特征在于，對同一基因的mRNA與DNA使用相同的引物分別進行實時定量熒光PCR擴增。6.權(quán)利要求1-7任一權(quán)利要求中所述的RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR檢測方法，其特征在于，還包括根據(jù)如下公式計算待測基因的表觀表達水平.待測基因mRNA的拷貝數(shù)外參基因mRNA的拷貝數(shù)外參基因mRNA的初始含量待測基因的表觀表達水平=待測基因DNA的拷貝數(shù)'外參基醫(yī)1DNA的拷貝數(shù)外參基因DNA的初始含量7.權(quán)利要求6所述的RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR檢測方法在芯片分析基因表達和基因拷貝數(shù)變化中的應(yīng)用，其特征在于，步驟l)中的外參基因相應(yīng)的探針同時出現(xiàn)在用于表達譜檢測和基因拷貝數(shù)檢測的芯片中，可以為1個或多個。全文摘要本發(fā)明涉及生物信息學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種RNA和DNA雙外參實時定量熒光PCR檢測方法及其應(yīng)用，包括如下步驟選定外參基因；制備外參基因的mRNA與DNA，配制外參基因的mRNA與DNA的預(yù)混合液；在抽提樣品時加入預(yù)混合液，收集樣品中的總mRNA和DNA部分；實時定量熒光PCR，計算待測基因和外參基因mRNA和DNA的拷貝數(shù)；數(shù)據(jù)處理和歸一化。本發(fā)明還公開了上述方法在基因芯片分析基因表達技術(shù)中的應(yīng)用。本發(fā)明改進了對基因轉(zhuǎn)錄水平檢測的實驗設(shè)計，可以得到某個基因的真實的轉(zhuǎn)錄水平而不是一個相對水平，為基因表達數(shù)據(jù)和基因拷貝數(shù)據(jù)的整合提供新的概念和框架。文檔編號C12Q1/68GK101538611SQ20091004930公開日2009年9月23日申請日期2009年4月14日優(yōu)先權(quán)日2009年4月14日發(fā)明者李園園,陸長德申請人:上海生物信息技術(shù)研究中心